CN115516097A

CN115516097A - 用于通过增强预苯酸脱水酶活性产生l-色氨酸的方法

Info

Publication number: CN115516097A
Application number: CN202180022503.7A
Authority: CN
Inventors: 徐昌一; 金贤雅; 孙晟光; 丁起龙; 郑武泳; 金泰延
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2021-03-05
Publication date: 2022-12-23
Also published as: KR102278000B1; KR20200136813A; MX2022011543A; BR112022018514A2; JP2023518743A; CA3171191A1; WO2021187781A1; US20230134555A1

Abstract

本申请涉及一种用于通过增强预苯酸脱水酶(PheA)活性来产生L‑色氨酸的方法。

Description

用于通过增强预苯酸脱水酶活性产生L-色氨酸的方法

技术领域

本公开涉及一种用于通过增强预苯酸脱水酶(PheA)活性来产生L-色氨酸的方法。

背景技术

L-色氨酸，作为必需氨基酸之一，已被广泛用作饲料添加剂、药物诸如浸剂的原材料和保健食品的材料。当前，使用微生物进行直接发酵主要用于产生L-色氨酸。

关于用于产生L-色氨酸的微生物，早期主要使用通过化学或物理突变获得的对L-色氨酸类似物表现出抗性的菌株，但是由于20世纪90年代基因重组技术的飞速发展和各种分子水平调控机制的建立，已经主要使用了通过基因工程化技术获得的重组菌株。

关于用于产生L-色氨酸的重组菌株，通常通过删除或弱化与分支酸盐相关的竞争途径上的苯丙氨酸(Phe)或酪氨酸(Tyr)的生物合成途径来尝试最大化色氨酸的发酵产率(J Ind Microbiol Biotechnol.2011年11月；38(12):1921–9；和Appl EnvironMicrobiol.1999年6月；65(6):2497–502)。

然而，需要苯丙氨酸或酪氨酸的产生L-色氨酸的菌株在生长期和生产期难以对两种氨基酸(苯丙氨酸和酪氨酸)的进料量进行不同控制，这增加了批量生产的额外成本，并且由于两种氨基酸(苯丙氨酸和酪氨酸)的低溶解度而导致难以制备主要介质和进料介质。

为了解决此类问题，本发明人在不删除或弱化苯丙氨酸或酪氨酸途径(US 2020-0063219 A1)的情况下构建了由野生型棒状杆菌属(Corynebacterium)菌株以高产率产生L-色氨酸的棒状杆菌属菌株。使用以高产率产生L-色氨酸的棒状杆菌属菌株导致在发酵浴中高浓度培养期间培养物中没有苯丙氨酸的积累，并且在培养结束时产生0.2g/L水平的酪氨酸。然而，所述菌株在培养后期产生邻氨基苯甲酸，并且因此不能最大化L-色氨酸的产生。

发明内容

技术问题

除以高产率产生L-色氨酸的棒状杆菌属菌株之外，本发明人还通过增强预苯酸脱水酶(PheA)活性优化了苯丙氨酸与酪氨酸之间的代谢通量分布。本发明人确认了，竞争途径上氨基酸产生的再平衡控制培养物中产生的苯丙氨酸或酪氨酸的最终量并且减少培养后期邻氨基苯甲酸的产生，并且最后本发明人通过确认L-色氨酸产量的显著提高而完成本公开。

技术方案

本公开的一方面是提供一种产生L-色氨酸并且具有增强的预苯酸脱水酶活性的微生物。

本公开的一方面是提供一种用于产生L-色氨酸的方法，所述方法包括在培养基中培养产生L-色氨酸并且具有增强的预苯酸脱水酶活性的微生物。

本公开的一方面是提供一种用于产生L-色氨酸的组合物，所述组合物含有产生L-色氨酸并且具有增强的预苯酸脱水酶活性的微生物。

有益效果

本公开的产生L-色氨酸并且具有增强的预苯酸脱水酶活性的微生物可以使邻氨基苯甲酸的积累最小化并且以高产率产生L-色氨酸。

附图说明

图1是pDCM2质粒的示意图。

具体实施方式

将如下具体地描述本公开。本公开中的每个描述和实施方案也可以应用于其他描述和实施方案。即，本公开中的各种要素的所有组合都落入本公开的范围内。此外，本公开的范围不受以下具体描述的限制。

如本文所用，术语“L-色氨酸”是指20种α-氨基酸中的一种，它是不在包括人类的许多生物体中生物合成的必需氨基酸。已知色氨酸主要作为生化前体起作用，并且多种物质，例如神经递质诸如血清素、神经激素诸如褪黑素、烟酸和生长素由色氨酸合成。

L-色氨酸是由分支酸盐(分支酸)合成的，并且一组编码参与这一过程的酶的基因被称为色氨酸操纵子(Trp操纵子)。已知色氨酸操纵子包括结构基因和调控区。常见的色氨酸操纵子被主动转录以产生足够量的细胞所需的色氨酸，但是当细胞中存在足够的色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合导致色氨酸操纵子失活，从而抑制转录。色氨酸操纵子可以来源于各种微生物，诸如棒状杆菌属的微生物和埃希氏菌属的微生物。色氨酸操纵子的“调控区”是指存在于构成色氨酸操纵子的结构基因的上游并且可以调控结构基因表达的位点。棒状杆菌属的微生物中构成色氨酸操纵子的结构基因可以包括trpE、trpG、trpD、trpC、trpB和trpA基因，并且埃希氏菌属的微生物中构成色氨酸操纵子的结构基因可以包括trpE、trpD、trpC、trpB和trpA基因。色氨酸操纵子的调控区可以存在于色氨酸操纵子结构基因的5′位置的trpE上游。具体地，色氨酸操纵子的调控区可以包括色氨酸调控子(trp调控子；trpR)、启动子(trp启动子)、操纵基因(trp操纵基因)、色氨酸前导肽(trp前导肽；trpL)和色氨酸衰减因子(trp衰减子)，不包括可以构成色氨酸操纵子的结构基因。更具体地，色氨酸操纵子的调控区可以包括启动子(trp启动子)、操纵基因(trp操纵基因)、色氨酸前导肽(trp前导肽；trp L)和色氨酸衰减因子(trp衰减子)。

如本文所用，术语“预苯酸脱水酶”(下文中是“PheA”)是指在由分支酸盐或预苯酸盐产生L-苯丙氨酸的途径上的酶，其中预苯酸脱水酶被称为与酪氨酸生物合成途径竞争的酶。所述蛋白质也可以被命名为双功能分支酸变位酶/预苯酸脱水酶。编码蛋白质的示例性基因可以是pheA基因，但不限于此，并且pheA基因可以通过上述色氨酸操纵子调控。在本文中，“pheA基因”可以与“编码预苯酸脱水酶的基因”和“pheA基因”可互换使用。

PheA可以具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，或者含有SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列，但不限于此。SEQ ID NO:1的序列可以从NCBI的已知数据库GenBank中确认。

具体地，PheA可以是SEQ ID NO:1的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或同一性的氨基酸序列。还明显的是，即使PheA在其一部分中具有缺失、修饰、取代或添加的氨基酸，也可以包括在本公开的范围内，只要所述氨基酸序列具有这样的同源性或同一性并表现出对应于PheA的活性即可。

如本文所用，术语“同源性和同一性”是指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关性程度，并且它可以百分比的形式表示。术语同源性和同一性经常可以可互换使用。

保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法确定，并且可以一起使用由所用程序建立的默认空位罚分。实质上，在中等或高度严格条件下，同源或相同序列通常可以与完整序列或序列全长的至少约50％、60％、70％、80％或90％杂交。在杂交中，还可以考虑包含简并密码子而不是密码子的多核苷酸。

多肽或多核苷酸序列的同源性或同一性可以使用例如文献中的算法BLAST(参见Karlin和Altschul,Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))或Pearson的FASTA(参见Methods Enzymol.,183,63,1990)来确定。基于此算法BLAST，开发了一个名为BLASTN或BLASTX的程序(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。另外，任何氨基酸或多核苷酸序列的同源性、相似性或同一性可以通过在定义的严格条件下使用南方式杂交(southernhybridization)比较序列来确定，并且待定义的适当杂交条件可以在本领域的范围内通过本领域技术人员熟知的方法确定(例如，J.Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold SpringHarbor,New York,1989；和F.M.Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology)。

如本文所用，术语“产生L-色氨酸的微生物”是指天然具有L-色氨酸产生能力的微生物或通过将L-色氨酸产生能力赋予不具有L-色氨酸产生能力的亲本菌株而获得的微生物。具体地，所述微生物可以是产生L-色氨酸并具有增强的PheA活性的微生物，但不限于此。

具体地，“产生L-色氨酸的微生物”包括所有野生型微生物或天然或人工遗传修饰的微生物。更具体地，产生L-色氨酸的微生物可以是其中由于外源基因的插入或内源基因活性的增强或失活而使特定机制被弱化或增强的微生物，其中所述微生物可以是具有基因突变或增强的L-色氨酸产生活性以用于产生靶标L-色氨酸的微生物。出于本公开的目的，产生L-色氨酸的微生物通过增强的PheA活性来增加产生所需L-色氨酸的能力，并且这种微生物可以是遗传修饰的微生物或重组微生物，但不限于此。

如本文所用，术语蛋白质的“活性增强”是指蛋白质的活性与其固有活性相比增加。“固有活性”是指转化之前的亲本菌株或转化通过自然或人为因素引起的基因突变发生时未修饰微生物原本具有的特定蛋白质的活性。此术语可以与“修饰之前的活性”可互换使用。术语与其固有活性相比“增加”蛋白质的活性意指与转化之前的亲本菌株或未修饰微生物原本具有的特定蛋白质的活性相比所述蛋白质的活性增强。

“活性增加”可以通过引入外源蛋白质或增强内源蛋白质的活性来实现，但具体地可以通过增强内源蛋白质的活性来实现。蛋白质活性的增强与否可以通过对应蛋白质的活性程度或表达水平或由对应蛋白质产生的产物量的增加来确认。

在本公开中，作为活性增强的靶标的蛋白质，即靶蛋白，可以是PheA，但不限于此。

在本公开中，由对应蛋白质产生的产物可以是L-色氨酸，但不限于此。

蛋白质活性的增强可以通过应用本领域熟知的各种方法来实现，并且所述方法不受限制，只要与转化之前的微生物的活性相比所述方法可以增强靶蛋白的活性即可。所述方法可以使用基因工程化或蛋白质工程化，但不限于此。

通过使用基因工程化来增强蛋白质的活性可以通过例如以下方式实施：

1)编码蛋白质的基因的细胞内拷贝数的增加；

2)用具有强活性的序列替换编码蛋白质的染色体上的表达调控序列的方法；

3)修饰蛋白质的起始密码子或5′-UTR区的核苷酸序列以增加蛋白质活性的方法；

4)修饰染色体上的多核苷酸序列以增强蛋白质活性的方法；

5)引入表现出蛋白质活性的外源多核苷酸或多核苷酸的密码子优化的突变多核苷酸；或

6)所述方法的组合，但不限于此。

通过使用蛋白质工程化来增强蛋白质的活性可以通过例如分析蛋白质的三级结构以选择暴露位点并修饰或化学修饰所述位点的方法来实施，但不限于此。

1)中编码蛋白质的基因的细胞内拷贝数的增加可以通过本领域已知的任何方法进行，例如通过将载体引入宿主细胞中，所述载体可操作地连接至编码对应蛋白质的基因并且可以独立于宿主复制和起作用。可替代地，这种增加可以通过将载体引入宿主细胞中来进行，所述载体可操作地连接至基因并且可以将基因整合到宿主细胞的染色体中，但不限于此。

如本文所用，术语“载体”是指含有编码靶蛋白的多核苷酸序列的DNA构建体，所述构建体呈可操作地连接至适合在宿主细胞中表达靶蛋白的表达调控序列的形式。表达调控序列可以包括能够启动转录的启动子、用于调控转录的任何操纵基因序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列以及调控转录和翻译终止的序列。转化到合适的宿主细胞后的载体可以独立于宿主基因组复制或起作用，或者可以整合到基因组本身中。

本公开中使用的载体不特别受限，只要载体可以在宿主细胞中复制即可，并且可以使用本领域中已知的任何载体。通常使用的载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A和Charon21A可以用作噬菌体载体或粘粒载体，并且基于pDZ、pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL和pET的载体可以用作质粒载体。具体地，可用于本公开的载体可以是pDCM2(图1，SEQ ID NO:3)，其被构建用于在棒状杆菌属的染色体中插入和替换基因，但不特别限于此，并且可以使用已知的表达载体。

如本文所用，术语“转化”指示将含有编码靶蛋白的多核苷酸的重组载体引入宿主细胞中，以在宿主细胞中表达由多核苷酸编码的蛋白质。转化的多核苷酸的实例可以包括可以在宿主细胞中表达的任何多肽，无论所述多肽是插入并位于宿主细胞的染色体中还是位于染色体之外。转化方法包括将核酸引入细胞中的任何方法，并且可以通过根据宿主细胞选择本领域已知的合适标准技术来实施。其实例可以是电穿孔、磷酸钙(CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)法、DEAE–葡聚糖法、阳离子脂质体法、乙酸锂–DMSO法等，但不限于此。

另外，术语“可操作地连接”是指启动和介导编码本公开的靶蛋白的多核苷酸的转录的启动子序列或表达调控序列与多核苷酸序列之间的功能性连接。可操作的连接可以使用本领域熟知的基因重组技术制备，并且位点特异性DNA切割和连接可以使用本领域的切割和连接酶等制备，但不限于此。

2)中用具有强活性的序列替换染色体上编码蛋白质的基因的表达调控序列的方法可以通过本领域已知的任何方法进行，例如通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合诱导核酸序列中的序列突变，以进一步增强表达调控序列的活性，或用具有更强活性的核酸序列进行替换。表达调控序列可以包括启动子、操纵基因序列、编码核糖体结合位点的序列、用于调控转录和翻译终止的序列等，但不特别限于此。具体地，所述方法可以通过连接强异源启动子而非原始启动子来进行，但不限于此。

强启动子的已知实例可以包括突变的lysC启动子(US 8426577)、CJ7启动子(US7662943 B2)、CJ1启动子(US 7662943 B2)、lac启动子、Trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子和tet启动子，但不限于此。具体地，可用于本公开的强启动子可以是通过修饰突变的lysC启动子(US 8426577)的部分序列制备的PlysCm1(SEQ ID NO:4)，但不特别限于此，并且可以使用已知的启动子。

3)中修饰蛋白质的起始密码子或5′-UTR区的核苷酸序列的方法可以通过本领域已知的任何方法进行，例如通过用具有比内源起始密码子更高的蛋白质表达率的另一个起始密码子替换蛋白质的内源起始密码子，但不限于此。

4)中修饰染色体上的多核苷酸序列以增强蛋白质活性的方法可以通过本领域已知的任何方法进行，例如通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合诱导核酸序列中的突变，以进一步增强多核苷酸序列的活性；或用经改进以具有更强活性的多核苷酸序列进行替换。替换具体地可以是通过同源重组将基因插入染色体中，但不限于此。

本文所用的载体还可以含有选择标记物，以用于检查染色体插入。选择标记物是选择用载体转化的细胞，即检查是否插入了待引入的基因，并且可以使用提供可选择表型的标记物，所述可选择表型诸如药物抗性、营养缺陷型、对细胞毒剂的抗性或表面蛋白质表达，但不限于此。只有表达选择标记物的细胞可以在用选择剂处理的环境下存活或显示不同的表型，并且因此可以选择经转化的细胞。

5)中引入具有蛋白质活性的外源多核苷酸可以通过将编码表现出与所述蛋白质相同/相似活性的蛋白质的外源多核苷酸或其密码子优化的突变体多核苷酸引入宿主细胞中来进行。可以使用外源多核苷酸，对其来源或序列没有限制，只要所述多核苷酸表现出与所述蛋白质相同/相似的活性即可。另外，为了优化引入到宿主细胞中的外源多核苷酸的转录和翻译，可以优化其密码子并将其引入宿主细胞中。引入可以通过由本领域技术人员适当选择的任何已知的转化方法进行，并且引入的多核苷酸在宿主细胞中表达以产生蛋白质，从而增强其活性。

最后，6)中的方法的组合可以通过应用1)至5)中的任一种或多种来进行。

蛋白质活性的这种增强可以指示对应蛋白质的活性或浓度与野生型微生物菌株或修饰之前的微生物中表达的蛋白质的活性或浓度相比增加，或由对应蛋白质产生的产物的量增加，但不限于此。如本文所用，术语“修饰之前的菌株”或“修饰之前的微生物”不排除包括可能在微生物中自然发生的突变的菌株，并且是指天然菌株本身或由于人为因素引起的基因突变导致的特征改变之前的菌株。在本公开中，特征改变可以是PheA的活性增强。“修饰之前的菌株”或“修饰之前的微生物”可以与“未突变菌株”、“未修饰菌株”、“未突变微生物”、“未修饰微生物”或“参考微生物”可互换使用。

在本公开中，参考微生物不特别受限，只要参考微生物产生L-色氨酸即可，并且与野生型微生物相比L-色氨酸产生能力增强的突变菌株也包括在内而不受限制。其实例可以包括野生型谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869菌株、CJ04-8321菌株(WO 2019-164346 A1)、或其中向以上菌株中添加一种或多种遗传修饰以增强L-色氨酸生物合成途径的菌株，但不限于此。

一种或多种遗传修饰可以是例如选自以下的任一种或多种遗传修饰：过表达L-色氨酸操纵子的活性；提高L-色氨酸前体的供应和效率；提高L-色氨酸的输出；减弱或灭活竞争途径上的基因、色氨酸操纵子的定向途径上的调控子、用于引入L-色氨酸的基因以及用于引入和降解色氨酸的基因，但不限于此。

过表达L-色氨酸操纵子的活性的遗传修饰可以是例如i)增强L-色氨酸生物合成基因操纵子的启动子，ii)根据L-色氨酸操纵子产生的改善解决TrpE蛋白的反馈抑制，和iii)增强L-色氨酸生物合成基因操纵子的启动子，并且具体地，i)可以是通过用强启动子SPL7替换L-色氨酸生物合成基因操纵子中的启动子进行的增强；ii)可以是引入trpE(P21S)DCBA或trpE(S38R)DCBA，它是具有反馈抑制trpE特征的L-色氨酸操纵子；并且iii)可以是通过用强启动子SPL7替换L-色氨酸生物合成基因操纵子中的启动子进行的增强，但不限于此。

提高L-色氨酸前体的供应和效率的遗传修饰可以是例如增强相关基因的表达以连续供应L-色氨酸前体，诸如赤藓糖-4-磷酸(E4P)，以及能量的有效利用，并且特别是引入编码转酮酶(tkt)的基因或增强其表达，但不限于此。

提高L-色氨酸的输出的遗传修饰可以是例如引入提高L-色氨酸的输出的外源膜蛋白，并且具体地是引入编码来源于草螺菌根瘤菌(Herbaspirillum rhizosphaerae)的膜蛋白的基因(登录号NZ_LFLU01000012.1)，但不限于此。

具有至少一种遗传修饰的菌株可以是例如通过将trpE(S38R)DCBA(一种含有SPL7作为强启动子并具有反馈限制性trpE特征的L-色氨酸操纵子)引入ATCC13869菌株而构建的CA04-8325(US 2020-0063219 A1)；将tkt基因插入CA04-8325菌株中的CA04-8352(WO2019-164346 A1)；或通过将编码来源于Herbaspilium risospere的膜蛋白的基因引入CJ04-8352菌株中而构建的CA04-8405菌株(US 2020-0063219 A1)，但不限于此。

出于本公开的目的，产生L-色氨酸的任何微生物可以是可能的，只要所述微生物可以通过增强PheA活性来产生L-色氨酸即可。在本文中，“产生L-色氨酸的微生物(microorganism producing L-tryptophan)”可以与“产生L-色氨酸的微生物(L-tryptophan-producing microorganism)”或“具有L-色氨酸产生能力的微生物”可互换使用。

微生物的实例可以包括属于棒状杆菌属、埃希氏菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗威登斯菌属(Providencia)和短杆菌属(Brevibacterium)的微生物，并且具体地可以是棒状杆菌属的微生物。

更具体地，棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、克氏棒状杆菌(Corynebacterium crudilactis)、荒漠棒状杆菌(Corynebacterium deserti)、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)、停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis)、奇棒状杆菌(Corynebacterium singulare)、耐盐棒状杆菌(Corynebacterium halotolerans)、纹带棒状杆菌(Corynebacteriumstriatum)、污染棒状杆菌(Corynebacterium pollutisoli)、亚胺棒状杆菌(Cxorynebacterium imitans)、睾丸棒状杆菌(Corynebacterium testudinoris)、微黄棒状杆菌(Corynebacterium flavescens)等，并且棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌。另外，可以包括但不限于属于棒状杆菌属的微生物。

根据本公开的另一方面，提供了一种用于产生L-色氨酸的方法，所述方法包括在培养基中培养产生L-色氨酸并且具有增强的预苯酸脱水酶活性的微生物。

预苯酸脱水酶、活性增强和产生L-色氨酸的微生物如上所述。

在所述方法中，微生物的培养可以通过已知的水浴培养、连续培养、分批补料培养等进行，但不特别限于此。培养条件不特别受限，但是可以使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨水)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)调节适当的pH(例如，pH 5–9，具体地pH 6–8，并且更具体地pH 7.0)，并且可以通过将氧气或含氧气体混合物引入培养物中来维持有氧条件。培养温度可以维持在20℃–45℃下，并且具体地25℃–40℃下，并且培养可以进行约10–160个小时，但不限于此。通过培养产生的氨基酸可以释放到培养基中或可以保留在细胞中。

在用于培养的培养基中，糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)、有机酸(例如，乙酸)等可以作为碳源单独或混合使用，但碳源不限于此。作为氮源，含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等可以单独或混合使用，但氮源不限于此。作为磷源，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、与其对应的含钠盐等可以单独或混合使用，但磷源不限于此。所述培养基还可以含有必需的促生长物质，诸如其他金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素。

根据本公开的方法还可以包括从所培养的培养基或微生物中回收L-色氨酸。回收培养步骤中产生的氨基酸可以是根据培养方法通过使用本领域已知的适当方法从培养物中收集靶氨基酸。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且可以通过使用本领域已知的适当方法从培养基或微生物中回收靶氨基酸。

回收步骤可以包括纯化过程，其可以使用本领域已知的适当方法进行。因此，回收的氨基酸可以呈纯化形式，或者可以是含有氨基酸的微生物发酵液(Introduction toBiotechnology and Genetic Engineering,A.J.Nair,2008)。回收靶氨基酸可以通过在培养步骤之前和之后或在回收步骤之前和之后添加本领域已知的合适方法来有效地进行。

根据本公开的另一方面，提供了一种用于产生L-色氨酸的组合物，所述组合物含有产生L-色氨酸并且具有增强的预苯酸脱水酶活性的微生物。

用于产生L-色氨酸的组合物可以含有编码PheA的pheA基因，并且可以包括但不限于可以增强PheA或pheA基因的元件。具体地，所述元件可以呈包含在载体中以表达可操作地连接至引入的宿主细胞的基因的形式，并且所述形式如上所述。具体地，通过增加基因拷贝数或用强启动子替换，可以增强作为编码预苯酸脱水酶的基因的pheA基因的表达。

根据本公开的又一方面，提供了组合物用于产生L-色氨酸的用途。

[实施本发明的模式]

在下文中，将参考示例性实施方案更详细地描述本公开。然而，给出这些示例性实施方案用于具体地说明本公开，并且本公开的范围不限于这些示例性实施方案。

实施例1：质粒的构建

设计了用于在棒状杆菌属染色体中插入和替换基因的质粒(pDCM2，图1，SEQ IDNO:3)。使用Bionix Co.,Ltd.的基因合成服务合成质粒。质粒被设计成包含一种限制性内切酶，参考与通常已知的sacB系统相关联的论文(Gene,145(1994)69–73)，所述限制性内切酶可以容易地用于克隆。由此合成的pDCM2质粒具有以下特征。

1)所述质粒具有仅在大肠杆菌中起作用的复制起点，并且因此所述质粒可以在大肠杆菌中实现其自我复制，但在棒状杆菌属中不能实现其自我复制。

2)所述质粒具有卡那霉素抗性基因作为选择标记物。

3)所述质粒具有果聚糖蔗糖基因(levansucrose gene，sacB)作为二级阳性选择标记物。

4)最终构建的菌株中没有来源于pDCM2质粒的遗传信息。

实施例2：用于增强预苯酸脱水酶的质粒的构建

为了增强预苯酸脱水酶(下文中为“pheA”)的活性，通过基于使用Bionix Co.,Ltd.的基因合成服务合成并命名为PlysCm1的已知为强启动子的突变lysC启动子(US8426577 B2)修饰部分序列来设计SEQ ID NO:4。使用PlysCm1启动子来构建用于通过另外插入pheA基因或用PlysCm1替换pheA基因的野生型启动子来增强预苯酸脱水酶活性的质粒。

实施例2-1：用于基因插入的质粒的构建

为了进一步插入具有PlysCm1启动子的pheA基因，使用野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13869染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物对和SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物对扩增用于染色体上的同源重组的上游区和下游区，从而分别获得基因片段。本文所用的引物序列在下表1中示出。

表1

进行PCR以获得片段。使用Solg^TMPfu-X DNA聚合酶作为聚合酶，并且在以下条件下进行PCR扩增：在95℃下变性4分钟，在95℃下变性30秒且进行30个循环，在60℃下退火30秒，并且在72℃下聚合50秒，然后在72℃下延伸5分钟。

使用先前合成的SEQ ID NO:4作为模板以及使用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10获得PlysCm1启动子片段。另外，使用野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13869染色体DNA作为模板以及使用SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12获得pheA基因片段(SEQ ID NO:2)。本文所用的引物序列在下表2中示出。

表2

使用Solg^TMPfu-X DNA聚合酶作为聚合酶，并且在以下条件下进行PCR扩增：在95℃下变性4分钟，在95℃下变性30秒且进行27个循环，在60℃下退火30秒，并且在72℃下聚合1分钟，然后在72℃下延伸5分钟。

通过Gibson组装法(D.G.Gibson等人.,NATURE METHODS,第6卷第5号,2009年5月,NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)克隆通过以上工艺获得的用于染色体上的同源重组的上游片段和下游片段、PlysCm1启动子片段、pheA基因片段和用于通过SmaI限制性内切酶切割的染色体转化的pDCM2载体，以获得重组质粒，然后将其命名为pDCM2-Tn::PlysCm1_pheA。

实施例2-2：用于启动子替换的质粒的构建

通过用PlysCm1替换pheA基因的野生型启动子来尝试构建具有增强的预苯酸脱水酶活性的质粒。具体地，使用野生型谷氨酸棒状杆菌(ATCC13869)染色体DNA作为模板以及使用SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物对来获得用于染色体上的同源重组的pheA基因的野生型启动子的上游区的基因片段。另外，使用先前构建的pDCM2-Tn::PlysCm1_pheA质粒作为模板以及使用SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16来获得含有PlysCm1启动子及其下游二者的基因片段。本文所用的引物序列在下表3中示出。

表3

为了获得以上片段，使用Solg^TMPfu-X DNA聚合酶作为聚合酶，并且在以下条件下进行PCR扩增：在95℃下变性4分钟，在95℃下变性30秒且进行27个循环，在60℃下退火30秒，并且在72℃下聚合50秒，然后在72℃下延伸5分钟。

通过Gibson组装法克隆通过以上工艺获得的pheA启动子的上游片段、含有PlysCm1的启动子和下游片段、以及用于通过SmaI限制性内切酶切割的染色体转化的pDCM2载体，以获得重组质粒，然后将其命名为pDCM2-Pn::PlysCm1_pheA。

实施例3：具有增强的预苯酸脱水酶活性和色氨酸产生的菌株的构建

通过电穿孔(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52:541–545)将实施例2-1中构建的pDCM2-Tn::PlysCm1_pheA转化到通过将编码来源于草螺菌根瘤菌的膜蛋白的基因(登录号NZ_LFLU01000012.1)引入CA04-8352菌株(韩国专利号10-1968317)中来构建的CA04-8405菌株(KCCM12099P，US 2020-0063219 A1)中，接着进行二级交叉，从而获得进一步插入有PlysCm1_pheA基因的菌株。使用能够扩增对应同源重组的上游区和下游区的外部位点的SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18引物对，通过PCR扩增和基因组测序确认对应基因的插入。将插入有基因的菌株命名为CM05-9157。本文所用的引物序列在下表4中示出。

表4

通过根据与上文相同的方法使用电穿孔将实施例2-2中构建的pDCM2-Pn::PlysCm1_pheA转化到CA04-8405菌株中，接着进行二级交叉，从而获得其中PlysCm1启动子替换野生型pheA启动子的菌株。使用能够扩增对应同源重组的上游区和下游区的外部位点的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20引物对，通过PCR扩增和基因组测序确认启动子的替换。将替换了启动子的菌株命名为CM05-9158。本文所用的引物序列在下表5中示出。

表5

SEQ ID NO	名称	序列(5′→3′)
			19	confirm_F2	TCTGGTGCGTGGTTGAAG
20	confirm_R2	TGGCACATTCGGTAGGG

为了研究通过以上工艺构建的CM05-9157和CM05-9158菌株的色氨酸产量，通过与下文相同的方法进行培养，并且将色氨酸的产量与作为对照的CA04-8405菌株进行比较。将每个菌株接种到含有25mL种子培养基的250mL角挡板烧瓶(corner-baffle flask)中，并且在30℃下以200rpm振荡培养20个小时。在培养之后，将1mL种子培养物接种到含有25mL针对每个菌株一式三份制备的生产培养基的250mL角挡板烧瓶中，并且在30℃下以200rpm振荡培养24个小时。在振荡培养完成之后，使用HPLC测量L-色氨酸的产量。

种子培养基(pH 7.0)

葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，尿素1.5g，KH₂PO₄ 4g，K₂HPO₄8g，MgSO₄ 7H₂O0.5g，生物素100μg，硫胺素HCl 1000μg，泛酸钙2000μg，烟酰胺2000μg(基于1L蒸馏水)。

生产培养基(pH 7.0)

葡萄糖30g、(NH₄)₂SO₄ 15g、MgSO₄ 7H₂O 1.2g、KH₂PO₄ 1g、酵母提取物5g、生物素900μg、硫胺素盐酸盐4500μg、泛酸钙4500μg、CaCO₃ 30g(基于1L蒸馏水)。

在培养基中CA04-8405菌株和具有增强的pheA表达的CM05-9157和CM05-9158菌株的L-色氨酸产生的结果在下表6中示出。

表6

作为培养具有增强的pheA表达的CM05-9157和CM05-9158菌株的结果，菌株分别产生1.93g/L和1.94g/L的L-色氨酸。这些结果指示与对照CA04-8405菌株相比，增加了约0.37g/L，并且发酵产率提高了约23％–24％。还确认了由于pheA表达增强，因此邻氨基苯甲酸盐的产生减少，从而导致色氨酸的产量增加。

根据布达佩斯条约的规定，CM05-9157菌株于2020年2月20日在国际保藏机构韩国微生物培养中心(KCCM)进行了国际保藏，并分配了登录号KCCM12670P。

如上所述，本公开所属领域的技术人员将能够理解，在不脱离技术精神或基本特征的情况下，本公开可以以其他特定形式实施。因此，以上所述的实施方案应被解释为示例性的而不是限制本公开。本公开的范围应理解为，所有源自权利要求及其等同物的定义和范围的变化或修改均落入本公开的范围内。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 用于通过增强预苯酸脱水酶活性产生L-色氨酸的方法

<130> OPA21060

<150> KR 10-2020-0032783

<151> 2020-03-17

<160> 20

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 201

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 谷氨酸棒状杆菌pheA

<400> 1

Met Ser Asp Ala Pro Ile Val Val Ala Tyr Leu Gly Pro Ala Gly Thr

1 5 10 15

Phe Thr Glu Glu Ala Leu Tyr Lys Phe Ala Asp Ala Gly Val Phe Gly

20 25 30

Asp Gly Glu Ile Glu Gln Leu Pro Ala Lys Ser Pro Gln Glu Ala Val

35 40 45

Asp Ala Val Arg His Gly Thr Ala Gln Phe Ala Val Val Ala Ile Glu

50 55 60

Asn Phe Val Asp Gly Pro Val Thr Pro Thr Phe Asp Ala Leu Asp Gln

65 70 75 80

Gly Ser Asn Val Gln Ile Ile Ala Glu Glu Glu Leu Asp Ile Ala Phe

85 90 95

Ser Ile Met Val Arg Pro Gly Thr Ser Leu Ala Asp Val Lys Thr Leu

100 105 110

Ala Thr His Pro Val Gly Tyr Gln Gln Val Lys Asn Trp Met Ala Thr

115 120 125

Thr Ile Pro Asp Ala Met Tyr Leu Ser Ala Ser Ser Asn Gly Ala Gly

130 135 140

Ala Gln Met Val Ala Glu Gly Thr Ala Asp Ala Ala Ala Ala Pro Ser

145 150 155 160

Arg Ala Ala Glu Leu Phe Gly Leu Glu Arg Leu Val Asp Asp Val Ala

165 170 175

Asp Val Arg Gly Ala Arg Thr Arg Phe Val Ala Val Gln Ala Gln Ala

180 185 190

Ala Val Ser Glu Pro Thr Gly His Asp

195 200

<210> 2

<211> 603

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 谷氨酸棒状杆菌pheA

<400> 2

atgagcgacg caccaattgt tgtggcctat ttggggcctg ccggaacctt caccgaagaa 60

gccctctaca aatttgccga cgccggcgta ttcggcgacg gtgagatcga gcagctacca 120

gccaaatcgc cacaagaagc tgtcgacgcg gtccgccacg gcaccgccca gttcgcggtg 180

gtcgccatcg aaaacttcgt cgacggcccc gtcaccccca ccttcgacgc ccttgaccag 240

ggctccaacg tgcaaatcat cgccgaagaa gaactcgata ttgccttttc catcatggtc 300

cggccaggga cttcgcttgc cgacgtcaaa accctcgcca cccacccggt tgggtaccaa 360

caagtgaaaa actggatggc aaccaccatt ccggacgcca tgtatctttc agcaagctcc 420

aacggcgccg gcgcacaaat ggttgccgaa ggaaccgccg acgcagccgc agcgccctcc 480

cgcgcagccg aactcttcgg actggaacgc cttgttgatg atgtcgccga cgtccgcggc 540

gcccgcaccc gcttcgttgc agtccaagcc caagcagccg tttccgaacc gaccggccac 600

gac 603

<210> 3

<211> 5803

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDCM2

<400> 3

gttcgcttgc tgtccataaa accgcccagt ctagctatcg ccatgtaagc ccactgcaag 60

ctacctgctt tctctttgcg cttgcgtttt cccttgtcca gatagcccag tagctgacat 120

tcatccgggg tcagcaccgt ttctgcggac tggctttcta cgtgttccgc ttcctttagc 180

agcccttgcg ccctgagtgc ttgcggcagc gtgaagctag cttttatcgc cattcgccat 240

tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc 300

tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt 360

cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag 420

tcgacctgca ggcatgcaag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 480

tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 540

ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 600

tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 660

ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 720

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 780

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 840

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 900

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 960

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 1020

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg 1080

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 1140

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 1200

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 1260

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 1320

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 1380

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 1440

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 1500

cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttgggg 1560

tgggcgaaga actccagcat gagatccccg cgctggagga tcatccagcc ctgatagaaa 1620

cagaagccac tggagcacct caaaaacacc atcatacact aaatcagtaa gttggcagca 1680

tcacccgacg cactttgcgc cgaataaata cctgtgacgg aagatcactt cgcagaataa 1740

ataaatcctg gtgtccctgt tgataccggg aagccctggg ccaacttttg gcgaaaatga 1800

gacgttgatc ggcacgtaag aggttccaac tttcaccata atgaaataag atcactaccg 1860

ggcgtatttt ttgagttatc gagattttca ggagctgata gaaacagaag ccactggagc 1920

acctcaaaaa caccatcata cactaaatca gtaagttggc agcatcaccc gacgcacttt 1980

gcgccgaata aatacctgtg acggaagatc acttcgcaga ataaataaat cctggtgtcc 2040

ctgttgatac cgggaagccc tgggccaact tttggcgaaa atgagacgtt gatcggcacg 2100

taagaggttc caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttttgagt 2160

tatcgagatt ttcaggagct ctttggcatc gtctctcgcc tgtcccctca gttcagtaat 2220

ttcctgcatt tgcctgtttc cagtcggtag atattccaca aaacagcagg gaagcagcgc 2280

ttttccgctg cataaccctg cttcggggtc attatagcga ttttttcggt atatccatcc 2340

tttttcgcac gatatacagg attttgccaa agggttcgtg tagactttcc ttggtgtatc 2400

caacggcgtc agccgggcag gataggtgaa gtaggcccac ccgcgagcgg gtgttccttc 2460

ttcactgtcc cttattcgca cctggcggtg ctcaacggga atcctgctct gcgaggctgg 2520

ccggctaccg ccggcgtaac agatgagggc aagcggatgg ctgatgaaac caagccaacc 2580

aggaagggca gcccacctat caaggtgtac tgccttccag acgaacgaag agcgattgag 2640

gaaaaggcgg cggcggccgg catgagcctg tcggcctacc tgctggccgt cggccagggc 2700

tacaaaatca cgggcgtcgt ggactatgag cacgtccgcg agggcgtccc ggaaaacgat 2760

tccgaagccc aacctttcat agaaggcggc ggtggaatcg aaatctcgtg atggcaggtt 2820

gggcgtcgct tggtcggtca tttcgaaaaa ggttaggaat acggttagcc atttgcctgc 2880

ttttatatag ttcantatgg gattcacctt tatgttgata agaaataaaa gaaaatgcca 2940

ataggatatc ggcattttct tttgcgtttt tatttgttaa ctgttaattg tccttgttca 3000

aggatgctgt ctttgacaac agatgttttc ttgcctttga tgttcagcag gaagctcggc 3060

gcaaacgttg attgtttgtc tgcgtagaat cctctgtttg tcatatagct tgtaatcacg 3120

acattgtttc ctttcgcttg aggtacagcg aagtgtgagt aagtaaaggt tacatcgtta 3180

ggcggatcaa gatccatttt taacacaagg ccagttttgt tcagcggctt gtatgggcca 3240

gttaaagaat tagaaacata accaagcatg taaatatcgt tagacgtaat gccgtcaatc 3300

gtcatttttg atccgcggga gtcagtgaac aggtaccatt tgccgttcat tttaaagacg 3360

ttcgcgcgtt caatttcatc tgttactgtg ttagatgcaa tcagcggttt catcactttt 3420

ttcagtgtgt aatcatcgtt tagctcaatc ataccgagag cgccgtttgc taactcagcc 3480

gtgcgttttt tatcgctttg cagaagtttt tgactttctt gacggaagaa tgatgtgctt 3540

ttgccatagt atgctttgtt aaataaagat tcttcgcctt ggtagccatc ttcagttcca 3600

gtgtttgctt caaatactaa gtatttgtgg cctttatctt ctacgtagtg aggatctctc 3660

agcgtatggt tgtcgcctga gctgtagttg ccttcatcga tgaactgctg tacattttga 3720

tacgtttttc cgtcaccgtc aaagattgat ttataatcct ctacaccgtt gatgttcaaa 3780

gagctgtctg atgctgatac gttaacttgt gcagttgtca gtgtttgttt gccgtaatgt 3840

ttaccggaga aatcagtgta gaataaacgg atttttccgt cagatgtaaa tgtggctgaa 3900

cctgaccatt cttgtgtttg gtcttttagg atagaatcat ttgcatcgaa tttgtcgctg 3960

tctttaaaga cgcggccagc gtttttccag ctgtcaatag aagtttcgcc gactttttga 4020

tagaacatgt aaatcgatgt gtcatccgca tttttaggat ctccggctaa tgcaaagacg 4080

atgtggtagc cgtgatagtt tgcgacagtg ccgtcagcgt tttgtaatgg ccagctgtcc 4140

caaacgtcca ggccttttgc agaagagata tttttaattg tggacgaatc aaattcagaa 4200

acttgatatt tttcattttt ttgctgttca gggatttgca gcatatcatg gcgtgtaata 4260

tgggaaatgc cgtatgtttc cttatatggc ttttggttcg tttctttcgc aaacgcttga 4320

gttgcgcctc ctgccagcag tgcggtagta aaggttaata ctgttgcttg ttttgcaaac 4380

tttttgatgt tcatcgttca tgtctccttt tttatgtact gtgttagcgg tctgcttctt 4440

ccagccctcc tgtttgaaga tggcaagtta gttacgcaca ataaaaaaag acctaaaata 4500

tgtaaggggt gacgccaaag tatacacttt gccctttaca cattttaggt cttgcctgct 4560

ttatcagtaa caaacccgcg cgatttactt ttcgacctca ttctattaga ctctcgtttg 4620

gattgcaact ggtctatttt cctcttttgt ttgatagaaa atcataaaag gatttgcaga 4680

ctacgggcct aaagaactaa aaaatctatc tgtttctttt cattctctgt attttttata 4740

gtttctgttg catgggcata aagttgcctt tttaatcaca attcagaaaa tatcataata 4800

tctcatttca ctaaataata gtgaacggca ggtatatgtg atgggttaaa aaggatcacc 4860

ccagagtccc gctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc 4920

gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc 4980

agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc 5040

acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc 5100

gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc gggcatccgc gccttgagcc tggcgaacag 5160

ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc 5220

ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt 5280

agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc 5340

aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc 5400

ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagaca gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc 5460

cacgatagcc gcgctgcctc gtcttggagt tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg 5520

acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc agagcagccg 5580

attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc cggagaacct 5640

gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc atcctgtctc ttgatcagat 5700

cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc ggcaagaaag ccatccagtt tactttgcag 5760

ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca gctggcaatt ccg 5803

<210> 4

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PlysCm1

<400> 4

gctccttagg gagccatctt ttggggtgcg gagcgcgatc cggtgtctga ccacggtgcc 60

ccatgcgatt gttaatgccg atgctagggc gaaaagcacg gcgagcagat tgctttgcac 120

ttgattcagg gtagttgact aaagagttgc tcgcgaagta gcacctgtca cttttgtctc 180

aaatattaaa tcgaatatca atatatggtc tgtttattgg aacgcgtccc agtggctgag 240

acgcatccgc taaagcccca ggaaccctgt gcagaaagaa aacactcctc tggctaggta 300

gacacagttt attgtggtag agttgagcgg gtaactgtca gcacgtagat cgaaaggtgc 360

acacat 366

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HR1 F

<400> 5

tgaattcgag ctcggtaccc agggtttagt gatgtccg 38

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HR1 R

<400> 6

atggctccct aaggagcact gtccgcggca agacagt 37

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HR2 F

<400> 7

acttgtcgac tttccaggac 20

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HR2 R

<400> 8

gtcgactcta gaggatcccc cgcaacgcat gctgaa 36

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PlysCm1 F

<400> 9

actgtcttgc cgcggacagt gctccttagg gagccat 37

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PlysCm1 R

<400> 10

cgtcgctcat atgtgtgcac ctttcga 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PheA F

<400> 11

gtgcacacat atgagcgacg caccaat 27

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PheA R

<400> 12

gtcctggaaa gtcgacaagt ctagttaagt ttccttcctt cg 42

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> UP F

<400> 13

tgaattcgag ctcggtaccc acgcacttgg gtggccac 38

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> UP R

<400> 14

atggctccct aaggagcact gtccgcggca agacagt 37

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PlysCm1 F2

<400> 15

acttgtcgac tttccaggac 20

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pheA partial R

<400> 16

gtcgactcta gaggatcccc cgcaacgcat gctgaa 36

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> confirm_F1

<400> 17

ccagcgacta agcttg 16

<210> 18

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> confirm_R1

<400> 18

aagccatcca agcagc 16

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> confirm_F2

<400> 19

tctggtgcgt ggttgaag 18

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> confirm_R2

<400> 20

tggcacattc ggtaggg 17

Claims

1.一种微生物，其产生L-色氨酸并且具有增强的预苯酸脱水酶活性。

2.如权利要求1所述的微生物，其中所述预苯酸脱水酶含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的微生物，其中所述增强的活性通过增加编码所述预苯酸脱水酶的基因的拷贝数或用强启动子替换所述基因的启动子来获得。

4.如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物是棒状杆菌属物种。

5.如权利要求4所述的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌。

6.一种用于产生L-色氨酸的方法，所述方法包括培养产生L-色氨酸并且具有增强的预苯酸脱水酶活性的微生物。

7.如权利要求6所述的微生物，其还包括从所培养的培养基或微生物中回收L-色氨酸。

8.一种用于产生L-色氨酸的组合物，所述组合物包含产生L-色氨酸并且具有增强的预苯酸脱水酶活性的微生物。