JPH0570429B2

JPH0570429B2 -

Info

Publication number: JPH0570429B2
Application number: JP27391386A
Authority: JP
Inventors: Shoichiro Myahara; Toshiaki Kamiguchi; Tooru Myahara; Masatsugu Hashimukai; Kazunari Nitsuta
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1986-01-27
Filing date: 1986-11-19
Publication date: 1993-10-05
Also published as: JPS62253390A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、酵素法にてＬ−シスチンを得る方法
に関する。

シスチンは還元をすることにより容易にシステ
インへ変換が可能であり、Ｌ−シスチン、Ｌ−シ
ステインは医薬あるいは医薬原料、食品添加物、
化粧品添加物などとして利用されており、特に近
年はコールドパーマ液の原料などとしても需要が
伸びているＳ元素素含有のアミノ酸である。

〔従来の技術及び発明が解決しようとしている問
題点〕まず、Ｌ−シスチンの前駆体であるＬ−システ
インの製法について考えると、従来、(1)天然物か
ら抽出する方法、(2)有機合成法、(3)発酵法、(4)酵
素法などが知られているが、天然物から抽出する
方法については、原料の供給が不安定であり、且
つ不要な他のアミノ酸が混入する。また有機合成
法においてはＤ，Ｌ一体の分割を要する。更に発
酵法は蓄積量が低いなどの欠点があり、工業的に
有利な製法とは言い難い。

酵素を用いてＬ−システインを合成する酵素方
法としては、(1)システイン・シンターゼや、シス
テイン・デスルフヒドラーゼを用いてＬ−セリン
と硫化水素から合成する方法、(2)システイン・デ
スルフヒドラーゼを用いてβ−置換アラニンと金
属硫化物などから合成する方法、(3)２−アミノ−
チアゾリン−４−カルボン酸（ATC）から、Ｌ
−ATC−ヒドラーゼ、ATC−ラセマーゼ、Ｓ−
カルバミル−Ｌ−システイン・ヒドラーゼを用い
て合成する方法などが知られている。また本出願
人は、先にＬ−セリンと金属水硫化物などのスル
フイドリル基を有する化合物とをトリプトフア
ン・シンターゼの存在下反応させて得る方法を出
願した（特願昭60−84545号）。

尚、これらの酵素反応においては、用いるスル
フイドリル基化合物としては、硫化水素（H₂S）
を直接使用した方が反応性がやや高く、また価格
も安いにもかかわらずH₂Sガスは水に対する溶解
度がほとんどないため、通常はH₂S源としては水
硫化ソーダなどの水可溶性塩が使用されていた。

これらの酵素法を問わず、発酵法、合成法のい
ずれにおいてもシステイン含有反応液からのシス
テインの分離においては、反応液の組成が複雑で
あることと、システインの水に対応する溶解度が
非常に大きいためシステイン含有反応液より直接
システインとして単離・精製することは極めて難
しく、通常システインを一旦強制的に酸化してシ
ステインとして精製・単離を行ない、必要により
電解還元などにより精システインとして回収する
方法が知られている。

次に、システインからシスチンを合成する方法
については、例えば特公昭57−7634公報ではシス
テイン発酵水溶液中のシステインをPH５〜10の範
囲に維持して、空気酸化やH₂O₂などの過酸化物
を用いた酸化方法が記載されている。

しかしながら該方法は、例えばＬ−セリンより
シスチンを得る場合は、一旦酵素反応を終了して
システインを製造した後でないと適用できず、ま
たH₂O₂や空気による酸化方法は、システイン酸
化反応条件制御に難があり、酸化反応条件を厳し
く制御しなければかなりの割合でシスチン以外の
分解物が生じるなど問題点があつた。

〔問題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記のような問題点を踏まえ
て、Ｌ−セリンから安価に高収率でＬ−シスチン
を合成する方法を鋭意検討した結果、本発明方法
に達したものである。

即ち本発明は、ジメチルスルホキシド及び酵素
の存在下で、Ｌ−セリンと、硫化水素、アルカリ
金属硫化物、またはアルカリ金属水硫化物とを反
応させてＬ−シスチンを得るに際し、該酵素とし
て、システイン・シンターゼ、システイン・デス
ルフヒドラーゼ、トリプトフアン・シンターゼの
うちのいずれかを用いることを特徴とする、Ｌ−
セリンからのＬ−シスチンの製造方法である。

このように本発明では、Ｌ−セリンの酵素反応
で生成するＬ−システインを酸化して、Ｌ−シス
チンを得るわけであるが、酸化剤として使用する
ジメチルスルホキシド（以下DMSOと略す）を、
酵素反応の段階で使用することにより、反応工程
において生成システインを完全にシスチンに変換
でき、またたとえシステイン反応に硫化水素ガス
を用いた場合でも、DMSOが反応系中で硫化水
素の溶解補助剤としての作用をするので、酵素反
応水性媒体中で充分な濃度を維持して実施でき
る。

また系中に添加したDMSOは全く酵素反応を
阻害することなく、酵素反応により生成してくる
Ｌ−システインを逐次安定なＬ−シスチンに酸化
して酵素反応系から析出させるため、Ｌ−システ
イン製造時の酵素反応速度を著しく速めることが
できることもわかつた。したがつて本発明によ
り、生成したＬ−システインの副生物への分解を
も防ぐことが可能となり、Ｌ−セリンから高収率
でＬ−シスチンを得ることができる。

本発明においては、酵素として、システイン・
シンターゼ、システイン・デスルフヒドラーゼ、
トリプトフアン・シンターゼのうちのいずれかを
用いて反応を行う。

特に本発明においては、トリプトフアン・シン
ターゼを用いて実施するのが効果も大きく好まし
い方法であり、トリプトフアン・シンターゼの酵
素生産菌としては前記特願昭60−84545号公報に
開示されているようにエシエリヒア・コリMT−
10232（FERM BP−19）、エエシエリヒア・コリ
MT−10242（FERM BP−20）などの微生物や、
ノイロスポラ・クラツサ（ATCC14692）などの
微生物が使用できるが、特にエシエリヒア・コリ
から得られたトリプトフアン・シンターゼを用い
るのが有利である。

酵素は必ずしも抽出された純粋なものを使う必
要はなく、上記生産菌株の培養物、培養物から遠
心分離などの方法によつて採取した生菌体、ある
いはその凍結菌体、凍結乾燥菌体、あるいは超音
波処理などによつて得られる菌体処理物などが利
用される。

本発明方法ににおいては、Ｌ−セリンの基質濃
度は特に制限はないが、通常液中濃度１〜25重量
％の範囲で使用するのがよい。また反応液中にお
ける酵素の使用量は、酵素の使用形態により異な
り特に制限はなく、基質濃度、酵素活性などの諸
条件により変更される。またトリプトフアン・シ
ンターゼ使用の場合は、基質の他に補酵素である
ピリドキサールリン酸を微量、例えば液中濃度と
して0.1〜50ppmの範囲で添加することが望まし
い。

本発明においては、酵素反応時に供給するスル
フイドリル基化合物としては、NaHS、KHSな
どのアルカリ金属水硫化物、Na₂S、K₂Sなどの
アルカリ金属硫化物であり、また直接硫化水素ガ
スを反応系中に導入してもよい。硫化水素の場合
は、その使用量はＬ−セリンに対して１倍モル以
上がよい。

また本発明の特徴であるDMSOの使用量は、
Ｌ−セリンに対して0.2〜５倍モル程度であり、
さらに好ましくは0.5〜2.0倍モルが反応系中に添
加される。使用量が0.2倍モル以下であると生成
Ｌ−システインを全量Ｌ−シスチンに変換するこ
とが難しく、また硫化水素を使用した場合は、そ
の溶解度も低下する。また５倍モル以上であると
酵素反応を阻害する傾向にある。

反応温度は通常20〜60℃の範囲であり、反応PH
は５〜10である。また反応時間は、通常２〜50時
間であり、硫化水素の場合は２〜10時間がよい。

反応液は、時間が経過するに従つて白色を呈
し、これは反応液中にＬ−シスチン結晶が遂次析
出してきていることを示す。

反応終了時の反応液中には、未反応Ｌ−セリン
及びＬ−シスチンが析出したロ状態で存在する
が、本反応液よりシスチンを単離するには、例え
ば反応液を塩酸酸性にして一旦Ｌ−シスチンを溶
解した後、活性炭を加え加熱処理、熱ろ過に付す
ることにより酵素菌体を除去して、反応液のPHを
再び５付近まで戻すことにより、Ｌ−シスチンを
晶析させ通常の固液分離により純度の高いＬ−シ
スチンが取得可能となる。また、このようにして
得られたＬ−シスチンを電解還元すれば、Ｌ−シ
ステインを得ることが出来る。

〔実施例〕

以下実施例によつて本発明を詳細に説明する
が、実施例中のシスチンの分析方法はは公知のガ
イトンデ（Gaitonde）の方法によりシステイン
換算で算出した。

すなわち1000〜2000倍に希釈した被検液に
5μMの１，４−ジチオトレイトール（還元剤）
約同量加えてさらに2NのNaOHによりPH8.0〜8.5
とし、室温にて１時間放置して含有するシスチン
をすべてシステインに還元し、酸性ニンヒドリン
試薬を用いて発色させ、吸光度計にて560nmの吸
光度を測定する。一方、既知の濃度の標準サンプ
ルを作成し、560nmの吸光度の検量線を作成して
おき、本検量線をもとに被検液中のシステイン濃
度を算出した。

実施例１攪拌機及び吹き込み管、排気管つきの200ml容
セパラブルフラスコにＬ−セリン10ｇ、
DMSO5.6ｇ、ピリドキサールリン酸25mgを加え、
イオン交換水にて全容を100ｇとする。10％
NaOH液にて反応液のPHを8.5として反応液を35
℃に一定に保ちトリプトフアン・シンターゼ含有
菌体（エシエリヒア・コリ MT−10242 FERM
BP−20）を乾燥菌体換算で2.0ｇ装入する。

硫化水素ガスをボンベより約14ml／分の速度で
吹き込み始め、約４時間で吹き込みを終了する。
（硫化水素の使用量は、対Ｌ−セリン約1.5倍モル
である。）その間、吹き込みを開始したら反応系
内は徐々に白色となりＬ−シスチンが析出した。

反応終了後の反応液をなるべく均一にサンプリ
ングし、2N塩酸に溶解後遠心分離により除菌し
てＬ−シスチンをＬ−システイン換算で分析する
と、9.3％、すなわちＬ−セリンのＬ−シスチン
への転換率は約81％であつた。

次に反応液に35％塩酸約25mlを加えて、反応液
のPHを0.5とし、活性炭1.0ｇを装入して、95℃で
約１時間加熱処理を付した。加熱処理後、直ちに
熱ろ過を行ない除菌をした。

除菌後の黄透色の液を40％NaOH約５mlを加
えてPH５とし、冷却によりＬ−シスチンの結晶を
析出させた。

析出したＬ−シスチンの結晶をヌツチエでろ過
し、イオン交換水20mlで洗浄後、乾燥して白色の
Ｌ−シスチン結晶8.2ｇを得た。

（仕込みＬ−セリンに対して72モルの収率）本結晶の旋光度〔α〕²⁰ _D＝−218.7゜、純度99.1
％、アツシユ分0.2％と良好であつた。

実施例２攪拌機つきの200ml容セパラブルフラスコにＬ
−セリン10ｇ、DMSO5.6ｇ、ピリドキサールリ
ン酸25mg、水硫化ソーダ9.5ｇ（試薬70％純分）
を加え、イオン交換水にて全容を200ｇとする。
10％NaOHにて反応液のPHを8.0として、反応液
を35℃に一定に保ち、実施例１に用いたトリプト
フアン・シンターゼ含示有菌体を乾燥菌体換算で
2.0ｇ装入し、反応中のPHを４モル／リン酸に
より8.0に維持する。

反応は、PH8.0／35℃にて約16時間行なつたが、
反応開始後２時間目付近より反応系内にシスチン
が析出して白濁し始めた。

反応終了後の反応液をなるべく均一にサンプリ
ングし、2N塩酸に溶解後遠心分離により除菌し
てＬ−シスチンをＬ−システイン換算で分析する
と、9.1％すなわちＬ−セリンのＬ−シスチンへ
の転換率は約79％であつた。

以下実施例１と同様にして処理をして、Ｌ−シ
スチンの結晶7.6ｇを得た。（仕込みのＬ−セリン
に対して66.7モルの収率）本結晶の旋光度〔α〕²⁰ _D＝−220゜、純度99.3％、
アツシユ分0.1と良好であつた。

実施例３攪拌機つきの200ml容セパラブルフラスコにＬ
−セリン10ｇ、DMSO5.6ｇ、ピリドキサールリ
ン酸25mg、硫化ソーゾ9.3ｇ（試薬純度96％以上）
を加え、イオン交換水にて全容を200ｇとする。
10％HClにて反応液のPHを8.0として反応液を35
℃に一定に保ち、実施例１に用いたトリプトフア
ンシンターゼ含有菌体を乾燥菌体換算で2.0ｇ装
入し、反応中のPHを10％HClにより8.0に維持す
る。

反応はHz8.0／35℃にて約16時間行なつたが、
反応開始後２時間目付近より反応系内にシスチン
が析出して白濁し始めた。

反応終了後の反応液をなるべく均一にサンプリ
ングし、2N塩酸に溶解後遠心分離により除菌し
てＬ−シスチンをＬ−システイン換算で分析する
と8.7％すなわちＬ−セリンのＬ−シスチンへの
転換率は約74％であつた。

以下、実施例１と同様にして処理をして、Ｌ−
シスチンの結晶7.4ｇを得た。（仕込みのＬ−セリ
ンに対して64.9モル％の収率）本結晶の旋光度〔α〕²⁰ _D＝−221゜、純度98.9％、
アツシユ分0.3％と良好であつた。

実施例４攪拌機つきの200ml容セパラブルフラスコにＬ
−セリン10ｇ、DMSO5.6ｇ、及びイオン交換水
にて全容を50ｇとする。

システイン・デスルフヒドラーゼ含有酵素液
（バチルス・ズブチリス ATCC6051を培養後集
菌し、バツフアー中で超音波により菌体破砕した
もの）を加え、NaOH液にてPH8.5とし、反応液
全容を100ｇとする。

硫化水素ガスをボンベより約14ml／分の速度で
吹き込み始め、約４時間で吹き込みを終了した。
（硫化水素の使用量は、対Ｌ−セリン約1.5倍モ
ル）その間、吹き込みを開始したら反応系内は
徐々に白色となりＬ−シスチンが析出した。反応
終了後の反応液をなるべく均一にサンプリング
し、2N塩酸に溶解後遠心分離により除菌してＬ
−シスチンをＬ−システイン換算で分析すると、
5.8％、すなわちＬ−セリンのＬ−シスチンへの
転換率は約53％であつた。また反応系内のシステ
インのみの濃度を測定すると0.1％以下であつた。

Claims

【特許請求の範囲】１ジメチルスルホキシド及び酵素の存在下で、
Ｌ−セリンと、硫化水素、アルカリ金属硫化物、
またはアルカリ金属水硫化物とを反応させてＬ−
シスチンを得るに際し、該酵素として、システイ
ン・シンターゼ、システイン・デスルフヒドラー
ゼ、トリプトフアン・シンターゼのうちのいずれ
かを用いることを特徴とする、Ｌ−セリンからの
Ｌ−シスチンの製造方法。２酵素として、トリプトフアン・シンターゼを
用いる特許請求の範囲第１項記載の方法。