KR20190097218A - 효소에 의한 시스틴의 환원 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시스틴을, (i) 활성 글루타티온 환원 효소(EC1.8.1.7); (ii) 보조인자; 및 (iii) 글루타티온을 포함하는 환원 용액에 접촉시키는 단계; 및 시스테인 포함 조성물을 회수하는 단계를 포함하는 시스틴을 시스테인으로 효소에 의해 환원시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 환원 용액은 시스틴에 접촉하는 동안 6 이상의 pH를 갖는다.
Description
본 발명은 시스틴을 시스테인으로 효소에 의해 환원시키는 방법에 관한 것이다. 또 다른 양상에 따라, 본 발명은 시스테인 포함 조성물, 및 천연 식품 향미로서 이의 용도에 관한 것이다. 또 다른 양상에 따라, 본 발명은 환원 용액 및 이의 용도에 관한 것이다.
시스테인(주로 L-거울상 이성질체)은 식품, 제약 및 개인 관리 산업에서 전구체이다. 보다 큰 식품 적용례 중 하나는 향미의 생산이다. 예를 들어, 메일라드(Maillard) 반응에 의한 시스테인과 당의 반응은 고기 향미를 산출한다. 또한, 시스테인은 베이킹용 가공 보조제로서 사용되고 천연 과일 주스 제품에 산화 방지제로서 첨가된다. 식품 첨가제로서 사용될 때, 시스테인은 E 번호 E920을 갖는다. 약제로서 이는 간 기능 및 색소 침착을 개선하도록 적용된다. 임상 영양학에서, 시스테인은 아미노산 주입제에 산화 방지제로서 첨가된다. 개인 관리 분야에서, 시스테인은 파마 적용례를 위해(주로 아시아에서) 사용되고, 여기서 시스테인은 머리카락의 케라틴의 다이설파이드 결합을 분해하는 데 사용된다.
시스테인 및 L-시스테인은 동일한 분자를 지칭하고, 두 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 유사하게, 시스틴 및 L-시스틴은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 시스테인(Cys 또는 C로 축약됨)은 준필수 아미노산이고, 이는 시스테인이 인간에 의해 메티오닌으로부터 합성될 수 있으나, 일부 경우에, 유아, 노인 및 환자의 경우 음식, 예컨대 브로콜리, 마늘, 양파 및 고기로부터 섭취될 필요가 있음을 의미한다. 시스테인 티올 기는 구조적 안정화에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 분자의 반응성 부분으로서 보다 중요한 역할을 한다. 티올 측쇄는 흔히 효소에 의한 반응에 참여하고 프로테아제 및 아실전이 효소에서와 같이 친핵체로서 작용한다. 티올은 산화되어 다이설파이드 가교를 제공하기 쉽고, 이는 많은 단백직에서 중요한 구조적 역할을 제공한다. 다른 가능한 번역-후 변형은 설펜화(SOH), 설핀화(SO2H), 니트로실화(SNO), 글루타티온일화이고, 이는 세포 산화환원 상태에 빠른 반응을 보이는 조절 스위치로서 작용한다.
시스테인은 통상적으로 동물 털로부터 화학적 가수분해를 통해 수득되었다. 그러나, 심각한 문제, 예컨대 안전성으로 의한 동물 털 사용의 방지, 낮은 생산성 및 환경 오염에 관한 우려가 존재한다. 따라서, 시스테인을 생산하는 환경친화적인 방법에 대한 강한 요구가 있었다. 보다 최근에, 시스테인의 생산 방법은 재조합 미생물을 사용하는 발효를 포함한다. 하나의 공지된 방법은 에스케리키아 콜라이(Eschericia coli)를 사용하여 1 l 당 20 g 초과의 시스테인을 생산하는 것이다. 그러나, 문제는 용액에서 시스테인의 산화가 용이하게 다이설파이드 시스틴을 야기하고, 이는 환원될 필요가 있다는 것이다.
시스테인을 제조하는 종래의 방법은 시스틴의 전기화학적 환원을 사용하는 전기화학적 방법이다. 전기분해를 사용하는 것의 단점은, 제공되는 시스테인이 향료에 대한 유럽 규정(European regulation on Flavourings)에서 의도되는 천연물로 분류될 수 없다는 것인데, 이는 전기분해가 시스테인의 화학적 성질을 의도적으로 변형하는 물리적 방법이기 때문이다.
WO 2011/039156은 효모를 사용하는 시스테인 제조 방법을 개시한다. 실시예는 시스틴의 비-효소적 환원을 보여주는데, 이는 실시예 4 및 5에서 나타난 바와 같이 51℃에서 및 5.9의 pH에서 효모의 글루타티온 환원 효소가 불활성이기 때문이다. 또한, 크림 효모의 사용에 의해, 반응에 첨가된 글루타티온의 양은 시스틴에서 시스테인으로의 환원을 추진시키기에 충분하다. WO 2011/039156에 개시된 방법의 단점은, 공정이 긴 시간을 요구하고, 시스테인 수율이 낮다는 것이다.
상기를 고려해볼 때, 수득된 시스테인이 천연물로서 분류될 수 있는, 시스틴을 시스테인으로 환원시키는 방법이 당분야에 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은 환원이 개선된 조건에서 수행되는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 감소된 양의 에너지를 필요로 하는 환원을 포함하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가적 목적은 출발 물질, 예컨대 효소 및/또는 매개자(mediator)의 용량이 감소될 수 있고 동시에 감소된 시스테인 생산량이 동일한 수준에서 유지되거나 심지어 증가되는, 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가적 목적은 시스틴에서 시스테인으로의 환원이 완료되는 환원을 수반하는 방법을 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 형성된 시스테인이 천연 향미 성분으로서 자격이 있는, 시스틴 환원 방법을 제공하는 것이다.
특히 상기 목적은 본 발명에 의해 해결된다. 구체적으로, 특히 상기 목적은 하기를 포함하는 시스틴을 시스테인으로 효소에 의해 환원시키는 방법을 제공함으로써 해결된다:
시스틴을 (i) 활성 글루타티온 환원 효소(EC1.8.1.7); (ii) 보조인자; 및 (iii) 글루타티온을 포함하는 환원 용액에 접촉시키는 단계; 및
시스테인 포함 조성물을 회수하는 단계(이때, 상기 환원 용액은 상기 시스틴에 접촉하는 동안 6 이상의 pH를 가짐).
놀랍게도, 본 발명자는 시스틴을 시스테인으로 완전히 환원시키는 것이 본 발명의 방법을 사용함으로써 달성될 수 있음을 밝혀냈다. 시스틴의 비-효소적 환원이 일반적으로 산화된 시스틴과 환원된 시스테인 사이의 평형, 또는 완전한 환원(환원제가 과량으로 첨가되는 경우)을 야기하는 경우, 본 효소에 의한 환원은 과량의 매개자 및/또는 보조인자 첨가 없이 반응을 100% 시스테인으로 향하게 할 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은, 시스틴의 100%가 환원되는, 시스틴을 시스테인으로 효소에 의해 환원시키는 방법이다. 유리하게, 본 발명의 방법으로 회수되는 시스테인은 천연물로서 자격이 있는데, 이는 미생물, 예컨대 박테리아 및 효모 또는 단리된 효소를 사용하는 효소적 방법이 천연 향미 성분의 제조를 위해 승인되기 때문이다.
효소에 의한 환원은, 본원에 사용된 바와 같이, 시스틴을 활성 글루타티온 환원 효소(EC1.8.1.7)의 존재 하에 글루타티온에 접촉시킴으로써 시스틴을 시스테인으로 환원시킴을 의미하되, 여기서 활성 글루타티온 환원 효소(EC1.8.1.7)는 글루타티온의 산화 후에 글루타티온을 환원시킨다.
활성 글루타티온 환원 효소(EC1.8.1.7)는, 본원에 사용된 바와 같이, 상기 효소가 글루타티온을 환원시키는 이의 기능에 있어서 활성임을 의미한다. 바람직하게는, 글루타티온 환원 효소는 시스틴을 환원 용액에 접촉시키는 단계 동안 활성을 유지한다. 보다 바람직하게는, 글루타티온 환원 효소는 시스틴을 환원 용액에 접촉시키는 전체 단계 동안 활성을 유지한다.
보조인자는, 본원에 사용된 바와 같이, 티올 환원 효소를 보조하는 헬퍼 분자를 의미한다. 바람직하게는, 보조인자는 조효소이다. 보조인자의 적합한 예는 환원된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NADH로 축약됨) 또는 환원된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드포스페이트(NADPH로 축약됨) 또는 플라빈 아데닌 다이뉴클레오티드(FADH2로 축약됨)이다.
시스테인을 회수함은, 본원에 사용된 바와 같이, 시스테인을 환원 용액으로부터 회수함을 의미한다. 시스테인은 당분야에 공지된 기술에 의해 환원 용액으로부터 회수될 수 있다. 시스테인의 회수에 사용될 수 있는 기술의 적합한 예는 막의 사용, 결정화, 크로마토그래피 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 시스테인 포함 조성물을 회수하는 본 단계는 시스틴을 환원 용액에 접촉시키는 단계 후에 15시간 이내에 수행될 수 있다. 보다 바람직하게는, 시스테인 포함 조성물을 회수하는 본 단계는 시스틴을 환원 용액에 접촉시키는 단계 후에 12시간 이내, 보다 바람직하게는 9시간 이내, 가장 바람직하게는 6시간 이내 또는 심지어 3시간 이내에 수행된다. 보다 바람직하게는, 시스테인 포함 조성물을 회수하는 본 단계는 시스틴을 환원 용액에 접촉시키는 단계 후에 0.5시간 후에 수행된다.
본 시스틴은 시스틴 제조 분야에 공지된 방법에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 본 시스틴은 발효 및 생체촉매반응에 의해 제공될 수 있다. 발효는 재조합 미생물을 사용하여 수행될 수 있다. 생체촉매반응은 재조합 미생물의 효소를 사용함으로써 수행될 수 있다. 또한, 본 시스틴은 시스틴 및 시스테인의 혼합물로서 순수하거나 희석된 형태로 제공될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 글루타티온은 조성물의 건조 중량을 기준으로 1%(중량) 초과, 바람직하게는 2%(중량) 초과, 예컨대 바람직하게는 5%, 10%, 20% 또는 심지어 50% 초과의 글루타티온을 포함하는 조성으로 환원 용액에 첨가된다. 보다 바람직하게는, 본 글루타티온은 정제된 형태 또는 단리된 형태이다, 즉, 90%(중량) 초과의 글루타티온 또는 95%(중량) 초과의 글루타티온을 포함하는 조성을 갖는다. 정제된 형태의 글루타티온을 사용하는 것이 유리한데, 이것이 시스테인을 회수하는 다운스트림 공정을 단순하게 만들기 때문이다. 정제된 형태, 또는 대안적으로 단리된 형태의 매개자는 글루타티온이 존재하고/하거나 본 환원 용액에 개별적 제제로서, 예를 들어 화합물로서 미생물 또는 무세포 추출물에 존재하지 않고 첨가되는 것을 의미한다.
본 글루타티온은 산화된 형태(GSSG로 축약됨) 또는 환원된 형태(GSH로 축약됨)일 수 있다. 글루타티온은 글루타티온 환원 효소에 대한 적합한 매개자이다. 본 발명자는 글루타티온을 글루타티온 환원 효소를 포함하는 환원 용액에 개별적으로 첨가하는 것이 시스틴의 시스테인으로의 환원을 증가시키거나 심지어 완전한 환원을 야기함을 밝혀냈다. 또한, 본 발명자는 효소에 의한 GSSG의 환원이 GSH를 제공하는 효율적인 방법이고 시스틴의 완전한 환원에 기여하는 것을 밝혀냈다. 또한, 효소에 의한 GSSG의 환원은, GSH가 비싸기 때문에, 생산 비용을 감소시킴으로써 개선된 방법을 제공한다.
환원 용액에서 글루타티온:시스틴의 몰비는 바람직하게는 1 미만이다. 바람직하게는, 글루타티온:시스틴의 몰비는 0.7 미만, 0.6 미만, 0.5 미만, 0.4 미만, 0.3 미만, 0.2 미만, 0.1 미만, 0.05 미만 또는 0.01 미만이다. 보다 바람직하게는, 글루타티온:시스틴의 몰비는 0.01 내지 0.7, 예컨대 0.02 내지 0.6이다. 바람직하게는, 본 글루타티온:시스틴의 몰비는 환원 용액에 존재하는 글루타티온:시스틴의 몰비이다. 글루타티온:시스틴의 비는 환원 용액에 존재하는 글루타티온의 몰량을 환원 용액에 존재하는 시스틴의 몰량으로 나눔으로써 계산될 수 있다. 본 발명자는 글루타티온을 환원 용액에 첨가하는 것이 시스틴의 시스테인으로의 환원을 증가시킴을 밝혀냈다. 적은 양의 글루타티온, 예컨대 시스틴보다 적은 양의 글루타티온이 시스틴의 시스테인으로의 보다 많은 환원을 야기함이 놀랍다. 보다 적은 양의 글루타티온을 사용하는 것이 유리한데, 이것이 시스테인을 제공하는 다운스트림 공정을 단순하게 만들기 때문이다.
바람직한 실시양태에서, 본 글루타티온 환원 효소는 정제된 형태 또는 단리된 형태로 첨가된다. 정제된 형태의 글루타티온 환원 효소를 사용하는 것이 유리한데, 이것이 시스테인을 회수하는 다운스트림 공정을 단순하게 만들기 때문이다. 대안적으로, 글루타티온 환원 효소는 지지체 상에 고정된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 글루타티온 환원 효소는 미생물에 포함된다. 보다 바람직한 실시양태에서, 본 글루타티온 환원 효소는 투과성 미생물에 포함된다. 보다 바람직하게는, 본 글루타티온 환원 효소는 미생물로부터 유래된 무세포 추출물에 포함된다. 무세포 추출물은 세포를 부수어 연 후에 수득된 세포의 가용성 분자를 포함한다. 바람직하게는, 본 무세포 추출물은 세포벽을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 본 무세포 추출물은 균류, 예컨대 페니실리움(Penicillium), 트리코더마(Trichoderma), 아스페르길루스(Aspergillus), 또는 효모로부터 유래된다. 보다 바람직하게는, 무세포 추출물은 페니실리움 또는 효모 균주(속 사카로미세스(Saccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 또는 칸디다(Candida)에 속함)로부터 유래된다. 가장 바람직하게는, 무세포 추출물은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)로부터 유래된다. 적합한 박테리아 미생물 속의 예는 클로스트리디아(Clostridia), 에스케리키아 및 아르케이아(Archaea), 예컨대 메타노박테리움(Methanobacterium) 및 메타노사르시나(Methanosarcina)이다. 무세포 추출물의 사용은 유리한데, 효소 생산을 위한 빵 효모 또는 균류 또는 박테리아 발효의 기존의 대규모 생산 능력이 무세포 추출물의 제공을 위해 효율적으로 사용될 수 있기 때문이다. 또한, 글루타티온 환원 효소를 제공하는 무세포 추출물의 사용은 비싼 정제된 글루타티온 환원 효소 사용의 필요성을 제거한다. 무세포 추출물 사용의 또 다른 유리점은 무세포 추출물이 본 환원 용액에서 (천연) 매개자로서 기능하는 소정의 양의 글루타티온 및/또는 티오레독신(또는 다른 유사한 분자)을 함유할 수 있다는 것이다. 무세포 추출물의 내인성 매개자의 사용은 비용 및 재료 효율적인 시스틴의 환원 방법을 제공한다.
보다 바람직하게는, 무세포 추출물은, 효모 세포를 효소에 의해, 기계적으로, 화학적으로 또는 물리적으로 파괴시킨 후에, 가용성 분획을 세포벽으로부터 분리하여 무세포 추출물을 제공함으로써 효모로부터 유래된다. 무세포 추출물은 바람직하게는 균질화 기술에 의해 수득된다. 균질화 기술은 혼합 또는 입자(예컨대 모래 및/또는 유리 비드)에 의한 밀링을 포함할 수 있다. 환원이 전체 효모 세포 산화환원 시스템으로부터 이득을 취할 수 있기 때문에 효모로부터 유래된 무세포 추출물을 사용하는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다. 바람직한 실시양태에서, 투과성 세포는 당분야에 공지된 방법(예컨대 냉동-및-해동 주기, 자기용해, DMSO 처리, 에탄올 또는 톨루엔 처리를 포함함)에 의해 세포로부터 유래된다. 바람직하게는, 무세포 추출물은 가열 단계 없이 수득된다. 보다 바람직하게는, 무세포 추출물은 글루타티온 환원 효소를 불활성화시키는 온도에 의한 가열 단계 없이 수득된다. 글루타티온 환원 효소를 불활성화시키는 온도의 예는 40℃ 초과, 45℃ 초과, 50℃ 초과 또는 심지어 55℃ 초과이다.
바람직한 실시양태에서, 본 환원 용액은 (iv) 보조인자 재생 시스템을 추가로 포함한다. 보조인자 재생 시스템의 사용은, 환원 과정 동안 보조 인자의 첨가를 위한 추가적 단계가 필요하지 않기 때문에, 효소에 의해 시스틴을 환원시키는 개선된 방법을 제공한다. 또한, 보조인자를 재생하는 것은 비용 효율적인데, 보다 적은 양의 보조인자가 시스틴을 시스테인으로 환원시키는 데 필요하기 때문이다. 바람직하게는, 보조인자 재생 시스템은 효소 및 상응하는 기질을 포함한다. 바람직하게는, 보조인자 재생 시스템은 글루코스 탈수소 효소 및 글루코스 및/또는 포메이트 탈수소 효소 및 포메이트를 포함한다. 포메이트 탈수소 효소는 NADH의 재생에 특히 적합한 것으로 밝혀진 반면에, 글루코스 탈수소 효소는 NADPH 및 NADH 재생 둘 다에 적합하다. 본 보조인자 재생 시스템에서 대안적 효소는 알코올 탈수소 효소, NADP-의존적 포메이트 탈수소 효소, 글루코스 6-포스페이트 탈수소 효소, H2-촉진된 NAD(P)+-환원성 수소화 효소 또는 포스파이트 탈수소 효소이다. 알코올 탈수소 효소 및 알코올, 보다 바람직하게는 알코올 탈수소 효소와 이소프로판올, 또는 알코올 탈수소 효소와 에탄올을 포함하는 보조인자 재생 시스템이 특히 바람직하다. 알코올 탈수소 효소와 알코올을 기재로서 사용하는 것의 유리점은 알코올 탈수소 효소에 의해 형성된 생성물(예컨대 에탄올을 사용한 후에 이소프로판올 및 아세트알데하이드를 사용한 후에 아세톤)이 휘발성이어서 본 환원 용액 및/또는 시스테인 포함 용액으로부터 용이하게 제거될 수 있다는 것이다.
바람직한 실시양태에서, 본 환원 용액의 온도는 바람직하게는 시스틴을 환원 용액에 접촉시키는 동안 2℃ 내지 90℃ 범위이다. 바람직하게는, 상기 온도는 10℃ 내지 60℃ 범위이다. 보다 바람직하게는, 환원 용액의 온도는 15℃ 내지 50℃ 범위이다. 가장 바람직하게는, 환원 용액의 온도는 15℃ 내지 40℃ 범위, 예컨대 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃ 또는 39℃이다.
바람직한 실시양태에서, 본 환원 용액의 pH는 바람직하게는 시스틴을 환원 용액에 접촉시키는 동안 pH 6 내지 10 범위의 pH를 갖는다. 바람직하게는, 상기 pH는 6.5 내지 9 범위이다. 보다 바람직하게는, 환원 용액의 pH는 6.5 내지 8.5 또는 7.0 내지 8.5 범위, 예컨대 pH 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3 및 8.4이다. 본 발명자는 6 내지 8.5 범위의 pH를 사용하여 시스틴의 증가된 환원을 달성하는 것을 밝혀냈다. 7 내지 8.5 범위의 pH에서 시스틴의 훨씬 증가된 환원 또는 심지어 완료된 환원이 달성됨이 놀랍다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 환원 용액에 첨가된 본 보조인자는 산화된 형태, 예컨대 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트(NADP+) 또는 산화된 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NAD+)이다. 본 발명자는 본 발명의 방법에서 보조인자를 산화된 형태로 사용함으로써 시스틴의 환원을 달성할 수 있음을 밝혀냈다. 보조인자를 산화된 형태로 사용하는 것은, 산화된 형태의 보조인자가 용이하게 입수가능하여 비용 효율적이기 때문에 개선된 방법을 제공한다. 보조인자 재생 시스템이 본 환원 용액에 존재하는 경우, 보조인자를 산화된 형태로 사용하는 것은, 산화된 형태의 보조인자가 보조인자 재생 시스템에 의해 재생되기 때문에, 미리 보조인자를 환원시키는 추가적 단계를 방지한다. 플라빈 아데닌 다이뉴클레오티드(FADH2)-의존적 효소 시스템이 사용되는 경우, 산화된 플라빈 아데닌 다이뉴클레오티드(FAD+)는 본 환원 용액에 첨가될 수 있다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 본 시스틴은, 시스틴의 50% 초과, 바람직하게는 60% 초과, 보다 바람직하게는 70% 초과, 보다 더 바람직하게는 80% 초과, 가장 바람직하게는 90% 초과 또는 99% 초과 또는 심지어 100%를 시스테인으로 환원시키는 데 충분한 기간 동안 환원 용액에 접촉된다. 바람직하게는, 상기 기간은 48시간 미만, 보다 바람직하게는 24시간 미만, 보다 더 바람직하게는 12시간 미만, 가장 바람직하게는 6시간 미만 또는 3시간 미만이다. 1 내지 3시간 또는 1.5 내지 2.5시간의 기간이 보다 바람직하다. 본 발명자는 본 발명의 방법이 산업적 규모에서 수행될 때에도 시간 효율적인 시스틴의 환원 방법임을 밝혀냈다. 따라서, 본 발명은 시스틴의 환원을 위한 개선된 조건을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 시스틴을 환원 용액에 접촉시키는 단계는 약간의 호기성 조건 하에 또는 훨씬 바람직하게는 혐기성 조건 하에 수행되어 시스테인이 시스틴으로 재산화하는 것을 방지한다. 따라서, 혐기성 조건 사용의 유리점은 본 환원 용액에서 증가된 양의 시스테인이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 산업적 규모로 수행된다. 본 발명의 설명에 걸쳐, 산업적 규모 방법 또는 산업적 공정은 10 L 이상, 바람직하게는 100 L 이상, 보다 바람직하게는 1 m3 이상, 5 m3 이상, 보다 더 바람직하게는 10 m3 이상, 가장 바람직하게는 25 m3 이상, 바람직하게는 250 m3 미만의 부피 규모를 갖는 환원 용액을 사용하는 방법을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 환원 용액은 시스테인을 시스틴으로 재산화시키는 것에 촉매작용하는 화합물을 적게, 즉, 5%(중량) 미만 또는 1%(중량) 미만으로 함유하거나 함유하지 않는다. 전자를 '흡착하는' 경향을 갖는 이러한 화합물의 예는 제2철, 니트레이트, 구리 이온이다. 유리점은 본 환원 용액에서 증가된 양의 시스테인이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 환원 용액은 수용액이다. 바람직하게는, 환원 용액 또는 수용액은 완충제를 포함한다. 바람직하게는, 완충제는 나트륨 포스페이트 완충제이다. 대안적으로, 완충제는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 완충제(또는 트리스 HCl 완충제) 또는 2-(N-모폴리노)에탄설폰산 완충제(MES 완충제로 축약됨)이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법으로 회수되는 본 시스테인 포함 조성물은 시스틴을 환원 용액에 접촉시키는 동안 시스테인 및 환원 용액에 존재하는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법으로 회수되는 본 시스테인 포함 조성물은 시스테인, 및 글루콘산, 글루코네이트, 폼산, 글루코스, 포메이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드, 글루타티온, 아세톤, 아세트알데하이드 및 글루타티온 환원 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 것을 포함한다. 본 환원 용액은 여러 성분, 예컨대 글루타티온, 보조인자 및 티올 환원 효소를 포함한다. 시스테인 포함 조성물의 회수는 환원 용액에 존재하는 성분 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명이 유익하게 천연물로서 자격이 있을 수 있는 시스테인을 제공한다는 것을 고려하면, 본 발명은, 또 다른 양상에 따라, 시스테인 또는 L-시스테인, 및 글루콘산, 글루코네이트, 폼산, 글루코스, 포메이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드, 글루타티온(GSH 또는 GSSG) 및 글루타티온 환원 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 것을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 조성물은 시스틴을 시스테인으로 효소에 의해 환원시키는 본 발명의 방법에 의해 수득가능하다. 보다 바람직하게는 본 조성물은 본 발명의 방법에 의해 수득가능하다.
바람직하게는, 본 발명의 방법으로 회수되는 본 조성물 또는 본 시스테인 포함 조성물은 시스테인 및/또는 글루콘산, 글루코네이트, 폼산, 글루코스, 포메이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드, 글루타티온 아세톤, 아세트알데하이드, 글루타티온(GSH 또는 GSSG) 및 글루타티온 환원 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 것 1 ppm 이상, 10 ppm 이상 또는 100 ppm 이상을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법으로 회수되는 본 조성물 또는 본 시스테인 포함 조성물은 시스테인 및/또는 글루콘산, 글루코네이트, 폼산, 글루코스, 포메이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드, 글루타티온, 아세톤, 아세트알데하이드, 글루타티온(GSH 또는 GSSG) 및 글루타티온 환원 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 것 1 ppb 이상, 10 ppb 이상 또는 100 ppb 이상을 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 방법으로 회수되는 본 조성물 또는 본 시스테인 포함 조성물은 시스테인, 및 글루콘산, 글루코네이트, 폼산, 글루코스, 포메이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드, 글루타티온, 아세톤, 아세트알데하이드, 글루타티온(GSH 또는 GSSG) 및 글루타티온 환원 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 것 1 ppm 이하, 10 ppm 이하 또는 100 ppm 이하를 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 회수되는 본 조성물 또는 본 시스테인 포함 조성물은 시스테인, 및 글루콘산, 글루코네이트, 폼산, 글루코스, 포메이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드, 글루타티온, 아세톤, 아세트알데하이드, 글루타티온(GSH 또는 GSSG) 및 글루타티온 환원 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 것 1 ppb 이하, 10 ppb 이하 또는 100 ppb 이하를 포함한다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 회수되는 본 조성물 또는 본 시스테인 포함 조성물은 시스테인, 및 글루콘산, 시스테인 및 폼산; 또는 시스테인 및 글루타티온(GSH 또는 GSSG)을 포함한다.
본 조성물의 유리점은 조성물이 효소에 의한 시스테인의 환원에 의해 수득되는 시스테인을 주로 포함하여 천연 시스테인으로 간주된다는 것이다. 따라서, 본 조성물은 유리하게 식품의 제조를 위해 또는 식품 향미의 제조를 위해 천연 식품 향미로서 또는 천연 성분으로서 사용될 수 있다.
도 1은 여러 글루타티온 농도 및 보조인자로서 NADH를 사용하는 여러 반응 세트업에서 환원된 L-시스틴의 백분율을 나타낸다.
도 2는 여러 글루타티온 농도 및 보조인자로서 NADPH를 사용하는 여러 반응 세트업에서 환원된 L-시스틴의 백분율을 나타낸다.
도 3은 효모 글루타티온 환원 효소에 대한 pH 활성 곡선을 나타낸다. 활성은 상이한 산도에서 NADPH의 백그라운드 전환에 대해 보정되고, pH 5 내지 10에서 관찰된 최고 활성에 상대적으로 표현된다.
도 4는 상이한 공정 조건 하에 효모 GR을 사용하는 시간에 따른 시스테인의 형성을 나타낸다.
도 5는 55℃에서 항온처리 전후에 글루타티온 환원 효소 활성을 나타낸다.
도 2는 여러 글루타티온 농도 및 보조인자로서 NADPH를 사용하는 여러 반응 세트업에서 환원된 L-시스틴의 백분율을 나타낸다.
도 3은 효모 글루타티온 환원 효소에 대한 pH 활성 곡선을 나타낸다. 활성은 상이한 산도에서 NADPH의 백그라운드 전환에 대해 보정되고, pH 5 내지 10에서 관찰된 최고 활성에 상대적으로 표현된다.
도 4는 상이한 공정 조건 하에 효모 GR을 사용하는 시간에 따른 시스테인의 형성을 나타낸다.
도 5는 55℃에서 항온처리 전후에 글루타티온 환원 효소 활성을 나타낸다.
재료 및 방법
1. 재료
하기 재료를 실시예에서 사용하였다.
L-시스틴, 시그마-알드리치, C7602-25G
빵 효모(사카로미세스 세레비시아)로부터의 글루타티온 환원 효소, 시그마-알드리치(Sigma-aldrich), G3664-2.5KU
환원된 L-글루타티온, 시그마-알드리치, G4251-100G
산화된 L-글루타티온, 시그마-알드리치, G4376-10G
에스케리키아 콜라이로부터의 티오레독신 환원 효소, 시그마-알드리치, T7915-250UG
에스케리키아 콜라이로부터의 티오레독신, 시그마-알드리치, T-0910-1MG
환원된 B-니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트 테트라 (사이클로헥실암모늄) 염, 시그마-알드리치, N5130-25MG
환원된 B-니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 이나트륨 염 수화물, 시그마-알드리치, N8129-50MG
B-니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트 수화물, 시그마-알드리치, N5755-110MG
B-니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 수화물, 시그마-알드리치, N1636-100MG
슈도모나스(Pseudomonas) 종으로부터의 글루코스 탈수소 효소, 시그마-알드리치, 19359-10MG-F
칸디다 보이디니(Candida boidinii)로부터의 포메이트 탈수소 효소, 시그마-알드리치, F8649-50UN
D(+)-글루코스, 무수물, 메르크(Merck), CAS 50-99-7, 칼바이오켐(Calbiochem)
폼산 나트륨, 시그마-알드리치, 71539-500G
인산 수소 이나트륨 이수화물, 메르크, CAS No 10028-24-7
인산 이수소 나트륨 일수화물, 메르크, CAS No 10049-21-5
2. 반응
본 실시예의 반응을 인산 나트륨 완충제인 환원 용액에서 수행하였다. 먼저, L-시스틴 포화 용액을 500 mg/L 초과의 L-시스틴을 인산 나트륨 완충제(pH 6.0 또는 pH 8.0)에서 1시간 동안 실온에서 교반함으로써 제조하였다. 또한, 추가적 임의적 성분, 예컨대 티올 환원 효소, 매개자, 보조인자 및 보조인자 재생 시스템을 첨가하였다. 반응을 실온(20 내지 25℃)에서 2시간 동안 수행하였다. 반응을 40 g/l 말산, 100 mg/l 1.1-다이플루오로-1-트라이메틸실란일 메틸포스폰산(FSP)(pH 6.4) 및 50% NaOH를 포함하는 중수소 산화물을 첨가하고 1시간 동안 항온처리하여 중단시켰다.
3. NMR 분석
L-시스테인을 함유하는 수득된 환원 용액을 NMR에 의해 L-시스틴 및 유리 티올 기에 대해 분석하였다. 샘플을 헬륨-냉각된 냉동 프로브를 갖춘 700 MHz 분광계 상에서 3 mm NMR 튜브에서 측정하였다. NOESYGPPR1d.COMP 물분자 억제를 적용하였다. 32개의 스캔을 1.2초의 휴지 지연에 의해 획득하였다. 성분을 0 ppm에서 FSP의 피크 면적에 대한 피크의 적분에 따라 정량화하였다:
D 5.04 ppm: 글루코스
Dd 3.18 ppm: 시스틴
Dd 3.09 ppm: GSSG
M 2.24 ppm: 총 SH.
4. 시스틴 환원율(%)
반응 종결시 시스틴의 양을 반응 출발시 시스틴의 양에서 감하고, 그 수를 반응 출발시 시스틴의 양으로 나누고 100을 곱하여 시스틴의 환원율(%)을 계산하였다.
실시예
실시예 1: 매개자:L-시스틴 비
175 μl의 L-시스틴 용액(pH 8.0)을 96-웰 플레이트로 피펫질하였다. 5 μl의 하기 것을 200 μl의 최종 반응 부피까지 첨가하였다: 글루타티온 환원 효소(17 U/ml); NADH 또는 NADPH(1.0 및 0.28 mM); 글루코스 탈수소 효소(3.4 U/ml) 및 D-글루코스(2 mM); 적용가능한 경우 밀리-큐(Milli-Q, 상표) 물. 마지막으로, 5 μl의 상이한 글루타티온 농축물을 200 μl의 최종 반응 부피까지 첨가하였다(도 1 및 2 참조). 반응에서 최종 L-시스틴 농도는 0.85 mM(최종 반응)이었다. 반응을 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 처리하고, L-시스틴 및 유리 티올 기를 NMR에 의해 분석하였다.
도 1은 여러 글루타티온 농도에 따른 환원된 L-시스테인의 백분율을 나타낸다. 구체적으로, 도 1은 GSH 및 NADH만을 사용하는 제1 시리즈의 비-효소적 환원이, L-시스틴보다 훨씬 더 많은 GSH가 존재하는 경우에만, 90% 초과의 환원을 제공함을 보여준다. 놀랍게도, 글루타티온 환원 효소의 첨가 후에, 증가된 환원이 낮은 비의 GSH:L-시스틴에서 달성된다.
또한, 도 1은 보조인자 재생 시스템, 예컨대 글루코스 탈수소 효소 및 D-글루코스의 존재 하에 훨씬 적은 양의 매개자가 90% 초과의 환원을 제공하는 데 필요하고, 놀랍게도 상기 GSH:L-시스틴의 비에서 상당한 환원을 가능하게 함을 보여준다. 또한, 첨가된 보조인자 재생 시스템은, 보조인자 재생 시스템이 부재하는 것과 비교하여, 훨씬 낮은 보조인자 NADH 농도에서 90% 초과의 환원율로 시스틴을 환원시킬 수 있다(0.28 mM NADH가 과량의 1.0 mM NADH를 사용한 것과 동일한 L-시스테인으로의 환원을 야기한다).
도 1과 유사하게, 도 2는, 글루타티온:L-시스틴 비가 1 미만인 경우에도, L-시스틴에서 L-시스테인으로의 90% 초과의 환원이 보조인자로서 NADPH를 사용하여 달성될 수 있음을 개시한다. 여기서, 보조인자 재생 시스템의 첨가는, 보조인자 재생 시스템이 부재하는 것과 비교하여, 훨씬 낮은 보조인자 NADPH 농도에서 90% 초과의 환원율로 시스틴을 환원시킬 수 있을 뿐만 아니라(0.28 mM NADPH가 과량의 1.0 mM NADPH를 사용한 것과 동일한 L-시스테인으로의 환원을 야기한다), 이는 놀랍게도 상기 GSH:L-시스틴 비에서 훨씬 많은 환원을 가능하게 한다.
결론적으로, 도 1 및 도 2는 L-시스틴의 개선된 환원 방법을 제공함에 있어서 본 발명의 실행가능성을 개시한다.
실시예 2: 무세포 추출물(CFE로 축약됨)을 사용하는 환원
CFE 제조
효모(사카로미세스 세레비시아) 및 균류(페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum)) 세포 배양물을 밀리-큐(상표) 물로 세척하고 100 mM 트리스-HCL 완충제(pH 7.5)에 현탁시키고 얼음 상에 저장하였다. 세포를 0.5 g의 0.45 내지 0.5 mm 유리 비드를 함유하는 2.0 ml 바이알에 옮기고 사이에 얼음 상에서 냉각하면서 3회 5000 rpm에서 40초 동안 Precellys 균질기 상에서 완전히 진탕하였다. 추출물을 2회 원심분리하고, 각각의 원심분리 단계 후에 상청액을 새로운 튜브에 옮겼다. 무세포 추출물(CFE)의 총 단백질 함량을 뷰렛법(Biuret Method)에 따라 결정하였다. 샘플을 추가 사용 전에 -20℃에서 저장하였다.
분석
185 μl의 L-시스틴 용액(pH 6.0 또는 8.0)을 96-웰 플레이트로 피펫질하였다. 5 μl의 하기 것을 200 μl의 최종 반응 부피까지 첨가하였다: 효모(1 mg/ml) 또는 균류(0.5 mg/ml) CFE; 매개자 L-글루타티온(100 μg/ml); NADH(700 μg/ml) 또는 NADPH(800 μg/ml); 적용가능한 경우 밀리-큐(상표) 물. L-시스틴 농도는 최종 반응에서 pH 6.0에서 0.63 mM이고 pH 8.0에서 0.78 mM이었다. 반응(표 1 참조)을 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 처리하고, L-시스틴 및 유리 티올 기를 NMR에 의해 분석하였다.
| 기질 | pH | CFE | 매개자 | 보조인자 | 환원율 |
| L-시스틴 | 6 | 사카로미세스 세레비시아 | - | NADH | 0 |
| GSH | 32 | ||||
| - | NADPH | 1 | |||
| GSH | 33 | ||||
| 페니실리움 크리소제눔 | - | NADH | 0 | ||
| GSH | 30 | ||||
| - | NADPH | 0 | |||
| GSH | 37 | ||||
| 8 | 사카로미세스 세레비시아 | - | NADH | 6 | |
| GSH | 31 | ||||
| - | NADPH | 0 | |||
| GSH | 100 | ||||
| 페니실리움 크리소제눔 | - | NADH | 7 | ||
| GSH | 47 | ||||
| - | NADPH | 2 | |||
| GSH | 72 |
표 1은 pH 8에서 L-시스틴의 환원이 증가함을 보여준다. 또한, 사카로미세스 세레비시아 및 페니실리움 크리소제눔의 CFE가 L-시스틴의 환원을 제공할 수 있음이 표 1로부터 분명하다.
실시예 3: 보조인자 재생
175 μl의 L-시스틴(pH 8.0)을 96-웰 플레이트로 피펫질하였다. 5 μl의 하기 것을 200 μl의 최종 반응 부피까지 첨가하였다: 글루타티온 환원 효소(17 U/ml) 또는 효모 CFE(1 mg/ml); 매개자 L-글루타티온(100 μg/ml); NADH 또는 NADPH(200 및 350 μg/ml); 글루코스 탈수소 효소(GDH) 또는 포메이트 탈수소 효소(FDH)(둘 다 3.4 U/ml); D-글루코스 또는 나트륨 폼산(둘 다 1 mM); 적용가능한 경우 밀리-큐(상표) 물. L-시스틴 농도는 각각 정제된 효소 및 CFE 반응에서 0.80 mM 및 0.52 mM이었다. 반응(표 2 참조)을 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 처리하고, L-시스틴 및 유리 티올 기를 NMR에 의해 분석하였다.
| 기질 | 매개자 | 보조인자 | 환원 효소 | 재생 효소 | 재생 기질 | 환원율(%) |
| L-시스틴 | GSH |
NADH | - | GDH | 글루코스 | 10 |
| 글루타티온 환원 효소 | - | - | 14 | |||
| GDH | 글루코스 | 91 | ||||
| FDH | 포메이트 | 100 | ||||
| NADPH | - | GDH | 글루코스 | 15 | ||
| 글루타티온 환원 효소 | - | - | 30 | |||
| GDH | 글루코스 | 100 | ||||
| FDH | 포메이트 | 100 | ||||
| NADH | 효모 CFE | - | - | 9 | ||
| 글루코스 | 0 | |||||
| 포메이트 | 6 | |||||
| GDH | 글루코스 | 28 | ||||
| FDH | 포메이트 | 100 | ||||
| NADPH | - | - | 55 | |||
| 글루코스 | 68 | |||||
| 포메이트 | 68 | |||||
| GDH | 글루코스 | 100 | ||||
| FDH | 포메이트 | 79 |
표 2는, 단지 제한된 양의 보조인자 NADH 또는 NADPH가 사용되었지만(200 및 350 μg/ml, 반면에 실시예 1 및 3에서는 각각 700 및 800 μg/ml), 보조인자 재생 시스템의 사용에 의해 시스틴의 환원이 달성됨을 분명히 보여준다. 또한, 표 2는 무세포 추출물과 보조인자 재생의 조합의 사용에 의해 시스틴의 100% 환원이 달성됨을 보여준다.
실시예 4: 산화된 보조인자
175 μl의 L-시스틴 용액(pH 8.0)을 96-웰 플레이트로 피펫질하였다. 5 μl의 하기 것을 200 μl의 최종 반응 부피까지 첨가하였다: 글루타티온 환원 효소(17 U/ml); 매개자 L-글루타티온(1 mM); NADH, NAD+, NADPH 또는 NADP+(모두 1 mM); 글루코스 탈수소 효소(3.4 U/ml) 및 D-글루코스(2 mM); 적용가능한 경우 밀리-큐(상표) 물. L-시스틴 농도는 최종 반응에서 0.96 mM이었다.
반응(표 3 참조)을 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 처리하고, L-시스틴 및 유리 티올 기를 NMR에 의해 분석하였다.
| 기질 | 환원 효소 | 매개자 | 보조인자 | 재생 효소 | 재생 기질 | 환원율 (%) |
| L-시스틴 | 글루타티온 환원 효소 | GSH | NADH | 글루코스 탈수소 효소 | D-글루코스 | 100 |
| NAD+ | 100 | |||||
| NADP+ | 100 | |||||
| NADPH | 100 |
표 3은 산화된 형태의 보조인자의 사용이 시스틴의 100% 환원을 야기함을 보여준다.
실시예 5: 효모 글루타티온 환원 효소의 pH 의존적 활성
효모 글루타티온 환원 효소(GR)의 pH 곡선을 pH 5 내지 10의 모든 pH 유닛에서 0.1 M 포스페이트 완충제 내에서 활성을 분석함으로써 수득하였다. GR 효소가 부재하는 블랭크를 모든 pH에 포함시켰다. pH 5 내지 9를 위한 완충제는 0.1 M Na2HPO4 용액 및 0.1 M NaH2PO4 용액의 혼합 완충제였다. 수산화 나트륨의 첨가가 완충제 pH 10 도달을 위해 필요하였다. NADPH 스톡(50 mM)을 밀리큐 물에서 pH 8까지 수산화 나트륨을 첨가하여 제조하고, 여기서 NADPH는 가용성이었고 안정하였다. GSSG 용액을 각각의 pH에 대해 별개로 제조하였다(15 mL 그라이너(Greiner) 튜브에서, 20 mM = 61.3 mg/5 mL 완충제). 효소를 먼저 물에 20x 희석한 후에 상이한 pH 세트 포인트에서 완충제에 100x 희석하였다. NADPH 스톡 용액을 효소의 첨가 전에 NADPH의 백그라운드 전환을 최소화하는 분석의 개시 전에 간략히 목적하는 완충제에서 25x 희석하였다. 분석을 하기와 같이 수행하였다: 100 μl GSSG 용액 pH X + 50 μl NADPH 용액 pH X + 50 μl 희석된 효소 pH X. 이어서, 목적하는 pH에서 1분 마다 340 nm에서 흡수 감소에 대한 동역학 판독을 수행하였다. 반응의 경사(Δ340 nm/분)를 동일한 pH에서의 블랭크 반응 경사에 대해 보정하고, 활성을 측정된 효소의 최고 활성에 상대적으로 표현하였다. 상대적 활성을 도 3에 나타냈다.
실시예 6: 상이한 공정 조건에서 효소의 존재 하에 시스틴의 환원
시스틴을 시스테인으로 환원시킴을 매개자로서 산화된 글루타티온 및 보조인자로서 NADP+의 존재 하에 효모 글루타티온 환원 효소(시그마) 및 글루코스 탈수소 효소(반응에서 NAPPH를 재생시키기 위해)를 사용하여 수행하였다. 개략적 반응은 하기와 같다:
반응 1: CYS-CYS+2GSH→2CYS+GSSG
반응 2: GSSG+NADPH→2GSH+NADP+H
반응 3: 글루코스+NADP→글루콘산+NADPH
효소에 의한 전환을 온도 및 pH가 제어된 200 ml 재킷화된 용기에서 수행하였다. 총 작업 부피는 100 ml였다. 반응을 2개의 용기에서 수행하였다. 둘 다의 용기는 효모 GR(시그마) 및 글루코스 탈수소 효소(GDH 105, 코덱시스(Codexis))를 함유하였다. 반응을 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 조절된 2개의 상이한 공정으로 수행하였다.
| 화합물 | 용기 1 | 용기 2 |
| 효모 GR (시그마) | 2 유닛/ml | 2 유닛/ml |
| GDH 105 (코덱시스) | 2 유닛/ml | 2 유닛/ml |
| GSH (g) | 0.12 | 0.12 |
| 시스틴 (g) | 1.0 | 1.0 |
| NADPH (g) | 0.0076 | 0.0076 |
| 온도 (℃) | 30 | 51 |
| pH | 8.0 | 5.1 |
샘플을 t=0(효소 첨가 전), 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 및 6시간에 채취하였다. 200 μl의 샘플을 1분 동안 13.000 RPM에서 원심분리하고, 100 μl의 상청액을 900 μl의 0.111 N HCL에 옮기고(최종 농도: 0.1 N HCL) 혼합하고 -20℃에서 저장하였다. 모든 샘플을 L-시스틴, L-시스테인, GSH, GSSG 및 이들 성분의 조합을 측정하는 LCMS-MS 방법에 의해 분석하였다. 시간에 따른 시스테인 형성을 도 4에 나타냈다.
용기 2의 시스테인 수준은 시간에 따라 증가하지 않았고, 이는 효모 글루타티온 환원 효소가 51℃ 및 pH 5.1의 적용된 조건 하에 활성이 아님을 보여준다. 이 반응에서 시스테인의 초기 증가는 GSH에 의한 비-효소적 환원의 결과이고, 글루타티온 환원 효소가 활성이 아니기 때문에 추가로 증가하지 않고, 따라서 산화된 글루타티온을 환원시킬 수 없다.
실시예 7: 55℃ 온도에서 글루타티온 환원 효소의 안정성
글루타티온 환원 효소의 열안정성을 연구하기 위해, 1.5 ml의 효소 스톡 용액을 55℃에서 항온처리하였다. 15, 30, 60, 120 및 240분의 항온처리 후에, 250 μl를 새로운 튜브에 옮기고 얼음물에서 저장하였다. 항온처리되지 않은 스톡 용액(약 3.5 ml)을 추가적 항온처리 없이 바로 얼음물에 위치시켰다.
하기 반응이 수행되었다:
NADPH + GR + GSSG → NADP+ + GR + 2GSH
반응 혼합물에, 50 μl의 트리스-HCL 완충제(pH 8.0), 50 μl의 NADPH , 50 μl의 글루타티온 환원 효소(GR) 및 50 μl 산화된 글루타티온을 첨가하였다. 글루타티온 환원 효소로서, 항온처리되지 않거나 열-처리된 샘플을 사용하였다. 반응을 200 μl의 총 부피에서 평평하고 투명한 바닥의 MTP96 플레이트에서 수행하였다. 반응을 실온에서 수행하였다. 글루타티온을 제외한 모든 성분을 혼합하였다. 반응을 동시에 개시하기 위해, 기질을, MTP96 플레이트를 마이크로퀀트(μquant) 분광 광도계에 두기 직전에 첨가하였다. 흡광도를 2시간 동안 1분 마다 340 nm에서 측정하였다.
도 5는 고온에서 항온처리 후에 시간에 따른 흡광도의 결과를 보여준다. 활성은 15분 후 감소하고, 활성 없음이 55℃에서 항온처리 30 및 60분 후에 측정된다.
실시예 8
프로테아제의 존재 또는 부재 하에 효모 글루타티온 환원 효소 열안정성
20 유닛의 효모 글루타티온 환원 효소(시그마)를 10 ml 완충제(0.5 M 트리스 HCL 완충제)에 첨가하고 51℃ 및 pH 5.1에서 18시간 동안 프로테아제의 존재 하에 및 부재 하에 수욕에서 항온처리하였다. 본 실험에 적용된 프로테아제는 용액의 건물 1 g 중의 0.0068 mg의 용량의 알칼라제(Alcalase, 노보자임(Novozyme))였다. 효소 활성을 분광 광도계에 의해 개발된 분석을 사용하여 둘 다의 용액에서 항온처리한 후에 측정하였다.
| 샘플 | 전 (t=0) | 후 (t=18시간) |
| 알칼라제가 부재하는 효모 GR | 2 U/ml | 0.010 U/ml |
| 알칼라제가 존재하는 효모 GR | 2 U/ml | 0.015 |
결과는 효모 GR 효소가 열안정하지 않고, 51℃ 및 pH 5.1에서 항온처리한 후에 18시간 후에 활성이 손실됨을 보여준다.
글루타티온 환원 효소 활성 측정 분석
GR 활성 측정을 위한 분석은 하기 반응을 기반으로 하였다:
GR + GSSG + NADPH → GR + 2GSH + NADP+
상기 식에서, GSSG는 산화된 L-글루타티온이고, GSH는 환원된 L-글루타티온이다.
적용된 재료는 하기와 같다:
글루타티온 환원 효소 분석 용액:
밀리-큐(mQ) 중의 20 mM NADPH(CAS no: 2646-71-1)
mQ 중의 20 mM GSSG(CAS no: 27025-41-8)
200 mM T트리스-HCl(pH 7.5, DSM MBK에서 입수)
45 ml의 스톡 용액(50개의 샘플)을 제조하기 위해: 17 ml mQ, 22.5 ml 200 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 500 μl 20 mM NADPH, 5 ml 20 mM GSSG를 분석 직전에 혼합하였다.
방법:
분광 광도계(유형: 울트로스펙(Ultrospec, 등록상표) 2000(제네틱스(Genetics) 및 Jasco V-630(ABC 랩 1128))를 0.000으로 공기를 사용하여 보정하였다. 분석 스톡 용액의 흡광도를 샘플 없이 측정하였다. 분석의 결과를 음성 대조군으로서 취했다. 효소 용액을 100 mM 트리스-HCl(pH 7.5)에 희석하였다. 100 μl의 희석된 샘플을 큐벳에서 900 μl의 분석 스톡 용액에 첨가하고 피펫에 의해 완전히 혼합하였다. 상기 큐벳을 분광 광도계에 위치시키고, 용액의 흡광도를 t = 0에서, 및 1분 후에(t = 1) 기록하였다.
계산:
효소 활성을 하기 수학식에 의해 결정하였다:
상기 식에서,
Df = 희석인자
ΔA min-1 = 1분 당 흡광도 증가량/감소량
Av = ml 단위의 분석 부피(1 ml)
d = cm 단위의 광학 경로 길이(큐벳의 경우, 이는 1 cm이다)
e = NADPH의 몰 흡광 계수(6.22 M-1cm-1)
Sv = ml 단위의 샘플 부피(0.1 ml)
Claims (14)
- 시스틴을, (i) 활성 글루타티온 환원 효소(EC1.8.1.7); (ii) 보조인자; 및 (iii) 글루타티온을 포함하는 환원 용액에 접촉시키는 단계; 및
시스테인 포함 조성물을 회수하는 단계
를 포함하는, 시스틴을 시스테인으로 효소에 의해 환원시키는 방법으로서,
상기 환원 용액이 상기 시스틴에 접촉하는 동안 6 이상의 pH를 갖는, 방법. - 제1항에 있어서,
시스테인 포함 조성물을 회수하는 단계가 시스틴을 환원 용액에 접촉시키는 단계 후에 15시간 이내에 수행되는, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
보조인자가 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트(NADPH), 바람직하게는 산화된 형태의 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트(NADP+), 또는 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NADH), 바람직하게는 산화된 형태의 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NAD+)인, 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
글루타티온 환원 효소가 투과성 미생물에 포함되는, 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
글루타티온 환원 효소가 무세포 추출물에 포함되고, 바람직하게는 효모 또는 균류 세포를 효소에 의해, 기계적으로 또는 화학적으로 파괴시킨 후에, 세포벽으로부터 가용성 분획을 분리하여 무세포 추출물을 제공함으로써 무세포 추출물이 효모 또는 균류로부터 유래되는, 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
환원 용액이 (iv) 글루코스 탈수소 효소 및 글루코스, 또는 포메이트 탈수소 효소 및 포메이트를 포함하는 보조인자 재생 시스템을 추가로 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
환원 용액에서 글루타티온:시스틴의 몰비가 0.1 미만인, 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
환원 용액이 7.0 내지 8.5 범위의 pH를 갖는, 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
시스틴의 50% 초과를 시스테인으로 환원시키기에 충분한 시간 동안 시스틴을 환원 용액에 접촉시키는, 방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
시스틴을 환원 용액에 접촉시키는 단계가 혐기성 조건 하에 수행되는, 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
시스테인 포함 조성물이 시스테인; 및 글루콘산, 폼산, 글루코스, 포메이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드, 글루타티온 및 글루타티온 환원 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 것을 포함하는, 방법. - 시스테인; 및 글루콘산, 폼산, 글루코스, 포메이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 포스페이트, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드, 글루타티온, 아세톤, 아세트알데하이드 및 글루타티온 환원 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 것을 포함하는 조성물.
- 천연 식품 향미로서 제12항의 조성물의 용도.
- (i) 활성 글루타티온 환원 효소(EC1.8.1.7);
(ii) 보조인자; 및
(iii) 글루타티온
을 포함하는 환원 용액.
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