CN116568701A

CN116568701A - 新型o-磷酸丝氨酸输出蛋白和使用其生产o-磷酸丝氨酸、半胱氨酸和半胱氨酸衍生物的方法

Info

Publication number: CN116568701A
Application number: CN202180061926.XA
Authority: CN
Inventors: 朴慧珉; 金昭延; 沈熙陈; 柳慧连; 李珍南
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2020-09-09
Filing date: 2021-09-06
Publication date: 2023-08-08
Also published as: KR102414743B1; BR112023004005A2; TWI817193B; EP4198130A1; US20230313243A1; TW202216741A; EP4198130A4; KR20220033316A; CA3191495A1; JP2023540374A; MX2023002722A; AR123451A1; WO2022055192A1; AU2021340470A1

Abstract

本发明涉及一种新型O‑磷酸丝氨酸输出蛋白，以及使用O‑磷酸丝氨酸输出蛋白生产O‑磷酸丝氨酸、半胱氨酸和半胱氨酸衍生物的方法。

Description

新型O-磷酸丝氨酸输出蛋白和使用其生产O-磷酸丝氨酸、半胱氨酸和半胱氨酸衍生物的方法

技术领域

本公开涉及一种O-磷酸丝氨酸输出蛋白，以及使用其生产O-磷酸丝氨酸、半胱氨酸和半胱氨酸衍生物的方法。

背景技术

L-半胱氨酸，一种在所有活生物体的硫代谢中起重要作用的氨基酸，不仅用于合成生物蛋白质(如毛发角蛋白等)、谷胱甘肽、生物素、甲硫氨酸和其它含硫代谢物，而且还用作辅酶A生物合成的前体。

使用本领域已知的微生物生产L-半胱氨酸的方法包括：1)利用微生物将D,L-2-氨基噻唑啉-4-羧酸(D,L-ATC)生物转化为L-半胱氨酸的方法，2)利用大肠杆菌(E.coli)通过直接发酵生产L-半胱氨酸的方法(EP 0885962 B；Wada M和Takagi H,Appl.Microbiol.Biochem.,73:48–54,2006)，和3)利用微生物通过发酵生产O-磷酸丝氨酸(以下称为“OPS”)，然后在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(以下称为“OPSS”)的催化作用下通过使O-磷酸丝氨酸与硫化物(sulfide)反应将O-磷酸丝氨酸转化为L-半胱氨酸的方法(欧洲专利号2444481)。

具体地，为了通过方法3)以高产率生产半胱氨酸，应过量生产OPS前体。

在这种情况下，本发明人做出了广泛的努力来鉴定合适的输出因子，这种输出因子能够将OPS生产菌株中生产的O-磷酸丝氨酸平顺地输出到细胞外并增加OPS产量。结果，他们发现了一种新型OPS输出蛋白，从而完成了本公开。

发明内容

技术问题

本发明人做出了广泛的努力来鉴定合适的输出因子，这种输出因子能够将O-磷酸丝氨酸平顺地输出到细胞外并增加OPS产量，而结果是，他们发现了一种新型OPS输出蛋白，从而完成了本公开。

技术方案

本公开的一个目的是提供一种用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物，其中mdtH蛋白的活性与其内源活性相比得到增强。

本公开的另一个目的是提供一种使用本公开的用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物生产O-磷酸丝氨酸的方法。

本公开的又另一个目的是提供一种使用本公开的用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物生产半胱氨酸或其衍生物的方法。

有利效果

当使用其中mdtH蛋白的活性与其内源活性相比得到增强的用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物来生产O-磷酸丝氨酸时，可导致与使用现有的未修饰菌株相比高产率生产O-磷酸丝氨酸。

具体实施方式

本申请将被详细描述。同时，本文公开的各个描述和实施方式可分别适用于其它描述和实施方式。也就是说，本文公开的各种要素的所有组合都落入本公开的范围。进一步，本公开的范围不受下述具体描述的限制。

在本公开的一个方面中，为了实现上述目的，本公开提供了一种用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物，其中mdtH蛋白的活性与其内源活性相比得到增强。

如本文所用，术语“O-磷酸丝氨酸”(以下称为“OPS”)是指作为许多蛋白质的构成组分的丝氨酸的磷酸酯。具体地，OPS是L-半胱氨酸的前体并且可通过在OPS硫化氢解酶(以下称为“OPSS”)的催化作用下与硫化物反应而转化为半胱氨酸，但不限于此(欧洲专利号2444481)。

具体地，与其内源活性相比，本公开的重组微生物可具有增强的O-磷酸丝氨酸输出活性。本公开的mdtH蛋白可具有向细胞外输出O-磷酸丝氨酸的活性，并且这种活性在本公开中首次被鉴定。

在一个实例中，本公开的mdtH蛋白可以是膜蛋白，并且可源自大肠杆菌(Escherichia coli)。

此外，本公开的mdtH蛋白可以是属于主要促进因子超家族(major facilitatorsuperfamily,MFS)的转运蛋白。

具体地，本公开的mdtH蛋白可以是包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:1具有至少95％同一性的氨基酸序列而同时具有O-磷酸丝氨酸输出活性的蛋白质。例如，包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸的蛋白质可非限制地包括表达与包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的mdtH蛋白相同或相应的OPS输出活性的任何蛋白质。

更具体地，与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸可以是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上、99.75％以上且100％以下的同一性的序列。

此外，本公开的mdtH蛋白可包括蛋白质变体，其中在SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列中，序列的一部分被缺失、修饰、取代、保守地取代或添加，只要它们具有O-磷酸丝氨酸输出活性即可，并且可实质上落入本公开的范围内。

此外，对本领域技术人员显而易见的是，本公开的mdtH蛋白可包括在SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％同一性而同时具有O-磷酸丝氨酸输出活性的氨基酸序列的上游或下游的无意义序列添加、天然发生的突变、或其沉默突变。

如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关度，并且可以以百分比表示。术语同源性和同一性通常可以彼此可互换地使用。

保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可利用标准比对算法来确定，并且可与所用程序建立的默认空位罚分联用。基本上，预期同源的或同一的序列总体上在中度或高度严格的条件下与序列的全部或部分杂交。显而易见的是，在杂交多核苷酸时，与含有通用密码子或简并密码子的多核苷酸的杂交也包括在内。

任意两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性都可例如通过已知的计算机算法如利用默认参数的“FASTA”程序确定(Pearson et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444)。可选地，其可通过以下确定：Needleman–Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)——利用EMBOSS包的Needleman程序执行(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276–277)(优选地，5.0.0版本或更高版本)(GCG程序包(Devereux,J.et al.,Nucleic Acids Research12:387(1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul,S.F.et al.,J MOLEC BIOL 215:403(1990)；Guide to Huge Computers,MartinJ.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994,和CARILLO et al.(1988)SIAM JApplied Math 48:1073)。例如，可利用National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)的BLAST或ClustalW来确定同源性、相似性或同一性。

多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可例如通过比较序列信息来确定，例如利用GAP计算机程序如Needleman et al.(1970),J Mol Biol.48:443，被公开于Smith和Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482。总之，GAP程序将同源性、相似性或同一性定义为通过将相似比对的符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短者的符号总数而获得的值。GAP程序的默认参数可包括(1)一元比较矩阵(包含同一性数值1和非同一性数值0)和Gribskov et al.(1986),Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz与Dayhoff,eds.,Atlas of Protein Sequence and Structure,National BiomedicalResearch Foundation,pp.353–358(1979)中公开(或EDNAFULL替换矩阵(NCBI NUC4.4的EMBOSS版))；(2)每个空位3.0的罚分和每个空位中每个符号另外0.10的罚分(或10的空位开放罚分和0.5的空位扩展罚分)；和(3)末端空位无罚分。

如本文所用，术语“用于生产O-磷酸丝氨酸(OPS)的重组微生物”可指具有天然弱的OPS生产能力的微生物或已经通过对不具有OPS生产能力的亲本菌株进行天然或人工遗传修饰而被提供OPS生产能力的微生物。在本公开中，“用于生产OPS的重组微生物”可与“具有OPS生产能力的微生物”互换使用。

出于本公开的目的，在生产OPS的微生物的情况下，与野生型或修饰前的微生物相比，OPS的产量可增加，因为mdtH蛋白的活性被增强。这是显著的，因为可通过增强本公开的mdtH蛋白的活性来增加OPS生产能力，而野生型微生物或修饰前的微生物不能生产OPS或者即使其能生产OPS也只能生产痕量。

如本文所用，术语多肽活性的“增强”是指多肽的活性与其内源活性相比得到增加。增强可与诸如激活、上调、过表达、增加等术语互换使用。具体而言，激活、增强、上调、过表达和增加可包括展示最初不具有的活性，或与内源活性或修饰前的活性相比活性被增强这两种情况。“内源活性”是指当性状通过由天然或人为因素引起的遗传修饰而改变时，转化前亲本菌株或非修饰微生物最初拥有的特定多肽的活性，并且可与“修饰前活性”互换使用。多肽活性与其内源活性相比“增强”、“上调”、“过表达”或“增加”是指多肽的活性和/或浓度(表达水平)与转化前亲本菌株或非修饰微生物最初拥有的特定多肽的活性和/或浓度(表达水平)相比得到增强。

增强可通过引入外源多肽，或通过增强内源多肽的活性和/或浓度(表达水平)来实现。多肽活性的增强可通过多肽活性水平、表达水平或多肽分泌产物的量的增加来证实。

多肽活性的增强可通过本领域公知的各种方法来施加，并且不受限制，只要与修饰前的微生物的活性相比，它可增强靶多肽的活性即可。具体地，可使用本领域技术人员公知的基因工程和/或蛋白质工程——分子生物学的常用方法，但方法不限于此(例如，Sitnicka et al.Functional Analysis of Genes.Advances in Cell Biology.2010,Vol.2.1–16；Sambrook etal.Molecular Cloning 2012,etc.)。

具体地，本申请的多肽的增强可通过以下实现：

1)增加编码所述多肽的多核苷酸的细胞内拷贝数；

2)修饰染色体上编码所述多肽的基因的表达调控区(例如，诱导对表达调控区的修饰，用具有更强活性的序列替换该序列，或插入具有更强活性的序列)；

3)修饰编码起始密码子的核苷酸序列或编码所述多肽的基因转录物的5′-UTR；

4)修饰所述多肽的氨基酸序列使得所述多肽的活性得到增强；

5)修饰编码所述多肽的多核苷酸序列使得所述多肽的活性得到增强(例如，修饰所述多肽基因的多核苷酸序列以编码一种经修饰以增强所述多肽的活性的多肽)；

6)导入表现出所述多肽活性的外源多肽或编码所述多肽的外源多核苷酸；

7)对编码所述多肽的多核苷酸密码子优化；

8)分析所述多肽的三级结构，从而选择和修饰暴露的位点，或对其化学修饰；或

9)选自上述1)至8)中的两种或更多种的组合，但不特别地限于此。

更具体地：

增加编码所述多肽的多核苷酸的细胞内拷贝数的方法1)可通过将载体导入宿主细胞中来实现，所述载体与编码所述多肽的多核苷酸可操作地连接并且能够复制和发挥功能而与宿主细胞无关。可选地，该方法可通过将编码所述多肽的多核苷酸的一个拷贝或两个拷贝导入宿主细胞的染色体来实现。可通过将能够将多核苷酸插入宿主细胞的染色体的载体导入宿主细胞来进行向染色体的导入，但不限于此。所述载体如上所述。

用具有强活性的序列替换染色体上编码所述多肽的基因的表达调控区(或表达调控序列)的方法2)可通过例如通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合诱导对序列的修饰以进一步增强表达调控区的活性，或通过用具有更强活性的序列替换该序列来实现。表达调控区可包括但不特别地限于启动子、操纵序列、编码核糖体结合位点的序列和调控转录和翻译终止的序列等。在一个实例中，该方法可包括用强启动子替换原始启动子，但不限于此。

已知的强启动子的实例可包括CJ1至CJ7启动子(US 7662943 B2)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、gapA启动子、SPL7启动子、SPL13(sm3)启动子(US 10584338 B2)、O2启动子(US 10273491 B2)、tkt启动子、yccA启动子等，但强启动子不限于此。

修饰编码起始密码子的核苷酸序列或编码所述多肽的基因转录物的5′-UTR的方法3)可通过例如用编码与内源起始密码子相比具有更高多肽表达率的另一起始密码子的核苷酸序列取代该核苷酸序列来实现，但不限于此。

修饰氨基酸序列或多核苷酸序列的方法4)和5)可通过以下实现：通过对所述多肽的氨基酸序列或编码所述多肽的多核苷酸序列缺失、插入、非保守或保守取代或其组合来诱导对序列的修饰以增强所述多肽的活性，或通过用经修饰以具有更强活性的氨基酸序列或多核苷酸序列，或经修饰以增强活性的氨基酸序列或多核苷酸序列来替换该序列，但不限于此。替换可具体地通过同源重组而将多核苷酸插入染色体中来执行，但不限于此。本文使用的载体可还包括选择标记以确认在染色体中的插入。选择标记如上所述。

导入表现出所述多肽活性的外源多肽的方法6)可通过将编码表现出与所述多肽相同/相似活性的多肽的外源多核苷酸导入宿主细胞中来实现。外源多核苷酸可以无论其来源或序列被非限制地使用，只要其表现出与所述多肽相同/相似的活性即可。导入可由本领域普通技术人员通过适当地选择本领域已知的转化方法进行，并且导入的多核苷酸在宿主细胞中的表达能够生产所述多肽，从而增加其活性。

对编码所述多肽的多核苷酸密码子优化的方法7)可通过对内源多核苷酸密码子优化以增加宿主细胞内的转录或翻译，或通过优化其密码子使得可在宿主细胞内实现外源多核苷酸的经优化的转录和翻译来实现。

分析所述多肽的三级结构，从而选择和修饰暴露的位点，或对其化学修饰的方法8)可通过以下实现：例如将待分析多肽的序列信息与存储已知蛋白质序列信息的数据库进行比较，以根据序列相似度确定模板蛋白质候选物，并因此基于该信息来确认结构，从而选择和转化或修饰待修饰或化学修饰的暴露的位点。

多肽活性的这种增强可意味着相对于在野生型或修饰前微生物中表达的多肽的活性或浓度，相应多肽的活性或浓度增加，或者产自多肽的产物的量增加，但不限于此。

如本文所用，术语“载体”可包括这样的DNA构建物：含有编码靶多肽的多核苷酸的核苷酸序列，其被可操作地连接到适合在合适的宿主细胞中表达靶多肽的表达调控区(或表达调控序列)。表达调控区可包括能够启动转录的启动子、用于调控转录的任何操纵序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及用于调控转录和翻译的终止的序列。在转化到合适的宿主细胞中后，载体可独立于宿主基因组复制或发挥功能，或者可整合到其基因组中。

本公开中使用的载体没有特别限制，并且可以使用本领域已知的任意载体。常规载体的实例可包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或黏粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A。作为质粒载体，可以使用pDZ型、pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型和pET型。具体地，可以使用pDZ、pDC、pDCM2、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118和pCC1BAC载体。

例如，可使用供染色体插入的载体将编码靶多肽的多核苷酸插入到染色体中。将多核苷酸插入到染色体中可通过本领域已知的任何方法执行，例如同源重组，但不限于此。多核苷酸可还包括选择标记以确认染色体插入。选择标记用于选择转化有载体的细胞，即用于确认所期望的核酸分子的插入，而选择标记的实例可包括提供可选择表型如耐药性、营养要求、细胞毒性剂耐性或表面多肽的表达的标记。只有表达选择标记的细胞能在用选择剂处理的环境下存活或显示出不同的表型，因此可以选择出转化的细胞。

如本文所用，术语“转化”是指将包括编码靶多肽的多核苷酸的载体导入宿主细胞或微生物中，使得多核苷酸编码的多肽在宿主细胞中表达。经转化的多核苷酸可以是被插入到宿主细胞的染色体中的形式，或者是位于染色体外的形式，只要蛋白质在宿主细胞中表达即可。此外，多核苷酸包括编码靶多肽的DNA和/或RNA。多核苷酸可以以任何形式被导入宿主细胞中，只要多核苷酸被导入宿主细胞中并且多肽在其中表达即可。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式被导入宿主细胞中，表达盒是包括自我复制所需的所有必要元件的基因构建物。表达盒通常可包括可操作地连接到多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是可自我复制的表达载体的形式。此外，多核苷酸可以以其原始形式被导入宿主细胞中并且在宿主细胞中被可操作地连接到表达所需的序列，但不限于此。

另外，如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动子序列和多核苷酸序列之间的可操作键合(linkage)，启动子序列能够启动和介导编码本公开靶变体的多核苷酸的转录。

具体地，本公开的重组微生物可以是导入有编码mdtH蛋白的基因/多核苷酸的微生物；编码mdtH蛋白的多核苷酸的细胞内拷贝数增加的微生物；转化有含有编码mdtH蛋白的多核苷酸的载体的微生物；染色体上编码mdtH蛋白的基因的表达调控序列被具有更强活性的序列替换的微生物；或染色体上编码mdtH蛋白的启动子被具有强活性的启动子替换的微生物。

更具体地，编码mdtH蛋白的基因可以是mdtH基因。此外，编码mdtH蛋白的多核苷酸可以是包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列可从NCBI的GenBank——已知的数据库——获得。

包括具体序列号的氨基酸序列或由具体序列号描述的氨基酸序列的蛋白质/多肽可以是具有该具体序列号的氨基酸序列或由该具体序列号描述的氨基酸序列的蛋白质/多肽，或者可以是由该具体序列号的氨基酸序列或由该具体序列号描述的氨基酸序列组成或主要由其组成的蛋白质/多肽。此外，包括具体序列号的核苷酸序列或由具体序列号描述的核苷酸序列的多核苷酸可以是具有该具体序列号的核苷酸序列或由该具体序列号描述的核苷酸序列的多核苷酸，或者可以是由该具体序列号的核苷酸序列或由该具体序列号描述的核苷酸序列组成或主要由其组成的多核苷酸。

本公开的微生物不受其类型限制，只要其能够生产OPS即可，并且可以是任何原核微生物或真核微生物，具体是原核微生物。原核微生物的实例可包括属于埃希氏菌属(thegenus Escherichia)、欧文氏菌属(the genus Erwinia)、沙雷氏菌属(the genusSerratia)、普罗威登斯菌属(the genus Providencia)、棒状杆菌属(the genusCorynebacterium)和短杆菌属(the genus Brevibacterium)的微生物菌株，具体是属于埃希氏菌属的微生物，更具体是大肠杆菌，但不限于此。具体地，在属于埃希氏菌属或棒状杆菌属的微生物的情况下，可以生产OPS和L-丝氨酸(Ahmed Zahoor,Computational andstructural biotechnology journal,第3卷,2012年10月；Wendisch,V.F.et al.,CurrOpin Microbiol.2006Jun；9(3):268–74；Peters-Wendisch,P.et al.,Appl EnvironMicrobiol.2005Nov；7 1(ll):7 139–44.)。

本公开的重组微生物可以是磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)的活性与其内源活性相比被进一步减弱的微生物。

本公开的SerB具有将OPS转化为L-丝氨酸的活性，因此经修饰使得SerB活性被减弱的微生物具有在其中累积OPS的性质，从而可用于生产OPS。本公开的SerB可以是包括由SEQ ID NO:3描述的氨基酸序列的蛋白质，但不限于此。另外，SerB可包括与由SEQ ID NO:3描述的氨基酸序列具有80％以上，具体90％以上，更具体95％以上，甚至更具体99％以上的同一性的氨基酸序列，只要其显示出SerB活性即可，但不限于此。此外，编码SerB的多核苷酸可具有编码由SEQ ID NO:3描述的氨基酸的核苷酸序列。可在不由于密码子简并性而改变蛋白质的氨基酸序列的范围内或考虑到蛋白质将在其中表达的生物体优选的密码子，在多核苷酸的编码区中进行各种修饰。本公开的编码SerB的多核苷酸可例如包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有80％以上，具体90％以上，更具体95％以上，甚至更具体99％以上的同一性的核苷酸序列，但不限于此。

如本文所用，术语多肽的“减弱”具有包括与固有活性相比活性的所有降低或缺乏的概念。减弱可与失活、缺失、下调、减少、降低、衰减等互换使用。

减弱还可包括：由于编码多肽的多核苷酸的突变等，与原始微生物所具备的多肽本身的活性相比，多肽本身的活性被降低或消除的情况；细胞中全部多肽的活性和/或浓度(表达水平)由于编码多肽的多核苷酸的基因表达受到抑制或翻译成多肽受到抑制而低于天然菌株的情况；不进行多核苷酸的表达的情况；和/或多肽尽管表达了多核苷酸但没有活性的情况。“内源活性”是指修饰前亲本菌株或野生型或非修饰微生物由于天然或人为因素引起的遗传变异而发生转化时最初具有的具体多肽的活性。此术语可与“修饰前活性”互换使用。与内源活性相比，多肽活性的“减弱”、“失活”、“缺乏”、“减少”、“下调”、“降低”或“衰减”是指与修饰前亲本菌株或非修饰微生物最初具有的具体多肽的活性相比，多肽活性被降低。

多肽活性的减弱可通过本领域已知的任何方法获得，但不限于此，并且可通过应用本领域公知的各种方法获得(例如，Nakashima N et al.,Bacterial cellularengineering by genome editing and gene silencing.Int J Mol Sci.2014；15(2):2773–2793,Sambrook et al.,Molecular Cloning 2012,etc.)。

具体地，本公开多肽的减弱可以是：

1)编码所述多肽的基因的部分或全部缺失；

2)修饰表达控制区(或表达控制序列)以降低编码所述多肽的基因的表达；

3)修饰构成所述多肽的氨基酸序列以消除或减弱所述多肽的活性(例如，氨基酸序列上至少一个氨基酸的缺失/取代/添加)。

4)修饰编码所述多核苷酸的基因序列以消除或减弱所述多肽的活性(例如，所述多肽基因的核苷酸序列上缺失/取代/添加至少一个核苷酸以编码经修饰以消除或减弱所述多肽的活性的多肽)；

5)修饰编码起始密码子的核苷酸序列或编码所述多肽的基因转录物的5′-UTR区；

6)导入与编码所述多肽的基因转录物互补结合的反义寡核苷酸(例如，反义RNA)；

7)在编码所述多肽的基因的Shine–Dalgarno序列上游添加与Shine–Dalgarno序列互补的序列以形成使核糖体不能附着的二级结构；

8)向编码所述多肽的基因序列的开放阅读框(ORF)的3’端添加逆转录启动子(逆转录工程(reverse transcription engineering)，RTE)；或

9)选自项目1)至8)的两种或更多种的组合，但不特别限于此。

例如，对这些的描述如下。

项目1)中编码所述多肽的基因的部分或全部缺失可以是染色体中编码内源靶蛋白的多核苷酸的全部的消除，用缺失一些核苷酸的多核苷酸替换，或用标记基因替换。

项目2)中对表达控制区(或表达控制序列)的修饰可以是通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合对表达控制区(或表达控制序列)的突变，或用活性较弱的序列替换。表达控制区包括启动子、操纵序列、编码核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列，但不限于此。

项目3)中对编码起始密码子的核苷酸序列或编码所述多肽的基因转录物的5′-UTR区的修饰可以是，例如，用编码另一种所述多肽表达率较低的起始密码子而不是内源起始密码子的核苷酸序列取代，但不限于此。

项目4)和5)中对氨基酸序列或多核苷酸序列的修饰可以是对序列的下列修饰：通过在所述多肽的氨基酸序列或编码所述多肽的多核苷酸序列中缺失、插入、非保守或保守取代或其组合，从而减弱所述多肽的活性，或者是用经修饰以具有较弱活性的氨基酸序列或多核苷酸序列或经修饰以不具有活性的氨基酸序列或多核苷酸序列进行的替换，但不限于此。例如，可通过将突变引入多核苷酸序列以形成终止密码子来抑制或减弱基因的表达。

项目6)中与编码所述多肽的基因转录物互补结合的反义寡核苷酸(例如，反义RNA)的导入可参考例如文献(Weintraub,H.et al.,Antisense-RNA as a Genetics,Vol.1(1)1986)。

项目7)中在编码所述多肽的基因的Shine–Dalgarno序列上游添加与Shine–Dalgarno序列互补的序列以形成使核糖体不能附着的二级结构可以使mRNA翻译不可能或降低其翻译率。

项目8中向编码所述多肽的基因序列的开放阅读框(ORF)的3’端添加逆转录启动子(逆转录工程，RTE)可以使反义核苷酸与编码所述多肽的基因的转录物互补，从而减弱所述多肽的活性。

本公开微生物中的多核苷酸的部分或全部的修饰可通过以下诱导：(a)基因组编辑，其采用同源重组或工程化核酸酶(例如，CRISPR-Cas9)——使用用于在微生物中供染色体插入的载体，和/或(b)用光(如紫外光和辐射)和/或化学物质处理，但不限于此。修饰基因的部分或全部的方法可包括使用DNA重组技术的方法。例如，可将核苷酸序列或含有与靶基因同源的核苷酸序列的载体导入微生物中以引起同源重组，从而导致基因的部分或全部缺失。待导入的核苷酸序列或载体可包括显性选择标记，但不限于此。

此外，本公开的重组微生物可以是磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)、磷酸丝氨酸氨基转移酶(SerC)或其组合当中任一者的活性与其内源活性相比被进一步增强的微生物。

本公开的SerA是具有将3-磷酸甘油酸转化为3-磷酸羟基丙酮酸的活性的蛋白质。本公开的SerC是具有将3-磷酸-羟基丙酮酸转化为OPS的活性的蛋白质。因此，任何具有增强的SerA和/或SerC活性的微生物都可有效地用作生产OPS的微生物。

本公开的SerA可以是包括SEQ ID NO:5或6的氨基酸序列的蛋白质。SEQ ID NO:5的氨基酸序列是野生型SerA的序列，而SEQ ID NO:6的氨基酸序列是其中对丝氨酸的反馈抑制被释放的SerA变体的序列。另外，SerA可包括与由SEQ ID NO:5或6描述的氨基酸序列具有80％以上，具体90％以上，更具体95％以上，甚至更具体99％以上的同一性的氨基酸序列，只要其显示出野生型SerA的活性或其中对丝氨酸的反馈抑制被释放的SerA变体的活性即可，但不限于此。其中对丝氨酸的反馈抑制被释放的SerA变体是指这样的蛋白质：通过插入、取代等对SerA编码基因引入修饰，从而维持防止丝氨酸或甘氨酸的反馈抑制的活性，或增强其活性，并且那些对丝氨酸反馈抑制被释放的SerA变体已是公知的(Grant,G.A.etal.,J.Biol.Chem.,39:5357–5361,1999；Grant,G.A.et al.,Biochem.,39:7316–7319,2000；Grant,G.A.et al.,J.Biol.Chem.,276:17844–17850,2001；Peters-Wendisch,P.etal.,Appl.Microbiol.Biotechnol,60:37–441,2002；EP 0943687 B)。

此外，编码野生型SerA或其中对丝氨酸的反馈抑制被释放的SerA变体的多核苷酸可包括编码由SEQ ID NO:5或6描述的任一氨基酸序列的核苷酸序列，但不限于此。由于密码子简并性或考虑到其中将表达多肽的生物体中优选的密码子，编码野生型SerA或其中对丝氨酸的反馈抑制被释放的SerA变体的多核苷酸序列可以在不改变多肽的氨基酸序列的范围内于编码区中经历各种修饰。编码野生型SerA或其中对丝氨酸的反馈抑制被释放的SerA变体的多核苷酸可以是例如包括SEQ ID NO:7或8的核苷酸序列的多核苷酸，或者可以是包括与SEQ ID NO:7或8的核苷酸序列具有80％以上，具体90％以上，更具体95％以上，甚至更具体99％以上的同源性的核苷酸序列的多核苷酸，但不限于此。

SerC可以是例如包括由SEQ ID NO:9描述的氨基酸序列的蛋白质，但不限于此。另外，SerC可包括与由SEQ ID NO:9描述的氨基酸序列具有80％以上，具体90％以上，更具体95％以上，甚至更具体99％以上的同一性的氨基酸序列，只要其显示出SerC的活性即可，但不限于此。

此外，编码SerC的多核苷酸可包括编码由SEQ ID NO:9描述的氨基酸序列的核苷酸序列。由于密码子简并性或考虑到其中将表达多肽的生物体中优选的密码子，编码SerC的多核苷酸可在不改变多肽的氨基酸序列的范围内于编码区中经历各种修饰。编码SerC的多核苷酸可包括例如SEQ ID NO:10的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有80％以上，具体90％以上，更具体95％以上，甚至更具体99％以上的同源性的核苷酸序列，但不限于此。

如本文所用，术语“与其内源活性相比增强”和增强方法与上述相同。

此外，本公开的重组微生物可以是将OPS导入细胞中或分解OPS的能力进一步减弱的微生物。

关于生产OPS的微生物的内容，除了上述那些之外，欧洲专利号2444481或美国专利申请公开号2012-0190081中的公开内容可用作本公开的参考。

在本公开的另一方面中，本公开提供了一种用于生产O-磷酸丝氨酸的方法，包括在培养基中培养用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物，其中mdtH蛋白的活性与其内源活性相比得到增强。

mdtH蛋白、内源活性、增强、O-磷酸丝氨酸和微生物如上所述。

如本文所用，术语“培养”是指使微生物在适当控制的环境条件下生长。本公开的培养过程可在本领域已知的合适的培养基和培养条件下进行。这种培养过程可根据待选择的菌株容易地被本领域技术人员调节以供使用。具体地，培养可以是分批培养、连续培养和补料-分批培养，但不限于此。

在培养SerB活性与其内源活性相比减弱的的重组微生物时，培养基可进一步含有甘氨酸或丝氨酸——在诱导微生物的丝氨酸需求时。甘氨酸可以以纯化的甘氨酸、含甘氨酸的酵母提取物或胰蛋白胨的形式提供。培养基中所含的甘氨酸浓度大致为0.1g/L至10g/L，具体地0.5g/L至3g/L。另外，丝氨酸可以以纯化的丝氨酸、含丝氨酸的酵母提取物或胰蛋白酶的形式提供。培养基中所含的丝氨酸浓度大致为0.1g/L至5g/L，具体地0.1g/L至1g/L。

培养基中所含的碳源的实例可包括糖和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，如大豆油、葵花籽油、蓖麻油和椰子油等；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，如甘油和乙醇等；和有机酸，如乙酸。这些碳源可单独使用或组合使用，但不限于此。

培养基中所含的氮源的实例可包括有机氮源，如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆和豆粉；和无机氮源，如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可单独使用或组合使用，但不限于此。

培养基中所含的磷源的实例可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和对应的含钠盐，但不限于此。

另外，培养基可包含金属盐，如硫酸镁或硫酸铁，并且可进一步含有氨基酸、维生素和适当的前体。这些培养基或前体可以以分批培养或连续培养的形式被添加到培养物中，但不限于此。

培养物的pH可通过在培养过程中以适当的方式添加诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸之类的化合物来调节。另外，可在培养过程中利用消泡剂如脂肪酸聚二醇酯来防止气泡形成。进一步，可将氧气或含氧气体注入培养物以维持培养物的有氧条件；或者可在不注入气体的情况下或通过注入氮气、氢气或二氧化碳来维持无氧或微氧条件。培养物的温度可在25℃至40℃的范围内，具体是30℃至35℃。培养可以持续，直到可获得所期望的材料的生产，并且可具体地实施10小时至100小时，但不限于这些示例性实例。

根据本公开的生产O-磷酸丝氨酸的方法例如在培养步骤之前可进一步包括制备本公开的微生物、制备用于培养菌株的培养基或其任何组合(不考虑顺序，以任意顺序)。

根据本公开的生产O-磷酸丝氨酸的方法可进一步包括在培养之后从培养基(进行所述培养的培养基)或本公开的微生物中回收O-磷酸丝氨酸。在培养步骤之后可进一步包括回收步骤。

回收可以是使用本公开的培养方法，例如本领域已知的适当的方法如分批法、连续法和补料-分批法收集所期望的O-磷酸丝氨酸。例如，离心、过滤、用蛋白质沉淀剂(盐析)处理、萃取、超声崩解、超滤、透析、各种色谱方法如分子筛色谱法(凝胶渗透)、吸附色谱法、离子交换色谱法和亲和色谱法、高效液相色谱法(HPLC)、其任意组合都可使用，并且可使用本领域公知的适当的方法从培养基或微生物中回收所期望的O-磷酸丝氨酸。

此外，本公开的生产O-磷酸丝氨酸的方法可进一步包括纯化O-磷酸丝氨酸。纯化步骤可使用本领域公知的适当的方法进行。在一个实施方式中，当本公开的生产O-磷酸丝氨酸的方法包括回收步骤和纯化步骤两者时，回收步骤和纯化步骤可以连续地或不连续地进行，而不管顺序如何，或者可同时或作为一个整体步骤进行，但不限于此。

在本公开的方法中，变体、多核苷酸、载体、微生物等如上所述。

在本发明的另一方面中，本发明提供了一种用于生产半胱氨酸或其衍生物的方法，包括：

a)通过在培养基中培养用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物来生产O-磷酸丝氨酸或含有O-磷酸丝氨酸的培养基，其中mdtH蛋白的活性与其内源活性相比得到增强；和

b)在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或包含其的微生物的存在下，使步骤a)中生产的O-磷酸丝氨酸或含有其的培养基与硫化物(sulfide)反应。

如本文所用，“包括/包含”关于微生物的特定蛋白质是指感兴趣的特定蛋白质被导入该微生物中或在微生物中表达的状态。

如本文所用，术语“衍生物”是指通过化学修饰任何化合物的部分而获得的相似化合物。该术语通常指代其中氢原子或具体原子基团被其它原子或原子基团取代的化合物。

如本文所用，术语“半胱氨酸衍生物”是指半胱氨酸的氢原子或具体原子基团被其它原子或原子基团取代的化合物。例如，半胱氨酸衍生物可具有如下形式：其中半胱氨酸中的氨基(–NH₂)的氮原子或硫醇基(–SH)的硫原子有其它原子或原子基团与其附接，并且半胱氨酸衍生物的实例可包括NAC(N-乙酰半胱氨酸)、SCMC(S-羧甲基半胱氨酸)、Boc-Cys(Me)-OH、(R)-S-(2-氨基-2-羧乙基)-L-高半胱氨酸、(R)-2-氨基-3-磺基丙酸、D-2-氨基-4-(乙基硫)丁酸、3-亚磺基-L-丙氨酸、Fmoc-Cys(Boc-甲基)-OH、硒基-L-胱氨酸、S-(2-噻唑基)-L-半胱氨酸、S-(2-噻吩基)-L-半胱氨酸、S-(4-甲苯基)-L-半胱氨酸等，但不限于此。

只要半胱氨酸是根据本公开的方法生产的，半胱氨酸就可转化为各种半胱氨酸衍生物，并且向半胱氨酸衍生物的转化就能够容易地通过本领域公知的方法实现。

具体地，生产半胱氨酸衍生物的方法可还包括将步骤b)中生产的半胱氨酸转化为半胱氨酸衍生物。例如，半胱氨酸可通过与乙酰化剂的反应被合成为N-乙酰半胱氨酸(NAC)，或者其可通过在碱性条件下与卤代乙酸的反应被合成为S-羧甲基半胱氨酸(SCMC)，但方法不限于此。

这些半胱氨酸衍生物主要用作药物材料，用于镇咳剂、止咳剂(cough-relievingagents)以及支气管炎、支气管哮喘、咽喉炎等的治疗剂，但不限于此。

如本文所用，术语“O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)”是指这样的酶：其催化通过向OPS赋予硫醇基(SH基团)而使OPS转化为半胱氨酸的反应。该酶可能首次被发现于敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、包皮垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)(Mino,K.andIshikawa,K.,FEBS Letters,551:133–138,2003；Burns,K.E.et al.,J.Am.Chem.Soc.,127:11602–11603,2005)。另外，OPSS可不仅包括野生型OPSS蛋白，而且包括在编码OPSS的多核苷酸序列的部分中包括缺失、取代或添加的、显示等同于或高于野生型OPSS蛋白的生物活性的变体蛋白，并且可还包括在欧洲专利号2444481和美国专利号9127324中公开的所有OPSS蛋白及其蛋白变体。

硫化物可以是不仅以本领域常用的固体形式提供的，而且以液体或气体形式提供——由于pH、压力和溶解度的差异——的任何硫化物，并且因此可转化为硫醇(SH)基团——以硫根(sulfide,S^2-)或硫代硫酸根(S₂O₃ ^2-)的形式。具体地，硫化物可包括Na₂S、NaSH、H₂S、(NH₄)₂S和Na₂S₂O₃——其可向OPS提供硫醇基，但不限于此。在反应中，单个硫醇基被提供给单个反应性OPS基团以产生单个半胱氨酸或其衍生物。在此反应中，硫化物具体地以，基于OPS的摩尔浓度，0.1至3摩尔当量，具体地1至2摩尔当量的量被添加，但不限于此。

此外，本公开的方法可进一步包括回收在上述反应步骤中生产的半胱氨酸的步骤。具体地，可利用本领域已知的适当反应，通过从反应溶液分离和纯化来回收期望的半胱氨酸。

在本公开的又一个方面中，本公开提供了用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物生产O-磷酸丝氨酸、半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的用途，其中mdtH蛋白的活性与其内源活性相比得到增强。

在本公开的再又一方面中，本公开提供了mdtH蛋白将O-磷酸丝氨酸从微生物中输出的用途。

mdtH蛋白、内源活性、增强、O-磷酸丝氨酸、半胱氨酸、半胱氨酸衍生物和微生物如上所述。

实施本发明的方式

在下文中，将通过实施例的方式更详细地描述本发明。然而，对于本公开所属领域技术人员显而易见的是，提供这些实施例仅仅是出于示例目的，并且本发明的范围并不旨在被这些实施例所限制。

实施例1：mdtH膜蛋白的鉴定

为了鉴定参与OPS输出的大肠杆菌膜蛋白，使用大肠杆菌野生型菌株大肠杆菌W3110(ATCC27325)的基因组DNA文库进行了筛选。

为了建立OPS抑制大肠杆菌生长的条件，制备了用于生产OPS的参考菌株。筛选参考菌株是这样的生产OPS的菌株：经过突变，减弱了W3110中内源性磷酸丝氨酸磷酸酶(serB)的活性，并命名为CA07-0012(KCCM11212P，欧洲专利号2444481；美国专利申请公开号2012-0190081)。

在含有OPS的培养基中培养CA07-0012以建立显示出生长抑制的最佳筛选条件。通过电穿孔将W3110基因组文库质粒转化到CA07-0012中(van der Rest et al.1999)，并选择在补充过量OPS的培养基条件下生长抑制被释放的菌落。从选择的菌落获得质粒，并通过测序技术分析核苷酸序列。由此，鉴定出在补充过量OPS的条件下参与释放生长抑制的两种类型的大肠杆菌膜蛋白。

结果，编码大肠杆菌膜蛋白(SEQ ID NO:1)的基因被鉴定为属于主要促进因子超家族(MFS)的mdtH转运蛋白。

实施例2：mdtH过表达载体的制备

当mdtH——参与OPS引起的生长抑制的释放——在各个生产OPS的菌株中被增强时，针对各个基因制备过表达载体以确认OPS输出能力是否被提高。此外，当生产OPS的菌株中磷酸丝氨酸输出蛋白yhhS被增强时，证实了OPS浓度增加(WO 2016/024771 A1)，因此其被用作阳性对照。此外，还以与mdtH相同的方式评估了属于主要促进因子超家族(MFS)的大肠杆菌膜蛋白yfaV MFS转运蛋白。用W3110基因组DNA为模板(SEQ IDNO:2)，通过PCR获得了编码mdtH的DNA片段。用于制备各个膜蛋白基因的过表达载体的引物序列示于下表1中。

[表1]

为了制备pCL_Ptrc-yhhS，用pCL_Ptrc-gfp(WO 2016/024771 A1)作为模板，并使用SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12进行PCR以获得Ptrc DNA片段。基于W3110为模板，采用SEQID NO:13和SEQ ID NO:14进行PCR，获得yhhS DNA片段。扩增的片段经历IST，其中pCL1920载体经过限制酶XbaI和HindIII处理，从而获得pCL_Ptrc-yhhS。IST(Gibson,D.G.et al.,NATURE METHODS,第6卷,第5期,2009年5月,NEBuilder HiFi DNAAssembly Master Mix)是指使用Gibson assembly方法进行克隆的方法，以下继续称为IST。

为了制备pCL_Ptrc-mdtH，还用pCL_Ptrc-gfp作为模板，并使用SEQ ID NO:15和16获得Ptrc DNA片段。基于W3110为模板，采用SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18获得mdtH DNA片段，并以与pCL_Ptrc-yhhS相同的方式通过IST制备pCL_Ptrc-mdtH。

以与这两个质粒的制备相同的方式还克隆了pCL_Ptrc-yfaV，并用pCL_Ptrc-gfp为模板获得了Ptrc DNA片段，并且用W3110为模板获得了yfaV DNA片段。作为引物，针对Ptrc使用SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20进行PCR，而针对yfaV使用SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:22进行PCR。

实施例3：mdtH MFS转运蛋白增强菌株的制备及其OPS生产能力的评价

3-1.利用CA07-0012制备mdtH MFS转运蛋白增强菌株及其OPS生产能力评价

制备菌株，实施例2中制备的三种质粒各自被导入生产OPS的菌株CA07-0012中，并评价其OPS生产能力。

将各个菌株铺板在固体LB培养基上，然后在33℃培养箱中培养过夜。将在固体LB培养基中培养过夜的菌株接种到上表2所示的25mL滴度培养基中，然后在33℃培养箱中以200rpm的速率培养48小时。其生产OPS的能力示于表3中。

[表2]

培养基组成	量
		葡萄糖	40g
KH₂PO₄(KP1)	6g
		(NH₄)₂SO₄	17g
MgSO₄·7H₂O	1g
		MnSO₄·4H₂O	5mg
FeSO₄·7H₂O	10mg
		L-Glycine	2.5g/L
酵母提取物	3g/L
		CaCO₃	30g/L
pH	6.8

[表3]

菌株	OD_562nm	葡萄糖消耗(g/L)	O-磷酸丝氨酸(g/L)
				CA07-0012/pCL1920	50.6	40	1.3
CA07-0012/pCL_Ptrc-yhhS	45.1	40	2.3
				CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH	38.2	40	2.4
CA07-0012/pCL_Ptrc-yfaV	39.5	40	1.3

由表3可知，在大肠杆菌膜蛋白基因被另外地导入大肠杆菌来源的CA07-0012菌株的情况当中，与CA07-0012相比，yhhS增强菌株和mdtH增强菌株中OPS的产量增加。具体地，证实了本公开的mdtH增强菌株中OPS浓度提高约2倍。相比之下，在yfaV增强菌株——即对照组——的情况下，OPS的产量未增加。

因此，将CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH命名为CA07-0354。CA07-0354菌株于2020年8月28日按照布达佩斯条约被保藏在韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms,KCCM)，登录号为KCCM12781P。

3-2.使用serA增强菌株和serC增强菌株制备mdtH MFS转运蛋白增强菌株，并评估其生产OPS的能力

CA07-0022(KCCM11103P,美国专利号9689009)——一种生产OPS的菌株，通过增强作为OPS生物合成途径的serA(3-磷酸甘油酸脱氢酶)和serC(3-磷酸丝氨酸氨基转移酶)的活性而具有提高的生产OPS的能力——被用于测定大肠杆菌膜蛋白基因的效果，并结合serA和serC制备了膜蛋白基因的过表达载体。使用的引物序列示于下表4中。

[表4]

首先，制备pCL_Ptrc-serA*C以制备导入了serA和serC的阴性对照质粒。基于pCL_Ptrc-gfp为模板，使用SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24获得Ptrc DNA片段。基于pC_Prmf-serA*C(WO 2016/024771 A1)为模板，使用SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26进行PCR以获得serA*C DNA片段。扩增的片段经历IST，其中pCL1920载体经过限制酶XbaI和HindIII处理，从而获得pCL_Ptrc-serA*C。

为了制备pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS，基于上面制备的pCL_Ptrc-yhhS为模板，使用SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28进行PCR。由此，获得Ptrc-yhhS DNA片段。扩增的片段经历IST，其中pCL_Ptrc-serA*C载体经HindIII处理，从而获得pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS。

以与pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS相同的方式还制备了pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-mdtH和pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yfaV。Ptrc-mdtH DNA片段是基于pCL_Ptrc-mdtH为模板，使用SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30获得的，而Ptrc-yfaV DNA片段是基于pCL_Ptrc-yfaV为模板，使用SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32获得的。

通过将制备的质粒导入生产OPS的菌株CA07-0022中，证实了生产OPS的能力，并且结果示于下表5中。

[表5]

如上表5所示，在大肠杆菌膜蛋白基因被另外地导入CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C的菌株当中，其与源自大肠杆菌的CA07-0012菌株相比具有提高的生产OPS的能力，再次证实了与对照相比，在yhhS增强菌株——即阳性对照——中OPS的产量增加。具体地，在根据本公开的mdtH增强菌株的情况下，OPS浓度增加，类似于表3中所示的结果。相比之下，在yfaV增强组——即对照组——的情况下，OPS产量与对照组相比是降低的。

3-3.根据染色体启动子强度制备mdtH转运蛋白增强菌株并评价其生产OPS的能力

为了确认在染色体上用更强的启动子替代mdtH的启动子时是否会提高输出能力，制备了用trc启动子取代自体启动子的菌株，并对其生产OPS的能力进行了评价。将trc启动子导入大肠杆菌染色体的方法通过以下常用方法实施。对于染色体插入，使用具有PI蛋白(pir基因)依赖性R6K复制子并且其中导入了sacB(蔗糖果聚糖酶(Levansucrase))基因的pSKH130载体。此外，该载体还含有卡那霉素抗性基因——其被用作制备菌株用的选择标记。在使用该载体初次交换(first crossover)时用R6K和卡那霉素获得所期望的菌株后，从含有蔗糖的培养基中除去抗生素以制备菌株。为了在CA07-0022中用trc替换mdtH的启动子，制备了pSKH130_Ptrc-mdtH载体，并且所用引物序列示于下表6中。

[表6]

为了制备pSKH130_Ptrc-mdtH，通过使用SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34进行基于W3110的PCR获得mdtHUP DNA片段。此外，通过使用SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36，基于上面制备的pCL_Ptrc-mdtH进行PCR获得Ptrc-mdtH DNA片段。扩增的片段经历IST，其中pSKH130载体经过限制酶EcoRV处理，从而获得pSKH_mdtHUP_Ptrc-mdtH。通过电穿孔将由此获得的质粒转化到CA7-0022菌株中。在通过重组(交换)于补充有卡那霉素的LB固体培养基中选择导入染色体的菌株后，在含有蔗糖的培养基中通过二次重组(置换)从染色体上切下质粒区域。使用SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的引物(CA07-0022::Ptrc-mdtH)获得了完成二次重组的菌株。

为了测定所制备的生产OPS的菌株的效果，生产OPS的能力示于下表7中。

[表7]

菌株	OD_562nm	葡萄糖消耗(g/L)	O-磷酸丝氨酸(g/L)
				CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C	42.4	40	3.5
CA07-0022::Ptrc-mdtH/pCL_Ptrc-serA*C	38.2	40	4.0

结果，如表7所示，当通过增强启动子来增加大肠杆菌膜蛋白的表达时，证实了与对照组相比OPS浓度增加。

实施例4：3-磷酸甘油酸输出的比较

OPS是一种含有磷酸且化学结构类似于3-磷酸甘油酸(以下称为3PG)的物质。因此，假设OPS输出蛋白可释放3PG，并在OPS输出蛋白增强的菌株中测量生产3PG的能力。使用高效液相色谱(HPLC)仪测量3PG，并且生产3PG的能力示于下表8中。

[表8]

菌株	OD₅₆₂ _nm	OPS(g/L)	3PG(g/L)
				CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C	45.0	3.5	0.2
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yhhS	35.1	7.6	2.6
				CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-mdtH	30.0	7.8	0.3
CA07-0022/pCL_Ptrc-serA*C_Ptrc-yfaV	25.9	3.2	0.3

如表8所示，3PG在yhhS增强菌株中积累，但在mdtH膜蛋白增强菌株中3PG没有增加。也就是说，证实了导入mdtH的菌株提高了输出OPS的能力，并且针对OPS特异性的输出能力也得以提高。

本领域普通技术人员将认识到，本公开可以以其它具体形式来实施，而不脱离其精神或本质特征。所描述的实施方式在所有方面都仅被认为是示例性而非限制性的。因此，本公开的范围由所附权利要求而非前文描述指明。所有落入权利要求的等同意义和范围内的变化都被包含在本公开的范围内。

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<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 新型O-磷酸丝氨酸输出蛋白和使用其生产O-磷酸丝氨酸、半胱氨酸和半胱氨酸衍生物的方法

<130> OPA21268-PCT

<150> KR 10-2020-0115569

<151> 2020-09-09

<160> 38

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 402

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> mdtH

<400> 1

Met Ser Arg Val Ser Gln Ala Arg Asn Leu Gly Lys Tyr Phe Leu Leu

1 5 10 15

Ile Asp Asn Met Leu Val Val Leu Gly Phe Phe Val Val Phe Pro Leu

20 25 30

Ile Ser Ile Arg Phe Val Asp Gln Met Gly Trp Ala Ala Val Met Val

35 40 45

Gly Ile Ala Leu Gly Leu Arg Gln Phe Ile Gln Gln Gly Leu Gly Ile

50 55 60

Phe Gly Gly Ala Ile Ala Asp Arg Phe Gly Ala Lys Pro Met Ile Val

65 70 75 80

Thr Gly Met Leu Met Arg Ala Ala Gly Phe Ala Thr Met Gly Ile Ala

85 90 95

His Glu Pro Trp Leu Leu Trp Phe Ser Cys Leu Leu Ser Gly Leu Gly

100 105 110

Gly Thr Leu Phe Asp Pro Pro Arg Ser Ala Leu Val Val Lys Leu Ile

115 120 125

Arg Pro Gln Gln Arg Gly Arg Phe Phe Ser Leu Leu Met Met Gln Asp

130 135 140

Ser Ala Gly Ala Val Ile Gly Ala Leu Leu Gly Ser Trp Leu Leu Gln

145 150 155 160

Tyr Asp Phe Arg Leu Val Cys Ala Thr Gly Ala Val Leu Phe Val Leu

165 170 175

Cys Ala Ala Phe Asn Ala Trp Leu Leu Pro Ala Trp Lys Leu Ser Thr

180 185 190

Val Arg Thr Pro Val Arg Glu Gly Met Thr Arg Val Met Arg Asp Lys

195 200 205

Arg Phe Val Thr Tyr Val Leu Thr Leu Ala Gly Tyr Tyr Met Leu Ala

210 215 220

Val Gln Val Met Leu Met Leu Pro Ile Met Val Asn Asp Val Ala Gly

225 230 235 240

Ala Pro Ser Ala Val Lys Trp Met Tyr Ala Ile Glu Ala Cys Leu Ser

245 250 255

Leu Thr Leu Leu Tyr Pro Ile Ala Arg Trp Ser Glu Lys His Phe Arg

260 265 270

Leu Glu His Arg Leu Met Ala Gly Leu Leu Ile Met Ser Leu Ser Met

275 280 285

Met Pro Val Gly Met Val Ser Gly Leu Gln Gln Leu Phe Thr Leu Ile

290 295 300

Cys Leu Phe Tyr Ile Gly Ser Ile Ile Ala Glu Pro Ala Arg Glu Thr

305 310 315 320

Leu Ser Ala Ser Leu Ala Asp Ala Arg Ala Arg Gly Ser Tyr Met Gly

325 330 335

Phe Ser Arg Leu Gly Leu Ala Ile Gly Gly Ala Ile Gly Tyr Ile Gly

340 345 350

Gly Gly Trp Leu Phe Asp Leu Gly Lys Ser Ala His Gln Pro Glu Leu

355 360 365

Pro Trp Met Met Leu Gly Ile Ile Gly Ile Phe Thr Phe Leu Ala Leu

370 375 380

Gly Trp Gln Phe Ser Gln Lys Arg Ala Ala Arg Arg Leu Leu Glu Arg

385 390 395 400

Asp Ala

<210> 2

<211> 1209

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> mdtH

<400> 2

atgtcccgcg tgtcgcaggc gaggaacctg ggtaaatatt tcctgctcat cgataatatg 60

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accggtatgc tgatgcgcgc cgccggattc gccacaatgg gtatcgccca cgaaccgtgg 300

ctattgtggt tttcatgcct gctctcggga ctcggtggca cgttgtttga tccgccgcgt 360

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aatgcgtggt tgttaccagc atggaaactc tccaccgtac gcacgcccgt tcgcgaaggc 600

atgacccgcg tgatgcgtga caagcgtttt gtcacctatg ttctgacgct ggcgggttac 660

tacatgctgg ctgtacaagt gatgctgatg ctgccaatta tggtcaacga cgtggctggc 720

gcgccctctg ccgttaaatg gatgtatgcc attgaagcgt gtctgtcgtt aacgttgctc 780

taccctatcg cccgctggag tgaaaagcat tttcgtctgg aacaccggtt gatggctggg 840

ctgttgataa tgtcattaag catgatgccg gtgggcatgg tcagcggcct gcaacaactt 900

ttcaccctga tttgtctgtt ttatatcggg tcgatcattg ccgagcctgc gcgtgaaacc 960

ttaagtgctt cgctggcgga cgcaagagct cgcggcagct atatggggtt tagccgtctg 1020

ggtctggcga ttggcggcgc tattggttat atcggtggcg gctggctgtt tgacctgggc 1080

aaatcggcgc accagccaga gcttccgtgg atgatgctgg gcattattgg catcttcact 1140

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gacgcctga 1209

<210> 3

<211> 322

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> serB

<400> 3

Met Pro Asn Ile Thr Trp Cys Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Leu Trp

1 5 10 15

Pro Gly Leu Pro Leu Ser Leu Ser Gly Asp Glu Val Met Pro Leu Asp

20 25 30

Tyr His Ala Gly Arg Ser Gly Trp Leu Leu Tyr Gly Arg Gly Leu Asp

35 40 45

Lys Gln Arg Leu Thr Gln Tyr Gln Ser Lys Leu Gly Ala Ala Met Val

50 55 60

Ile Val Ala Ala Trp Cys Val Glu Asp Tyr Gln Val Ile Arg Leu Ala

65 70 75 80

Gly Ser Leu Thr Ala Arg Ala Thr Arg Leu Ala His Glu Ala Gln Leu

85 90 95

Asp Val Ala Pro Leu Gly Lys Ile Pro His Leu Arg Thr Pro Gly Leu

100 105 110

Leu Val Met Asp Met Asp Ser Thr Ala Ile Gln Ile Glu Cys Ile Asp

115 120 125

Glu Ile Ala Lys Leu Ala Gly Thr Gly Glu Met Val Ala Glu Val Thr

130 135 140

Glu Arg Ala Met Arg Gly Glu Leu Asp Phe Thr Ala Ser Leu Arg Ser

145 150 155 160

Arg Val Ala Thr Leu Lys Gly Ala Asp Ala Asn Ile Leu Gln Gln Val

165 170 175

Arg Glu Asn Leu Pro Leu Met Pro Gly Leu Thr Gln Leu Val Leu Lys

180 185 190

Leu Glu Thr Leu Gly Trp Lys Val Ala Ile Ala Ser Gly Gly Phe Thr

195 200 205

Phe Phe Ala Glu Tyr Leu Arg Asp Lys Leu Arg Leu Thr Ala Val Val

210 215 220

Ala Asn Glu Leu Glu Ile Met Asp Gly Lys Phe Thr Gly Asn Val Ile

225 230 235 240

Gly Asp Ile Val Asp Ala Gln Tyr Lys Ala Lys Thr Leu Thr Arg Leu

245 250 255

Ala Gln Glu Tyr Glu Ile Pro Leu Ala Gln Thr Val Ala Ile Gly Asp

260 265 270

Gly Ala Asn Asp Leu Pro Met Ile Lys Ala Ala Gly Leu Gly Ile Ala

275 280 285

Tyr His Ala Lys Pro Lys Val Asn Glu Lys Ala Glu Val Thr Ile Arg

290 295 300

His Ala Asp Leu Met Gly Val Phe Cys Ile Leu Ser Gly Ser Leu Asn

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Gln Lys

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<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> serB

<400> 4

atgcctaaca ttacctggtg cgacctgcct gaagatgtct ctttatggcc gggtctgcct 60

ctttcattaa gtggtgatga agtgatgcca ctggattacc acgcaggtcg tagcggctgg 120

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<210> 5

<211> 410

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> SerA野生型

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Met Ala Lys Val Ser Leu Glu Lys Asp Lys Ile Lys Phe Leu Leu Val

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Glu Gly Val His Gln Lys Ala Leu Glu Ser Leu Arg Ala Ala Gly Tyr

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Thr Asn Ile Glu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Asp Glu Gln Leu Lys

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Leu Thr Glu Asp Val Ile Asn Ala Ala Glu Lys Leu Val Ala Ile Gly

65 70 75 80

Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gln Val Asp Leu Asp Ala Ala Ala Lys

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Glu Ala Asn Ala Lys Ala His Arg Gly Val Trp Asn Lys Leu Ala Ala

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Gly Ser Phe Glu Ala Arg Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly

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His Ile Gly Thr Gln Leu Gly Ile Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met Tyr

165 170 175

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Gln Val Gln His Leu Ser Asp Leu Leu Asn Met Ser Asp Val Val Ser

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Leu His Val Pro Glu Asn Pro Ser Thr Lys Asn Met Met Gly Ala Lys

210 215 220

Glu Ile Ser Leu Met Lys Pro Gly Ser Leu Leu Ile Asn Ala Ser Arg

225 230 235 240

Gly Thr Val Val Asp Ile Pro Ala Leu Cys Asp Ala Leu Ala Ser Lys

245 250 255

His Leu Ala Gly Ala Ala Ile Asp Val Phe Pro Thr Glu Pro Ala Thr

260 265 270

Asn Ser Asp Pro Phe Thr Ser Pro Leu Cys Glu Phe Asp Asn Val Leu

275 280 285

Leu Thr Pro His Ile Gly Gly Ser Thr Gln Glu Ala Gln Glu Asn Ile

290 295 300

Gly Leu Glu Val Ala Gly Lys Leu Ile Lys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser

305 310 315 320

Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu Val Ser Leu Pro Leu His Gly

325 330 335

Gly Arg Arg Leu Met His Ile His Glu Asn Arg Pro Gly Val Leu Thr

340 345 350

Ala Leu Asn Lys Ile Phe Ala Glu Gln Gly Val Asn Ile Ala Ala Gln

355 360 365

Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Gln Met Gly Tyr Val Val Ile Asp Ile Glu

370 375 380

Ala Asp Glu Asp Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Ala Met Lys Ala Ile

385 390 395 400

Pro Gly Thr Ile Arg Ala Arg Leu Leu Tyr

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<210> 6

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SerA突变体型

<400> 6

Met Ala Lys Val Ser Leu Glu Lys Asp Lys Ile Lys Phe Leu Leu Val

1 5 10 15

Glu Gly Val His Gln Lys Ala Leu Glu Ser Leu Arg Ala Ala Gly Tyr

20 25 30

Thr Asn Ile Glu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Asp Glu Gln Leu Lys

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65 70 75 80

Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gln Val Asp Leu Asp Ala Ala Ala Lys

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Glu Ala Asn Ala Lys Ala His Arg Gly Val Trp Asn Lys Leu Ala Ala

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Gly Ser Phe Glu Ala Arg Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly

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His Ile Gly Thr Gln Leu Gly Ile Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met Tyr

165 170 175

Val Tyr Phe Tyr Asp Ile Glu Asn Lys Leu Pro Leu Gly Asn Ala Thr

180 185 190

Gln Val Gln His Leu Ser Asp Leu Leu Asn Met Ser Asp Val Val Ser

195 200 205

Leu His Val Pro Glu Asn Pro Ser Thr Lys Asn Met Met Gly Ala Lys

210 215 220

Glu Ile Ser Leu Met Lys Pro Gly Ser Leu Leu Ile Asn Ala Ser Arg

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Gly Thr Val Val Asp Ile Pro Ala Leu Cys Asp Ala Leu Ala Ser Lys

245 250 255

His Leu Ala Gly Ala Ala Ile Asp Val Phe Pro Thr Glu Pro Ala Thr

260 265 270

Asn Ser Asp Pro Phe Thr Ser Pro Leu Cys Glu Phe Asp Asn Val Leu

275 280 285

Leu Thr Pro His Ile Gly Gly Ser Thr Gln Glu Ala Gln Glu Asn Ile

290 295 300

Gly Leu Glu Val Ala Gly Lys Leu Ile Lys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser

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Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu Val Ser Leu Pro Leu His Val

325 330 335

Gly Arg Arg Leu Met His Ile His Glu Asn Arg Pro Gly Val Leu Thr

340 345 350

Ala Leu Asn Lys Ile Phe Ala Glu Gln Gly Val Asn Ile Ala Ala Gln

355 360 365

Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Gln Met Gly Tyr Val Val Ile Asp Ile Glu

370 375 380

Ala Asp Glu Asp Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Ala Met Lys Ala Ile

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Pro Gly Thr Ile Arg Ala Arg Leu Leu Tyr

405 410

<210> 7

<211> 1233

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> SerA野生型

<400> 7

atggcaaagg tatcgctgga gaaagacaag attaagtttc tgctggtaga aggcgtgcac 60

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<210> 8

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SerA突变体型

<400> 8

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<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> SerC

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Glu Val Leu Lys Gln Ala Gln Gln Glu Leu Arg Asp Trp Asn Gly Leu

20 25 30

Gly Thr Ser Val Met Glu Val Ser His Arg Gly Lys Glu Phe Ile Gln

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Val Ala Glu Glu Ala Glu Lys Asp Phe Arg Asp Leu Leu Asn Val Pro

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Ser Asn Tyr Lys Val Leu Phe Cys His Gly Gly Gly Arg Gly Gln Phe

65 70 75 80

Ala Ala Val Pro Leu Asn Ile Leu Gly Asp Lys Thr Thr Ala Asp Tyr

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Val Asp Ala Gly Tyr Trp Ala Ala Ser Ala Ile Lys Glu Ala Lys Lys

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Tyr Cys Thr Pro Asn Val Phe Asp Ala Lys Val Thr Val Asp Gly Leu

115 120 125

Arg Ala Val Lys Pro Met Arg Glu Trp Gln Leu Ser Asp Asn Ala Ala

130 135 140

Tyr Met His Tyr Cys Pro Asn Glu Thr Ile Asp Gly Ile Ala Ile Asp

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Glu Thr Pro Asp Phe Gly Ala Asp Val Val Val Ala Ala Asp Phe Ser

165 170 175

Ser Thr Ile Leu Ser Arg Pro Ile Asp Val Ser Arg Tyr Gly Val Ile

180 185 190

Tyr Ala Gly Ala Gln Lys Asn Ile Gly Pro Ala Gly Leu Thr Ile Val

195 200 205

Ile Val Arg Glu Asp Leu Leu Gly Lys Ala Asn Ile Ala Cys Pro Ser

210 215 220

Ile Leu Asp Tyr Ser Ile Leu Asn Asp Asn Gly Ser Met Phe Asn Thr

225 230 235 240

Pro Pro Thr Phe Ala Trp Tyr Leu Ser Gly Leu Val Phe Lys Trp Leu

245 250 255

Lys Ala Asn Gly Gly Val Ala Glu Met Asp Lys Ile Asn Gln Gln Lys

260 265 270

Ala Glu Leu Leu Tyr Gly Val Ile Asp Asn Ser Asp Phe Tyr Arg Asn

275 280 285

Asp Val Ala Lys Ala Asn Arg Ser Arg Met Asn Val Pro Phe Gln Leu

290 295 300

Ala Asp Ser Ala Leu Asp Lys Leu Phe Leu Glu Glu Ser Phe Ala Ala

305 310 315 320

Gly Leu His Ala Leu Lys Gly His Arg Val Val Gly Gly Met Arg Ala

325 330 335

Ser Ile Tyr Asn Ala Met Pro Leu Glu Gly Val Lys Ala Leu Thr Asp

340 345 350

Phe Met Val Glu Phe Glu Arg Arg His Gly

355 360

<210> 10

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<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> SerC

<400> 10

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cacggttaa 1089

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yhhS_Ptrc_R

<400> 12

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<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yhhS_F

<400> 13

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<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yhhS_R

<400> 14

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<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mdtH_Ptrc_F

<400> 15

cggggatcct ctagacgctt gctgcaactc tctca 35

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<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mdtH_Ptrc_R

<400> 16

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mdtH_F

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mdtH_R

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yfaV_Ptrc_F

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cggggatcct ctagacgctt gctgcaactc tctca 35

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<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yfaV_Ptrc_R

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caaagcggtg ctcatgatat ctttcctgtg tgaaa 35

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yfaV_F

<400> 21

cacaggaaag atatcatgag caccgctttg cttga 35

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> yfaV_R

<400> 22

gattacgcca agcttttaat gatgtgccac gtcgg 35

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> serA*,serC_Ptrc_F

<400> 23

cggggatcct ctagaggtac ccgcttgctg caact 35

<210> 24

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> serA*,serC_Ptrc_R

<400> 24

cgataccttt gccatgatat ctttcctgtg tgaaa 35

<210> 25

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> serA*,serC_F

<400> 25

cacaggaaag atatcatggc aaaggtatcg ctgga 35

<210> 26

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> serA*,serC_R

<400> 26

gattacgcca agcttttaac cgtgacggcg ttcga 35

<210> 27

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> serA*,serC,yhhS_Ptrc-yhhS_F

<400> 27

cacggttaaa agcttcgctt gctgcaactc tctca 35

<210> 28

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> serA*,serC,yhhS_Ptrc-yhhS_R

<400> 28

gattacgcca agcttttaag atgatgaggc ggcct 35

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> serA*,serC,mdtH_Ptrc-mdtH_F

<400> 29

cacggttaaa agcttcgctt gctgcaactc tctca 35

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> serA*,serC,mdtH_Ptrc-mdtH_R

<400> 30

gattacgcca agctttcagg cgtcgcgttc aagca 35

<210> 31

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> serA*,serC,mdtH_Ptrc-yfaV_F

<400> 31

cacggttaaa agcttcgctt gctgcaactc tctca 35

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> serA*,serC,mdtH_Ptrc-yfaV_R

<400> 32

gattacgcca agcttttaat gatgtgccac gtcgg 35

<210> 33

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mdtHUP_F

<400> 33

caggaattcg atatctaatc tctttttcgt ccggg 35

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mdtHUP_R

<400> 34

gagttgcagc aagcgttccc ctcccgggaa ataaa 35

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ptrc-mdtH_F

<400> 35

ttcccgggag gggaacgctt gctgcaactc tctca 35

<210> 36

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ptrc-mdtH_R

<400> 36

gactagcgtg atatccagac caggcgaaag tcgta 35

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ptrc-mdtH_conf_F

<400> 37

caccgctgcg tttattgt 18

<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ptrc-mdtH_conf_R

<400> 38

aaacgcttgt cacgcatca 19

Claims

1.一种用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物，其中mdtH蛋白的活性与其内源活性相比得到增强。

2.根据权利要求1所述的微生物，其中O-磷酸丝氨酸输出活性与其内源活性相比得到增强。

3.根据权利要求1所述的微生物，其中所述mdtH蛋白包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的氨基酸序列，而同时具有O-磷酸丝氨酸输出活性。

4.根据权利要求1所述的微生物，其中磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)的活性与其内源活性相比得到进一步减弱。

5.根据权利要求1所述的微生物，其中磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)、磷酸丝氨酸氨基转移酶(SerC)或其组合中任一者的活性与其内源活性相比得到进一步增强。

6.根据权利要求1所述的微生物，其中所述重组微生物属于埃希氏菌属(Escherichia)。

7.一种用于生产O-磷酸丝氨酸的方法，包括在培养基中培养用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物，在所述重组微生物中mdtH蛋白的活性与其内源活性相比得到增强。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法还包括回收所培养的培养基或所述微生物中的O-磷酸丝氨酸。

9.一种用于生产半胱氨酸或其衍生物的方法，包括：

a)通过在培养基中培养用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物来生产O-磷酸丝氨酸或含有O-磷酸丝氨酸的培养基，在所述重组微生物中mdtH蛋白的活性与其内源活性相比得到增强；和

b)在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或含有其的微生物的存在下，使步骤a)中生产的所述O-磷酸丝氨酸或含有其的培养基与硫化物反应。

10.根据权利要求9所述的方法，其中用于生产半胱氨酸衍生物的方法还包括将步骤b)中生产的半胱氨酸转化为半胱氨酸衍生物。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述硫化物是选自Na₂S、NaSH、(NH₄)₂S、H₂S和Na₂S₂O₃中的至少一种。

12.用于生产O-磷酸丝氨酸、半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的重组微生物用于生产O-磷酸丝氨酸的用途，在所述重组微生物中mdtH蛋白的活性与其内源活性相比得到增强。

13.mdtH蛋白将O-磷酸丝氨酸从微生物中输出的用途。