JPH0427396A - Ｌ―アスパラギン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、酵素法によるＬ−アスパラギン酸の製造法に
間するものである。

Ｌ−アスパラギン酸は重要なアミノ酸の１つとして蛋白
質中にその存在が知られ、医薬、食品添加物として用い
られている。その需要が近年急激に増加しつつある。

（従来の技術と課題） 従来、Ｌ−アスパラギン酸の工業的製造法としては、フ
マル酸とアンモニアを出発原料として、アスパルターゼ
活性を有する微生物を用いる酵素法が数多く提案されて
いる。

この場合、高いアスパルターゼ活性を有する菌体を新た
に自然界から採取することは重要なことである。しかし
ながらこの様な菌体を人手することはきわめて困難であ
るので、これに代わって例えば、本発明者等の提案（特
公昭６１−２９７１８号公報）した、ブレビバクテリウ
ム属に属する菌体にα−アミノ−ｎ−酪酸耐性を付与し
、フマル酸及びアンモニアからＬ−アスパラギン酸を合
成する能力を高める方法、またＬＣｂｉｂａｔａ　　ｅ
　ｔ、　　ａ　１．　　、　、Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、、１２，８７８（１９７４）の提案している
アスパルターゼ生産菌としてエシェリヒア・コリを用い
、該菌体の培養終了後、該菌体をフマル酸を含む水溶液
に３７℃にて数１０時間浸ン貴することにより奔勺ｌＯ
倍、アスパルターゼ活性を増加させ得ることが知られて
いる。

また、微生物の産生ずるアスパルターゼの量を培養条件
の検討により増大させることも重要てあ′るが、本発明
者らは既に、フマル酸を０．５〜２゜８％含有する培地
て好気的にブレビバクテリウム属面体を培養する方法（
特開昭６０−１２０９８３号公ｗＩ）を提案している。

本発明者らは、アスパルターゼ活性を更に増大させるべ
く鋭意検討した結果、ブレビバクテリウム属に属し、α
−アミノ−ｎ−酪酸に耐性の微生物を、培地の溶存酸素
濃度を０．　５〜０．０１ｐｐｍに維持して培養するこ
とにより、菌体内に産生されるアスパルターゼ含量が著
しく増大することを見出し、本発明を完成した。本発明
の方法で調製した微生物またはその処理物を用いれは、
フマル酸あるいはその塩及びアンモニアあるいはその塩
から効率良くＬ−アスパラギン酸を得ることができる。

本発明において用いられる微生物は、アスパルターゼを
産生ずるもので、α−アミノ−ｎ−酪酸に耐性を有する
微生物であれは特に限定されるものてはないが、例えは
、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ−１４９７）からα−アミノ−ｎ−ｔｋｔ酸
耐性株として誘導した菌株：　ブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−
１４９８）（。

特公昭６１−２９７１８号公報）が好適に用いられる。

本発明の菌体調製に使用する培地組成としては、一般に
用いられている、炭素源、窒素源を用いることができる
。

炭素源としては、例えはグルコース、エタノール、フマ
ル酸、酢酸等が用いられる。窒素源としては、アンモニ
ア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、尿素等を単独若しくは混合して用いることが出
来る。

無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他に
菌の生育及びＬ−イソロイシン生成に必要であれば、ペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、コンスティーブリカー
　カザミノ酸、各種ヒタミン等の栄養素を培地に添加し
用いる。

培養は、培養温度２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５
℃で行い、ｐＨは５〜１０好ましくは７〜８付近にて行
い、培養中のｐＨの調整には酸、アルカリを添加して行
う。培養開始時の培地中の炭素源の濃度は０．０５〜１
０重量％が用いられ、具体例としてエタノールを使用す
る場合、エタノール濃度は、好ましくは０．０５〜３重
量％、更に好ましくは０．１〜１．５重量％が適する。

培養期間は１０時間〜４日間、最適期間は１５時間〜３
日間である。

培養中は通気攪拌を調整し、培養開始後数時間のうちに
は溶存酸素濃度を０．５ｐｐｍ以下となるようにし、以
後その溶存酸素濃度を０．５〜０゜０１ｐｐｍに維持す
る。

このようにして得られた培養物から各々菌体を集めて、
水又は適当な緩衝液で洗浄し、Ｌ−アスパラギン酸生成
反応に使用する。

本発明の方法においては、これらの菌体は菌体そのまま
、あるいは超音波処理等を加えた菌体破砕物として、あ
るいは適当な担体に固定化して用いることができる。さ
らに好ましくは、該菌体もしくはその破砕物または固定
化物をあらかじめＬ−アスパラギン酸及びアンモニウム
イオンの存在下且つｐＨのアルカリ域に於て４０°Ｃ以
上６０°Ｃ以下に加熱処理した処理物を用いることもて
きる。

フマル酸あるいはその塩と、アンモニア又はその塩を用
いる場合には、これら２成分のモル比は１：　１〜５の
間にあるのか適当である。酵素反応は、０〜６０℃の温
度範囲で実施することができるが・　アスパルターゼの
安定性を考慮して２０〜５０℃で実施するのが好ましい
。

実施例及び比較例 第１表に示した培地５０　ｍ　Ｊ！を５００ｍλ容三角
フラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したも
のに、エタノール２容量％を添加後、アスパルターゼ生
産菌であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭＢＰ−１４９８）を植菌し、３
０℃にて２４時間培養を行った。この培養）夜２０ｍえ
を、２尤のジャーフアーメンター中の第２表に示す組成
の培地１児に接種し、３３℃ｐＨ７，６（２８％アンモ
ニア水て調整〉にて、通気量０．５ｖｖｍ、攪拌回転数
４００　ｒ　ｐｍにて２０時間培養を行った。

この培養中の培地の溶存酸素レベルはＤ○電極ロオリエ
ンタル電気■製Ｓ−１型、２ｍ１ｌ膜使用］にて測定し
たが、培養開始後４時間で０．５ｐｐｍ以下となり、そ
のまま０．５〜０．０ｉｐｐｍに維持された。尚、比較
例としては、通気量をＩＶ　Ｖ　ｆｌ’ｌ、　　攪拌回
転数８０Ｏｒｐｍにて、培地の溶存酸素レベルを０．６
ｐｐｍ〜７ｐｐｍに維持した以外は実施例と同様に培養
したくこれら実施例と比較例の培養中の培地の溶存酸素
濃度の経過を第１図に示した）。

培養終了後、これらの培養液を遠心分離（４０００ｒｐ
ｍ、１５分間）したのち集菌体を蒸留水に懸濁し、○、
Ｄ、（光学密度、波長６１０ｎｍでの吸光度）値５０の
菌体懸濁液を調整し、該菌体懸濁液を供試液とした。

アパラギン酸の生成は、第３表に示した反応液０５０　
ｍ　ｆｌにて４５℃５時間反応を行い該反応終了液を遠
心分離（４０００ｒｐｍ、１５分間）し、その上清液中
のアスパラギン酸生成量をロイコノストックメセンテロ
イデス　、へＴＣＣ８０４２による微生物定量法により
生成アスパラキン酸量を求めた。結果を第４表に示した
。

第１表 尿素 （ＮＨ４）２ＳＯ４ Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏａ Ｋ２ＨＰＯ４ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ・７Ｈ２０ 酵母エキス カザミノ酸 ビオチン 塩酸チアミン ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０ Ｍ　ｎ　Ｓ　Ｏａ　・４　６　Ｈ２０ 蒸留水 ｇ ４ｇ ０．５８ ０．５ｇ ０．５ｇ ｇ 　ｇ ２００ノＩｇ １００μ　ｇ ０ｍ　ｇ ０ｆｎｇ １０００ｍ　　夫 第２表 （ＮＨ４）２Ｓ○４ Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４ Ｋ　　２　　ＨＰ　　○　４ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ・７Ｈ２０ 酵母エキス カザミノ酸 ビオチン 塩酸チアミン ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０ Ｍ　ｎ　Ｓ○ａ・ｌＪ−６Ｈ２０ 蒸留水 ３ｇ ０．５ｇ ０．５ｇ ０．５ｇ ｇ ｇ ２００μ　ｇ １００μ　ｇ ０ｍｇ ０ｍｇ １０００ｍ　　見 第３表 フマル酸 Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２０ ポリオキシエチレン（２０） モノラウレート アンモニア（２８％濃度） 供試液 全量　　　　　　　５０ｍ１ ｇ ０．１ｇ ソルビタン ０．０５ｍ　１ ４ｍ２ ０ｍ　ｌ （ｐ　Ｈ９，４） 第４表 ※１比較例のブロス（ｂｒｏｔｈ）１１２当たりの湿菌
体量を１００とした相対値 第４表に示したように、本発明の方法によれば、菌体収
量を大きく低下させる事なく、アスパルターセ高含量の
菌体を得る事かでき、本菌体を用いる事により、フマル
酸あるいはその塩と、アンモニアあるいはその塩から効
率良くＬ−アスパラギン酸を生成できた。

４、

【図面の簡単な説明】

第 図は前述の実施例及び比較例における、上音 養中の培地の溶存酸素濃度及び菌体の相対生育度の経過
を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ブレビバクテリウム属に属し、α−アミノ−ｎ−
   酪酸に耐性を有する微生物、またはその処理物を用いて
   、フマル酸あるいはその塩とアンモニアあるいはその塩
   からＬ−アスパラギン酸を製造させるに際し、該微生物
   を培地の溶存酸素濃度を０．５ｐｐｍ〜０．０１ｐｐｍ
   に維持して培養することを特徴とするＬ−アスパラギン
   酸の製造法。