JP2023540374A - 新規なo-ホスホセリン排出タンパク質及びそれを用いたo-ホスホセリン、システイン及びその誘導体の生産方法 - Google Patents
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Abstract
本出願は、新規なO-ホスホセリン排出タンパク質及びそれを用いたO-ホスホセリン、システイン及びシステインの誘導体の生産方法に関する。
Description
本出願は、新規なO-ホスホセリン排出タンパク質及びそれを用いたO-ホスホセリン、システイン及びシステインの誘導体の生産方法に関する。
L-システインは、全ての生物体の硫黄代謝において重要なアミノ酸であり、毛髪のケラチンなど、生体内タンパク質、グルタチオン、ビオチン、メチオニン及びその他、硫黄を含有した代謝産物の合成に用いられるだけでなく、コエンザイムA生合成の前駆物質として用いられる。
微生物を用いてL-システインを生産する方法として、1)微生物を用いてD,L-ATC(D,L-2-amino-2-thiazoline-4-carboxylate)を生物学的に転換する方法、2)大腸菌を用いてL-システインを生産する直接醗酵方法(欧州登録特許 EP0885962B; Wada M andTakagi H , Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006)、3)微生物を用いてO-ホスホセリン(O-phosphoserine、以下「OPS」)を醗酵生産した後、O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(O-phosphoserine sulfhydrylase、以下「OPSS」)の触媒作用の下に硫化物と反応してL-システインに転換させる方法(欧州公開特許EP 2444481)などが知られている。
この時、上記3)方法で高収率のシステインを生産するために前駆体であるOPSを過量生産しなければならない必要が存在した。
Wada M andTakagi H , Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006
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本発明者らは、OPS生産菌株で生産されたO-ホスホセリンが細胞外に円滑に排出させる適切な排出因子を究明し、OPSの生産を増加させるために、鋭意努力した結果、新規なOPS排出タンパク質を発掘することにより本出願を完成した。
本出願の一つの目的は、mdtHタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化された、O-ホスホセリン生産組換え微生物を提供することにある。
本出願のもう一つの目的は、本出願のO-ホスホセリン生産組換え微生物を用いたO-ホスホセリンの生産方法を提供することにある。
本出願のもう一つの目的は、本出願のO-ホスホセリン生産組換え微生物を用いたシステインまたはその誘導体の生産方法を提供することにある。
本出願のもう一つの目的は、本出願のO-ホスホセリン生産組換え微生物を用いたO-ホスホセリンの生産方法を提供することにある。
本出願のもう一つの目的は、本出願のO-ホスホセリン生産組換え微生物を用いたシステインまたはその誘導体の生産方法を提供することにある。
本出願のmdtHタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化されたO-ホスホセリン生産組換え微生物を用い、O-ホスホセリンを生産する場合、既存の非変形菌株を用いる場合に比べて高収率のO-ホスホセリン生産が可能である。
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用され得る。即ち、本出願で開示された多様な要素の全ての組合わせが本出願の範疇に属する。また、下記の具体的な記述により本出願の範疇が制限されるとは見られない。また、当該技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定様態に対する多数の等価物を認知または確認することができる。また、このような等価物は、本出願に含まれることが意図される。
上記目的を達成するための本出願の一つの様態として、本出願は、mdtHタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化された、O-ホスホセリン生産組換え微生物を提供する。
本出願において用語、「O-ホスホセリン(O-phosphoserine,OPS)」は、セリンのリン酸(phosphoric acid)エステルであり、種々のタンパク質の構成要素である。上記OPSは、L-システインの前駆体であり、OPSスルフヒドリラーゼ(OPS sulfhydrylase,OPSS)の触媒の作用の下に硫化物と反応してシステインに転換されてもよいが、これに制限されない(欧州公開特許EP 2444481)。
具体的には、本出願の組換え微生物は、O-ホスホセリン排出活性が内在的活性に比べて強化されてもよい。本出願のmdtHタンパク質は、O-ホスホセリンを細胞外に排出できる活性を有することができ、このような活性は、本出願で初めて究明した。
一例として、本出願のmdtHタンパク質は膜タンパク質であってもよく、本出願のmdtHタンパク質は大腸菌(Escherichia coli)由来であってもよい。
また、本出願のmdtHタンパク質は、MFS(major facilitator superfamily)に属するトランスポータであってもよい。
具体的には、本出願のmdtHタンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列またはO-ホスホセリン排出活性を有しながら上記配列番号1と95%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。例えば、上記配列番号1のアミノ酸配列と95%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質は、上記配列番号1のアミノ酸配列を含むmdtHタンパク質と同一または対応するOPS排出活性を示すタンパク質であれば、制限なく含まれる。
より具体的には、上記配列番号1のアミノ酸配列と95%以上の同一性を示すアミノ酸配列は、上記配列番号1のアミノ酸配列と96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上または99.75%以上、及び100%未満の同一性を有する配列であってもよい。
また、本出願のmdtHタンパク質は、上記配列番号1のアミノ酸配列または上記配列番号1のアミノ酸配列と95%以上の同一性を示すアミノ酸配列で一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたタンパク質変異体も実質的にO-ホスホセリン排出活性を有する限り、本出願の範囲内に含まれ得る。
また、本出願のmdtHタンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列またはO-ホスホセリン排出活性を有しながら上記配列番号1と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列の前後への無意味な配列の追加または自然に発生し得る突然変異、またはこのサイレント突然変異(silent mutation)を含み得ることは、当業者に自明であってもよい。
本出願において、用語「相同性(homology)」または「同一性(identity)」とは、2つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列相互間の類似度を意味し、百分率で表すことができる。用語の相同性及び同一性はしばしば互換的に使用することができる。
保存された(conserved)ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準的な配列アルゴリズムにより決定され、使用されるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に使用されてもよい。実質的に、相同性を有したり(homologous)または同一の(identical)配列は、一般に、配列の全部または一部と中程度または高いストリンジェントな条件(stringent conditions)でハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドにおける一般のコドンまたはコドン縮退性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることが自明である。
任意の2つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444でのようなデフォルトパラメータを用いて「FASTA」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを使用して決定されてもよい。または、EMBOSSパッケージのニードルマンプログラム(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(バージョン5.0.0または以降のバージョン)で行われるような、ニードルマン-ウンシュ(Needleman-Wunsch)アルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)を使用して決定されてもよい(GCGプログラムパッケージ(Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994,及び[CARILLO ET AL.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073を含む)。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのBLASTまたはClustalWを用いて相同性、類似性または同一性を決定することができる。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482において公知となっているように、例えば、Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443のようなGAPコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定されてもよい。要約すると、GAPプログラムは、2つの配列中、より短いものにおける記号の総数であり、類似の配列された記号(すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸)の数を除した値と定義することができる。GAPプログラムのためのデフォルトパラメータは、(1)二進法比較マトリックス(同一性のために1、そして非-同一性のために0の値を含む)、及びSchwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)により開示されているように、Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745の加重比較マトリックス(またはEDNAFULL(NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン)置換マトリックス);(2)各ギャップのための3.0のペナルティ及び各ギャップにおいて各記号のための追加の0.10ペナルティ(またはギャップ開放ペナルティ10、ギャップ延長ペナルティ0.5);(3)末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。
本出願において、用語「O-ホスホセリン(OPS)生産組換え微生物」は、自然的に弱いOPS生産能を有している微生物あるいはOPS生産能がない親株に自然的または人為的に遺伝的変形が起きてOPS生産能が付与された微生物を意味する。本出願において上記「OPS生産組換え微生物」は、「OPS生産能を有する微生物」と混用され得る。
本出願の目的上、上記OPS生産微生物の場合、mdtHタンパク質の活性が強化されることにより、OPSの生産量が野生型または変形前の微生物に比べて増加したものであってもよい。これは、野生型または変形前の微生物がOPSを生産できなかったり、OPSを生産しても極微量を生産できるのに対し、本出願の微生物は、mdtHタンパク質の活性を強化することによりOPS生産能を増加させ得ることに意味がある。
本出願において、用語ポリペプチド活性の「強化」とは、ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて増加することを意味する。前記強化は、活性化(activation)、上方制御(up-regulation)過発現(overexpression)、増加(increase)などの用語と混用され得る。ここで、活性化、強化、上方制御、過剰発現、増加は、本来有していなかった活性を示すこと、または内在的活性または変形前の活性に比べて向上した活性を示すようになることを全て含むことができる。前記「内在的活性」とは、天然または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化した場合、形質転換前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が、内在的活性に比べて「強化」、「上方制御」、「過剰発現」または「増加」するとは、形質転換前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性及び/または濃度(発現量)に比べて向上したことを意味する。
前記強化は、外来のポリペプチドを導入するか、または内在的なポリペプチドの活性強化及び/または濃度(発現量)を通じて達成することができる。前記ポリペプチドの活性の強化有無は、当該ポリペプチドの活性度、発現量または当該ポリペプチドから排出される産物の量の増加から確認することができる。
前記ポリペプチドの活性の強化は、当技術分野においてよく知られた様々な方法の適用が可能であり、目的のポリペプチドの活性を改変前の微生物より強化させることができる限り、限定されない。具体的には、分子生物学の日常的な方法である当業者の通常の技術者によく知られた遺伝子工学及び/又はタンパク質工学を利用したものであってもよいが、これに限定されない(例えば、Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012など)。
具体的には、本出願のポリペプチドの強化は、
1)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加;
2)ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性の強力な配列で交換;
3)ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは5’-UTR領域をコードする塩基配列の変形;
4)ポリペプチド活性が強化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形;
5)ポリペプチド活性が強化するように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形(例えば、ポリペプチドの活性が強化するように変形されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形);
6)ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはそれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入;
7)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化;
8)ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選別して変形するか、または化学的に修飾;または
9)前記1)~8)から選択される2以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
1)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加;
2)ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性の強力な配列で交換;
3)ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは5’-UTR領域をコードする塩基配列の変形;
4)ポリペプチド活性が強化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形;
5)ポリペプチド活性が強化するように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形(例えば、ポリペプチドの活性が強化するように変形されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形);
6)ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはそれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入;
7)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化;
8)ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選別して変形するか、または化学的に修飾;または
9)前記1)~8)から選択される2以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
より具体的には、
前記1)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製して機能し得るベクターの宿主細胞内への導入により達成されることであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞内の染色体内に1コピーまたは2コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。前記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行うことができるが、これらに限定されない。前記ベクターは、前述の通りである。
前記1)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製して機能し得るベクターの宿主細胞内への導入により達成されることであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞内の染色体内に1コピーまたは2コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。前記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行うことができるが、これらに限定されない。前記ベクターは、前述の通りである。
前記2)ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域(または発現調節配列)を活性の強力な配列での交換は、例えば、前記発現調節領域の活性をさらに強化するように欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはそれらの組合せにより配列上の変異の発生、またはより強い活性を有する配列への交換であってもよい。前記発現調節領域は、特にこれに限定されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。一例として、本来のプロモーターを強力なプロモーターと交換させることであってもよいが、これらに限定されない。
公知の強力なプロモーターの例としては、cj1~cj7プロモーター(米国特許US 7662943 B2)、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、ラムダファージPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター、gapAプロモーター、SPL7プロモーター、SPL13(sm3)プロモーター(米国登録特許US 10584338 B2)、O2プロモーター(米国登録特許US 10273491 B2)、tktプロモーター、yccAプロモーターなどがあるが、これらに限定されない。
前記3)ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは5’-UTR領域をコードする塩基配列の変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がより高い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換することであってもよいが、これらに限定されない。
前記4)及び5)のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を強化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせにより配列上の変異の発生、またはより強い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列または活性が増加するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記交換は、具体的には、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行うことができるが、これらに限定されない。このときに使用されるベクターは、染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー(selection marker)をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは前述した通りである。
前記6)ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドの導入は、前記ポリペプチドと同一/類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドの宿主細胞内の導入であってもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドと同一/類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限はない。前記導入に用いられる方法は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選別して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることによりポリペプチドが生成し、その活性が増加され得る。
前記7)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化は、内在ポリヌクレオチドが宿主細胞内で転写または翻訳が増加するようにコドン最適化したものであるか、または外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるようにそのコドンを最適化したものであってもよい。
前記8)ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形または化学的に修飾することは、例えば、分析しようとするポリペプチドの配列情報を既知のタンパク質の配列情報が格納されたデータベースと比較することにより、配列の類似性の程度にしたがって、鋳型タンパク質候補を決定し、それに基づいて構造を確認し、変形または化学的に修飾する露出部位を選択して変形または修飾することであってもよい。
このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性または濃度発現量が野生型や変形前の微生物菌株で発現されたポリペプチドの活性または濃度を基準として増加したり、当該ポリペプチドから生産される産物の量が増加するものであってもよいが、これに制限されるものではない。
本出願において用語、「ベクター」は適切な宿主内で目的のポリペプチドを発現させるように、適切な発現調節領域(または発現調節配列)に作用可能に連結された前記目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むDNA調製物を含んでもよい。前記発現調節領域は、転写を開始するプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノム自体に統合されてもよい。
本出願で使用されるベクターは特に限定されず、当技術分野で知られている任意のベクターを使用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを挙げることができる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてpWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A及びCharon21Aなどを用いることができ、プラスミドベクターとしてpDZ系、pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系及びpET系などを用いることができる。具体的には、pDZ、pDC、pDCM2、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BACベクターなどを用いることができる。
一例として、細胞内における染色体挿入用ベクターを通じて目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られている任意の方法、例えば、相同組換え(homologous recombination)により行われてもよいが、これに限定されない。前記染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー(selection marker)をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、即ち、目的核酸分子の挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが使用されてもよい。選択剤(selective agent)が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみが生存するか、または他の発現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
本出願における用語「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞または微生物内に導入し、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現できる限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、または染色体外に位置するかに関係なく、それらの全部を含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードするDNA及び/又はRNAを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、如何なる形態でも導入されてもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体で発現されるのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット(expression cassette)の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター(promoter)、転写終結信号、リボソーム結合部位、及び翻訳終結信号を含んでもよい。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに制限されない。
また、前記において用語「作動可能に連結」されたとは、本出願の目的変異体をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。
具体的には、本出願の組換え微生物は、上記mdtHタンパク質をコードする遺伝子/ポリヌクレオチドが導入された微生物、上記mdtHタンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数が増加した微生物、上記mdtHタンパク質コードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された微生物、上記mdtHタンパク質をコードする染色体上の遺伝子発現調節配列が活性が強力な配列で交替された微生物または上記mdtHタンパク質をコードする染色体上のプロモーターが活性が強力なプロモーターで交替された微生物であってもよい。
より具体的には、上記mdtHタンパク質をコードする遺伝子はmdtH遺伝子であってもよい。また、上記mdtHタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号2の塩基配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。上記配列番号1及び配列番号2は公知のデータベースであるNCBIのGenBankでその配列を得ることができる。
本出願の特定配列番号のアミノ酸配列または特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を含むタンパク質/ポリペプチドは、上記特定配列番号のアミノ酸配列または特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質/ポリペプチドまたは上記特定配列番号のアミノ酸配列または特定配列番号で記載されたアミノ酸配列からなる/必須で構成される(consisting essentially of)タンパク質/ポリペプチドであってもよい。また、本出願の特定配列番号の塩基配列または特定配列番号で記載された塩基配列を含むポリヌクレオチドは、上記特定配列番号の塩基配列または特定配列番号で記載された塩基配列を有するポリヌクレオチドまたは上記特定配列番号の塩基配列または特定配列番号で記載された塩基配列からなる/必須で構成される(consisting essentially of)ポリヌクレオチドであってもよい。
本出願の微生物はOPSを生産することができれば、その種類が特に制限されず、原核細胞または真核細胞がいずれも可能であるが、具体的には、原核細胞であってもよい。一例として、エシェリキア(Escherichia)属、エルウィニア(Erwinia)属、セラチア(Serratia)属、プロビデンシア(Providencia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属及びブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に属する微生物の菌株を含んでもよく、具体的には、エシェリキア属微生物、より具体的には、大腸菌(Escherichia coli)であってもよいが、これに制限されない。エシェリキア属またはコリネバクテリウム属微生物の場合、OPS及びL-セリンを生産できることが知られている(Ahmed Zahoor, Computational and structural biotechnology journal, vol 3, 2012 October; Wendisch V F et al., Curr Opin Microbiol. 2006 Jun;9(3):268-74; Peters-Wendisch P et al., Appl Environ Microbiol. 2005 Nov;7 1( l l):7 139-44.)。
本出願の組換え微生物は、さらにホスホセリンホスファターゼ(phosphoserine phosphatase,SerB)の活性が内在的活性に比べて弱化したものであってもよい。
上記SerBは、OPSをL-セリン(L-serine)に転換させる活性を有するため、上記SerB活性が弱化するように変異された微生物はOPSを蓄積する特徴を有し、OPSの生産に有用に用いられる。上記SerBは、配列番号3で記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいが、これに制限されるものではない。また、上記SerBは、SerBの活性を示す限り、上記配列番号3で記載されるアミノ酸配列と80%以上、具体的に90%以上、より具体的に95%以上、さらに具体的に99%以上の同一のアミノ酸配列を含んでもよいが、これに制限されない。また、上記SerBをコードするポリヌクレオチドは、上記配列番号3で記載されたアミノ酸をコードする塩基配列を有することができる。上記ポリヌクレオチドはコドンの縮退性(degeneracy)または本出願の変異体を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、本出願の変異体のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形がなされてもよい。上記SerBをコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号4の塩基配列を含んでもよく、これと同一性が80%以上、具体的に90%以上、より具体的に95%以上、さらに具体的に99%以上である塩基配列を含んでもよいが、これに制限されない。
本出願における用語、ポリペプチドの「弱化」は、内在的活性に比べて活性が減少または活性がないことを全て含む概念である。前記弱化は、不活性化(inactivation)、欠乏(deficiency)、下方制御(down-regulation)、減少(decrease)、低下(reduce)、減衰(attenuation)などの用語と混用され得る。
前記弱化は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異などにより、ポリペプチド自体の活性が本来微生物が有しているポリペプチドの活性に比べて減少または除去された場合、それをコードするポリヌクレオチドの遺伝子の発現阻害またはポリペプチドへの翻訳(translation)阻害などにより細胞内で全体的なポリペプチド活性度及び/又は濃度(発現量)が天然型菌株に比べて低い場合、前記ポリヌクレオチドの発現が全く行われていない場合、及び/又はポリヌクレオチドの発現にもかかわらず、ポリペプチドの活性がない場合も含むことができる。前記「内在的活性」とは、天然または人為的要因による遺伝的変異により形質が変化した場合、形質転換前の親株、野生型または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて「不活性化、欠乏、減少、下方制御、低下、減衰」するということは、形質転換前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性に比べて低下したことを意味する。
そのようなポリペプチドの活性の弱化は、当業界に知られた任意の方法により行うことができるが、これらに限定されるものではなく、当該分野においてよく知られている様々な方法の適用により達成されてもよい(例えば、Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012など)。
具体的には、本出願のポリペプチドの弱化は、
1)ポリペプチドをコードする遺伝子の全部または一部の欠損;
2)ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域(または発現調節配列)の変形;
3)ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の変形(例えば、アミノ酸配列上の1以上のアミノ酸の削除/置換/付加);
4)ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、前記ポリペプチドをコードする遺伝子配列の変形(例えば、ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように変形されたポリペプチドをコードするように、前記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列上の1以上の核酸塩基の削除/置換/追加);
5)ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは5’-UTR領域をコードする塩基配列の変形;
6)ポリペプチドをコードする前記遺伝子の転写物に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスRNA)の導入;
7)リボソーム(ribosome)の付着が不可能な二次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ(Shine-Dalgarno)配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加;
8)ポリペプチドをコードする遺伝子配列のORF(open reading frame)の3’末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加(Reverse transcription engineering, RTE);または
9)前記1)~8)から選択された2以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
1)ポリペプチドをコードする遺伝子の全部または一部の欠損;
2)ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域(または発現調節配列)の変形;
3)ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の変形(例えば、アミノ酸配列上の1以上のアミノ酸の削除/置換/付加);
4)ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、前記ポリペプチドをコードする遺伝子配列の変形(例えば、ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように変形されたポリペプチドをコードするように、前記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列上の1以上の核酸塩基の削除/置換/追加);
5)ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは5’-UTR領域をコードする塩基配列の変形;
6)ポリペプチドをコードする前記遺伝子の転写物に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスRNA)の導入;
7)リボソーム(ribosome)の付着が不可能な二次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ(Shine-Dalgarno)配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加;
8)ポリペプチドをコードする遺伝子配列のORF(open reading frame)の3’末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加(Reverse transcription engineering, RTE);または
9)前記1)~8)から選択された2以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
例えば、
前記1)ポリペプチドをコードする前記遺伝子の一部または全部の欠損は、染色体内の内在的目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換、またはマーカー遺伝子への交換であってもよい。
前記1)ポリペプチドをコードする前記遺伝子の一部または全部の欠損は、染色体内の内在的目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換、またはマーカー遺伝子への交換であってもよい。
また、前記2)発現調節領域(又は発現調節配列)の変形は、欠失、挿入、非保存的若しくは保存的置換又はこれらの組み合わせで発現調節領域(又は発現調節配列)上の変異が発生、又は更に弱い活性を有する配列への交換であってもよい。前記発現調節領域には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列が含むが、これらに限定されるものではない。
また、上記3)ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは5’-UTR領域をコードする塩基配列変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がさらに低い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換されるものであってもよいが、これに制限されない。
また、前記4)及び5)のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を弱化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはそれらの組み合わせで、配列上の変異の発生、またはより弱い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列もしくは活性がないように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これに限定されるものではない。例えば、ポリヌクレオチド配列内の変異を導入して終結コドンを形成することにより、遺伝子の発現を阻害または弱化させることができるが、これに限定されない。
前記6)ポリペプチドをコードする前記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスRNA)の導入は、例えば、文献[Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews -Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]を参照することができる。
前記7)リボソーム(ribosome)の付着が不可能な二次構造物を形成させるために、ポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ(Shine-Dalgarno)配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加はmRNA翻訳を不可能にするか、または速度を低下させるものであってもよい。
前記8)ポリペプチドをコードする遺伝子配列のORF(open reading frame)の3’の末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加(Reverse transcription engineering,RTE)は、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の転写体に相補的なアンチセンスヌクレオチドを作って活性を弱化するものであってもよい。
本出願の微生物においてポリヌクレオチドの一部または全部の変形は、(a)微生物内の染色体挿入用ベクターを用いた相同組換えまたは遺伝子はさみ(engineered nuclease, e.g.,CRISPR-Cas9)を用いたゲノム編集及び/または(b)紫外線及び放射線などのような光及び/または化学物質の処理により誘発されてもよいが、これらに限定されない。前記遺伝子の一部または全体の変形方法には、DNA組換え技術による方法を含むことができる。例えば、目的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを前記微生物に注入して相同組換え(homologous recombination)を起こさせるようにして、遺伝子の一部または全体の欠損がなされてもよい。前記注入されるヌクレオチド配列またはベクターは、優性選別マーカーを含み得るが、これらに限定されるものではない。
また、本出願の組換え微生物は、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(phosphoglycerate dehydrogenase,SerA)、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ(phosphoserine aminotransferase,SerC)またはこれらの組合わせのいずれか一つの活性が内在的活性に比べてさらに強化されたものであってもよい。
上記SerAは、3-ホスホグリセリン酸(3-phosphoglycerate)を3-ホスホヒドロキシピルベート(3-phospho-hydroxypyruvate)に転換する活性を有するタンパク質であり、上記SerCは、3-ホスホヒドロキシピルベートをOPSに転換する活性を有するタンパク質である。従って、上記SerA又は/及びSerCの活性が強化された微生物は、OPS生産菌株として有用に用いられる。
上記SerAは、これに制限されないが、配列番号5または6のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。上記配列番号5は野生型SerAの配列であり、配列番号6はセリンに対するフィードバックが解除されたSerA変異体の配列である。また、野生型SerAの活性またはセリンに対するフィードバックが解除されたSerA変異体の活性を示す限り、上記SerAは配列番号5または6で記載されたアミノ酸配列と80%以上、具体的に90%以上、より具体的に95%以上、さらに具体的に99%以上同一のアミノ酸配列を含んでもよいが、これに制限されない。上記セリンに対するフィードバックが解除されたSerA変異体は、上記SerAをコードする遺伝子に挿入、置換などの方法で変異を導入してセリンあるいはグリシンによるフィードバック阻害からその活性を維持したり、強化された場合を意味し、上記セリンに対するフィードバックが解除されたSerA変異体は既によく知られている(Grant GA et al., J. Biol. Chem., 39: 5357-5361, 1999; Grant GA et al., Biochem., 39: 7316-7319, 2000; Grant GA et al., J. Biol. Chem., 276:17844-17850, 2001;Peters-Wendisch P et al., Appl. Microbiol. BiotechnoL, 60:37-441, 2002;欧州登録特許EP 0943687 B)。
また、上記SerAの野生型またはセリンに対するフィードバックが解除されたSerA変異体をコードするポリヌクレオチドは、上記配列番号5~6に記載されたいずれか一つのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでもよいが、これに制限されない。上記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退性によりまたは上記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われてもよい。上記SerAの野生型またはセリンに対するフィードバックが解除されたSerA変異体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号7または8の塩基配列を含むポリヌクレオチドであってもよく、これと相同性が80%以上、具体的に90%以上、より具体的に95%以上、さらに具体的に99%以上である塩基配列を含むポリヌクレオチドであってもよいが、これに制限されない。
上記SerCは、例えば、配列番号9で記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいが、これに制限されるものではない。また、SerCの活性を示す限り、上記配列番号9で記載されるアミノ酸配列と80%以上、具体的に90%以上、より具体的に95%以上、より一層具体的に99%以上同一のアミノ酸配列を含み得るが、これに制限されない。
また、上記SerCをコードするポリヌクレオチドは、上記配列番号9で記載されたアミノ酸をコードする塩基配列を含んでもよい。上記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退性によりまたは上記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われ得る。上記SerCをコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号10の塩基配列を含んでもよく、これと相同性が80%以上、具体的に90%以上、より具体的に95%以上、さらに具体的に99%以上である塩基配列を含んでもよいが、これに制限されない。
本出願において用語、「内在的活性に比べて強化」及び強化方法は、前述した通りである。
また、本出願の組換え微生物は、OPSの細胞中への流入または分解能力をさらに減少させた微生物であってもよい。
上記のようなOPS生産微生物に関する内容は、上記で記述された内容以外にも欧州公開特許EP 2444481または米国公開公報第2012-0190081号等に開示された内容が本出願の参考資料として用いられるが、これに制限されない。
本出願のもう一つの様態として、本出願は、mdtHタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化されたO-ホスホセリン生産組換え微生物を培地で培養する段階を含む、O-ホスホセリンの生産方法を提供する。
上記mdtHタンパク質、内在的活性、強化、O-ホスホセリン及び微生物については前述した通りである。
本出願において、用語「培養」とは、前記微生物を適切に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当業界に知られている適当な培地と培養条件に応じて行うことができる。このような培養過程は、選択される菌株に応じて当業者が容易に調整して使用することができる。具体的には、前記培養は、回分式、連続式及び流加式であってもよいが、これらに制限されるものではない。
上記SerB活性が内在的活性に比べて弱化した組換え微生物の培養は、上記微生物のセリン要求性が誘導されて培地にグリシンまたはセリンがさらに含まれてもよい。グリシンは、精製されたグリシン、グリシンを含むイースト抽出物、トリプトンの形態で提供されてもよく、培養液に含まれる濃度は通常0.1~10g/L、具体的には0.5~3g/Lであってもよい。また、セリンは精製されたセリン、セリンを含有するイースト抽出物、トリプトンなどの形態で提供されてもよく、培養液に含まれる濃度は、通常0.1~5g/L、具体的には0.1~1g/Lであってもよい。
上記培地に含まれる炭素源は、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油などのようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸を含んでもよく、これら物質は個別にまたは混合物として用いられてもよいが、これに制限されるものではない。
上記培地に含まれる窒素源として、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液及び大豆粕のような有機窒素源及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源が含まれてもよく、これら窒素源は単独または組み合わせて用いられるが、これに制限されるものではない。
上記培地に含まれるリン源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応するナトリウム含有塩が含まれてもよいが、これに制限されるものではない。
また、上記培地は、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含んでもよく、それ以外にアミノ酸、ビタミン及び適切な前駆体などが含んでもよい。これら培地または前駆体は培養物に回分式または連続式で添加されてもよいが、これに制限されるものではない。
培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化学物を培養物に適切な方法で添加し、培養物のpHを調整することができる。また、培養中は脂肪酸ポリグリコールエステルなどのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入することができる。培養物の温度は通常25℃~40℃、具体的に30℃~35℃であってもよい。培養物の培養期間は、所望の有用物質の生産量が得られる時まで続けることができ、具体的には10~100時間であってもよい。しかし、これら例示に制限されるものではない。
本出願のO-ホスホセリンの生産方法は、本出願の微生物を準備する段階、前記微生物を培養するための培地を準備する段階、またはこれらの組み合わせ(順は無関係、in any order)を、例えば、前記培養段階の前に、さらに含むことができる。本出願のO-ホスホセリンの生産方法は、前記培養による培地(培養済み培地)または本出願の微生物からO-ホスホセリンを回収する段階をさらに含むことができる。前記回収する段階は、前記培養する段階の後にさらに含むことができる。
前記O-ホスホセリンを回収する方法は、本出願の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などにより当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて所望のO-ホスホセリンを収集(collect)することであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化タンパク質沈殿剤による処理(塩析法)、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー(ゲルろ過)、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、HPLCまたはそれらの方法を組み合わせて使用することができ、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて培地または微生物から所望のO-ホスホセリンを回収することができる。
また、本出願のO-ホスホセリン生産方法は、さらに精製段階を含んでもよい。前記精製は、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて行うことができる。一例として、本出願のO-ホスホセリン生産方法が回収段階と精製段階の両方を含む場合、前記回収段階及び精製段階は、順序に関係なく連続的または非連続的に行われるか、もしくは同時にまたは一つの段階に統合されて行うことができるが、これに限定されるものではない。
本出願の方法において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、及び菌株などは、前記他の態様で記載された通りである。
本出願のもう一つの様態として、本出願は、a)mdtHタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化されたO-ホスホセリン生産組換え微生物を培地で培養してO-ホスホセリンまたはO-ホスホセリンを含む培地を生産する段階;及びb)O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(O-phosphoserine sulfliydrylase,OPSS)またはこれを含む微生物の存在下に、上記a)段階で生産されたO-ホスホセリンまたはこれを含む培地を硫化物と反応させる段階を含む、システインまたはこの誘導体の生産方法を提供する。
本出願で微生物に用いられる用語、特定タンパク質を「含む」は、目的とする特定タンパク質が微生物内に導入されたり、微生物内で発現される状態を意味する。
上記mdtHタンパク質、内在的活性、強化、O-ホスホセリン微生物については前述した通りである。
本出願において用語、「誘導体」とは、ある化合物の一部を化学的に変化させて得られる類似の化合物であり、概ね化合物中の水素原子または特定原子団が他の原子または原子団により置換された化合物を意味する。
本出願において用語、「システイン誘導体」とは、システインの水素原子または特定原子団が他の原子または原子団により置換された化合物を意味する。その例として、システインのアミノ基(-NH2)の窒素原子またはチオール基(-SH)の硫黄原子に他の原子または原子団が付着された形態であってもよく、その例として NAC(N-acetylcysteine), SCMC(S-Carboxymetylcysteine), BOC-CYS(ME)-OH,(R)-S-(2-Amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine, (R)-2-Amino-3-sulfopropionic acid, D-2-Amino-4-(ethylthio)butyric acid, 3-sulfino-L-alanine, Fmoc-Cys(Boc-methyl)-OH, Seleno-L-cystine, S-(2-Thiazolyl)-L-cysteine, S-(2-Thienyl)-L-cysteine, S-(4-Tolyl)-L-cysteineなどがあるが、これに制限されない。
本出願の方法によりシステインを生産しさえすれば、システイン誘導体への変換は当業界に広く知られている方法で容易に多様なシステイン誘導体への変換が可能である。
具体的には、上記システイン誘導体の生産方法は、上記b)段階で生成されたシステインをシステイン誘導体に転換させる段階をさらに含むことができ、その例としてシステインをアセチル化剤(acetylation agent)と反応させてNAC(N-acetylcysteine)を合成したり、システインを塩基性条件でハロ酢酸(haloacetic acid)と反応させることによりSCMC(S-Carboxymetylcysteine)を合成できるが、これに制限されない。
上記システイン誘導体は、主に、製薬原料として鎮咳剤、せき緩和剤、気管支炎、気管支喘息と咽喉炎などの治療剤として用いられるが、これに制限されない。
本出願において用語、「O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(O-phosphoserine sulfhydrylase,OPSS)」とは、OPSにチオール基(thiol group、SH基)を提供して上記OPSをシステインに転換する反応を触媒する酵素を意味する。上記酵素は、アエロピュルム・ペルニクス(Aeropymm pernix)、マイコバクテリウム・テュバキュローシス(Mycobacterium tuberculosis)、マイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium smegmatics)、トリコモナス・ヴァギナリス(Trichomonas vaginalis)(Mino K and Ishikawa K, FEBSletters, 551:133-138, 2003; Bums K E et al., J. Am. Chem. Soc, 127: 11602-11603, 2005)で初めて明らかになったものであってもよい。また、上記OPSSは、野生型OPSSタンパク質だけでなく、上記OPSSをコードするポリヌクレオチド配列中の一部の配列が欠失、置換または付加された配列であり、野生型OPSSタンパク質の生物学的活性と同等またはそれ以上の活性を示す変異体タンパク質も含み、欧州公開特許EP 2444481及び米国登録特許US 9127324に開示されたタンパク質及びこの変異体タンパク質も全て含み得る。
上記硫化物は、当該技術分野において通常用いる固形だけでなく、pH、圧力、溶解度の差により液体または気体の形態で提供され、スルフィド(sulfide,S2-)、チオサルフェート(thiosulfate,S203
2-)などの形態でチオール基(thiol group、SH基)に転換され得る硫化物であれば、制限なく用いることができる。具体的には、チオール基をOPSに提供するNa2S、NaSH、H2S、(NH4)2SまたはNa2S203を用いることができるが、これに制限されない。上記反応は、一つのOPS反応基に一つのチオール基を提供して一つのシステインまたはシステイン誘導体を製造する反応であり、上記反応時に硫化物の添加量は、OPSモル濃度の0.1~3倍であってもよく、具体的には、1~2倍であってもよいが、これに制限されるものではない。
また、本出願では、さらに上記反応段階を通じて生産されたシステインを回収する段階を含んでもよい。この時、当該分野で公知となった適した反応を用いて反応液から目的とするシステインを分離及び精製して収集することができる。
本出願のもう一つの様態として、本出願は、mdtHタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化されたO-ホスホセリン生産組換え微生物のO-ホスホセリン、システインまたはシステインの誘導体生産への使用を提供する。
本出願の他の一つの様態として、本出願は、mdtHタンパク質のO-ホスホセリンを微生物から排出するための使用を提供する。
上記mdtHタンパク質、内在的活性、強化、O-ホスホセリン、システイン、システインの誘導体及び微生物については、前述した通りである。
以下、本出願を実施例により、より詳しく説明する。しかし、下記実施例は、本出願を例示するための好ましい実施様態に過ぎず、従って、本出願の権利範囲をこれに限定することと意図されない。一方、本明細書に記載されていない技術的な事項は、本出願の技術分野または類似技術分野で熟練した通常の技術者であれば、十分に理解して容易に実施できる。
実施例1:mdtH膜タンパク質同定
OPSの排出に関与する大腸菌の膜タンパク質を同定するために、大腸菌野生型菌株であるEscherichia coli W3110(ATCC27325)のゲノムDNAライブラリを用いてスクリーニングを行った。
OPSの排出に関与する大腸菌の膜タンパク質を同定するために、大腸菌野生型菌株であるEscherichia coli W3110(ATCC27325)のゲノムDNAライブラリを用いてスクリーニングを行った。
OPSにより大腸菌の生育が低下する条件をセットアップ(set-up)するために、OPSを生産する基盤菌株を製作した。スクリーニング基盤菌株は、W3110で内在的ホスホセリンホスファターゼ(phosphoserine phosphatase,serB)の活性が弱化されるように変異させたOPS生産菌株であり、CA07-0012(KCCM11212P、欧州公開特許EP 2444481;米国公開特許第2012-0190081号)と命名した菌株である。
CA07-0012をOPSを含む培地で培養させて生育低下(growth inhibition)を示す最適スクリーニング条件を樹立した。W3110ゲノムライブラリプラスミドをCA07-0012に電気穿孔法で形質転換させ(van der Rest et al. 1999)、過量のOPSが添加された培地条件で生育低下が解除されるコロニーを選別した。選別されたコロニーからプラスミドを獲得してシーケンシング技法を通じて塩基配列を分析した。これから過量のOPS添加条件で生育低下を解除させるのに関与する大腸菌膜タンパク質2種を同定した。
その結果、上記大腸菌膜タンパク質(配列番号1)をコードする遺伝子は、MFS(major facilitator superfamily)に属するmdtHトランスポータであることが確認された。
実施例2:mdtH過発現ベクターの製作
OPSによる生育低下を解除させるのに関与するmdthをOPS生産菌株でそれぞれ強化させた場合、OPS排出能が向上するかを確認するために、それぞれ遺伝子の過発現ベクターを製作した。また、ホスホセリンエクスポータyhhSをOPS生産菌株に強化させた場合、OPS濃度が上昇することを確認したため(WO2016/024771 A1)、これを陽性対照群(positive control)として用いた。そしてmdtHと同様に、MFS(major facilitator superfamily)に属する大腸菌膜タンパク質yfaV MFSトランスポータもともに評価した。mdtHをコードするDNA断片はW3110ゲノムDNAを鋳型としてPCRを通じて獲得した(配列番号2)。それぞれの膜タンパク質遺伝子に対する過発現ベクターを製作するために用いたプライマー配列は、下記表1で表記した通りである。
OPSによる生育低下を解除させるのに関与するmdthをOPS生産菌株でそれぞれ強化させた場合、OPS排出能が向上するかを確認するために、それぞれ遺伝子の過発現ベクターを製作した。また、ホスホセリンエクスポータyhhSをOPS生産菌株に強化させた場合、OPS濃度が上昇することを確認したため(WO2016/024771 A1)、これを陽性対照群(positive control)として用いた。そしてmdtHと同様に、MFS(major facilitator superfamily)に属する大腸菌膜タンパク質yfaV MFSトランスポータもともに評価した。mdtHをコードするDNA断片はW3110ゲノムDNAを鋳型としてPCRを通じて獲得した(配列番号2)。それぞれの膜タンパク質遺伝子に対する過発現ベクターを製作するために用いたプライマー配列は、下記表1で表記した通りである。
pCL_Ptrc-yhhSを製作するために鋳型としてpCL_Ptrc-gfp(WO 2016/024771A1)を用い、配列番号11及び配列番号12を用いてPCRを進行してPtrc DNA断片を得た。yhhS DNA断片はW3110を鋳型として用いて配列番号13及び配列番号14でPCRを進行して得た。増幅された断片はXbaIとHindIIIで制限酵素処理されたpCL1920ベクターとISTを進行してpCL_Ptrc-yhhSを確保した。
IST(DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)は、ギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングする方法を意味し、以下に継続的にISTと表記した。
PCL_Ptrc-mdtHもpCL_Ptrc-gfpを鋳型として用い、配列番号15及び配列番号16を用いてPtrc DNA断片を確保した。W3110を鋳型として配列番号17及び配列番号18を用いてmdtHDNA断片を確保し、pCL_Ptrc-yhhSと同様にISTを通じてpCL_Ptrc-mdtHを製作した。
pCL_Ptrc-yfaVも上記2種類のプラスミドを製作した方法と同様にクローニングし、Ptrc DNA断片はpCL_Ptrc-gfpを、yfaV DNA断片はW3110を鋳型として確保した。プライマーはPtrcは配列番号19及び配列番号20を用い、yfaVは配列番号21及び配列番号22を用いてPCRを進行した。
実施例3:mdtH MFSトランスポータ強化菌株の製作及びOPS生産能の評価
3-1.CA07-0012を用いたmdtH MFSトランスポータ強化菌株の製作及びOPS生産能の評価
実施例2で製作された3種のプラスミドをそれぞれOPS生産株であるCA07-0012に導入した菌株を製作してOPSの生産能を評価した。
3-1.CA07-0012を用いたmdtH MFSトランスポータ強化菌株の製作及びOPS生産能の評価
実施例2で製作された3種のプラスミドをそれぞれOPS生産株であるCA07-0012に導入した菌株を製作してOPSの生産能を評価した。
それぞれの菌株をLB固体培地に塗抹した後、33℃のインキュベーターで一晩中培養した。LB固体培地で一晩中培養した菌株を下記表2の25ml力価培地に接種した後、これを33℃、200rpmのインキュベーターで48時間培養し、このOPS生産能を表3に示した。
上記表3で見られるように、大腸菌由来のCA07-0012菌株に大腸菌膜タンパク質遺伝子をさらに導入した場合のうち、yhhSとmdtH強化株の場合、OPSの生産量がCA07-0012に比べて増加した結果を示し、特に、本出願のmdtH強化株の場合、OPS濃度が2倍値に近く上昇することを確認した。一方、比較群であるyfaV強化株の場合には、OPSの生産量を増加させない結果を示した。
上記CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtHは、CA07-0354と命名した。CA07-0354菌株は、ブダペスト条約下に韓国微生物センター(Korean Culture Center of Microorganisms,KCCM)に2020年8月28日付で寄託して寄託番号KCCM12781Pの付与を受けた。
3-2.serA及びserC強化菌株を用いたmdtH MFSトランスポータ強化菌株の製作及びOPS生産能の評価
OPS生合成経路であるserA(3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)とserC(3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、3-phosphoserine aminotransferase)の活性を強化させてOPS生産能が増加したOPS生産菌株であるCA07-0022(KCCM11103P、米国登録特許US 9689009 B2)を用いて上記大腸菌膜タンパク質遺伝子の効果を把握するために、serA、serCとともに膜タンパク質遺伝子に対する過発現ベクターを製作した。用いたプライマー配列は、下記表4で表記した通りである。
OPS生合成経路であるserA(3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)とserC(3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、3-phosphoserine aminotransferase)の活性を強化させてOPS生産能が増加したOPS生産菌株であるCA07-0022(KCCM11103P、米国登録特許US 9689009 B2)を用いて上記大腸菌膜タンパク質遺伝子の効果を把握するために、serA、serCとともに膜タンパク質遺伝子に対する過発現ベクターを製作した。用いたプライマー配列は、下記表4で表記した通りである。
まず、serAとserCが導入された陰性対照群プラスミドを製作するためにpCL_Ptrc-serA*Cを製作した。配列番号23及び配列番号24を用い、鋳型をpCL_Ptrc-gfpとしてPtrc DNA断片を確保した。pC_Prmf-serA*C(WO 2016/024771 A1を鋳型とし、配列番号25及び配列番号26を用いてPCRを進行してserA*CDNA断片を確保した。増幅された断片はXbaIとHindIIIで制限酵素処理されたpCL1920ベクターとISTを進行してpCL_Ptrc-serA*Cを確保した。
pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhSの製作のために配列番号27及び配列番号28を用い、鋳型として上位に製作されたpCL_Ptrc-yhhS用いてPCRを進行した。これからPtrc-yhhS DNA断片を確保した。増幅された断片はHindIIIで制限酵素処理されたpCL_Ptrc-serA*CベクターとISTを進行してpCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhSを確保した。
pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-mdtHとpCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yfaVもpCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhSと同様の方法でベクターを製作した。配列番号29及び配列番号30を用い、pCL_Ptrc-mdtHを鋳型としてPtrc-mdtHDNA断片を確保し、配列番号31及び配列番号32を用いてpCL_Ptrc-yfaVを鋳型としてPtrc-yfaV DNA断片を確保した。
OPS生産菌株であるCA07-0022に上記製作されたプラスミドを導入してOPS生産能を確認し、その結果は、下記表5に示した。
上記表5で見られるように、大腸菌由来のCA07-0012菌株よりOPS生産能が向上したCA07-0022/pCL_Ptrc-serA*Cに大腸菌膜タンパク質遺伝子をさらに導入した菌株中、陽性対照群であるyhhS強化株の場合、OPSの生産量が対照群比増加することを再度確認することができた。特に、本出願によるmdtH強化株の場合、上記表3の結果と同様にOPS濃度が上昇する結果を示した。一方、比較群であるyfaV強化群の場合には、対照群比OPS生産量が減少した結果を示した。
3-3.染色体上プロモーター強度に応じたmdtHトランスポータ強化菌株の製作及びOPS生産能の評価
染色体上でmdtHのプロモーターをさらに強いプロモーターに変えた場合、排出能が向上するかを確認するために、自己プロモーターがtrcプロモーターで置換された菌株を製作してO-ホスホセリンの生産能を評価した。trcプロモーターを大腸菌の染色体に導入する方法は、通常用いられる下記方法で製作した。染色体上の挿入のためにPIタンパク質(pir遺伝子)に依存性を有するR6Kレプリコン(replicon)を有しており、sacB(レバンスクラーゼ、Levansucrase)遺伝子が導入されているpSKH130ベクターを用いた。また、上記べクターは、カナマイシン(kanamycin)耐性遺伝子を含んでおり、これは、菌株製作の選択マーカーとして用いられた。上記ベクターを用いた1次交差でR6K及びカナマイシンを用いて所望の菌株を確保した後、スクロース(sucrose)がある培地で抗生剤を除去する作業を進めて菌株を製作した。CA07-0022でmdtHのプロモーターをtrcに交替するためにpSKH130_Ptrc-mdtHベクターを製作し、用いたプライマー塩基配列は、下記表6に示した。
染色体上でmdtHのプロモーターをさらに強いプロモーターに変えた場合、排出能が向上するかを確認するために、自己プロモーターがtrcプロモーターで置換された菌株を製作してO-ホスホセリンの生産能を評価した。trcプロモーターを大腸菌の染色体に導入する方法は、通常用いられる下記方法で製作した。染色体上の挿入のためにPIタンパク質(pir遺伝子)に依存性を有するR6Kレプリコン(replicon)を有しており、sacB(レバンスクラーゼ、Levansucrase)遺伝子が導入されているpSKH130ベクターを用いた。また、上記べクターは、カナマイシン(kanamycin)耐性遺伝子を含んでおり、これは、菌株製作の選択マーカーとして用いられた。上記ベクターを用いた1次交差でR6K及びカナマイシンを用いて所望の菌株を確保した後、スクロース(sucrose)がある培地で抗生剤を除去する作業を進めて菌株を製作した。CA07-0022でmdtHのプロモーターをtrcに交替するためにpSKH130_Ptrc-mdtHベクターを製作し、用いたプライマー塩基配列は、下記表6に示した。
pSKH130_Ptrc-mdtHを製作するために、鋳型としてW3110を用い、配列番号33及び配列番号34でPCRを進行してmdtHUPDNA断片を確保した。配列番号35及び配列番号36を用い、鋳型としては上記に製作されたpCL_Ptrc-mdtHでPCRを進行してPtrc-mdtHのDNA断片を確保した。増幅された断片は、EcoRVで制限酵素処理されたpSKH130ベクターとISTを進行してpSKH_mdtHUP_Ptrc-mdtHを確保した。確保されたプラスミドはCA7-0022菌株に電気穿孔法で形質転換させた。組換え(交差)によりカナマイシンがあるLB固体培地で染色体に導入された菌株が選択された後、スクロースがある培地で2次組換え(交替)を通じて染色体からプラスミド部位の切除が起きた。上記2次組換えが完了した菌株は、配列番号37及び配列番号38のプライマーを用いて確保された(CA07-0022::Ptrc-mdtH)。
製作されたOPS生産菌株の効果を把握することにし、OPS生産能を下記表7に示した。
その結果、上記表7で見られるように、プロモーターを強化して大腸菌膜タンパク質の発現を増加させた場合、対照群比OPS濃度が増加することを確認することができた。
実施例4:3-ホスホグリセリン酸(3-phosphoglycerate)排出の比較
OPSはホスフェート(phosphate)を含んでいる物質であり、化学構造的に3-ホスホグリセリン酸(3-phosphoglycerate、以下、3PGと表記)と類似の形態を有しているため、OPSエクスポータが3PGを排出することもできると仮定し、OPSエクスポータが強化された菌株で3PG生産能をともに測定した。3PGは、HPLC(high performance liquid chromatography)機器を用いて測定し、3PG生産能を表8に示した。
OPSはホスフェート(phosphate)を含んでいる物質であり、化学構造的に3-ホスホグリセリン酸(3-phosphoglycerate、以下、3PGと表記)と類似の形態を有しているため、OPSエクスポータが3PGを排出することもできると仮定し、OPSエクスポータが強化された菌株で3PG生産能をともに測定した。3PGは、HPLC(high performance liquid chromatography)機器を用いて測定し、3PG生産能を表8に示した。
上記表8で見られるように、yhhS強化菌株では3PGが蓄積される結果を示したが、mdtH膜タンパク質が強化された菌株では3PGが増加しない結果を確認することができた。即ち、mdtHが導入された菌株はOPS排出能が増加し、また、OPS特異的排出能が増加したことが示された。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、制限的なものでないことを理解すべきである。本出願の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
Claims (13)
- mdtHタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化された、O-ホスホセリン生産組換え微生物。
- 前記組換え微生物は、O-ホスホセリン排出活性が内在的活性に比べて強化された、請求項1に記載の微生物。
- 前記mdtHタンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列またはO-ホスホセリン排出活性を有しながら前記配列番号1と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の微生物。
- 前記組換え微生物は、ホスホセリンホスファターゼ(phosphoserine phosphatase, SerB)の活性が内在的活性に比べてさらに弱化された、請求項1に記載の微生物。
- 前記組換え微生物は、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(phosphoglycerate dehydrogenase, SerA)、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ(phosphoserine aminotransferase,SerC)またはその組合わせのいずれか一つの活性が内在的活性に比べてさらに強化された、請求項1に記載の微生物。
- 前記組換え微生物は、エシェリキア属(the genus of Escherichia)である、請求項1に記載の微生物。
- mdtHタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化されたO-ホスホセリン生産組換え微生物を培地で培養する段階を含む、O-ホスホセリンの生産方法。
- 前記方法は、培養された培地または微生物からO-ホスホセリンを回収する段階をさらに含む、請求項7に記載のO-ホスホセリンの生産方法。
- a)mdtHタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化されたO-ホスホセリン生産組換え微生物を培地で培養してO-ホスホセリンまたはO-ホスホセリンを含む培地を生産する段階;及び
b)O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼ(O-phosphoserine sulfliydrylase,OPSS)またはそれを含む微生物の存在下に、前記a)段階で生産されたO-ホスホセリンまたはそれを含む培地を硫化物と反応させる段階を含む、システインまたはその誘導体の生産方法。 - 前記システイン誘導体の生産方法は、前記b)段階で生成されたシステインをシステイン誘導体に転換させる段階をさらに含む、請求項9に記載のシステインまたはその誘導体の生産方法。
- 前記硫化物は、Na2S、NaSH、(NH4)2S、H2S及びNa2S2O3からなる群から選択される一つ以上である、請求項9に記載のシステインまたはその誘導体の生産方法。
- mdtHタンパク質の活性が内在的活性に比べて強化されたO-ホスホセリン生産組換え微生物のO-ホスホセリン、システインまたはシステインの誘導体生産への使用。
- mdtHタンパク質のO-ホスホセリンを微生物から排出するための使用。
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