JP2023540374A - 新規なｏ－ホスホセリン排出タンパク質及びそれを用いたｏ－ホスホセリン、システイン及びその誘導体の生産方法 - Google Patents
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Abstract
本出願は、新規なＯ－ホスホセリン排出タンパク質及びそれを用いたＯ－ホスホセリン、システイン及びシステインの誘導体の生産方法に関する。
Description
本出願は、新規なＯ－ホスホセリン排出タンパク質及びそれを用いたＯ－ホスホセリン、システイン及びシステインの誘導体の生産方法に関する。
Ｌ－システインは、全ての生物体の硫黄代謝において重要なアミノ酸であり、毛髪のケラチンなど、生体内タンパク質、グルタチオン、ビオチン、メチオニン及びその他、硫黄を含有した代謝産物の合成に用いられるだけでなく、コエンザイムＡ生合成の前駆物質として用いられる。
微生物を用いてＬ－システインを生産する方法として、１）微生物を用いてＤ，Ｌ－ＡＴＣ（Ｄ，Ｌ－２－ａｍｉｎｏ－２－ｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－４－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）を生物学的に転換する方法、２）大腸菌を用いてＬ－システインを生産する直接醗酵方法（欧州登録特許 ＥＰ０８８５９６２Ｂ； Ｗａｄａ Ｍ ａｎｄＴａｋａｇｉ Ｈ ， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ７３：４８－５４， ２００６）、３）微生物を用いてＯ－ホスホセリン（Ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ、以下「ＯＰＳ」）を醗酵生産した後、Ｏ－ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（Ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌａｓｅ、以下「ＯＰＳＳ」）の触媒作用の下に硫化物と反応してＬ－システインに転換させる方法（欧州公開特許ＥＰ ２４４４４８１）などが知られている。
この時、上記３）方法で高収率のシステインを生産するために前駆体であるＯＰＳを過量生産しなければならない必要が存在した。
Ｗａｄａ Ｍ ａｎｄＴａｋａｇｉ Ｈ ， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ７３：４８－５４， ２００６
Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８）［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］： ２４４４
Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６： ２７６－２７７
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３
Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２： ３８７ （１９８４）
Ａｔｓｃｈｕｌ， ［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ， Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］： ４０３ （１９９０
Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ， Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ， ［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４
［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８： １０７３
Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ （１９８１） ２：４８２
Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ．， Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ． ３５３－３５８ （１９７９）
Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ６７４５
Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１０， Ｖｏｌ． ２． １－１６，
Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２
Ａｈｍｅｄ Ｚａｈｏｏｒ， Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｊｏｕｒｎａｌ， ｖｏｌ ３， ２０１２ Ｏｃｔｏｂｅｒ
Ｗｅｎｄｉｓｃｈ Ｖ Ｆ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００６ Ｊｕｎ；９（３）：２６８－７４
Ｐｅｔｅｒｓ－Ｗｅｎｄｉｓｃｈ Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００５ Ｎｏｖ；７ １（ ｌ ｌ）：７ １３９－４４．
Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２０１４；１５（２）：２７７３－２７９３
Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｖｉｅｗｓ －Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖｏｌ． １（１） １９８６
Ｇｒａｎｔ ＧＡ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ３９： ５３５７－５３６１， １９９９
Ｇｒａｎｔ ＧＡ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３９： ７３１６－７３１９， ２０００
Ｇｒａｎｔ ＧＡ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６：１７８４４－１７８５０， ２００１
Ｐｅｔｅｒｓ－Ｗｅｎｄｉｓｃｈ Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬ， ６０：３７－４４１， ２００２
Ｍｉｎｏ Ｋ ａｎｄ Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｋ， ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ， ５５１：１３３－１３８， ２００３
Ｂｕｍｓ Ｋ Ｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， １２７： １１６０２－１１６０３， ２００５
ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ． １９９９
本発明者らは、ＯＰＳ生産菌株で生産されたＯ－ホスホセリンが細胞外に円滑に排出させる適切な排出因子を究明し、ＯＰＳの生産を増加させるために、鋭意努力した結果、新規なＯＰＳ排出タンパク質を発掘することにより本出願を完成した。
本出願の一つの目的は、ｍｄｔＨタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化された、Ｏ－ホスホセリン生産組換え微生物を提供することにある。
本出願のもう一つの目的は、本出願のＯ－ホスホセリン生産組換え微生物を用いたＯ－ホスホセリンの生産方法を提供することにある。
本出願のもう一つの目的は、本出願のＯ－ホスホセリン生産組換え微生物を用いたシステインまたはその誘導体の生産方法を提供することにある。
本出願のもう一つの目的は、本出願のＯ－ホスホセリン生産組換え微生物を用いたＯ－ホスホセリンの生産方法を提供することにある。
本出願のもう一つの目的は、本出願のＯ－ホスホセリン生産組換え微生物を用いたシステインまたはその誘導体の生産方法を提供することにある。
本出願のｍｄｔＨタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化されたＯ－ホスホセリン生産組換え微生物を用い、Ｏ－ホスホセリンを生産する場合、既存の非変形菌株を用いる場合に比べて高収率のＯ－ホスホセリン生産が可能である。
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用され得る。即ち、本出願で開示された多様な要素の全ての組合わせが本出願の範疇に属する。また、下記の具体的な記述により本出願の範疇が制限されるとは見られない。また、当該技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定様態に対する多数の等価物を認知または確認することができる。また、このような等価物は、本出願に含まれることが意図される。
上記目的を達成するための本出願の一つの様態として、本出願は、ｍｄｔＨタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化された、Ｏ－ホスホセリン生産組換え微生物を提供する。
本出願において用語、「Ｏ－ホスホセリン（Ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ，ＯＰＳ）」は、セリンのリン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）エステルであり、種々のタンパク質の構成要素である。上記ＯＰＳは、Ｌ－システインの前駆体であり、ＯＰＳスルフヒドリラーゼ（ＯＰＳ ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌａｓｅ，ＯＰＳＳ）の触媒の作用の下に硫化物と反応してシステインに転換されてもよいが、これに制限されない（欧州公開特許ＥＰ ２４４４４８１）。
具体的には、本出願の組換え微生物は、Ｏ－ホスホセリン排出活性が内在的活性に比べて強化されてもよい。本出願のｍｄｔＨタンパク質は、Ｏ－ホスホセリンを細胞外に排出できる活性を有することができ、このような活性は、本出願で初めて究明した。
一例として、本出願のｍｄｔＨタンパク質は膜タンパク質であってもよく、本出願のｍｄｔＨタンパク質は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来であってもよい。
また、本出願のｍｄｔＨタンパク質は、ＭＦＳ（ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属するトランスポータであってもよい。
具体的には、本出願のｍｄｔＨタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列またはＯ－ホスホセリン排出活性を有しながら上記配列番号１と９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。例えば、上記配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質は、上記配列番号１のアミノ酸配列を含むｍｄｔＨタンパク質と同一または対応するＯＰＳ排出活性を示すタンパク質であれば、制限なく含まれる。
より具体的には、上記配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列は、上記配列番号１のアミノ酸配列と９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上または９９．７５％以上、及び１００％未満の同一性を有する配列であってもよい。
また、本出願のｍｄｔＨタンパク質は、上記配列番号１のアミノ酸配列または上記配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列で一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたタンパク質変異体も実質的にＯ－ホスホセリン排出活性を有する限り、本出願の範囲内に含まれ得る。
また、本出願のｍｄｔＨタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列またはＯ－ホスホセリン排出活性を有しながら上記配列番号１と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列の前後への無意味な配列の追加または自然に発生し得る突然変異、またはこのサイレント突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含み得ることは、当業者に自明であってもよい。
本出願において、用語「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列相互間の類似度を意味し、百分率で表すことができる。用語の相同性及び同一性はしばしば互換的に使用することができる。
保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準的な配列アルゴリズムにより決定され、使用されるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に使用されてもよい。実質的に、相同性を有したり（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、一般に、配列の全部または一部と中程度または高いストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）でハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドにおける一般のコドンまたはコドン縮退性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることが自明である。
任意の２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） ［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］： ２４４４でのようなデフォルトパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを使用して決定されてもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ： Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ， Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６： ２７６－２７７）（バージョン５．０．０または以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３）を使用して決定されてもよい（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２： ３８７ （１９８４））， ＢＬＡＳＴＰ， ＢＬＡＳＴＮ， ＦＡＳＴＡ （Ａｔｓｃｈｕｌ， ［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ， Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］： ４０３ （１９９０）； Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ， Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ， ［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４，及び［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴ ＡＬ．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８： １０７３を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴまたはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定することができる。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ （１９８１） ２：４８２において公知となっているように、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９７０）， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定されてもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列中、より短いものにおける記号の総数であり、類似の配列された記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を除した値と定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）二進法比較マトリックス（同一性のために１、そして非－同一性のために０の値を含む）、及びＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ．， Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ． ３５３－３５８ （１９７９）により開示されているように、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ６７４５の加重比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップにおいて各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；（３）末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。
本出願において、用語「Ｏ－ホスホセリン（ＯＰＳ）生産組換え微生物」は、自然的に弱いＯＰＳ生産能を有している微生物あるいはＯＰＳ生産能がない親株に自然的または人為的に遺伝的変形が起きてＯＰＳ生産能が付与された微生物を意味する。本出願において上記「ＯＰＳ生産組換え微生物」は、「ＯＰＳ生産能を有する微生物」と混用され得る。
本出願の目的上、上記ＯＰＳ生産微生物の場合、ｍｄｔＨタンパク質の活性が強化されることにより、ＯＰＳの生産量が野生型または変形前の微生物に比べて増加したものであってもよい。これは、野生型または変形前の微生物がＯＰＳを生産できなかったり、ＯＰＳを生産しても極微量を生産できるのに対し、本出願の微生物は、ｍｄｔＨタンパク質の活性を強化することによりＯＰＳ生産能を増加させ得ることに意味がある。
本出願において、用語ポリペプチド活性の「強化」とは、ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて増加することを意味する。前記強化は、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、上方制御（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）などの用語と混用され得る。ここで、活性化、強化、上方制御、過剰発現、増加は、本来有していなかった活性を示すこと、または内在的活性または変形前の活性に比べて向上した活性を示すようになることを全て含むことができる。前記「内在的活性」とは、天然または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化した場合、形質転換前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が、内在的活性に比べて「強化」、「上方制御」、「過剰発現」または「増加」するとは、形質転換前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性及び／または濃度（発現量）に比べて向上したことを意味する。
前記強化は、外来のポリペプチドを導入するか、または内在的なポリペプチドの活性強化及び／または濃度（発現量）を通じて達成することができる。前記ポリペプチドの活性の強化有無は、当該ポリペプチドの活性度、発現量または当該ポリペプチドから排出される産物の量の増加から確認することができる。
前記ポリペプチドの活性の強化は、当技術分野においてよく知られた様々な方法の適用が可能であり、目的のポリペプチドの活性を改変前の微生物より強化させることができる限り、限定されない。具体的には、分子生物学の日常的な方法である当業者の通常の技術者によく知られた遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を利用したものであってもよいが、これに限定されない（例えば、Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１０， Ｖｏｌ． ２． １－１６， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。
具体的には、本出願のポリペプチドの強化は、
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性の強力な配列で交換；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化するように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化するように変形されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはそれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選別して変形するか、または化学的に修飾；または
９）前記１）～８）から選択される２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性の強力な配列で交換；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化するように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化するように変形されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはそれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選別して変形するか、または化学的に修飾；または
９）前記１）～８）から選択される２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
より具体的には、
前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製して機能し得るベクターの宿主細胞内への導入により達成されることであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。前記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行うことができるが、これらに限定されない。前記ベクターは、前述の通りである。
前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製して機能し得るベクターの宿主細胞内への導入により達成されることであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。前記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行うことができるが、これらに限定されない。前記ベクターは、前述の通りである。
前記２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域（または発現調節配列）を活性の強力な配列での交換は、例えば、前記発現調節領域の活性をさらに強化するように欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはそれらの組合せにより配列上の変異の発生、またはより強い活性を有する配列への交換であってもよい。前記発現調節領域は、特にこれに限定されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。一例として、本来のプロモーターを強力なプロモーターと交換させることであってもよいが、これらに限定されない。
公知の強力なプロモーターの例としては、ｃｊ１～ｃｊ７プロモーター（米国特許ＵＳ ７６６２９４３ Ｂ２）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（米国登録特許ＵＳ １０５８４３３８ Ｂ２）、Ｏ２プロモーター（米国登録特許ＵＳ １０２７３４９１ Ｂ２）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどがあるが、これらに限定されない。
前記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がより高い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換することであってもよいが、これらに限定されない。
前記４）及び５）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を強化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせにより配列上の変異の発生、またはより強い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列または活性が増加するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記交換は、具体的には、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行うことができるが、これらに限定されない。このときに使用されるベクターは、染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは前述した通りである。
前記６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドの導入は、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドの宿主細胞内の導入であってもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限はない。前記導入に用いられる方法は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選別して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることによりポリペプチドが生成し、その活性が増加され得る。
前記７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化は、内在ポリヌクレオチドが宿主細胞内で転写または翻訳が増加するようにコドン最適化したものであるか、または外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるようにそのコドンを最適化したものであってもよい。
前記８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形または化学的に修飾することは、例えば、分析しようとするポリペプチドの配列情報を既知のタンパク質の配列情報が格納されたデータベースと比較することにより、配列の類似性の程度にしたがって、鋳型タンパク質候補を決定し、それに基づいて構造を確認し、変形または化学的に修飾する露出部位を選択して変形または修飾することであってもよい。
このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性または濃度発現量が野生型や変形前の微生物菌株で発現されたポリペプチドの活性または濃度を基準として増加したり、当該ポリペプチドから生産される産物の量が増加するものであってもよいが、これに制限されるものではない。
本出願において用語、「ベクター」は適切な宿主内で目的のポリペプチドを発現させるように、適切な発現調節領域（または発現調節配列）に作用可能に連結された前記目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ調製物を含んでもよい。前記発現調節領域は、転写を開始するプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノム自体に統合されてもよい。
本出願で使用されるベクターは特に限定されず、当技術分野で知られている任意のベクターを使用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを挙げることができる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしてｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
一例として、細胞内における染色体挿入用ベクターを通じて目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られている任意の方法、例えば、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により行われてもよいが、これに限定されない。前記染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、即ち、目的核酸分子の挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが使用されてもよい。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみが生存するか、または他の発現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
本出願における用語「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞または微生物内に導入し、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現できる限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、または染色体外に位置するかに関係なく、それらの全部を含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、如何なる形態でも導入されてもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体で発現されるのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位、及び翻訳終結信号を含んでもよい。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに制限されない。
また、前記において用語「作動可能に連結」されたとは、本出願の目的変異体をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。
具体的には、本出願の組換え微生物は、上記ｍｄｔＨタンパク質をコードする遺伝子／ポリヌクレオチドが導入された微生物、上記ｍｄｔＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数が増加した微生物、上記ｍｄｔＨタンパク質コードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された微生物、上記ｍｄｔＨタンパク質をコードする染色体上の遺伝子発現調節配列が活性が強力な配列で交替された微生物または上記ｍｄｔＨタンパク質をコードする染色体上のプロモーターが活性が強力なプロモーターで交替された微生物であってもよい。
より具体的には、上記ｍｄｔＨタンパク質をコードする遺伝子はｍｄｔＨ遺伝子であってもよい。また、上記ｍｄｔＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。上記配列番号１及び配列番号２は公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋでその配列を得ることができる。
本出願の特定配列番号のアミノ酸配列または特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドは、上記特定配列番号のアミノ酸配列または特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質／ポリペプチドまたは上記特定配列番号のアミノ酸配列または特定配列番号で記載されたアミノ酸配列からなる／必須で構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）タンパク質／ポリペプチドであってもよい。また、本出願の特定配列番号の塩基配列または特定配列番号で記載された塩基配列を含むポリヌクレオチドは、上記特定配列番号の塩基配列または特定配列番号で記載された塩基配列を有するポリヌクレオチドまたは上記特定配列番号の塩基配列または特定配列番号で記載された塩基配列からなる／必須で構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）ポリヌクレオチドであってもよい。
本出願の微生物はＯＰＳを生産することができれば、その種類が特に制限されず、原核細胞または真核細胞がいずれも可能であるが、具体的には、原核細胞であってもよい。一例として、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及びブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物の菌株を含んでもよく、具体的には、エシェリキア属微生物、より具体的には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であってもよいが、これに制限されない。エシェリキア属またはコリネバクテリウム属微生物の場合、ＯＰＳ及びＬ－セリンを生産できることが知られている（Ａｈｍｅｄ Ｚａｈｏｏｒ， Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｊｏｕｒｎａｌ， ｖｏｌ ３， ２０１２ Ｏｃｔｏｂｅｒ； Ｗｅｎｄｉｓｃｈ Ｖ Ｆ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００６ Ｊｕｎ；９（３）：２６８－７４； Ｐｅｔｅｒｓ－Ｗｅｎｄｉｓｃｈ Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００５ Ｎｏｖ；７ １（ ｌ ｌ）：７ １３９－４４．）。
本出願の組換え微生物は、さらにホスホセリンホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＳｅｒＢ）の活性が内在的活性に比べて弱化したものであってもよい。
上記ＳｅｒＢは、ＯＰＳをＬ－セリン（Ｌ－ｓｅｒｉｎｅ）に転換させる活性を有するため、上記ＳｅｒＢ活性が弱化するように変異された微生物はＯＰＳを蓄積する特徴を有し、ＯＰＳの生産に有用に用いられる。上記ＳｅｒＢは、配列番号３で記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいが、これに制限されるものではない。また、上記ＳｅｒＢは、ＳｅｒＢの活性を示す限り、上記配列番号３で記載されるアミノ酸配列と８０％以上、具体的に９０％以上、より具体的に９５％以上、さらに具体的に９９％以上の同一のアミノ酸配列を含んでもよいが、これに制限されない。また、上記ＳｅｒＢをコードするポリヌクレオチドは、上記配列番号３で記載されたアミノ酸をコードする塩基配列を有することができる。上記ポリヌクレオチドはコドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）または本出願の変異体を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、本出願の変異体のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形がなされてもよい。上記ＳｅｒＢをコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号４の塩基配列を含んでもよく、これと同一性が８０％以上、具体的に９０％以上、より具体的に９５％以上、さらに具体的に９９％以上である塩基配列を含んでもよいが、これに制限されない。
本出願における用語、ポリペプチドの「弱化」は、内在的活性に比べて活性が減少または活性がないことを全て含む概念である。前記弱化は、不活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、欠乏（ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、下方制御（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）、低下（ｒｅｄｕｃｅ）、減衰（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）などの用語と混用され得る。
前記弱化は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異などにより、ポリペプチド自体の活性が本来微生物が有しているポリペプチドの活性に比べて減少または除去された場合、それをコードするポリヌクレオチドの遺伝子の発現阻害またはポリペプチドへの翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）阻害などにより細胞内で全体的なポリペプチド活性度及び／又は濃度（発現量）が天然型菌株に比べて低い場合、前記ポリヌクレオチドの発現が全く行われていない場合、及び／又はポリヌクレオチドの発現にもかかわらず、ポリペプチドの活性がない場合も含むことができる。前記「内在的活性」とは、天然または人為的要因による遺伝的変異により形質が変化した場合、形質転換前の親株、野生型または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて「不活性化、欠乏、減少、下方制御、低下、減衰」するということは、形質転換前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性に比べて低下したことを意味する。
そのようなポリペプチドの活性の弱化は、当業界に知られた任意の方法により行うことができるが、これらに限定されるものではなく、当該分野においてよく知られている様々な方法の適用により達成されてもよい（例えば、Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２０１４；１５（２）：２７７３－２７９３， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。
具体的には、本出願のポリペプチドの弱化は、
１）ポリペプチドをコードする遺伝子の全部または一部の欠損；
２）ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（または発現調節配列）の変形；
３）ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の変形（例えば、アミノ酸配列上の１以上のアミノ酸の削除／置換／付加）；
４）ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、前記ポリペプチドをコードする遺伝子配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように変形されたポリペプチドをコードするように、前記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列上の１以上の核酸塩基の削除／置換／追加）；
５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
６）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の転写物に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入；
７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な二次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加；
８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ＲＴＥ）；または
９）前記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
１）ポリペプチドをコードする遺伝子の全部または一部の欠損；
２）ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（または発現調節配列）の変形；
３）ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の変形（例えば、アミノ酸配列上の１以上のアミノ酸の削除／置換／付加）；
４）ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、前記ポリペプチドをコードする遺伝子配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように変形されたポリペプチドをコードするように、前記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列上の１以上の核酸塩基の削除／置換／追加）；
５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
６）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の転写物に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入；
７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な二次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加；
８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ＲＴＥ）；または
９）前記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
例えば、
前記１）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の一部または全部の欠損は、染色体内の内在的目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換、またはマーカー遺伝子への交換であってもよい。
前記１）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の一部または全部の欠損は、染色体内の内在的目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換、またはマーカー遺伝子への交換であってもよい。
また、前記２）発現調節領域（又は発現調節配列）の変形は、欠失、挿入、非保存的若しくは保存的置換又はこれらの組み合わせで発現調節領域（又は発現調節配列）上の変異が発生、又は更に弱い活性を有する配列への交換であってもよい。前記発現調節領域には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列が含むが、これらに限定されるものではない。
また、上記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がさらに低い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換されるものであってもよいが、これに制限されない。
また、前記４）及び５）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を弱化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはそれらの組み合わせで、配列上の変異の発生、またはより弱い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列もしくは活性がないように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これに限定されるものではない。例えば、ポリヌクレオチド配列内の変異を導入して終結コドンを形成することにより、遺伝子の発現を阻害または弱化させることができるが、これに限定されない。
前記６）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入は、例えば、文献［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｖｉｅｗｓ －Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖｏｌ． １（１） １９８６］を参照することができる。
前記７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な二次構造物を形成させるために、ポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加はｍＲＮＡ翻訳を不可能にするか、または速度を低下させるものであってもよい。
前記８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’の末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＲＴＥ）は、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の転写体に相補的なアンチセンスヌクレオチドを作って活性を弱化するものであってもよい。
本出願の微生物においてポリヌクレオチドの一部または全部の変形は、（ａ）微生物内の染色体挿入用ベクターを用いた相同組換えまたは遺伝子はさみ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ， ｅ．ｇ．，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）を用いたゲノム編集及び／または（ｂ）紫外線及び放射線などのような光及び／または化学物質の処理により誘発されてもよいが、これらに限定されない。前記遺伝子の一部または全体の変形方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法を含むことができる。例えば、目的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを前記微生物に注入して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を起こさせるようにして、遺伝子の一部または全体の欠損がなされてもよい。前記注入されるヌクレオチド配列またはベクターは、優性選別マーカーを含み得るが、これらに限定されるものではない。
また、本出願の組換え微生物は、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＳｅｒＡ）、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＳｅｒＣ）またはこれらの組合わせのいずれか一つの活性が内在的活性に比べてさらに強化されたものであってもよい。
上記ＳｅｒＡは、３－ホスホグリセリン酸（３－ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ）を３－ホスホヒドロキシピルベート（３－ｐｈｏｓｐｈｏ－ｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｕｖａｔｅ）に転換する活性を有するタンパク質であり、上記ＳｅｒＣは、３－ホスホヒドロキシピルベートをＯＰＳに転換する活性を有するタンパク質である。従って、上記ＳｅｒＡ又は／及びＳｅｒＣの活性が強化された微生物は、ＯＰＳ生産菌株として有用に用いられる。
上記ＳｅｒＡは、これに制限されないが、配列番号５または６のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。上記配列番号５は野生型ＳｅｒＡの配列であり、配列番号６はセリンに対するフィードバックが解除されたＳｅｒＡ変異体の配列である。また、野生型ＳｅｒＡの活性またはセリンに対するフィードバックが解除されたＳｅｒＡ変異体の活性を示す限り、上記ＳｅｒＡは配列番号５または６で記載されたアミノ酸配列と８０％以上、具体的に９０％以上、より具体的に９５％以上、さらに具体的に９９％以上同一のアミノ酸配列を含んでもよいが、これに制限されない。上記セリンに対するフィードバックが解除されたＳｅｒＡ変異体は、上記ＳｅｒＡをコードする遺伝子に挿入、置換などの方法で変異を導入してセリンあるいはグリシンによるフィードバック阻害からその活性を維持したり、強化された場合を意味し、上記セリンに対するフィードバックが解除されたＳｅｒＡ変異体は既によく知られている（Ｇｒａｎｔ ＧＡ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ３９： ５３５７－５３６１， １９９９； Ｇｒａｎｔ ＧＡ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３９： ７３１６－７３１９， ２０００； Ｇｒａｎｔ ＧＡ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６：１７８４４－１７８５０， ２００１；Ｐｅｔｅｒｓ－Ｗｅｎｄｉｓｃｈ Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬ， ６０：３７－４４１， ２００２；欧州登録特許ＥＰ ０９４３６８７ Ｂ）。
また、上記ＳｅｒＡの野生型またはセリンに対するフィードバックが解除されたＳｅｒＡ変異体をコードするポリヌクレオチドは、上記配列番号５～６に記載されたいずれか一つのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでもよいが、これに制限されない。上記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退性によりまたは上記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われてもよい。上記ＳｅｒＡの野生型またはセリンに対するフィードバックが解除されたＳｅｒＡ変異体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号７または８の塩基配列を含むポリヌクレオチドであってもよく、これと相同性が８０％以上、具体的に９０％以上、より具体的に９５％以上、さらに具体的に９９％以上である塩基配列を含むポリヌクレオチドであってもよいが、これに制限されない。
上記ＳｅｒＣは、例えば、配列番号９で記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいが、これに制限されるものではない。また、ＳｅｒＣの活性を示す限り、上記配列番号９で記載されるアミノ酸配列と８０％以上、具体的に９０％以上、より具体的に９５％以上、より一層具体的に９９％以上同一のアミノ酸配列を含み得るが、これに制限されない。
また、上記ＳｅｒＣをコードするポリヌクレオチドは、上記配列番号９で記載されたアミノ酸をコードする塩基配列を含んでもよい。上記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退性によりまたは上記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われ得る。上記ＳｅｒＣをコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１０の塩基配列を含んでもよく、これと相同性が８０％以上、具体的に９０％以上、より具体的に９５％以上、さらに具体的に９９％以上である塩基配列を含んでもよいが、これに制限されない。
本出願において用語、「内在的活性に比べて強化」及び強化方法は、前述した通りである。
また、本出願の組換え微生物は、ＯＰＳの細胞中への流入または分解能力をさらに減少させた微生物であってもよい。
上記のようなＯＰＳ生産微生物に関する内容は、上記で記述された内容以外にも欧州公開特許ＥＰ ２４４４４８１または米国公開公報第２０１２－０１９００８１号等に開示された内容が本出願の参考資料として用いられるが、これに制限されない。
本出願のもう一つの様態として、本出願は、ｍｄｔＨタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化されたＯ－ホスホセリン生産組換え微生物を培地で培養する段階を含む、Ｏ－ホスホセリンの生産方法を提供する。
上記ｍｄｔＨタンパク質、内在的活性、強化、Ｏ－ホスホセリン及び微生物については前述した通りである。
本出願において、用語「培養」とは、前記微生物を適切に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当業界に知られている適当な培地と培養条件に応じて行うことができる。このような培養過程は、選択される菌株に応じて当業者が容易に調整して使用することができる。具体的には、前記培養は、回分式、連続式及び流加式であってもよいが、これらに制限されるものではない。
上記ＳｅｒＢ活性が内在的活性に比べて弱化した組換え微生物の培養は、上記微生物のセリン要求性が誘導されて培地にグリシンまたはセリンがさらに含まれてもよい。グリシンは、精製されたグリシン、グリシンを含むイースト抽出物、トリプトンの形態で提供されてもよく、培養液に含まれる濃度は通常０．１～１０ｇ／Ｌ、具体的には０．５～３ｇ／Ｌであってもよい。また、セリンは精製されたセリン、セリンを含有するイースト抽出物、トリプトンなどの形態で提供されてもよく、培養液に含まれる濃度は、通常０．１～５ｇ／Ｌ、具体的には０．１～１ｇ／Ｌであってもよい。
上記培地に含まれる炭素源は、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油などのようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸を含んでもよく、これら物質は個別にまたは混合物として用いられてもよいが、これに制限されるものではない。
上記培地に含まれる窒素源として、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液及び大豆粕のような有機窒素源及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源が含まれてもよく、これら窒素源は単独または組み合わせて用いられるが、これに制限されるものではない。
上記培地に含まれるリン源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応するナトリウム含有塩が含まれてもよいが、これに制限されるものではない。
また、上記培地は、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含んでもよく、それ以外にアミノ酸、ビタミン及び適切な前駆体などが含んでもよい。これら培地または前駆体は培養物に回分式または連続式で添加されてもよいが、これに制限されるものではない。
培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化学物を培養物に適切な方法で添加し、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中は脂肪酸ポリグリコールエステルなどのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入することができる。培養物の温度は通常２５℃～４０℃、具体的に３０℃～３５℃であってもよい。培養物の培養期間は、所望の有用物質の生産量が得られる時まで続けることができ、具体的には１０～１００時間であってもよい。しかし、これら例示に制限されるものではない。
本出願のＯ－ホスホセリンの生産方法は、本出願の微生物を準備する段階、前記微生物を培養するための培地を準備する段階、またはこれらの組み合わせ（順は無関係、ｉｎ ａｎｙ ｏｒｄｅｒ）を、例えば、前記培養段階の前に、さらに含むことができる。本出願のＯ－ホスホセリンの生産方法は、前記培養による培地（培養済み培地）または本出願の微生物からＯ－ホスホセリンを回収する段階をさらに含むことができる。前記回収する段階は、前記培養する段階の後にさらに含むことができる。
前記Ｏ－ホスホセリンを回収する方法は、本出願の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などにより当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて所望のＯ－ホスホセリンを収集（ｃｏｌｌｅｃｔ）することであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣまたはそれらの方法を組み合わせて使用することができ、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて培地または微生物から所望のＯ－ホスホセリンを回収することができる。
また、本出願のＯ－ホスホセリン生産方法は、さらに精製段階を含んでもよい。前記精製は、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて行うことができる。一例として、本出願のＯ－ホスホセリン生産方法が回収段階と精製段階の両方を含む場合、前記回収段階及び精製段階は、順序に関係なく連続的または非連続的に行われるか、もしくは同時にまたは一つの段階に統合されて行うことができるが、これに限定されるものではない。
本出願の方法において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、及び菌株などは、前記他の態様で記載された通りである。
本出願のもう一つの様態として、本出願は、ａ）ｍｄｔＨタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化されたＯ－ホスホセリン生産組換え微生物を培地で培養してＯ－ホスホセリンまたはＯ－ホスホセリンを含む培地を生産する段階；及びｂ）Ｏ－ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（Ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ｓｕｌｆｌｉｙｄｒｙｌａｓｅ，ＯＰＳＳ）またはこれを含む微生物の存在下に、上記ａ）段階で生産されたＯ－ホスホセリンまたはこれを含む培地を硫化物と反応させる段階を含む、システインまたはこの誘導体の生産方法を提供する。
本出願で微生物に用いられる用語、特定タンパク質を「含む」は、目的とする特定タンパク質が微生物内に導入されたり、微生物内で発現される状態を意味する。
上記ｍｄｔＨタンパク質、内在的活性、強化、Ｏ－ホスホセリン微生物については前述した通りである。
本出願において用語、「誘導体」とは、ある化合物の一部を化学的に変化させて得られる類似の化合物であり、概ね化合物中の水素原子または特定原子団が他の原子または原子団により置換された化合物を意味する。
本出願において用語、「システイン誘導体」とは、システインの水素原子または特定原子団が他の原子または原子団により置換された化合物を意味する。その例として、システインのアミノ基（－ＮＨ２）の窒素原子またはチオール基（－ＳＨ）の硫黄原子に他の原子または原子団が付着された形態であってもよく、その例として ＮＡＣ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）， ＳＣＭＣ（Ｓ－Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）， ＢＯＣ－ＣＹＳ（ＭＥ）－ＯＨ，（Ｒ）－Ｓ－（２－Ａｍｉｎｏ－２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）－Ｌ－ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ， （Ｒ）－２－Ａｍｉｎｏ－３－ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ， Ｄ－２－Ａｍｉｎｏ－４－（ｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ， ３－ｓｕｌｆｉｎｏ－Ｌ－ａｌａｎｉｎｅ， Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｂｏｃ－ｍｅｔｈｙｌ）－ＯＨ， Ｓｅｌｅｎｏ－Ｌ－ｃｙｓｔｉｎｅ， Ｓ－（２－Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ， Ｓ－（２－Ｔｈｉｅｎｙｌ）－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ， Ｓ－（４－Ｔｏｌｙｌ）－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅなどがあるが、これに制限されない。
本出願の方法によりシステインを生産しさえすれば、システイン誘導体への変換は当業界に広く知られている方法で容易に多様なシステイン誘導体への変換が可能である。
具体的には、上記システイン誘導体の生産方法は、上記ｂ）段階で生成されたシステインをシステイン誘導体に転換させる段階をさらに含むことができ、その例としてシステインをアセチル化剤（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）と反応させてＮＡＣ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）を合成したり、システインを塩基性条件でハロ酢酸（ｈａｌｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）と反応させることによりＳＣＭＣ（Ｓ－Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）を合成できるが、これに制限されない。
上記システイン誘導体は、主に、製薬原料として鎮咳剤、せき緩和剤、気管支炎、気管支喘息と咽喉炎などの治療剤として用いられるが、これに制限されない。
本出願において用語、「Ｏ－ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（Ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌａｓｅ，ＯＰＳＳ）」とは、ＯＰＳにチオール基（ｔｈｉｏｌ ｇｒｏｕｐ、ＳＨ基）を提供して上記ＯＰＳをシステインに転換する反応を触媒する酵素を意味する。上記酵素は、アエロピュルム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｍｍ ｐｅｒｎｉｘ）、マイコバクテリウム・テュバキュローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｃｓ）、トリコモナス・ヴァギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）（Ｍｉｎｏ Ｋ ａｎｄ Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｋ， ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ， ５５１：１３３－１３８， ２００３； Ｂｕｍｓ Ｋ Ｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ， １２７： １１６０２－１１６０３， ２００５）で初めて明らかになったものであってもよい。また、上記ＯＰＳＳは、野生型ＯＰＳＳタンパク質だけでなく、上記ＯＰＳＳをコードするポリヌクレオチド配列中の一部の配列が欠失、置換または付加された配列であり、野生型ＯＰＳＳタンパク質の生物学的活性と同等またはそれ以上の活性を示す変異体タンパク質も含み、欧州公開特許ＥＰ ２４４４４８１及び米国登録特許ＵＳ ９１２７３２４に開示されたタンパク質及びこの変異体タンパク質も全て含み得る。
上記硫化物は、当該技術分野において通常用いる固形だけでなく、ｐＨ、圧力、溶解度の差により液体または気体の形態で提供され、スルフィド（ｓｕｌｆｉｄｅ，Ｓ２－）、チオサルフェート（ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ，Ｓ２０３
２－）などの形態でチオール基（ｔｈｉｏｌ ｇｒｏｕｐ、ＳＨ基）に転換され得る硫化物であれば、制限なく用いることができる。具体的には、チオール基をＯＰＳに提供するＮａ２Ｓ、ＮａＳＨ、Ｈ２Ｓ、（ＮＨ４）２ＳまたはＮａ２Ｓ２０３を用いることができるが、これに制限されない。上記反応は、一つのＯＰＳ反応基に一つのチオール基を提供して一つのシステインまたはシステイン誘導体を製造する反応であり、上記反応時に硫化物の添加量は、ＯＰＳモル濃度の０．１～３倍であってもよく、具体的には、１～２倍であってもよいが、これに制限されるものではない。
また、本出願では、さらに上記反応段階を通じて生産されたシステインを回収する段階を含んでもよい。この時、当該分野で公知となった適した反応を用いて反応液から目的とするシステインを分離及び精製して収集することができる。
本出願のもう一つの様態として、本出願は、ｍｄｔＨタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化されたＯ－ホスホセリン生産組換え微生物のＯ－ホスホセリン、システインまたはシステインの誘導体生産への使用を提供する。
本出願の他の一つの様態として、本出願は、ｍｄｔＨタンパク質のＯ－ホスホセリンを微生物から排出するための使用を提供する。
上記ｍｄｔＨタンパク質、内在的活性、強化、Ｏ－ホスホセリン、システイン、システインの誘導体及び微生物については、前述した通りである。
以下、本出願を実施例により、より詳しく説明する。しかし、下記実施例は、本出願を例示するための好ましい実施様態に過ぎず、従って、本出願の権利範囲をこれに限定することと意図されない。一方、本明細書に記載されていない技術的な事項は、本出願の技術分野または類似技術分野で熟練した通常の技術者であれば、十分に理解して容易に実施できる。
実施例１：ｍｄｔＨ膜タンパク質同定
ＯＰＳの排出に関与する大腸菌の膜タンパク質を同定するために、大腸菌野生型菌株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のゲノムＤＮＡライブラリを用いてスクリーニングを行った。
ＯＰＳの排出に関与する大腸菌の膜タンパク質を同定するために、大腸菌野生型菌株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のゲノムＤＮＡライブラリを用いてスクリーニングを行った。
ＯＰＳにより大腸菌の生育が低下する条件をセットアップ（ｓｅｔ－ｕｐ）するために、ＯＰＳを生産する基盤菌株を製作した。スクリーニング基盤菌株は、Ｗ３１１０で内在的ホスホセリンホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ｓｅｒＢ）の活性が弱化されるように変異させたＯＰＳ生産菌株であり、ＣＡ０７－００１２（ＫＣＣＭ１１２１２Ｐ、欧州公開特許ＥＰ ２４４４４８１；米国公開特許第２０１２－０１９００８１号）と命名した菌株である。
ＣＡ０７－００１２をＯＰＳを含む培地で培養させて生育低下（ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を示す最適スクリーニング条件を樹立した。Ｗ３１１０ゲノムライブラリプラスミドをＣＡ０７－００１２に電気穿孔法で形質転換させ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ． １９９９）、過量のＯＰＳが添加された培地条件で生育低下が解除されるコロニーを選別した。選別されたコロニーからプラスミドを獲得してシーケンシング技法を通じて塩基配列を分析した。これから過量のＯＰＳ添加条件で生育低下を解除させるのに関与する大腸菌膜タンパク質２種を同定した。
その結果、上記大腸菌膜タンパク質（配列番号１）をコードする遺伝子は、ＭＦＳ（ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属するｍｄｔＨトランスポータであることが確認された。
実施例２：ｍｄｔＨ過発現ベクターの製作
ＯＰＳによる生育低下を解除させるのに関与するｍｄｔｈをＯＰＳ生産菌株でそれぞれ強化させた場合、ＯＰＳ排出能が向上するかを確認するために、それぞれ遺伝子の過発現ベクターを製作した。また、ホスホセリンエクスポータｙｈｈＳをＯＰＳ生産菌株に強化させた場合、ＯＰＳ濃度が上昇することを確認したため（ＷＯ２０１６／０２４７７１ Ａ１）、これを陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）として用いた。そしてｍｄｔＨと同様に、ＭＦＳ（ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属する大腸菌膜タンパク質ｙｆａＶ ＭＦＳトランスポータもともに評価した。ｍｄｔＨをコードするＤＮＡ断片はＷ３１１０ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを通じて獲得した（配列番号２）。それぞれの膜タンパク質遺伝子に対する過発現ベクターを製作するために用いたプライマー配列は、下記表１で表記した通りである。
ＯＰＳによる生育低下を解除させるのに関与するｍｄｔｈをＯＰＳ生産菌株でそれぞれ強化させた場合、ＯＰＳ排出能が向上するかを確認するために、それぞれ遺伝子の過発現ベクターを製作した。また、ホスホセリンエクスポータｙｈｈＳをＯＰＳ生産菌株に強化させた場合、ＯＰＳ濃度が上昇することを確認したため（ＷＯ２０１６／０２４７７１ Ａ１）、これを陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）として用いた。そしてｍｄｔＨと同様に、ＭＦＳ（ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属する大腸菌膜タンパク質ｙｆａＶ ＭＦＳトランスポータもともに評価した。ｍｄｔＨをコードするＤＮＡ断片はＷ３１１０ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを通じて獲得した（配列番号２）。それぞれの膜タンパク質遺伝子に対する過発現ベクターを製作するために用いたプライマー配列は、下記表１で表記した通りである。
ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｙｈｈＳを製作するために鋳型としてｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｇｆｐ（ＷＯ ２０１６／０２４７７１Ａ１）を用い、配列番号１１及び配列番号１２を用いてＰＣＲを進行してＰｔｒｃ ＤＮＡ断片を得た。ｙｈｈＳ ＤＮＡ断片はＷ３１１０を鋳型として用いて配列番号１３及び配列番号１４でＰＣＲを進行して得た。増幅された断片はＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理されたｐＣＬ１９２０ベクターとＩＳＴを進行してｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｙｈｈＳを確保した。
ＩＳＴ（ＤＧ Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＴＨＯＤＳ， ＶＯＬ．６ ＮＯ．５， ＭＡＹ ２００９， ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）は、ギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングする方法を意味し、以下に継続的にＩＳＴと表記した。
ＰＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨもｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｇｆｐを鋳型として用い、配列番号１５及び配列番号１６を用いてＰｔｒｃ ＤＮＡ断片を確保した。Ｗ３１１０を鋳型として配列番号１７及び配列番号１８を用いてｍｄｔＨＤＮＡ断片を確保し、ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｙｈｈＳと同様にＩＳＴを通じてｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨを製作した。
ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｙｆａＶも上記２種類のプラスミドを製作した方法と同様にクローニングし、Ｐｔｒｃ ＤＮＡ断片はｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｇｆｐを、ｙｆａＶ ＤＮＡ断片はＷ３１１０を鋳型として確保した。プライマーはＰｔｒｃは配列番号１９及び配列番号２０を用い、ｙｆａＶは配列番号２１及び配列番号２２を用いてＰＣＲを進行した。
実施例３：ｍｄｔＨ ＭＦＳトランスポータ強化菌株の製作及びＯＰＳ生産能の評価
３－１．ＣＡ０７－００１２を用いたｍｄｔＨ ＭＦＳトランスポータ強化菌株の製作及びＯＰＳ生産能の評価
実施例２で製作された３種のプラスミドをそれぞれＯＰＳ生産株であるＣＡ０７－００１２に導入した菌株を製作してＯＰＳの生産能を評価した。
３－１．ＣＡ０７－００１２を用いたｍｄｔＨ ＭＦＳトランスポータ強化菌株の製作及びＯＰＳ生産能の評価
実施例２で製作された３種のプラスミドをそれぞれＯＰＳ生産株であるＣＡ０７－００１２に導入した菌株を製作してＯＰＳの生産能を評価した。
それぞれの菌株をＬＢ固体培地に塗抹した後、３３℃のインキュベーターで一晩中培養した。ＬＢ固体培地で一晩中培養した菌株を下記表２の２５ｍｌ力価培地に接種した後、これを３３℃、２００ｒｐｍのインキュベーターで４８時間培養し、このＯＰＳ生産能を表３に示した。
上記表３で見られるように、大腸菌由来のＣＡ０７－００１２菌株に大腸菌膜タンパク質遺伝子をさらに導入した場合のうち、ｙｈｈＳとｍｄｔＨ強化株の場合、ＯＰＳの生産量がＣＡ０７－００１２に比べて増加した結果を示し、特に、本出願のｍｄｔＨ強化株の場合、ＯＰＳ濃度が２倍値に近く上昇することを確認した。一方、比較群であるｙｆａＶ強化株の場合には、ＯＰＳの生産量を増加させない結果を示した。
上記ＣＡ０７－００１２／ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨは、ＣＡ０７－０３５４と命名した。ＣＡ０７－０３５４菌株は、ブダペスト条約下に韓国微生物センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ＫＣＣＭ）に２０２０年８月２８日付で寄託して寄託番号ＫＣＣＭ１２７８１Ｐの付与を受けた。
３－２．ｓｅｒＡ及びｓｅｒＣ強化菌株を用いたｍｄｔＨ ＭＦＳトランスポータ強化菌株の製作及びＯＰＳ生産能の評価
ＯＰＳ生合成経路であるｓｅｒＡ（３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、Ｄ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）とｓｅｒＣ（３－ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、３－ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の活性を強化させてＯＰＳ生産能が増加したＯＰＳ生産菌株であるＣＡ０７－００２２（ＫＣＣＭ１１１０３Ｐ、米国登録特許ＵＳ ９６８９００９ Ｂ２）を用いて上記大腸菌膜タンパク質遺伝子の効果を把握するために、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＣとともに膜タンパク質遺伝子に対する過発現ベクターを製作した。用いたプライマー配列は、下記表４で表記した通りである。
ＯＰＳ生合成経路であるｓｅｒＡ（３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、Ｄ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）とｓｅｒＣ（３－ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、３－ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の活性を強化させてＯＰＳ生産能が増加したＯＰＳ生産菌株であるＣＡ０７－００２２（ＫＣＣＭ１１１０３Ｐ、米国登録特許ＵＳ ９６８９００９ Ｂ２）を用いて上記大腸菌膜タンパク質遺伝子の効果を把握するために、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＣとともに膜タンパク質遺伝子に対する過発現ベクターを製作した。用いたプライマー配列は、下記表４で表記した通りである。
まず、ｓｅｒＡとｓｅｒＣが導入された陰性対照群プラスミドを製作するためにｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊Ｃを製作した。配列番号２３及び配列番号２４を用い、鋳型をｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｇｆｐとしてＰｔｒｃ ＤＮＡ断片を確保した。ｐＣ＿Ｐｒｍｆ－ｓｅｒＡ＊Ｃ（ＷＯ ２０１６／０２４７７１ Ａ１を鋳型とし、配列番号２５及び配列番号２６を用いてＰＣＲを進行してｓｅｒＡ＊ＣＤＮＡ断片を確保した。増幅された断片はＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理されたｐＣＬ１９２０ベクターとＩＳＴを進行してｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊Ｃを確保した。
ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊Ｃ＿Ｐｔｒｃ－ｙｈｈＳの製作のために配列番号２７及び配列番号２８を用い、鋳型として上位に製作されたｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｙｈｈＳ用いてＰＣＲを進行した。これからＰｔｒｃ－ｙｈｈＳ ＤＮＡ断片を確保した。増幅された断片はＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理されたｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊ＣベクターとＩＳＴを進行してｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊Ｃ＿Ｐｔｒｃ－ｙｈｈＳを確保した。
ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊Ｃ＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨとｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊Ｃ＿Ｐｔｒｃ－ｙｆａＶもｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊Ｃ＿Ｐｔｒｃ－ｙｈｈＳと同様の方法でベクターを製作した。配列番号２９及び配列番号３０を用い、ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨを鋳型としてＰｔｒｃ－ｍｄｔＨＤＮＡ断片を確保し、配列番号３１及び配列番号３２を用いてｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｙｆａＶを鋳型としてＰｔｒｃ－ｙｆａＶ ＤＮＡ断片を確保した。
ＯＰＳ生産菌株であるＣＡ０７－００２２に上記製作されたプラスミドを導入してＯＰＳ生産能を確認し、その結果は、下記表５に示した。
上記表５で見られるように、大腸菌由来のＣＡ０７－００１２菌株よりＯＰＳ生産能が向上したＣＡ０７－００２２／ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｓｅｒＡ＊Ｃに大腸菌膜タンパク質遺伝子をさらに導入した菌株中、陽性対照群であるｙｈｈＳ強化株の場合、ＯＰＳの生産量が対照群比増加することを再度確認することができた。特に、本出願によるｍｄｔＨ強化株の場合、上記表３の結果と同様にＯＰＳ濃度が上昇する結果を示した。一方、比較群であるｙｆａＶ強化群の場合には、対照群比ＯＰＳ生産量が減少した結果を示した。
３－３．染色体上プロモーター強度に応じたｍｄｔＨトランスポータ強化菌株の製作及びＯＰＳ生産能の評価
染色体上でｍｄｔＨのプロモーターをさらに強いプロモーターに変えた場合、排出能が向上するかを確認するために、自己プロモーターがｔｒｃプロモーターで置換された菌株を製作してＯ－ホスホセリンの生産能を評価した。ｔｒｃプロモーターを大腸菌の染色体に導入する方法は、通常用いられる下記方法で製作した。染色体上の挿入のためにＰＩタンパク質（ｐｉｒ遺伝子）に依存性を有するＲ６Ｋレプリコン（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）を有しており、ｓａｃＢ（レバンスクラーゼ、Ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）遺伝子が導入されているｐＳＫＨ１３０ベクターを用いた。また、上記べクターは、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を含んでおり、これは、菌株製作の選択マーカーとして用いられた。上記ベクターを用いた１次交差でＲ６Ｋ及びカナマイシンを用いて所望の菌株を確保した後、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）がある培地で抗生剤を除去する作業を進めて菌株を製作した。ＣＡ０７－００２２でｍｄｔＨのプロモーターをｔｒｃに交替するためにｐＳＫＨ１３０＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨベクターを製作し、用いたプライマー塩基配列は、下記表６に示した。
染色体上でｍｄｔＨのプロモーターをさらに強いプロモーターに変えた場合、排出能が向上するかを確認するために、自己プロモーターがｔｒｃプロモーターで置換された菌株を製作してＯ－ホスホセリンの生産能を評価した。ｔｒｃプロモーターを大腸菌の染色体に導入する方法は、通常用いられる下記方法で製作した。染色体上の挿入のためにＰＩタンパク質（ｐｉｒ遺伝子）に依存性を有するＲ６Ｋレプリコン（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）を有しており、ｓａｃＢ（レバンスクラーゼ、Ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）遺伝子が導入されているｐＳＫＨ１３０ベクターを用いた。また、上記べクターは、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を含んでおり、これは、菌株製作の選択マーカーとして用いられた。上記ベクターを用いた１次交差でＲ６Ｋ及びカナマイシンを用いて所望の菌株を確保した後、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）がある培地で抗生剤を除去する作業を進めて菌株を製作した。ＣＡ０７－００２２でｍｄｔＨのプロモーターをｔｒｃに交替するためにｐＳＫＨ１３０＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨベクターを製作し、用いたプライマー塩基配列は、下記表６に示した。
ｐＳＫＨ１３０＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨを製作するために、鋳型としてＷ３１１０を用い、配列番号３３及び配列番号３４でＰＣＲを進行してｍｄｔＨＵＰＤＮＡ断片を確保した。配列番号３５及び配列番号３６を用い、鋳型としては上記に製作されたｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨでＰＣＲを進行してＰｔｒｃ－ｍｄｔＨのＤＮＡ断片を確保した。増幅された断片は、ＥｃｏＲＶで制限酵素処理されたｐＳＫＨ１３０ベクターとＩＳＴを進行してｐＳＫＨ＿ｍｄｔＨＵＰ＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨを確保した。確保されたプラスミドはＣＡ７－００２２菌株に電気穿孔法で形質転換させた。組換え（交差）によりカナマイシンがあるＬＢ固体培地で染色体に導入された菌株が選択された後、スクロースがある培地で２次組換え（交替）を通じて染色体からプラスミド部位の切除が起きた。上記２次組換えが完了した菌株は、配列番号３７及び配列番号３８のプライマーを用いて確保された（ＣＡ０７－００２２：：Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨ）。
製作されたＯＰＳ生産菌株の効果を把握することにし、ＯＰＳ生産能を下記表７に示した。
その結果、上記表７で見られるように、プロモーターを強化して大腸菌膜タンパク質の発現を増加させた場合、対照群比ＯＰＳ濃度が増加することを確認することができた。
実施例４：３－ホスホグリセリン酸（３－ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ）排出の比較
ＯＰＳはホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含んでいる物質であり、化学構造的に３－ホスホグリセリン酸（３－ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ、以下、３ＰＧと表記）と類似の形態を有しているため、ＯＰＳエクスポータが３ＰＧを排出することもできると仮定し、ＯＰＳエクスポータが強化された菌株で３ＰＧ生産能をともに測定した。３ＰＧは、ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）機器を用いて測定し、３ＰＧ生産能を表８に示した。
ＯＰＳはホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含んでいる物質であり、化学構造的に３－ホスホグリセリン酸（３－ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ、以下、３ＰＧと表記）と類似の形態を有しているため、ＯＰＳエクスポータが３ＰＧを排出することもできると仮定し、ＯＰＳエクスポータが強化された菌株で３ＰＧ生産能をともに測定した。３ＰＧは、ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）機器を用いて測定し、３ＰＧ生産能を表８に示した。
上記表８で見られるように、ｙｈｈＳ強化菌株では３ＰＧが蓄積される結果を示したが、ｍｄｔＨ膜タンパク質が強化された菌株では３ＰＧが増加しない結果を確認することができた。即ち、ｍｄｔＨが導入された菌株はＯＰＳ排出能が増加し、また、ＯＰＳ特異的排出能が増加したことが示された。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、制限的なものでないことを理解すべきである。本出願の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
Claims (13)
- ｍｄｔＨタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化された、Ｏ－ホスホセリン生産組換え微生物。
- 前記組換え微生物は、Ｏ－ホスホセリン排出活性が内在的活性に比べて強化された、請求項１に記載の微生物。
- 前記ｍｄｔＨタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列またはＯ－ホスホセリン排出活性を有しながら前記配列番号１と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の微生物。
- 前記組換え微生物は、ホスホセリンホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ， ＳｅｒＢ）の活性が内在的活性に比べてさらに弱化された、請求項１に記載の微生物。
- 前記組換え微生物は、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， ＳｅｒＡ）、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＳｅｒＣ）またはその組合わせのいずれか一つの活性が内在的活性に比べてさらに強化された、請求項１に記載の微生物。
- 前記組換え微生物は、エシェリキア属（ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）である、請求項１に記載の微生物。
- ｍｄｔＨタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化されたＯ－ホスホセリン生産組換え微生物を培地で培養する段階を含む、Ｏ－ホスホセリンの生産方法。
- 前記方法は、培養された培地または微生物からＯ－ホスホセリンを回収する段階をさらに含む、請求項７に記載のＯ－ホスホセリンの生産方法。
- ａ）ｍｄｔＨタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化されたＯ－ホスホセリン生産組換え微生物を培地で培養してＯ－ホスホセリンまたはＯ－ホスホセリンを含む培地を生産する段階；及び
ｂ）Ｏ－ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（Ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ｓｕｌｆｌｉｙｄｒｙｌａｓｅ，ＯＰＳＳ）またはそれを含む微生物の存在下に、前記ａ）段階で生産されたＯ－ホスホセリンまたはそれを含む培地を硫化物と反応させる段階を含む、システインまたはその誘導体の生産方法。 - 前記システイン誘導体の生産方法は、前記ｂ）段階で生成されたシステインをシステイン誘導体に転換させる段階をさらに含む、請求項９に記載のシステインまたはその誘導体の生産方法。
- 前記硫化物は、Ｎａ２Ｓ、ＮａＳＨ、（ＮＨ４）２Ｓ、Ｈ２Ｓ及びＮａ２Ｓ２Ｏ３からなる群から選択される一つ以上である、請求項９に記載のシステインまたはその誘導体の生産方法。
- ｍｄｔＨタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化されたＯ－ホスホセリン生産組換え微生物のＯ－ホスホセリン、システインまたはシステインの誘導体生産への使用。
- ｍｄｔＨタンパク質のＯ－ホスホセリンを微生物から排出するための使用。
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