CN116875580A - 利用人工突变创制玉米msp1雄性不育系 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了利用人工突变创制玉米msp1雄性不育系。首先通过EMS诱变控制玉米雄花发育的ZmMSP1基因，获得了该基因的等位雄性不育突变体msp1；进一步通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在野生型玉米中定点突变该基因，创制出另外三个雄花完全败育的等位突变体，这些等位突变体对玉米不育系繁殖和杂交种子制备具有重要意义。本发明还针对msp1的三个等位雄性不育突变体设计了功能分子标记，在玉米雄性不育系培育、不育化杂交制种和分子标记辅助选择中具有重要应用价值。

Description

利用人工突变创制玉米msp1雄性不育系
技术领域
本发明属于植物生物技术育种领域，具体涉及利用人工突变创制玉米msp1雄性不育系。
背景技术
玉米（Zea mays L.）作为一种重要的粮饲两用作物，在我国经济发展中起到了重要作用。通过充分利用杂种优势，玉米的产量得到了显著提升。在我国，玉米杂交种的种植率已达到95%，杂种优势使得玉米产量提升了15％~50%。
雄性不育系被证明是作物杂种优势利用和杂交制种的重要工具，其主要包括细胞质雄性不育（CMS）和基因核雄性不育（GMS）。CMS由线粒体基因和核基因共同控制，虽然已广泛应用于玉米育种和杂交种生产中，但其存在一些限制，如资源利用效率不高、胞质单一以及易感病等问题。相比之下，GMS由核基因单独控制，尽管能够克服CMS的部分缺点，但通过常规育种方法大规模繁殖纯合不育系却面临显著的难度。伴随着生物技术的飞速进步，结合基因工程和分子设计育种创制的玉米多控不育技术以及植物通用型显性不育技术，为解决玉米隐性核雄性不育系的维持和繁殖问题提供了新的可能性。实现这些技术的广泛应用的核心前提是必须获取大量的、功能明确的控制玉米雄性发育的GMS基因以及相应的雄性不育材料。
与拟南芥和水稻这两大模式植物相比，玉米中的雄性不育（GMS）基因及相关不育材料的克隆和鉴定较为匮乏。CRISPR/Cas9基因编辑技术，以其成本低、操作简便、突变效率高等特性，正逐渐在植物基因研究和作物改良等方面获得广泛应用。借助这一技术来挖掘和鉴定玉米的雄性不育候选基因和开发不育材料，能迅速丰富玉米的基因资源，助推不育化育种和制种的推广。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的提供利用人工突变创制玉米msp1雄性不育系，可以用来创制玉米雄性不育系，从而应用于玉米杂交育种和制种。
为实现上述目的，本发明提供了一种创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于通过EMS诱变鉴定到一种玉米雄性不育突变基因msp1，该突变是由野生型ZmMSP1基因第2个外显子的+4366—+4367位缺失2个碱基（CT）引起，该突变造成ZmMSP1蛋白翻译提前终止，蛋白长度只有509个氨基酸，这导致含有该突变核苷酸序列msp1突变体虽能正常抽雄，但花药无法外挂且无法正常开裂，花药发育后期呈现短小、干瘪、褐化的特点，最终表现为完全雄性不育表型；所述突变基因msp1的全长DNA和氨基酸具体序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
进一步，本发明还提供了另外一种创制玉米雄性不育系的方法，其特征在于，抑制玉米基因组中的育性基因编码蛋白的表达和/或活性，进而使所述育性基因功能丧失，得到玉米雄性不育系；所述育性基因为ZmMSP1（Zm00001d042362）；所述ZmMSP1（Zm00001d042362）的核酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述 ZmMSP1（Zm00001d042362）编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一些实施方案中，上述抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入中任一种。
在一些实施方案中，上述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。
在一些实施方案中，在该基因第二外显子处设计CRISPR/Cas9载体靶点，所述靶点的DNA序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
在另一方面，本发明还提供一种获得msp1雄性不育系的方法，将通过上述方法获得的msp1雄性不育系与目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得msp1雄性不育的性状和基因突变。
本发明还包括通过上述任一方法获得的msp1雄性不育系在杂交育种和制种中的应用。所述在杂交育种和制种中的应用是指将msp1雄性不育系作为母本与其他父本进行杂交，或是将获得的msp1雄性不育系与其他目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得msp1雄性不育的性状和基因突变。
更进一步地，本发明还提供了三种玉米雄性不育系msp1的分子标记引物，引物ZmMSP1-F1和ZmMSP1-R1的序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；引物ZmMSP1-F2和ZmMSP1-R2的序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；ZmMSP1-F3和ZmMSP1-R3的序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。
本发明的优点及有益效果如下：本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过遗传转化，将育性基因ZmMSP1（Zm00001d042362）在玉米中特异敲除，经一系列实验获得了三种具有新的突变位点的msp1雄性不育系。这些不育系育性稳定，呈现完全败育，可以创制不同遗传背景的玉米雄性不育系，从而可以应用于玉米杂交育种和制种。针对三种msp1的雄性不育系开发的共分离分子标记，可在玉米不育系育种和制种中应用于等位基因鉴定、目标单株的筛选和种子纯度鉴定等。因此，本发明在玉米不育化育种和制种上具有重要意义，可以为玉米增产提供重要生物资源。
附图说明
图1为玉米野生型（WT）和突变体msp1的表型
A和B，WT和突变体msp1的雄穗表型；C和D，WT和突变体msp1的花药表型；E和F，WT和突变体msp1的花药I2-KI染色表型。标尺=5cm （A-B），2mm（C-D）100μm（E-F）。
图2为S2-S5时期WT与msp1 突变体的半薄切片观察
PPC：初生壁细胞；SPC：次生壁细胞；eSP：多余的造胞细胞；dSP：降解的造孢细胞
图3为玉米ZmMSP1基因的精细定位和图位克隆
A，不育msp1群体DNA与可育群体DNA的多态性分子标记的分离比；B，F2群体中48个雄性不育株和48个雄性可育株用于玉米ZmMSP1基因的初定位，初步将ZmMSP1基因定位于3号染色体SSR标记umc1012和umc2158之间；C，ZmMSP1基因精细定位于SSR标记P2 和P5 之间，约112.05 kb的区间；D，精细定位区间内预测的5个基因模型；E，区间内5个候选基因通过玉米花药RNA-Seq数据进行表达谱分析，发现只有Zm00001d042362在花药发育早期有高表达，与突变体植株表型相一致；F，野生型和msp1突变体中ZmMSP1基因结构及测序分析。野生型ZmMSP1（WT- ZmMSP1）：基因全长6816 bp，包括2个外显子和1个内含子。
图4为野生型（WT）和msp1突变体中Zm00001d042362基因的序列比对
图5为ZmMSP1基因在玉米花药不同发育时期中的表达模式分析
S5，造孢细胞时期；S6, 小孢子母细胞时期；S7，减数分裂开始时期；S8a，减数分裂Ⅰ，二分体时期；S8b，减数分裂Ⅱ，四分体时期；S9，单核小孢子时期；S10，小孢子空泡化时期；S11，小孢子第一次不均等有丝分裂，二核小孢子时期；S12，小孢子第二次有丝分裂，三核小孢子时期。
图6为pCas9-ZmMSP1定点突变表达载体的物理图谱
pCas9-ZmMSP1：从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒；核酸酶编码基因Cas9的表达盒；ZmMSP1基因靶标1（MT1）的表达盒；靶标2（MT2）的表达盒；靶标3（MT3）的表达盒；靶标4（MT4）的表达盒。
图7为野生型ZmMSP1与ZmMSP1-Cas9不育突变体的基因结构和DNA序列分析
msp1突变体ZmMSP1-Cas9-1：在第2个外显子+3050bp处插入1个碱基（C）和+3267bp处缺失1个碱基G；突变体ZmMSP1-Cas9-2：在第2个外显子+3547bp-+3549 bp处缺失3个碱基（GCT）和+3684bp处缺失1个碱基A；突变体ZmMSP1-Cas9-3：在第2个外显子+3051bp-+3265bp处缺失215个碱基（TGAAGGGAAGGGATTTCTCCGTGACTGGTTTGATTCAGAAAAAGCCCCTTGCAGTTGGTCAGGTATAACTTGTGTGGAACATGCTGTAGTGGATATAGACTTGTCATCTGTGCCAATTTATGCCCCGTTCCCGTTATGTGTCGGGTCATTCCAATCACTGGCTCGTCTCAACTTCAGTGGTTGTGGGTTTTCTGGCGAGCTTCCGGATGCCTTGG）。
图8为野生型（WT）与msp1三个等位纯合突变体的雄穗、花药和花粉粒表型分析
上排为玉米WT与ZmMSP1-Cas9-1、ZmMSP1-Cas9-2和ZmMSP1-Cas9-3纯合突变体雄穗的表型比较；第二排为WT及与ZmMSP1-Cas9-1、ZmMSP1-Cas9-2和ZmMSP1-Cas9-3纯合突变体花药的表型比较；下排为WT与ZmMSP1-Cas9-1、ZmMSP1-Cas9-2和ZmMSP1-Cas9-3纯合突变体花粉粒的I2-KI染色比较。
图9为利用共分离标记对ZmMSP1-Cas9-1不育突变体的F2代植株进行基因分型
共分离标记ZmMSP1-F1/R1对30株ZmMSP1-Cas9-1不育突变体F2代植株的PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定结果：在纯合野生型（AA）植株中扩增出74 bp条带；在MSP1/ msp1-Cas9-1杂合型（Aa）植株中扩增出73 bp和74 bp两条带；在msp1-Cas9-1/msp1-Cas9-1纯合突变型（aa）植株中扩增出73 bp条带。
图10为利用共分离标记对ZmMSP1-Cas9-2不育突变体的F2代植株进行基因分型
共分离标记ZmMSP1-F2/R2对19株ZmMSP1-Cas9-2不育突变体F2代植株的PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定结果：在纯合野生型（AA）植株中扩增出74 bp条带；在MSP1/ msp1-Cas9-2杂合型（Aa）植株中扩增出74 bp和71 bp两条带；在msp1-Cas9-2/msp1-Cas9-2纯合突变型（aa）植株中扩增出71 bp条带。
图11为利用共分离标记对ZmMSP1-Cas9-3不育突变体的F2代植株进行基因分型
共分离标记ZmMSP1-F3/R3对14株ZmMSP1-Cas9-3不育突变体F2代植株的PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定结果：在纯合野生型（AA）植株中扩增出559 bp条带；在MSP1/ msp1- Cas9-3杂合型（Aa）植株中扩增出559 bp和344 bp两条带；在msp1-Cas9-3/msp1-Cas9-3纯合突变型（aa）植株中扩增出344 bp条带。
具体实施方式
下述实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。如无特殊说明，实施例中所用引物及基因的合成和测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例一、玉米雄性不育突变体msp1的获得
通过筛选本实验室甲基磺酸乙酯（Ethyl Methane Sulfonate，EMS）诱导的玉米自交系B73突变体库，获得一个完全雄性不育的突变体，将其命名为msp1。该突变体的雄性不育性状在北京和海南三亚经过与野生型多代杂交均可稳定遗传，不受环境影响。在北京科技大学试验田和海南三亚等多地条件下观察和比较突变体与野生型整个生长周期植株形态，发现无明显差异，仅表现出雄性不育性状。
实施例二、植株表型鉴定、花粉育性观察以及花药半薄切片观察
msp1突变体在营养生长和雌穗发育方面，与野生型相比基本无差异；在雄穗发育方面，野生型能够正常抽雄，花药能够正常开裂、散粉，自交后可正常结实， 而msp1突变体虽能正常抽雄，但是花药无法外挂且无法正常开裂，花药发育后期呈现短小、干瘪、褐化的特点（图1）；进一步对野生型和突变体的花粉进行I2-KI染色，发现野生型花粉发育正常，花粉粒染色后呈黑色，但突变体无花粉粒形成（图1）。花药半薄切片观察也发现突变体缺乏绒毡层和中间层，小孢子母细胞数量异常增多，药室体积异常肿胀膨大（图2）。
实施例三、ZmMSP1基因的定位、克隆和突变位点分析
以自交系郑58为父本与突变体msp1杂交，F1代育性正常，F2代出现育性分离，如表1所示，F2群体中正常可育株（F）与不育株（S）的分离符合单基因3:1的分离比，即突变体的雄性不育表型表现为明显的单基因隐性遗传。
表1 玉米msp1突变体育性分离的遗传分析
F2 群体 总植株数 可育植株 不育植株 可育：不育 卡方值 显著性检验P>0.05
msp1×郑58 1225 914 311 2.94:1 0.09(X2 0.05=3.84) ns*
挑选msp1×郑58 F2群体中48个雄性不育株和48个雄性可育株，用于玉米ZmMSP1基因的初定位研究。所使用的SSR标记如表2所示，基因定位情况如图3所示。
表2 用于ZmMSP1基因定位的SSR标记
引物名称 引物序列(5'-3')
umc1495-F ACACAGCACAACACAACACAACAC
umc1495-R TACTGATGGGGGAACGAATAATTG
umc1012-F TTCTTGCGGACCTCAAACTTGT
umc1012-R CTCCATCACCACTCAGAATGTCA
P1-F TTGCACATTTGGTTTTC
P1-R ACGCTTTCAGACTTTAGG
P2-F GCAGCACCAACCAAACCA
P2-R GCAGCACCAACCAAACCA
P5-F AATAGCAATCGCCACTTA
P5-R AATAGCAATCGCCACTTA
umc2158-F ACACAGCACAACACAACACAACAC
umc2158-R AATAATTGTACCGAGATGTTGGCG
Umc2259-F GGCTCGACTTCGAGGACACC
Umc2259-R GAGGAGGAGAGGGACAGGGAAG
Umc2033-F TCTAGATCCCTAGAGTAGCTGCGG
Umc2033-R CACTCACGCAAATTAGCACAACTT
结果表明，基于玉米Maize 6H-60K SNP基因芯片分析，初步将基因定位于玉米三号染色体（图3A）；ZmMSP1基因初步定位于3号染色体SSR标记umc1012 和 umc2158之间（图3B），进一步精细定位于标记P2 和P5之间约112.05 kb的区间（图3C），在此区间预测有5个候选基因（图3D）；利用玉米不同发育时期的花药RNA-Seq数据开展基因的表达谱分析，发现只有Zm00001d042362 在花药发育早期有高表达，与突变体植株表型相一致（图3E）。对ZmMSP1（Zm00001d042362）和突变体基因进行克隆、测序分析，发现msp1突变体在第2个外显子的+4366—+4367位缺失2个碱基（CT）引起（图3F和图4），导致氨基酸移码突变，蛋白翻译提前终止（图3F）。ZmMSP1基因包含4639个核苷酸，包括2个外显子，编码一个受体激酶蛋白（signalling peptide receptor kinase），因此本发明将该基因命名为ZmMSP1。
实施例四、ZmMSP1的时空表达分析
为了研究该基因与玉米雄性生殖发育的关系，本发明首先利用qPCR分析了该基因在玉米花药发育不同阶段的表达模式。具体步骤如下：
1、玉米花药的取样与发育时期鉴定
从玉米自交系B73处于不同发育阶段的雄穗中，按照花药的长度，收集不同长度的花药样品；每份样品采集20个长度相近的新鲜花药，其中3个固定在FAA溶液中（Coolaber，中国）通过树脂半薄切片实验确定具体的发育阶段，其余17个花药立即冷冻在液氮中，用于RNA的提取。
利用梯度乙醇（50%、70%、90%、100%）对用于树脂切片的固定花药进行脱水，每步15-30分钟。脱水过程中花药可置于70%乙醇中长期保存；为便于后期包埋，可在90%乙醇中加入0.1%的伊红对材料进行染色；为保证脱水彻底，材料须在无水乙醇中脱水2-3次。随后进行树脂替换，将花药依次置于乙醇与Spurr树脂体积比为3:1、1:1、1:3液体中2-4小时，最后置于纯树脂中过夜。树脂置换完成后，将花药置于模具中，加入200 µL Spurr树脂，置于烘箱中，70℃聚合过夜。随后进行修块，然后可利用德国莱卡切片机进行切片，切片厚度为2µm；用镊子夹取切好的片子，置于载玻片中央的无菌水中，42℃条件下展片过夜。将固定有样品的载玻片浸入0.1%的甲苯胺蓝染液中，染色1分钟，然后用去离子水冲洗，再置于展片台上，烘干后即可用于显微观察；也可以封片后长期保存。分析树脂切片的结果，根据玉米14个不同发育时期（Stage1-Stage14：S1-S14）的细胞学特点，确定每份样品的具体发育时期。
2、qPCR分析
用Trizol试剂（Invitrogen，美国）提取上述鉴定的处于不同发育时期（S5-S12）的玉米花药总RNA；然后使用5X All-in-One RT Master Mix （ABM，加拿大）合成cDNA；采用TBGreen™PreMix Ex Taq™（TaKaRa，日本）在QuantStudio5 QuantStudio 5 Real-Time PCRSystem （ABI，美国）上进行定量逆转录聚合酶链反应检测，扩增引物为：qMSP1-F（5’-AGGGACATGGTCACTGAAGG-3’）和qMSP1-R（5’-TTGAGACGAGCCAGTGATTG-3’）；ZmUbiqutin为参照基因，其扩增引物为：Ubiqutin-F（5’-CGACAACGTGAAGGCGAAGA-3’）和Ubiqutin-R（5’-ACGCAGATACCCAGGTACAGC-3’）；每个发育时期包括三个生物学重复，每个样品有三个技术重复；数据用2-ΔΔCt方法进行分析，并以均值±标准差（Means±SD）的形式给出定量结果。
ZmMSP1基因呈现花药发育时期特异表达的模式：在玉米花药发育的早期S2~S4时具有较高水平的表达，且在S3时期迎来高峰表达，之后表达量降低，在S10~S11 时表达量再次升高（图5）。
实施例五、ZmMSP1基因的功能验证和利用CRISPR/Cas9方法创制玉米雄性不育突变体
为了明确玉米ZmMSP1在玉米中的功能，本发明采用CRISPR/Cas9基因编辑方法突变 Zm00001d042362 基因序列，敲除该基因在玉米中的功能。本发明选取玉米杂交种Hi II作为基因编辑的受体材料。本发明分别选取基因保守区的SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列作为CRISPR/Cas9基因编辑的靶标区域。
1、ZmMSP1的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
本发明的基因编辑载体为pBUE411-MT1T2-Cas9，该载体的基础载体为pBUE411- Cas9，中间载体为pCBCmT1T2，提供gRNA。本发明通过在引物上设计靶点然后通过PCR获得MT-sgRNA进而通过酶切连接到基础载体中，具体的构建流程如下：
（1）靶标gRNA的设计。将ZmMSP1（Zm00001d042362）的基因序列输入http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR进行靶标设计。本发明选择的四个靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。本发明的sgRNA骨架序列从中间载体pCBCmT1T2直接扩增获得。
（2）通过在引物上设计靶点然后PCR扩增获得MT-sgRNA。引物ZmMSP1-MT1-F和引物ZmMSP1-MT2-R扩增中间载体pCBCmT1T2，用于获得包含第一个和第二个靶标的sgRNA的片段，产物长度为965 bp。引物ZmMSP1-MT3-F和引物ZmMSP1-MT4-R扩增中间载体pCBCmT1T2，用于获得包含第三个和第四个靶标的sgRNA的片段，产物长度为965 bp。PCR 体系和条件如下：模板DNA （中间载体pCBCmT1T2 ≥30 ng/μL）1.2 μL；Primer F/R：各1.2 μL；灭菌ddH2O：11.4 μL；2X MCLAB 酶（产品编号：I5HM-200）：15 μL。PCR的温度程序如下：①98 ℃2分钟；②98 ℃ 10秒；③58 ℃ 30秒；④72 ℃ 30秒；⑤ 从②－④循环34次；⑥ 72 ℃ 5分钟；⑦ 25 ℃ 10分钟。最后回收PCR产物。载体构建所需的引物序列如下：
ZmMSP1-MT1-F: 5’-ATATATGGTCTCTGGCGTGAGGGACATGGTCACTGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA-3’
ZmMSP1-MT2-R: 5’-ATTATTGGTCTCTAAACTGGGGAGCTTGCACAATCTTGCTTCTTGGTGCCGC-3’
ZmMSP1-MT3-F: 5’-ATATATGGTCTCTGGCGACAGATTACCCAAAGCTGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA-3’
ZmMSP1-MT4-R: 5’-ATTATTGGTCTCTAAACCTACCTAGGGAGATTGGTCTGCTTCTTGGTGCCGC-3’
（3）通过酶切连接构建到骨架载体。将pBUE411-Cas9载体和回收的带有靶标的sgRNA片段用BsaI消化，同时加入T4连接酶将载体和sgRNA片段连接。10 μL的酶切连接体系如下，sgRNA片段：1 μL，pBUE411-Cas9载体（≥60 ng/μL) ：1 μL，10 x NEB Buffer：1 μL，BsaI内切酶（产品编号：#R3733S ）：0.5 μL，T4 连接酶（产品编号：#M0202M ）：0.25 μL，灭菌ddH2O：6.25 μL。
图6所示为目的基因ZmMSP1（Zm00001d042362）的四靶标，标记基因Cas9和bar与骨架载体pBUE411-Cas9构建的表达载体pCas9-ZmMSP1。
2、农杆菌介导的玉米遗传转化
将上述构建的pCas9-ZmMSP1载体分别通过热激法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定；然后以1:1的体积农杆菌和甘油混合于-80 ℃保存菌液。以新鲜剥离的1.8 mm左右的玉米杂交种Hi II的幼胚作为受体材料，将剥离的玉米胚放入含有1.8 mL悬浮液的2 mL塑料离心管中，放置时间不超过1小时，每个离心管中大约放入100个幼胚；吸去悬浮液，并用新的悬浮液将幼胚清洗2遍，管底保留少量可没过幼胚的悬浮液，然后43 ℃热激2分钟，之后再冰浴1分钟，用移液枪吸尽管底残留的洗液，并加入1.0 mL的农杆菌侵染液，轻摇30秒，然后黑暗静置8分钟。接下来将离心管中的幼胚和侵染液倒入共培养基上，晃匀后用移液枪吸出多余的侵染液，所有幼胚的盾片朝上，于23 ℃黑暗共培养3天。共培养结束后，用无菌的镊子将幼胚转移至恢复培养基，于28 ℃培养7-14天，中间过程需留意及时去掉幼胚上长出的幼芽。恢复培养结束后将幼胚放至含1.5 mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养3轮，每轮筛选2周，然后转到2 mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养2轮，每轮筛选2周。将抗性愈伤组织转至扩繁培养基，28 ℃，暗培养2周。随后将扩繁好的抗性愈伤组织转移至诱导培养基，于28 ℃黑暗环境下培养2周。然后转到分化培养基中，25 ℃，5000 lx，光照培养2周。培养结束后将分化出的苗簇分离出单个幼苗放置于生根培养基中，25 ℃，5000 lx，光照培养直到生根；将小苗转入小营养钵中生长，生长成活后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。
T0代植株CRISPR/Cas9突变结果检测
为确定T0代植株CRISPR/Cas9突变结果，采取如下步骤进行：
本发明首先采用CTAB法提取玉米叶片DNA，具体方法如下：剪取2厘米左右长度的幼苗叶片，放入装有钢珠的2 mL离心管；将装有叶片的离心管放入液氮浸没5分钟，然后利用研磨仪打碎叶片样品；向离心管中加入500 μL CTAB提取缓冲液（其中含有1%的β-巯基乙醇），并用力震荡混匀， 65 ℃恒温水浴中预热20-30 min，（期间取出颠倒1-2次，并注意实验样品编号的对应）；离心管冷却至室温后加入500 μL氯仿：异戊醇（24:1）萃取液，用力摇晃30s之后在室温条件下静置片刻；在4 ℃条件下，以12000 rpm速度离心5 min，取离心完成后的500 μl上清液于新的1.5 mL离心管中；将等体积的异丙醇加入到盛有上清液的离心管中轻轻震荡混匀，室温条件下静置10 min左右；随后将盛有样品的离心管放入4 ℃离心机中，以12000 rpm速度离心10 min之后，轻轻吸取上清液，弃上清，保留沉淀；加入800 μL75 %乙醇，洗涤沉淀两次，以10000 rpm速度离心5 min，弃掉上清；将样品放置在室温下自然干燥2-4小时，得到DNA沉淀，加入适量无菌水溶解，轻微震荡，充分溶解DNA。DNA样品存于-20 ℃保存。用Nanodrop检测DNA浓度，稀释至10 ng/L用作PCR模板。
然后根据ZmMSP1（Zm00001d042362）基因序列设计PCR引物。
检测靶标：MT1、MT2、MT3和MT4；产物大小：965 bp；引物序列如下：
ZmMSP1-T-F: 5’- GATTGCCACTTTAATTGACTTCTTC-3’；
ZmMSP1-T-R: 5’- CTTCCATTGAAACCATTATGTCCC-3’。
提取基因组DNA，按照以下PCR参数扩增：
反应体系：15 μL MIX常规PCR体系，0.5 μL forward primer，0.5 μL reverseprimer，1 μL DNA，5.5 μL 灭菌ddH2O，7.5 μL 2x taq mix（产品编号：10103ES ）。
反应程序：常规PCR：55 ℃退火、延伸40 s、32轮循环。
接着将PCR产物回收并连接T载体测序，通过测序多个T0代独立阳性转化事件靶标区域的DNA序列，明确靶标区域是否发生基因编辑，最终发现3个T0转化事件靶标区域序列发生了变化，且均为纯合突变，编辑前后的序列如图7所示，对应3个msp1等位纯合突变体：ZmMSP1-Cas9-1、ZmMSP1-Cas9-2和ZmMSP1-Cas9-3。与野生型序列比对显示，ZmMSP1-Cas9-1在靶标1和靶标2处发生了插入和缺失突变，ZmMSP1-Cas9-2在靶标3和靶标4处发生了缺失突变，ZmMSP1-Cas9-3在靶标1和2处发生了缺失突变。
对3个msp1等位突变体中氨基酸序列进行比对分析发现，与未编辑的WT相比，突变后的品系ZmMSP1-Cas9-1在靶点1处有一个碱基C的插入，同时在靶点2处有一个碱基G的缺失，靶点1处1bp碱基的插入导致移码突变，+3053 bp 处出现终止密码子，翻译提前终止；ZmMSP1-Cas9-2在靶点3，即+3547—+3549bp 处有三个碱基（GCT）的缺失，同时在靶点 4 位置处，即+3684bp处存在一个A碱基的缺失，导致终止密码子于+3719bp处提前出现，翻译出的 ZmMSP1蛋白仅含有239个氨基酸；ZmMSP1-Cas9-3，是靶点1和靶点2的Cas9蛋白同时发挥功能，靶点1和靶点2中间的215 bp的碱基全部被切除，形成大片段缺失，在+345bp 处提前出现终止密码子。因此这些转化体中Zm00001d042362蛋白的功能均呈现缺失。
4、F1代植株的基因分型
由于在温室生长的玉米T0代植株，经常雌穗和雄穗发育不协调，同时当编辑的基因与雄性发育相关时也会影响育性，因此为了繁殖T0代植株，并使获得的基因编辑类型遗传下去，本发明使用玉米自交系郑58的野生型花粉为上述获得的ZmMSP1-Cas9-1、ZmMSP1- Cas9-2和ZmMSP1-Cas9-3的T0代植株授粉，进而获得F1代种子，生长的植株为F1代植株。
F1代植株包括2种分离类型，一种为Cas9-阳性植株（转基因植株），另一种为Cas9-阴性植株（非转基因植株），为了避免sgRNA和Cas9对杂交授粉引入的郑58野生型等位基因进行持续编辑，从而造成突变类型的复杂性，我们需要通过基因分型从F1代植株中挑选出不含有Cas9基因，但含有T0代突变类型的植株，这类植株自交后可以得到非转基因的F2代。F1代植株的基因分型步骤如下：
按照上述的CTAB法提取叶片DNA后，首先利用Cas9基因的特异引物Cas9-F（5’-CCCGGACAATAGCGATGT-3）和Cas9-R（5’- GAGTGGGCCGACGTAGTA-3’）进行PCR扩增。PCR反应体系同上；反应程序：常规PCR：58℃退火、延伸1分钟、32轮循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，根据结果区分出Cas9-阳性植株和Cas9-阴性植株。
进一步针对Cas9-阴性植株，采用上述的检测MT1和MT2靶标的引物ZmMSP1-T-F 和ZmMSP1-T-R，进行PCR扩增；PCR产物纯化后，连接T载体，进行测序；根据测序结果分析确定T0代突变类型的遗传情况。
实施例六、玉米ZmMSP1-Cas9雄性不育突变体的表型分析
上述实施例六鉴定的不含有Cas9基因的F1代植株自交后获得F2代种子，三种突变类型（ZmMSP1-Cas9-1、ZmMSP1-Cas9-2和ZmMSP1-Cas9-3）各取1个自交单穗进行穗行播种，在成熟期进行表型的调查。三种F2株系中，可育株与不育株的比例，均符合3:1分离，进一步表明ZmMSP1-Cas9不育突变体的不育性状由单个隐性基因控制，然后针对F2代获得的稳定非转基因ZmMSP1-Cas9不育突变体与野生型进行详细的雄穗、花药和花粉活力的观察。
在营养生长和雌穗的发育方面，ZmMSP1-Cas9-1、ZmMSP1-Cas9-2和ZmMSP1-Cas9-3不育突变体的植株与野生型相比基本无差异；在雄穗发育方面，野生型能够正常抽雄，花药能够正常开裂、散粉，自交后可正常结实， 而三个ZmMSP1-Cas9不育突变体花药形态明显弱小，花药状态呈干瘪缩水状态（图8）；进一步对野生型和突变体的花粉进行I2-KI染色，发现野生型花粉发育正常，花粉粒染色后呈黑色，但突变体无花粉粒形成（图8）。这表明ZmMSP1（Zm00001d042362）基因控制玉米的雄性发育，通过基因编辑方法创制的ZmMSP1-Cas9不育突变体为无花粉型不育系，呈现完全败育的特点。
实施例七ZmMSP1-Cas9不育体鉴定的共分离功能分子标记开发和应用
1、共分离分子标记的开发
在本发明中，针对获得的三种ZmMSP1-Cas9不育突变体的突变位点，利用Primer5.0软件进行引物设计，开发出三对共分离功能分子标记：ZmMSP1-F1/R1、ZmMSP1-F2/R2和ZmMSP1-F3/R3，结合PCR与聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或琼脂糖凝胶电泳检测的方法，根据获得的条带及大小即可分离出突变体的基因型。
共分离分子标记ZmMSP1-F1/R1包括第一引物ZmMSP1-F1和第二引物ZmMSP1-R1；该标记能够特异性检测玉米ZmMSP1-Cas9-1突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因msp1-Cas9-1，并能同时区分野生型MSP1基因和突变型msp1-Cas9-1基因；针对突变基因msp1-Cas9-1中扩增出73 bp的条带，而对野生型MSP1基因扩增出74 bp的条带。引物序列如下：
ZmMSP1-F1：5’- TCTCAACTTCAGTGGTTGTG -3’
ZmMSP1-R1：5’- GGTACTCAAGATTGTGC -3’
共分离分子标记ZmMSP1-F2/R2包括第一引物ZmMSP1-F2和第二引物ZmMSP1-R2，该标记能够特异性检测玉米ZmMSP1-Cas9-2突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因msp1-Cas9-2，并能同时区分野生型MSP1基因和突变型msp1-Cas9-2基因；针对突变基因msp1-Cas9-2中扩增出71 bp的条带，而对野生型MSP1基因扩增出74 bp的条带。引物序列如下：
ZmMSP1-F2：5’- CACTTAACGGGTCGATACCAT -3’
ZmMSP1-R2：5’- ATTATTCTGGCTAGCATCAAGGTG -3’
共分离分子标记ZmMSP1-F3/R3包括第一引物ZmMSP1-F3和第二引物ZmMSP1-R3，该标记能够特异性检测玉米ZmMSP1-Cas9-3突变体及由其转育的玉米不育材料中的突变基因msp1-Cas9-3，并能同时区分野生型MSP1基因和突变型msp1-Cas9-3基因；针对突变基因msp1-Cas9-3中扩增出344 bp的条带，而对野生型MSP1基因扩增出559 bp的条带。引物序列如下：
ZmMSP1-F3：5’- GCTTATGTTGATCCTGTGTGGTCC -3’
ZmMSP1-R3：5’- TGTGCAATAGCAGGGCTCAATT -3’
2、共分离分子标记的应用
为了验证上述标记的有效性，以实施例六中获得的F2株系为材料，进行MSP1等位基因的检测。DNA提取方法、PCR扩增体系和条件同实施例二，PCR产物进行PAGE或琼脂糖凝胶电泳分离。
理论上，ZmMSP1-F1/R1、ZmMSP1-F2/R2和ZmMSP1-F3/R3在MSP1/ MSP1纯合野生型（AA）DNA中能分别扩增出74 bp、74 bp和559 bp的条带，在msp1/ msp1纯合突变型材料（aa）DNA中分别扩增出73 bp、71 bp和344 bp的条带，而在MSP1/msp1杂合型（Aa）材料中，则能分别同时扩增出对应的两条条带。ZmMSP1-F1/R1、ZmMSP1-F2/R2和ZmMSP1-F3/R3 分子标记的验证结果如图9、图10和图11所示，结果显示设计的3个功能性分子标记对F2植株的检测结果完全符合预期，在MSP1/ MSP1纯合野生型（AA）、MSP1/ msp1杂合型（Aa）和msp1/ msp1纯合突变型材料（aa）中分别扩增出对应大小的条带，可以作为MSP1，msp1等位基因检测的理想标记。
这些分子标记有助于在开花和授粉前确定突变基因型，以便在不同遗传背景下进行杂交和回交选育雄性不育系，具有重要的应用价值。

Claims (8)

1.一种玉米雄性不育突变基因msp1，其特征在于，该突变基因的突变位点是野生型ZmMSP1基因第2个外显子的+4366和+4367位点缺失2个碱基CT；所述突变基因msp1的全长DNA和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述野生型ZmMSP1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码蛋白序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种针对玉米雄性育性基因ZmMSP1创制等位雄性不育突变体的方法，其特征在于，所述方法是基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法，对玉米基因组中的ZmMSP1基因进行定点突变，进而使其育性功能丧失，得到不同突变类型的玉米雄性不育系；
所述育性基因ZmMSP1为权利要求1所述ZmMSP1基因；
所述CRISPR/Cas9系统中包括四个sgRNA，位于ZmMSP1基因的第二外显子处，分别命名为MT1-gRNA、MT2-gRNA、MT3-gRNA、MT4-gRNA；
所述MT1-gRNA识别的靶序列为SEQ ID NO.5所示；
所述MT2-gRNA识别的靶序列为SEQ ID NO.6所示；
所述MT3-gRNA识别的靶序列为SEQ ID NO.7所示；
所述MT4-gRNA识别的靶序列为SEQ ID NO.8所示；
所述编辑的方法为向野生型ZmMSP1玉米中导入玉米基因组编辑的载体；
所述玉米基因组编辑的载体含有所述MT1-gRNA的编码基因、所述MT2-gRNA的编码基因、MT3-gRNA的编码基因、所述MT4-gRNA的编码基因、RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子、Cas9蛋白表达盒和筛选标记基因；
用于启动所述MT1-gRNA的编码基因转录的RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子为启动子OsU3；
用于启动所述MT2-gRNA的编码基因转录的RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子为启动子TaU3。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述ZmMSP1等位雄性不育突变体包括ZmMSP1-Cas9-1、ZmMSP1-Cas9-2和ZmMSP1-Cas9-3；其中，ZmMSP1-Cas9-1在第2个外显子+3050 bp处插入1个碱基C和+3267 bp处缺失1个碱基G；ZmMSP1-Cas9-2在第2个外显子+3547bp - +3549 bp处缺失3个碱基GCT和+3684 bp处缺失1个碱基A；ZmMSP1-Cas9-3在第2个外显子+3051 bp - +3265 bp处缺失215个碱基。
4.一种获得msp1雄性不育系的方法，其特征在于，通过权利要求2和3之任一所述方法获得的msp1雄性不育系与目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得msp1雄性不育的性状和基因突变。
5.通过权利要求4所述的方法获得的msp1雄性不育系在杂交育种和制种中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其中所述的杂交育种和制种是指将所述msp1雄性不育系作为母本与其他父本进行杂交。
7.如权利要求6所述的应用，包括将获得的msp1雄性不育系与其他目标材料进行杂交和回交，从而使目标材料获得msp1雄性不育的性状和基因突变。
8.根据权利要求4所述获得msp1雄性不育系的方法，其特征在于，该方法包含3组功能标记：（1）针对玉米雄性不育突变体ZmMSP1-Cas9-1的功能标记，所述功能分子标记引物ZmMSP1-F1和ZmMSP1-R1的序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；（2）针对玉米雄性不育突变体ZmMSP1-Cas9-2的功能标记，所述功能分子标记引物ZmMSP1-F2和ZmMSP1-R2的序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；（3）玉米雄性不育突变体ZmMSP1-Cas9-3的功能标记，所述功能分子标记引物ZmMSP1-F3和ZmMSP1-R3的序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。
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