CN110087488A - 胱氨酸的酶促还原 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于将胱氨酸酶促还原成半胱氨酸的方法，所述方法包括使胱氨酸与还原溶液接触，所述还原溶液包含：(i)活性谷胱甘肽还原酶(EC1.8.1.7)；(ii)辅因子；(iii)谷胱甘肽；以及回收包含半胱氨酸的组合物，其中所述还原溶液在与胱氨酸接触期间的pH为至少6。

Description

胱氨酸的酶促还原
技术领域
本发明涉及一种用于将胱氨酸酶促还原成半胱氨酸的方法。根据另一方面，本发明涉及一种包含半胱氨酸的组合物及所述组合物作为天然食品调味剂的用途。根据又一方面，本发明涉及一种还原溶液及其用途。
背景技术
半胱氨酸，主要是L-对映体，是食品，制药和个人护理行业中的前体。更多的食品应用中的一种是产生风味。例如，美拉德反应中半胱氨酸与糖的反应产生肉风味。半胱氨酸也用作烘焙的加工助剂，并作为抗氧化剂添加到天然果汁产品中。当用作食品添加剂时，半胱氨酸的E编号为E920。作为药物，其被施加用于改善肝功能和色素沉着。在临床营养中，将半胱氨酸添加到氨基酸输注液中作为抗氧化剂。在个人护理领域，半胱氨酸用于永久波应用(主要在亚洲)，其中半胱氨酸用于打断头发角蛋白中的二硫键。
半胱氨酸和L-半胱氨酸是指相同的分子，并且这两个术语可互换使用。类似地，胱氨酸和L-胱氨酸可互换使用。半胱氨酸，缩写为Cys或C，是一种半必需氨基酸，意味着它可以由人类从蛋氨酸合成，但在一些情况下，诸如对于婴儿、老年人和患病的人，它需要从饮食(诸如花椰菜、大蒜、洋葱和肉)中获得。半胱氨酸硫醇基团不仅在结构稳定性中起着重要作用，而且更重要的是作为分子的反应性部分。硫醇侧链通常参与酶促反应，如在蛋白酶和酰基转移酶中充当亲核试剂。硫醇易于氧化而产生二硫桥，二硫桥在许多蛋白质中起重要的结构作用。其他可能的翻译后修饰是磺化(SOH)、亚磺化(SO2H)、亚硝基化(SNO)、谷胱甘肽化，其充当响应于细胞氧化还原状态的调节开关。
传统上已经经由化学水解从动物毛发中获得半胱氨酸。然而，存在严重的问题，诸如为了安全避免动物毛发使用、低生产率和对环境污染的担忧。因此，强烈需要用于生产半胱氨酸的环保方法。最近用于生产半胱氨酸的方法包括使用重组微生物进行发酵。一种已知的方法是使用产生每升>20克半胱氨酸的重组E.coli。然而，问题在于半胱氨酸的溶液氧化容易产生二硫化物胱氨酸，该二硫化物胱氨酸需要被还原。
用于生产半胱氨酸的常规方法是使用胱氨酸的电化学还原的电化学方法。使用电解的缺点是如在欧洲调味品法规(European regulation on Flavourings)中所认定的，所提供的半胱氨酸无法被分类为天然的，因为电解是有意改变半胱氨酸的化学性质的物理方法。
WO2011/039156公开了一种用于采用酵母生产半胱氨酸的方法。实施例显示了对胱氨酸的非酶促还原，因为酵母的谷胱甘肽还原酶在51℃和pH 5.9下是无活性的，如下文实施例4和实施例5中所示。此外，通过使用膏状酵母(cream yeast)，加入到反应中的谷胱甘肽的量足以驱使胱氨酸向半胱氨酸还原。WO2011/039156中公开的方法的一个缺点是该方法需要很长时间并且半胱氨酸产率较低。
鉴于上述情况，本领域需要一种用于将胱氨酸还原为半胱氨酸的方法，对于该方法所获得的半胱氨酸可被分类为天然的。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种方法，在所述方法中在改善的条件下进行还原。本发明的另一个目的是提供一种涉及还原的方法，该方法需要减少量的能量。本发明的另一个目的是提供一种方法，其中可以减少起始材料(诸如酶和/或介导剂(mediator))的剂量，并与此同时将被还原的半胱氨酸的输出保持在相同水平或甚至升高。本发明的又一个目的是提供一种涉及还原的方法，其中从胱氨酸至半胱氨酸的还原是完全的。另一个目的是提供一种用于还原胱氨酸的方法，其中所形成的半胱氨酸被认定是天然调味成分。
通过本发明解决了上述目的以及其他目的。特别地，通过提供以下方法解决了上述目的以及其他目的，所述方法是一种用于将胱氨酸酶促还原为半胱氨酸的方法，该方法包括使胱氨酸与还原溶液接触，该还原溶液包含：
(i)活性谷胱甘肽还原酶(EC1.8.1.7)；
(ii)辅因子；以及
(iii)谷胱甘肽；
以及回收包含半胱氨酸的组合物，
其中该还原溶液在与胱氨酸接触期间的pH为至少6。
令人惊讶的是，本发明的发明人发现通过使用本发明的方法可以获得胱氨酸到半胱氨酸的完全还原。发现胱氨酸的非酶促还原通常导致氧化型胱氨酸与还原型半胱氨酸之间的平衡，或者如果过量添加还原剂则实现完全还原，本发明的酶促还原使得反应能够在不过量加入介导剂和/或辅因子的情况下朝向100％半胱氨酸进行。因此，在一个优选的实施方式中，本发明是一种用于将胱氨酸酶促还原成半胱氨酸的方法，其中100％的胱氨酸被还原。有利地，在本发明方法中回收的半胱氨酸被认定是天然半胱氨酸，因为允许以使用微生物(诸如细菌和酵母)或分离的酶的酶促方法来生产天然调味成分。
如本发明上下文中所用，酶促还原意指通过在活性谷胱甘肽还原酶(EC1.8.1.7)存在下使胱氨酸与谷胱甘肽接触而使胱氨酸朝向半胱氨酸还原，其中活性谷胱甘肽还原酶(EC1.8.1.7)在谷胱甘肽氧化后还原谷胱甘肽。
如本发明上下文中所用，活性谷胱甘肽还原酶(EC1.8.1.7)意指该酶在其用于还原谷胱甘肽的功能方面具有活性。优选地，谷胱甘肽还原酶在使胱氨酸与还原溶液接触的步骤期间保持活性。更优选地，谷胱甘肽还原酶在使胱氨酸与还原溶液接触的整个步骤期间保持活性。
如本发明上下文中所用的辅因子旨在表示辅助硫醇还原酶的辅助分子。优选地，辅因子是辅酶。辅因子的合适示例是还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(也缩写为NADH)或还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(也缩写为NADPH)，或黄素腺嘌呤二核苷酸(也缩写为FADH2)。
如本发明上下文中所用，回收半胱氨酸意指从还原溶液中回收半胱氨酸。可以通过本领域已知的技术从还原溶液中回收半胱氨酸。可用于回收半胱氨酸的技术的合适示例可包括使用膜、结晶、色谱法，以及它们的组合。
在一个优选的实施方式中，在使胱氨酸与还原溶液接触的步骤后15小时内进行本发明的回收包含半胱氨酸的组合物的步骤。更优选地，在使胱氨酸与还原溶液接触的步骤后12小时内，更优选在9小时内，最优选在6小时或甚至3小时内进行本发明的回收包含半胱氨酸的组合物的步骤。更优选地，在使胱氨酸与还原溶液接触的步骤后0.5小时后进行本发明的回收包含半胱氨酸的组合物的步骤。
本发明的胱氨酸可以通过本领域已知的用于生产胱氨酸的方法提供。例如，本发明的胱氨酸可以通过发酵和生物催化来提供。可以使用重组微生物来进行发酵。可以通过使用来自重组微生物的酶进行生物催化。本发明的胱氨酸也可以纯的或稀释的形式提供为胱氨酸和半胱氨酸的混合物。
在一个优选的实施方式中，将本发明的谷胱甘肽以组合物形式加入到本发明的还原溶液中，该组合物包含基于组合物的干重超过1％(重量)，优选超过2％(重量)的谷胱甘肽，诸如大于优选5％、10％、20％或甚至50％。更优选地，本发明的谷胱甘肽是纯化的或分离的形式，即在包含超过90％(重量)的谷胱甘肽或超过95％(重量)的谷胱甘肽的组合物中。使用纯化形式的谷胱甘肽是有利的，因为这简化了用于回收半胱氨酸的下游加工。纯化形式或替代地分离形式的介导剂是指谷胱甘肽作为单独的试剂存在和/或加入到本发明的还原溶液中，例如不作为微生物或无细胞提取物中的化合物存在。
本发明的谷胱甘肽可以为氧化形式(也缩写为GSSG)或还原形式(也缩写为GSH)。谷胱甘肽是谷胱甘肽还原酶的合适介导剂。本发明的发明人发现，向包含谷胱甘肽还原酶的还原溶液中单独加入谷胱甘肽导致胱氨酸向半胱氨酸的增加或甚至完全的还原。此外，本发明人发现GSSG的酶促还原是用于提供GSH的有效方法，并有助于胱氨酸的完全还原。此外，GSSG的酶促还原通过降低生产成本而提供了改善的方法，因为GSH是昂贵的。
还原溶液中谷胱甘肽:胱氨酸的摩尔比优选小于1。优选地，谷胱甘肽:胱氨酸的摩尔比小于0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05或小于0.01。更优选地，谷胱甘肽:胱氨酸的摩尔比在0.01与0.7之间，诸如在0.02与0.6之间。优选地，本发明的谷胱甘肽与胱氨酸的摩尔比是还原溶液中存在的谷胱甘肽与胱氨酸的摩尔比。谷胱甘肽与胱氨酸的比率可以通过将还原溶液中存在的谷胱甘肽的摩尔量除以还原溶液中存在的胱氨酸的摩尔量来计算。本发明人发现向还原溶液中加入谷胱甘肽导致胱氨酸向半胱氨酸的还原增加。令人惊讶的是，少量的谷胱甘肽(诸如比胱氨酸更低量的谷胱甘肽)导致高的胱氨酸向半胱氨酸的还原。使用较少量的谷胱甘肽是有利的，因为这简化了用于提供半胱氨酸的下游加工。
在一个优选的实施方式中，将本发明的谷胱甘肽还原酶以纯化或分离的形式加入。使用纯化形式的谷胱甘肽还原酶是有利的，因为这简化了用于回收半胱氨酸的下游加工。或者，将谷胱甘肽还原酶固定在支撑物上。
在另一个优选的实施方式中，本发明的谷胱甘肽还原酶包含在微生物中。在一个更优选的实施方式中，本发明的谷胱甘肽还原酶包含在经透化的微生物中。更优选地，本发明的谷胱甘肽还原酶包含在源自微生物的无细胞提取物中。无细胞提取物包含在破碎细胞后获得的细胞的可溶性分子。优选地，本发明的无细胞提取物不包含细胞壁。优选地，本发明的无细胞提取物来源于真菌，诸如Penicillium、Trichoderma、Aspergillus或酵母。更优选地，无细胞提取物来源于Penicillium或属于Saccharomyces、Kluyveromyces或Candida属的酵母菌株。最优选地，无细胞提取物来源于Saccharomyces cerevisiae。合适的细菌微生物的属的示例是Clostridia、Escherichia和Archaea，诸如Methanobacterium和Methanosarcina。使用无细胞提取物是有利的，因为例如用于酶生产的真菌或细菌发酵或面包酵母(bakers’yeast)的现有大规模生产能力可以有效地用于提供无细胞提取物。此外，使用无细胞提取物来提供谷胱甘肽还原酶消除了使用纯化的谷胱甘肽还原酶的需要，纯化的谷胱甘肽还原酶是有费用支出的。使用无细胞提取物的另一个优点是无细胞提取物可含有一定量的谷胱甘肽和/或硫氧还蛋白(或其他类似分子)，该谷胱甘肽和/或硫氧还蛋白(或其他类似分子)在本发明的还原溶液中起(天然)介导剂的作用。使用无细胞提取物的内源性介导剂提供了用于胱氨酸还原的节约成本和材料的方法。
更优选地，无细胞提取物通过以下方式而从酵母中获得：对酵母细胞进行酶促、机械、化学或物理破坏，然后将可溶性级分与细胞壁分离以提供无细胞提取物。无细胞提取物优选通过匀化技术获得。匀化技术可包括用诸如沙子和/或玻璃珠的粒子研磨或混合。发现使用源自酵母的无细胞提取物是有利的，因为还原可以受益于整个酵母细胞氧化还原体系。在一个优选的实施方式中，透化细胞通过本领域中已知的方法而来源于细胞，所述方法为诸如但不限于冷冻和解冻循环、自溶、DMSO处理、乙醇或甲苯处理。优选地，在没有加热步骤的情况下获得无细胞提取物。更优选地，在没有使用使谷胱甘肽还原酶失活的温度的加热步骤的情况下获得无细胞提取物。使谷胱甘肽还原酶失活的温度的示例是高于40℃、高于45℃、高于50℃或甚至高于55℃。
在一个优选的实施方式中，本发明的还原溶液还包含(iv)辅因子再生体系。辅因子再生体系的使用提供了用于酶促还原胱氨酸的改善方法，因为在还原过程期间不需要用于添加辅因子的额外步骤。此外，使辅因子再生是成本有效的，因为需要较低量的辅因子来提供胱氨酸朝半胱氨酸的还原。优选地，辅因子再生体系包含酶和相应的底物。优选地，辅因子再生体系包含葡糖脱氢酶和葡萄糖和/或甲酸脱氢酶以及甲酸盐。发现甲酸脱氢酶特别适用于NADH的再生，而葡糖脱氢酶适合于NADPH和NADH两者的再生。本发明的辅因子再生体系中的替代酶是醇脱氢酶、NADP依赖性甲酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、H2驱动的NAD(P)+-还原氢化酶或亚磷酸脱氢酶。特别优选的是包含醇脱氢酶和醇的辅因子再生体系，更优选包含醇脱氢酶和异丙醇或醇脱氢酶和乙醇的辅因子再生体系。使用醇脱氢酶和作为底物的醇的优点在于，由醇脱氢酶形成的产物(诸如在使用异丙醇后形成的丙酮和使用乙醇后形成的乙醛)是挥发性的，因此它们可以容易地从本发明的还原溶液和/或包含半胱氨酸的溶液中去除。
在一个优选的实施方式中，本发明的还原溶液的温度在2℃至90℃的范围内，优选在使胱氨酸与还原溶液接触期间本发明的还原溶液的温度在2℃至90℃的范围内。优选地，温度在10℃至60℃的范围内。更优选地，还原溶液的温度在15℃至50℃的范围内。最优选地，还原溶液的温度在15℃至40℃的范围内，诸如20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃或39℃。
在一个优选的实施方式中，本发明的还原溶液的pH在pH 6至10的范围内，优选地在使胱氨酸与还原溶液接触期间本发明的还原溶液的pH在pH 6至10的范围内。优选地，pH在6.5至9的范围内。更优选地，还原溶液的pH在6.5至8.5或7.0至8.5的范围内，诸如pH7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3和8.4。本发明的发明人发现，使用在6至8.5范围内的pH获得了增强的胱氨酸还原。令人惊讶的是，在7至8.5范围内的pH下，获得了胱氨酸的甚至更高或甚至完全的还原。
在本发明的又一个优选实施方式中，加入到本发明的还原溶液中的本发明辅因子为氧化形式的，诸如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或氧化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。本发明人发现，在本发明方法中，可以通过使用氧化形式的辅因子来获得胱氨酸的还原。使用氧化形式的辅因子提供了改善的方法，因为氧化形式的辅因子易获得并因此节约成本。如果在本发明的还原溶液中存在辅因子再生体系，则使用氧化形式的辅因子避免了提前还原辅因子的额外步骤。因为氧化形式的辅因子将被辅因子再生体系还原。如果使用黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)依赖性酶体系，则可以将氧化的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD+)加入到本发明的还原溶液中。
在本发明方法的一个优选实施方式中，使本发明的胱氨酸与还原溶液接触一段时间，该段时间足以将超过50％、优选超过60％、更优选超过70％、甚至更优选超过80％，最优选超过90％或99％或甚至100％的胱氨酸还原成半胱氨酸。优选地，该时间段短于48小时，更优选短于24小时，甚至更优选短于12小时，最优选短于6小时或短于3小时。更优选的是1至3小时或1.5至2.5小时的时间段。本发明的发明人发现，本发明的方法是用于还原胱氨酸的节约时间的方法，即使当该方法在工业规模上进行时也如此。因此，本发明提供了用于还原胱氨酸的改善条件。
在一个优选的实施方式中，使胱氨酸与还原溶液接触在低需氧条件下或甚至更优选在厌氧条件下进行，以减少或防止将半胱氨酸再氧化成胱氨酸。因此，使用厌氧条件的优点是本发明的还原溶液中半胱氨酸的量增加。
在一个优选的实施方式中，本发明的方法在工业规模上进行。在本发明的整个说明书中，工业规模方法或工业方法可以理解为涵盖使用体积尺度为≥10L，优选≥100L，更优选≥1m3、≥5m3，甚至更优选≥10m3，最优选≥25m3，优选地小于250m3的还原溶液的方法。
在另一个优选的实施方式中，本发明的还原溶液含有少量，即低于5％(重量)或低于1％(重量)的能催化半胱氨酸再氧化成胱氨酸的化合物，或不含所述化合物。具有“吸附”电子倾向的此类化合物的示例是铁离子、硝酸根离子、铜离子。优点是本发明的还原溶液中半胱氨酸的量增加。
在另一个优选的实施方式中，本发明的还原溶液是水溶液。优选地，还原溶液或水溶液包含缓冲液。优选地，缓冲液是磷酸钠缓冲液。或者，缓冲液是三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液(或tris HCl缓冲液)或2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(缩写为MES缓冲液)。
在一个优选的实施方式中，本发明方法中回收的本发明的包含半胱氨酸的组合物包含半胱氨酸和一种或多种化合物，该一种或多种化合物在使胱氨酸与还原溶液接触期间存在于所述还原溶液中。优选地，在本发明方法中回收的本发明的包含半胱氨酸的组合物包含半胱氨酸以及选自葡糖酸、葡糖酸盐、甲酸、葡萄糖、甲酸盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、谷胱甘肽、丙酮、乙醛和谷胱甘肽还原酶中的一者或多者。本发明的还原溶液包含若干成分，诸如谷胱甘肽、辅因子和硫醇还原酶。本发明的包含半胱氨酸的组合物的回收可包含还原溶液中存在的成分中的一种或多种成分。
鉴于本发明方法提供的半胱氨酸可以有利地被认定是天然的，根据另一个方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包含半胱氨酸或L-半胱氨酸，以及选自葡糖酸、葡糖酸盐、甲酸、葡萄糖、甲酸盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、谷胱甘肽(GSH或GSSG)和谷胱甘肽还原酶中的一者或多者。优选地，本发明的组合物可通过本发明的用于将胱氨酸酶促还原成半胱氨酸的方法获得。更优选地，本发明的组合物是通过本发明方法获得的。
优选地，在本发明方法中回收的本发明组合物或本发明的包含半胱氨酸的组合物包含半胱氨酸和/或至少1ppm、至少10ppm或至少100ppm的选自葡糖酸、葡糖酸盐、甲酸、葡萄糖、甲酸盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、谷胱甘肽丙酮、乙醛、谷胱甘肽(GSH或GSSG)和谷胱甘肽还原酶中的一者或多者。
优选地，在本发明方法中回收的本发明组合物或本发明的包含半胱氨酸的组合物包含半胱氨酸和/或至少1ppb、至少10ppb或至少100ppb的选自葡糖酸、葡糖酸盐、甲酸、葡萄糖、甲酸盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、谷胱甘肽丙酮、乙醛、谷胱甘肽(GSH或GSSG)和谷胱甘肽还原酶中的一者或多者。
更优选地，在本发明方法中回收的本发明组合物或本发明的包含半胱氨酸的组合物包含半胱氨酸和至多1ppm、至多10ppm或至多100ppm的选自葡糖酸、葡糖酸盐、甲酸、葡萄糖、甲酸盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、谷胱甘肽丙酮、乙醛、谷胱甘肽(GSH或GSSG)和谷胱甘肽还原酶中的一者或多者。
更优选地，在本发明方法中回收的本发明组合物或本发明的包含半胱氨酸的组合物包含半胱氨酸和至多1ppb、至多10ppb或至多100ppb的选自葡糖酸、葡糖酸盐、甲酸、葡萄糖、甲酸盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、谷胱甘肽丙酮、乙醛、谷胱甘肽(GSH或GSSG)和谷胱甘肽还原酶中的一者或多者。
最优选地，在本发明方法中回收的本发明组合物或本发明的包含半胱氨酸的组合物包含半胱氨酸和葡糖酸，半胱氨酸和甲酸，或半胱氨酸和谷胱甘肽(GSH或GSSG)。
本发明组合物的优点在于其实质上包含通过本发明的半胱氨酸酶促还原而获得的半胱氨酸，因此被认为是天然半胱氨酸。因此，本发明的组合物可有利地用作天然食品调味剂，或用作用于食品生产或食品调味剂生产的天然成分。
附图说明
图1：在具有不同谷胱甘肽浓度和作为辅因子的NADH的几种反应设置中，被还原的L-胱氨酸的百分比。
图2：在具有不同谷胱甘肽浓度和作为辅因子的NADPH的几种反应设置中，被还原的L-胱氨酸的百分比。
图3：酵母谷胱甘肽还原酶的pH活性曲线。将活性根据不同酸度下的NADPH背景转化进行校正，并且关于在pH 5与10之间观察到的最高活性进行表示。
图4：在不同的处理条件下使用酵母GR随时间推移形成半胱氨酸。
图5：在55℃温育之前和之后的谷胱甘肽还原酶活性。
材料和方法
1.材料
在实施例中使用了以下材料。
L-胱氨酸，Sigma-aldrich，C7602-25G
来自面包酵母(S.cerevisiae)的谷胱甘肽还原酶，Sigma-aldrich，G3664-2.5KU
被还原的L-谷胱甘肽，Sigma-aldrich，G4251-100G
被氧化的L-谷胱甘肽，Sigma-aldrich，G4376-10G
来自Escherichia coli的硫氧还蛋白还原酶，Sigma-aldrich，T7915-250UG
来自Escherichia coli的硫氧还蛋白，Sigma-aldrich，T-0910-1MG
B-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原四(环己基铵)盐，Sigma-aldrich，N5130-25MG
还原B-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐水合物，Sigma-aldrich，N8129-50MG
B-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸水合物，Sigma-aldrich，N5755-110MG
B-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物，Sigma-aldrich，N1636-100MG
来自Pseudomonas sp.的葡糖脱氢酶，Sigma-aldrich，19359-10MG-F
来自Candida boidinii的甲酸脱氢酶，Sigma-aldrich，F8649-50UN
无水D(+)-葡萄糖，Merck，CAS 50-99-7，Calbiochem
甲酸钠，Sigma-aldrich，71539-500G
二水合磷酸氢二钠，Merck，CAS号10028-24-7
一水合磷酸二氢钠，Merck,CAS号10049-21-5
2.反应
本发明的实施例的反应在还原溶液中进行，该还原溶液是磷酸钠缓冲液。首先，通过在室温下在磷酸钠缓冲液(pH 6.0或pH 8.0)中搅拌>500mg/L的L-胱氨酸1小时，来制备饱和L-胱氨酸溶液。此外，加入附加的任选成分，诸如硫醇还原酶、介导剂、辅因子和辅因子再生体系。在室温(20-25℃)下进行反应2小时。通过加入包含40g/l的苹果酸、100mg/l的1.1-二氟-1-三甲基硅烷基甲基膦酸(FSP)，pH为6.4的用50％NaOH的氧化氘溶液并温育1小时来终止反应。
3.NMR分析
通过NMR分析所获得的包含L-半胱氨酸的还原溶液的L-胱氨酸和游离硫醇基。在配备有氦冷冷冻探针的700MHz光谱仪上，在3mm NMR管中测量样品。施加NOESYGPPR1d.COMP水抑制。使用1.2秒的驰豫延迟获取32次扫描。根据相对于0ppm处的FSP峰面积的峰积分来对组分进行定量：
D 5.04ppm：葡萄糖
Dd 3.18ppm：胱氨酸
Dd 3.09ppm：GSSG
M 2.24ppm：总SH。
4.胱氨酸还原％
通过从反应开始时的胱氨酸量中减去反应结束时的胱氨酸量，并将该数除以反应开始时的胱氨酸量，乘以100，来计算胱氨酸还原百分比(％)。
实施例
实施例1
比率的介导剂：L-胱氨酸
将175μl的L-胱氨酸溶液(pH 8.0)移液至96孔板中。将5μl以下物质加入以达到200μl的最终反应体积：谷胱甘肽还原酶(17U/ml)；NADH或NADPH(1.0和0.28mM)；葡糖脱氢酶(3.4U/ml)和D-葡萄糖(2mM)；如果适用的话，Milli-QTM水。最后，加入5μl不同的谷胱甘肽浓度(参见图1和图2)以达到200μl的最终反应体积。反应中的最终L-胱氨酸浓度为0.85mM最终反应。如材料和方法中所述进行反应，并通过NMR分析L-胱氨酸和游离硫醇基。
图1示出了在不同谷胱甘肽浓度下还原的L-半胱氨酸的百分比。具体地，图1示出只有当存在的GSH比L-胱氨酸多得多时，第一系列中仅使用GSH和NADH的非酶促还原才提供高于90％的还原。令人惊讶的是，在加入谷胱甘肽还原酶后，在较低的GSH:L-胱氨酸比率下获得了增强的还原。
此外，图1示出，在辅因子再生体系(如葡糖脱氢酶和D-葡萄糖)的存在下，甚至需要更低量的介导剂来提供高于90％的还原，令人惊讶地能够显著降低GSH:L-胱氨酸的比率。此外，与没有辅因子再生体系相比，加入的辅因子再生体系能够在低得多的辅因子NADH浓度下以高于90％的还原率来还原胱氨酸(因为0.28mM的NADH导致与使用过量的1.0mMNADH时相同的朝向L-半胱氨酸的还原)。
类似于图1，图2公开了使用NADPH作为辅因子可以获得高于90％的L-胱氨酸朝向L-半胱氨酸的还原，即使谷胱甘肽:L-胱氨酸的比率小于1也如此。在此，与没有辅因子再生体系相比，加入辅因子再生体系不仅能够在低得多的辅因子NADPH浓度下以高于90％的还原来还原胱氨酸(因为0.28mM的NADPH导致与使用过量的1.0mM NADPH时相同的朝向L-半胱氨酸的还原)，还令人惊讶地允许更进一步降低GSH:L-胱氨酸的比率。
总之，图1和图2公开了本发明提供用于还原L-胱氨酸的改良方法的可行性。
实施例2
使用无细胞提取物(缩写为CFE)进行还原
CFE制备
用Milli-QTM水洗涤酵母(Saccharomyces cerevisiae)和真菌(Penicilliumchrysogenum)细胞培养物，悬浮于100mM Tris-HCL缓冲液(pH 7.5)中，并储存在冰上。将细胞转移到含有0.5g的0.45-0.5mm玻璃珠粒的2.0ml小瓶中，并在Precellys匀浆器上以5000rpm充分振荡40秒三次，在各次振荡之间将小瓶在冰上冷却。将提取物离心两次，同时在每次离心步骤后将上清液转移到新试管中。根据Biuret方法测定无细胞提取物(CFE)的总蛋白质含量。将样品储存在-20℃直至进一步使用。
测定：
将185μl的L-胱氨酸溶液(pH 6.0或8.0)移液至96孔板中。将5μl的以下物质加入以达到200μl的最终反应体积：酵母(1mg/ml)或真菌(0.5mg/ml)CFE；介导剂L-谷胱甘肽(100μg/ml)；NADH(700μg/ml)或NADPH(800μg/ml)；如果适用的话，Milli-QTM水。在最终反应中，L-胱氨酸浓度在pH 6.0时为0.63mM，并且在pH 8.0时为0.78mM。如材料和方法中所述进行反应(参见表2)，并通过NMR分析L-胱氨酸和游离硫醇基。
表2：使用CFE的L-胱氨酸还原反应和还原百分比的总述
表2清楚地表明，在pH 8时，L-胱氨酸的还原增长。此外，从表2中可以清楚地看出，S.cerevisiae和Penicillium chr.的CFE能够提供L-胱氨酸的还原。
实施例3
辅因子再生
将175μl的L-胱氨酸(pH 8.0)移液至96孔板中。将5μl的以下物质加入以达到200μl的最终反应体积：谷胱甘肽还原酶(17U/ml)或酵母CFE(1mg/ml)；介导剂L-谷胱甘肽(100μg/ml)；NADH或NADPH(200和350μg/ml)；葡糖脱氢酶(GDH)或甲酸脱氢酶(FDH)(均为3.4U/ml)；D-葡萄糖或甲酸钠(均为1mM)；如果适用的话，Milli-QTM水。在纯化的酶和CFE反应中，L-胱氨酸浓度分别为0.80mM和0.52mM。如材料和方法中所述进行反应(参见表3)，并通过NMR分析L-胱氨酸和游离硫醇基。
表3：用纯化的酶或CFE进行辅因子再生的反应设置和还原的L-胱氨酸的百分比。
表3清楚地显示，通过使用辅因子再生体系，获得了胱氨酸的还原，同时仅使用有限量的辅因子NADH或NADPH(200μg/ml和350μg/ml，而在实施例1和实施例3中分别使用700μg/ml和800μg/ml)。此外，表3显示通过使用无细胞提取物与辅因子再生的组合，获得了100％的胱氨酸还原。
实施例4
氧化的辅因子
将175μl的L-胱氨酸溶液(pH 8.0)移液至96孔板中。将5μl的以下物质加入以达到200μl的最终反应体积：谷胱甘肽还原酶(17U/ml)；介导剂L-谷胱甘肽(1mM)；NADH、NAD+、NADPH或NADP+(均为1mM)；葡糖脱氢酶(3.4U/ml)和D-葡萄糖(2mM)；如果适用的话，Milli-QTM水。最终反应中的L-胱氨酸浓度为0.96mM。
如材料和方法中所述进行反应(参见表4)，并通过NMR分析L-胱氨酸和游离硫醇基。
表4：使用还原的和氧化的辅因子的反应和还原的L-胱氨酸的百分比。
表4显示了使用氧化形式的辅因子导致100％的胱氨酸还原。
实施例5
酵母谷胱甘肽还原酶的pH依赖性活性
通过在0.1M磷酸盐缓冲液中测定在pH 5与10之间的每个pH单位处的活性，来获得酵母谷胱甘肽还原酶(GR)的pH曲线。在每个pH下包括没有GR酶的空白。pH 5-9的缓冲液是0.1M Na2HPO4溶液与0.1M NaH2PO4溶液的混合缓冲液。达到pH 10的缓冲液需要加入氢氧化钠。在milliQ水中制备50mM的NADPH储备液，加入氢氧化钠将pH调节至pH8，其中NADPH为可溶且稳定的。针对每个pH单独制备GSSG溶液(20mM＝在15mL Greiner管中61.3mg/5mL缓冲液)。首先将酶在水中稀释20倍，然后在不同pH设定点的缓冲液中稀释100倍。在开始测定之前不久，将NADPH储备溶液在所需缓冲液中稀释25倍，以在加入酶之前使NADPH的背景转化最小化。该测定如下执行：100微升GSSG溶液pH X+50微升NADPH溶液pH X+50微升稀释酶pH X。随后，在所需pH下进行对340nm处的每分钟吸光度降低的动力学读数。根据相同pH下空白反应的斜率来校正反应的斜率(Δ340nm/min)，并且将活性关于酶的最高测量活性进行表示。相对活性如图3所示。
实施例6
在不同处理条件下在酶存在下的胱氨酸还原。
在存在氧化型谷胱甘肽作为介导剂和NADP+作为辅因子的情况下，使用酵母谷胱甘肽还原酶(sigma)和葡糖脱氢酶以使NAPPH在反应中再生，从而将胱氨酸还原为半胱氨酸。反应示意如下：
反应1：CYS–CYS+2GSH→2CYS+GSSG
反应2：GSSG+NADPH→2GSH+NADP+H
反应3：葡萄糖+NADP→葡萄糖酸+NADPH
在具有温度和pH控制的200ml夹套容器中执行酶促转化。总工作体积为100ml。在两个容器中执行反应。两个容器均含有酵母GR(Sigma)和葡糖脱氢酶(GDH 105，Codexis)。按照条件如下表5所示的两种不同的过程来执行反应。
表5：在使用酵母GR和GDH酶(100mL)还原胱氨酸过程中施加的组分的量和工艺条件
在t＝0小时(加入酶之前)、0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时和6小时处进行取样。将200μl样品以13.000RPM离心1分钟，并将100μl上清液转移至900μl的0.111NHCL(最终浓度为0.1N HCL)中，混合并在-20℃下储存。通过LCMS-MS方法分析所有样品，以测量L-胱氨酸、L-半胱氨酸、GSH、GSSG和这些组分的组合。随时间推移的半胱氨酸形成示出于图4中。
容器2中的半胱氨酸水平不随时间推移增加，表明酵母谷胱甘肽还原酶在51℃和pH 5.1的施加条件下没有活性。该反应中半胱氨酸的初始增加是使用GSH进行非酶促还原的结果，并且不会进一步增加，因为谷胱甘肽还原酶不具有活性并且因此无法还原被氧化的谷胱甘肽。
实施例7
谷胱甘肽还原酶在55℃温度下的稳定性
为了研究谷胱甘肽还原酶的热稳定性，将1.5ml酶储备溶液在55℃温育。在温育15分钟、30分钟、60分钟、120分钟和240分钟后，将250μl转移到新试管中并储存在冰水中。在不进行附加温育的情况下，将未温育的储备溶液(约3.5ml)直接置于冰水上。
执行以下反应：
NADPH+GR+GSSG→NADP++GR+2GSH
在反应混合物中，加入50μl Tris-HCL缓冲液(pH 8.0)、50μl NADPH、50μl谷胱甘肽还原酶(GR)和50μl被氧化的谷胱甘肽。使用未经温育或热处理的样品来作为谷胱甘肽还原酶。在平坦、透明的底部MTP96板中以200μl的总体积进行反应。在室温下进行反应。将除谷胱甘肽外的所有组分进行混合。为了同时开始反应，在就要将MTP96板放入μquant分光光度计之前加入这些底物。在340nm处每分钟测量吸光度，持续两个小时。
图5示出了在较高温度下温育后随时间推移的吸光度结果。15分钟后活性已经下降，并且在55℃温育30分钟和60分钟后没有测量到活性。
实施例8
在存在和不存在蛋白酶的情况下酵母谷胱甘肽还原酶的热稳定性
将20个单位的酵母谷胱甘肽还原酶(Sigma)加入10ml缓冲液(0.5M Tris HCL缓冲液)中，并在有和没有蛋白酶的情况下，在水浴中于51℃和pH 5.1下温育18个小时。在该实验中施加的蛋白酶是剂量为0.0068mg的碱性蛋白酶(Alcalase)(Novozyme)，该剂量以溶液的干物质克数计。通过分光光度计，使用已开发的测定来测量在两种溶液中温育后的酶活性。
表6：在使用和不使用碱性蛋白酶的情况下，在温育之前和之后缓冲溶液中的GR活性
样品 之前(t＝0) 之后(t＝18h)
在没有碱性蛋白酶情况下的酵母GR 2U/ml 0.010U/ml
酵母GR与碱性蛋白酶 2U/ml 0.015
结果表明，酵母GR酶不是热稳定的，并且在51摄氏度和pH 5.1温育18小时后活性丧失。
用于谷胱甘肽还原酶活性测量的测定
用于测量GR活性的测定基于以下反应：
GR+GSSG+NADPH→GR+2GSH+NADP+
其中GSSG＝氧化的L-谷胱甘肽，并且GSH＝还原的L-谷胱甘肽。
所施加的材料是：
谷胱甘肽还原酶测定溶液：
20mM NADPH(CAS号：2646-71-1)在mili-Q(mQ)中
20mM GSSG(CAS号：27025-41-8)在mQ中
200mM Tris-HCl(pH 7.5，在DSM MBK中获得)
为了制备45ml的储备溶液(50个样品)：在临测定之前，将17ml mQ、22.5ml 200mMTris-HCl(pH 7.5)、500μl 20mM NADPH、5ml 20mM GSSG进行混合。
方法：
使用空气将分光光度计(类型：Genetics中的2000和ABC lab 1128中的Jasco V-630)校准至0.000。在没有样品的情况下测量测定储备液的吸光度。将分析结果用作阴性对照，将酶溶液在100mM Tris-HCl(pH 7.5)中稀释。将100μl稀释的样品加入到比色皿中的900μl测定储备溶液中，并用移液管充分混合。将该比色皿置于分光光度计中，并在时间零(t＝0)和1分钟(t＝1)后记录溶液的吸光度。
计算：
通过以下公式来确定酶活性：
其中：
Df＝稀释因子
ΔA＝每分钟(min-1)的吸光度增加/减少
Av＝以ml计的测定体积(1ml)
d＝以cm计的光程长度(对于比色皿，光程长度为1cm)
e＝NADPH的摩尔消光系数，其为6.22M-1cm-1
Sv＝以ml计的样品体积(0.1ml)。

Claims (14)

1.一种用于将胱氨酸酶促还原为半胱氨酸的方法，所述方法包括使胱氨酸与还原溶液接触，所述还原溶液包含：
(i)活性谷胱甘肽还原酶(EC1.8.1.7)；
(ii)辅因子；以及
(iii)谷胱甘肽；
以及回收包含半胱氨酸的组合物，
其中所述还原溶液在与胱氨酸接触期间的pH为至少6。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述使胱氨酸与还原溶液接触的步骤后15小时内进行所述回收包含半胱氨酸的组合物的步骤。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述辅因子为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)优选为氧化形式(NADP+)，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)优选为氧化形式(NAD+)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述谷胱甘肽还原酶包含在透化的微生物中。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述谷胱甘肽还原酶包含在无细胞提取物中，优选地其中所述无细胞提取物通过以下方式从酵母或真菌获得：对酵母或真菌细胞进行酶促、机械或化学破坏，然后将可溶性级分与细胞壁分离以提供所述无细胞提取物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述还原溶液还包含：
(iv)辅因子再生体系，所述辅因子再生体系包含葡糖脱氢酶和葡萄糖，或甲酸脱氢酶和甲酸盐。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述还原溶液中的谷胱甘肽:胱氨酸的摩尔比小于0.1。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述还原溶液的pH范围为7.0至8.5。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中使所述胱氨酸与所述还原溶液接触足以将超过50％的胱氨酸还原为半胱氨酸的时间。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在厌氧条件下进行使所述胱氨酸与所述还原溶液的接触。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述包含半胱氨酸的组合物包含半胱氨酸以及选自以下的一者或多者：葡糖酸、甲酸、葡萄糖、甲酸盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、谷胱甘肽和谷胱甘肽还原酶。
12.一种组合物，所述组合物包含半胱氨酸以及选自以下的一者或多者：葡糖酸、甲酸、葡萄糖、甲酸盐、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、谷胱甘肽、丙酮、乙醛和谷胱甘肽还原酶。
13.权利要求12中所限定的组合物作为天然食品调味剂的用途。
14.一种还原溶液，所述还原溶液包含：
(i)活性谷胱甘肽还原酶(EC1.8.1.7)；
(ii)辅因子；以及
(iii)谷胱甘肽。
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