CN110982833A - 一种对香豆酸响应的动态调控系统及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种对香豆酸响应的动态调控系统及其构建方法，属于代谢工程技术领域。本发明以对香豆酸响应蛋白PadR为基础，利用基因过表达技术和反义RNA抑制技术等调控手段，结合柚皮素合成代谢途径，建立了一种可感应胞内对香豆酸含量变化的动态调控系统。该动态调控系统可在对香豆酸过剩时强化丙二酰‑CoA合成，加速下游代谢途径，从而降低胞内对香豆酸积累量促进柚皮素合成，产量可提高至原来的1.5倍。本发明实现了细胞生长和产物合成之间的平衡，为其他高附加值化合物生产菌株的代谢工程改造提供了思路。

Description

一种对香豆酸响应的动态调控系统及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种对香豆酸响应的动态调控系统及其构建方法，属于代谢工程技术领域。
背景技术
对香豆酸是苯丙素类化合物合成的直接前体，同时其也具有多种生理功能，如利肝利胆、保护心脏、降血脂、抗癌和抗氧化等，已经在食品和药品领域被广泛应用。以大肠杆菌为底盘微生物合成苯丙素类化合物(如黄酮类化合物和芪类化合物)过程中，往往涉及到丙二酰-CoA的供给。胞内丙二酰-CoA的供给不足是导致最终产量较低和对香豆酸积累的重要原因。因此，强化微生物中丙二酰-CoA合成有助于降低对香豆酸积累和提高目标化合物产量。然而，丙二酰-CoA的前体乙酰-CoA大部分进入TCA循环，为菌体生长提供必须的能量。过量消耗乙酰-CoA合成丙二酰-CoA可能会导致菌体能量供应不足等问题。目前已有报道中，研究者主要通过抑制胞内脂肪酸合成途径，以及过表达丙二酰-CoA合成途径相关基因来强化积累丙二酰-CoA。
已有报道都是应用静态的代谢工程策略强化丙二酰-CoA合成，然而细胞生长以及能量消耗都是一个动态的变化过程。静态代谢工程策略在实施过程中添加诱导剂的时间、诱导时间、诱导剂浓度和菌体的生长状态等都对最终产量具有较大影响。因此，构建稳定、高效、可动态调节对香豆酸积累、丙二酰-CoA合成、细胞生长和产物合成的动态调控平台菌株至关重要。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种动态响应对香豆酸含量调控丙二酰-CoA合成途径的方法，从而进一步强化下游苯丙素类化合物合成。
本发明的第一个目的是提供一种动态响应对香豆酸含量调控丙二酰-CoA合成途径的方法，是利用动态响应对香豆酸含量的生物传感器调控丙二酰-CoA合成途径，所述生物传感器包括对香豆酸响应的调控蛋白PadR和受PadR调控的启动子PPadC，所述调控蛋白PadR的氨基酸序列如NCBI-Protein ID:NP_388715所示。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子PPadC包括PPadC(608-1)、PPadC(608-496)、PPadC(608-476)、PPadC(608-456)、PPadC(216-1)、PPadC(216-39)、PPadC(216-79)或PPadC(216-123)。所述PPadC(608-1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
以PPadC(608-1)3’端第一个核苷酸为1位、5’端第一个核苷酸为608位计算，PPadC(608-496)、PPadC(608-476)、PPadC(608-456)、PPadC(216-1)、PPadC(216-39)、PPadC(216-79)或PPadC(216-123)启动子所在区域分别为608-496、608-476、608-456、216-1、216-39、216-79和216-123区域(5’-3’)。
在本发明的一种实施方式中，编码所述调控蛋白PadR的基因的核苷酸序列如NCBI-Gene ID:936174所示。
在本发明的一种实施方式中，所述调控丙二酰-CoA合成途径包括利用PPadC启动子调控丙二酰-CoA合成途径基因或其反义RNA，抑制TCA循环，强化丙二酰-CoA积累。
在本发明的一种实施方式中，所述调控丙二酰-CoA合成途径是利用反义RNA抑制策略调控TCA循环中编码柠檬酸脱氢酶的gltA基因，并过表达编码乙酸激酶的acs基因和编码乙酰-CoA羧化酶的ACC基因。
所述反义RNA，含有一个PT发夹回文结构携带目标基因的互补序列，以及一个rrnB终止子结构。
本发明的第二个目的是提供一种动态响应对香豆酸含量的生物传感器，包括对香豆酸响应的调控蛋白PadR和受PadR调控的启动子PPadC，所述启动子PPadC包括PPadC(608-1)、PPadC(608-496)、PPadC(608-476)、PPadC(608-456)、PPadC(216-1)、PPadC(216-39)、PPadC(216-79)或PPadC(216-123)。
本发明的第三个目的是提供一种动态响应对香豆酸含量的载体，含有上述生物传感器。
在本发明的一种实施方式中，所述载体是以pRSM3为基础构建的。所述pRSM3的构建方法公开于Xu,P.,et al.(2012)."ePathBrick:A synthetic biology platform forengineering metabolic pathways in E.coli."ACS Synthetic Biology 1(7):256-266中。
本发明的第四个目的是提供一种动态响应对香豆酸含量的工程菌株，以上述载体为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述工程菌株以大肠杆菌为宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述工程菌株过表达acs和ACC基因，抑制gltA基因的表达。
本发明的第五个目的是提供上述生物传感器在食品或制药领域中的应用。
本发明的有益之处：
本发明建立了一种动态响应胞内对香豆酸含量的生物传感器，通过调控丙二酰-CoA合成途径，最终强化柚皮素的合成。此方法是首次建立的针对微生物发酵生产以柚皮素为代表的黄酮类化合物的动态调控方法，为黄酮类化合物的微生物法生产提供了一个高效的代谢调控体系。其他具有相似代谢途径的苯丙素类化合物合成同样可采用此方法。与传统的静态调控方法相比较，本方法最大的优势是无需添加诱导剂，可实现细胞生长、丙二酰-CoA积累以及柚皮素合成之间的动态平衡。更加有助于实现微生物全局代谢网络的平衡，强化苯丙素类化合物合成，可将柚皮素产量提高至原先的1.5倍。此外，此方法也为其他高附加值化合物的动态合成提供了思路。
附图说明
图1：启动子PPadC结构优化。A：T7启动子控制表达PadR阻遏蛋白的传感器示意图；B：不同长度PpadC启动子表达其强度。
图2：对香豆酸响应的动态调控模块，虚线箭头代表促进反应，虚线钝尖头代表抑制反应。
图3：不同丙二酰-CoA来源代谢途径基因组合与柚皮素产量关系。
图4：对香豆酸响应的丙二酰-CoA来源动态调控原理图。模块B：图2所示调控模块。
具体实施方式
材料与方法
柚皮素合成菌株为9G3，仅含有pCDM-PssrA-UTRrpsT-CHS-PUTRglpD-CHI和pETM-PUTRtrxA-TAL-PUTRtalB-4CL两个质粒用于合成柚皮素，公开于Zhou SH et al.,2019,Biotechnol Bioeng,116:1392-1404(DOI：10.1002/bit.26941)中，限制性内切酶和DNA聚合酶分别购自赛默飞和Takara公司，MOPS盐购自生工生物工程(上海)股份有限公司。多功能酶标仪Cytation 3plate reader(BioTek)用于检测样品荧光强度。大肠杆菌BL21(DE3)用于蛋白质表达和柚皮素合成，大肠杆菌JM109用于分子克隆。
pRSM3经过XbaI/KpnI双酶切后回收1900bp片段。从枯草芽孢杆菌168基因组上扩增“PadR-终止子”片段，经XbaI/KpnI双酶切后与pRSM3连接得到pRSM-PadR质粒。
pRSM3经过XbaI/KpnI双酶切后回收3700bp片段，并与XbaI/KpnI双酶切后的“PadR-终止子”DNA片段连接得到pRSM-T7-PadR质粒。
以枯草芽孢杆菌基因组为模板扩增不同长度的PpadC启动子区域。通过融合PCR将不同长度的PpadC启动子与EGFP连接，得到不同的PpadC-PQ-EGFP组合。随后BamHI/SpeI双酶切pRSM-T7-PadR质粒，并与同样酶切的PpadC-PQ-EGFP连接，构建得到不同的pRSM-T7-PadR-PpadC(P-Q)-EGFP质粒(P-Q组合分别为608-1、608-496、608-476、608-456、216-1、216-39、216-79和216-123)。
以大肠杆菌MG1655基因组为模板扩增对数期表达PcspA启动子，随后经过XbaI/AscI双酶切后连接pRSM-PadR质粒得到pRSM-PcspA-PadR质粒，从而使PadR的在对数期表达且避免对依赖IPTG诱导的依赖。以pRSM-PcspA-PadR质粒为基础，连接PpadC(608-476)-EGFP得到pRSM-PcspA-PadR-PpadC(608-476)-EGFP质粒，获得受对香豆酸诱导的生物传感器。
利用融合PCR融合PpadC(608-476)和ACC、PpadC(608-476)和acs、PpadC(608-496)和PtasgltA，分别构建得到PpadC(608-476)-ACC片段、PpadC(608-476)-acs和PpadC(608-496)-PTasgltA片段。以pRSM-PcspA-PadR质粒为骨架，首先利用Biobrick原理在XbaI/NdeI位点依次连接入PpadC(608-476)-acs和PpadC(608-496)-PTasgltA，得到pRSM-PadR-acs、pRSM-PadR-PTasgltA和pRSM-PadR-acs-PTasgltA质粒。以pRSM-PcspA-PadR，pRSM-PadR-acs，pRSM-PadR-PTasgltA和pRSM-PadR-acs-PTasgltA质粒为骨架，利用Biobrick原理在BamHI/SpeI位点连接padC(608-476)-ACC片段，得到质粒pRSM-PadR-ACC、pRSM-PadR-acs-ACC、pRSM-PadR-PTasgltA-ACC和pRSM-PadR-acs-PTasgltA-ACC。最后检测不同基因组合得到的柚皮素产量。
本发明构建的动态调控系统的工作机制：以L-酪氨酸为底物组成型表达柚皮素合成途径基因，当胞内丙二酰-CoA供应不足时会引起上游代谢中间产物对香豆酸积累，当对香豆酸浓度高时，对香豆酸可与PadR蛋白结合并激活受PadR蛋白调控的PpadC启动子，从而强化表达受PpadC启动子调控的acs、ACC和PTasgltA基因，这三个基因的表达会进一步强化乙酸转化为丙二酰-CoA，并且减弱丙二酰-CoA的合成前体乙酰-CoA的消耗途径(进入TCA循环)，最终强化丙二酰-CoA的合成。因此，本发明要解决的技术问题是，当丙二酰-CoA不足导致对香豆酸积累后，工程菌株自发地强化丙二酰-CoA合成，从而形成丙二酰-CoA的动态平衡。
附图说明以及以下实施例中所涉及的所有菌体培养都利用LB培养基，培养条件为37℃、220rpm。柚皮素发酵利用MOPS培养基，发酵条件为30℃、220rpm。
本发明涉及的基因的核苷酸序列如表1所示。
表1本发明涉及的基因的核苷酸序列
Figure BDA0002335268720000041
Figure BDA0002335268720000051
Figure BDA0002335268720000061
Figure BDA0002335268720000071
Figure BDA0002335268720000081
实施例1PPadC启动子结构精简及生物传感器功能验证
由于对香豆酸响应蛋白PadR的识别启动子PPadC的最小结构尚不清楚且结构复杂，而为了构建高效的调控体系必须利用最小长度的PPadC启动子。因此，利用启动子截短策略，从PPadC两端不同程度截短启动子，并利用截短的PPadC表达绿色荧光蛋白，克隆至pRSM-T7-PadR质粒的BamHI/SpeI位点，得到一系列的pRSM-T7-PadR-PpadC(P-Q)-EGFP质粒(图1A)。该质粒受到IPTG诱导表达PadR蛋白进而阻遏下游荧光蛋白表达，对香豆酸可与PadR蛋白结合从而解除阻遏效应，开启荧光蛋白表达。首先在LB培养基37℃培养过夜，次日以1％的接种量接种到新的LB培养基中30℃培养至OD600＝0.4-0.6，随后在添加0.01mM浓度IPTG和100mg/L对香豆酸诱导条件下，30℃诱导培养8h，最后以pH＝7.4的PBS缓冲液洗涤诱导后的细胞2次，并利用荧光酶标仪在488nm激发光和520nm发射光条件下测定荧光强度和OD600，检测绿色荧光蛋白表达水平。结果显示：PPadC启动子长度在608-476范围内，即PPadC(608-476)，具有较高强度，达38086荧光强度/OD600，且启动子长度最短(图1B)，可用于后续代谢调控。而由于608-496范围内启动子不包含RBS位点且同样具有较高的表达水平，可直接用于表达反义RNA。截短启动子下游区域(216-1)会导致启动子表达活性消失，说明PPadC启动子区域和蛋白质结合位点均处于上游区域(608-456)。
实施例2丙二酰-CoA合成途径优化
在实施例1的基础上，利用结构精简的PPadC启动子构建如图2所示调控系统。其中PPadC(608-496)启动子调控gltA基因的反义RNA表达，PPadC(608-476)启动子过表达acs和ACC基因，并组合表达上述基因。将7种途径优化组合(包括pRSM-PadR-acs、pRSM-PadR-PTasgltA、pRSM-PadR-acs-PTasgltA、pRSM-PadR-ACC、pRSM-PadR-acs-ACC、pRSM-PadR-PTasgltA-ACC和pRSM-PadR-acs-PTasgltA-ACC质粒)转化入柚皮素合成菌株中。首先挑取所有工程菌株的3个单克隆作为生物学平行，在LB培养基中37℃培养过夜，次日以1％的接种量接种到新鲜的MOPS培养基中30℃、220rpm培养48h。随后检测胞内生成的柚皮素产量。
结果显示：组合过表达acs和ACC基因时柚皮素产量最高，相对柚皮素合成对照菌株，产量是原来的1.5倍，达56mg/L(图3)。组合柚皮素合成途径与实施例1中所构建生物传感器后即形成一个对香豆酸响应的动态调控系统(图4)，当胞内对香豆酸积累后启动模块B基因表达，从而强化丙二酰-CoA的合成，为柚皮素合成的下游途径提供所需前体，最终实现降低对香豆酸积累、强化柚皮素合成的目的。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种对香豆酸响应的动态调控系统及其构建方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
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atccgcgcgc tgatggcgga aggcgataaa gcgatcgaag gcaccgaccg ttcgtcgctg 1140
cgcattctcg gttccgtggg cgagccaatt aacccggaag cgtgggagtg gtactggaaa 1200
aaaatcggca acgagaaatg tccggtggtc gatacctggt ggcagaccga aaccggcggt 1260
ttcatgatca ccccgctgcc tggcgctacc gagctgaaag ccggttcggc aacacgtccg 1320
ttcttcggcg tgcaaccggc gctggtcgat aacgaaggta acccgctgga gggggccacc 1380
gaaggtagcc tggtaatcac cgactcctgg ccgggtcagg cgcgtacgct gtttggcgat 1440
cacgaacgtt ttgaacagac ctacttctcc accttcaaaa atatgtattt cagcggcgac 1500
ggcgcgcgtc gcgatgaaga tggctattgc tggataaccg ggcgtgtgga cgacgtgctg 1560
aacgtctccg gtcaccgtct ggggacggca gagattgagt cggcgctggt ggcgcatccg 1620
aagaatgccg aagccgccgt agtaggtatt ccgcacaata ttaaaggtca ggcgatctac 1680
gcctacgtca cgcttaatca cggggaggaa ccgtcaccag aactgtacgc agaagtccgc 1740
aactgggtgc gtaaagagat tggcccgctg gcgacgccag acgtgctgca ctggaccgac 1800
tccctgccta aaacccgctc cggcaaaatt atgcgccgta ttctgcgcaa aattgcggcg 1860
ggcgatacca gcaacctggg cgatacctcg acgcttgccg atcctggcgt agtcgagaag 1920
ctgcttgaag agaagcaggc tatcgcgatg ccatcgtaa 1959
<210> 4
<211> 3411
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgtcagtcg agactaggaa gatcaccaag gttcttgtcg ctaaccgtgg tgagattgca 60
atccgcgtgt tccgtgcagc tcgagatgaa ggcatcggat ctgtcgccgt ctacgcagag 120
ccagatgcag atgcaccatt cgtgtcatat gcagacgagg cttttgccct cggtggccaa 180
acatccgctg agtcctacct tgtcattgac aagatcatcg atgcggcccg caagtccggc 240
gccgacgcca tccaccccgg ctacggcttc ctcgcagaaa acgctgactt cgcagaagca 300
gtcatcaacg aaggcctgat ctggattgga ccttcacctg agtccatccg ctccctcggc 360
gacaaggtca ccgctcgcca catcgcagat accgccaagg ctccaatggc tcctggcacc 420
aaggaaccag taaaagacgc agcagaagtt gtggctttcg ctgaagaatt cggtctccca 480
atcgccatca aggcagcttt cggtggcggc ggacgtggca tgaaggttgc ctacaagatg 540
gaagaagtcg ctgacctctt cgagtccgca acccgtgaag caaccgcagc gttcggccgc 600
ggcgagtgct tcgtggagcg ctacctggac aaggcacgcc acgttgaggc tcaggtcatc 660
gccgataagc acggcaacgt tgttgtcgcc ggaacccgtg actgctccct gcagcgccgt 720
ttccagaagc tcgtcgaaga agcaccagca ccattcctca ccgatgacca gcgcgagcgt 780
ctccactcct ccgcgaaggc tatctgtaag gaagctggct actacggtgc aggcaccgtt 840
gagtacctcg ttggctccga cggcctgatc tccttcctcg aggtcaacac ccgcctccag 900
gtggaacacc cagtcaccga agagaccacc ggcatcgacc tggtccgcga aatgttccgc 960
atcgcagaag gccacgagct ctccatcaag gaagatccag ctccacgcgg ccacgcattc 1020
gagttccgca tcaacggcga agacgctggc tccaacttca tgcctgcgcc aggcaagatc 1080
accagctacc gcgagccaca gggcccaggc gtccgcatgg actccggtgt cgttgaaggt 1140
tccgaaatct ccggacagtt cgactccatg ctggcaaagc tgatcgtttg gggcgacacc 1200
cgcgagcagg ctctccagcg ctcccgccgt gcacttgcag agtacgttgt cgagggcatg 1260
ccaaccgtta tcccattcca ccagcacatc gtggaaaacc cagcattcgt gggcaacgac 1320
gaaggcttcg agatctacac caagtggatc gaagaggttt gggataaccc aatcgcacct 1380
tacgttgacg cttccgagct cgacgaagat gaggacaaga ccccagcaca gaaggttgtt 1440
gtggagatca acggccgtcg cgttgaggtt gcactcccag gcgatctggc actcggtggc 1500
accgctggtc ctaagaagaa ggccaagaag cgtcgcgcag gtggtgcaaa ggctggcgta 1560
tccggcgatg cagtggcagc tccaatgcag ggcactgtca tcaaggtcaa cgtcgaagaa 1620
ggcgctgaag tcaacgaagg cgacaccgtt gttgtcctcg aggctatgaa gatggaaaac 1680
cctgtgaagg ctcataagtc cggaaccgta accggcctta ctgtcgctgc aggcgagggt 1740
gtcaacaagg gcgttgttct cctcgagatc aagggtacca tgaccatttc ctcacctttg 1800
attgacgtcg ccaaccttcc agacatcaac accactgccg gcaagatcgc cgaccttaag 1860
gctcgccgcg cggaagccca tttccccatg ggtgaaaagg cagtagagaa ggtccacgct 1920
gctggacgcc tcactgcccg tgagcgcttg gattacttac tcgatgaggg ctccttcatc 1980
gagaccgatc agctggctcg ccaccgcacc accgctttcg gcctgggcgc taagcgtcct 2040
gcaaccgacg gcatcgtgac cggctggggc accattgatg gacgcgaagt ctgcatcttc 2100
tcgcaggacg gcaccgtatt cggtggcgcg cttggtgagg tgtacggcga aaagatgatc 2160
aagatcatgg agctggcaat cgacaccggc cgcccattga tcggtcttta cgaaggcgct 2220
ggcgctcgta ttcaggacgg cgctgtctcc ctggacttca tttcccagac cttctaccaa 2280
aacattcagg cttctggcgt tatcccacag atctccgtca tcatgggcgc atgtgcaggt 2340
ggcaacgctt acggcccagc tctgaccgac ttcgtggtca tggtggacaa gacctccaag 2400
atgttcgtta ccggcccaga cgtgatcaag accgtcaccg gcgaggaaat cacccaggaa 2460
gagcttggcg gagcaaccac ccacatggtg accgctggta actcccacta caccgctgcg 2520
accgatgagg aagcactgga ttgggtacag gacctggtgt ccttcctccc atccaacaat 2580
cgctcctacg caccgatgga agacttcgac gaggaagaag gcggcgttga agaaaacatc 2640
accgctgacg atctgaagct cgacgagatc atcccagatt ccgcgaccgt tccttacgac 2700
gtccgcgatg tcatcgaatg cctcaccgac gatggcgaat acctggaaat ccaggcagac 2760
cgcgcagaaa acgttgttat tgcattcggc cgcatcgaag gccagtccgt tggctttgtt 2820
gccaaccagc caacccagtt cgctggctgc ctggacatcg actcctctga gaaggcagct 2880
cgcttcgtcc gcacctgcga cgcgttcaac atcccaatcg tcatgcttgt cgacgtcccc 2940
ggcttcctcc caggcgcagg ccaggagtac ggtggcattc tgcgtcgtgg cgcaaagctg 3000
ctctacgcat acggcgaagc aaccgttcca aagatcaccg tcaccatgcg taaggcttac 3060
ggcggagcgt actgcgtgat gggttccaag ggcttgggct ctgacatcaa ccttgcatgg 3120
ccaaccgcac agatcgccgt catgggcgct gctggcgcag ttggattcat ctaccgcaag 3180
gagctcatgg cagctgatgc caagggcctc gataccgtag ctctggctaa gtccttcgag 3240
cgcgagtatg aagaccacat gctcaacccg taccacgctg cagaacgtgg cctgatcgac 3300
gccgtgatcc tgccaagcga aacccgcgga cagatttccc gcaaccttcg cctgctcaag 3360
cacaagaacg tcactcgccc tgctcgcaag cacggcaaca tgccactgta a 3411
<210> 5
<211> 522
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcggccgcag gaggaattaa ccatgcagtg gtggtggtgg tggtgccaca tccagttcaa 60
cagctgtatc cccgttgagg gtgagttttg cttttgtatc agccatttaa ggtctcctta 120
gcgccttatt gcgtaagact gccggaactt aaatttgcct tcgcacatca acctggcttt 180
acccgttttt tatttggctc gccgctctgt gaaagagggg aaaaccgagc accaccacca 240
ccaccactgc atggttaatt cctccttagt tttggcggat gagagaagat tttcagcctg 300
atacagatta aatcagaacg cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc tggcggcagt 360
agcgcggtgg tcccacctga ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg tagcgccgat 420
ggtagtgtgg ggtctcccca tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa taaaacgaaa 480
ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgccta gg 522

Claims (10)

1.一种动态响应对香豆酸含量调控丙二酰-CoA合成途径的方法，其特征在于，是利用动态响应对香豆酸含量的生物传感器调控丙二酰-CoA合成途径，所述生物传感器包括对香豆酸响应的调控蛋白PadR和受PadR调控的启动子PPadC，所述调控蛋白PadR的氨基酸序列如NCBI-Protein ID:NP_388715所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述启动子PPadC包括PPadC(608-1)、PPadC(608-496)、PPadC(608-476)、PPadC(608-456)、PPadC(216-1)、PPadC(216-39)、PPadC(216-79)或PPadC(216-123)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述调控蛋白PadR的基因的核苷酸序列如NCBI-Gene ID:936174所示。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调控丙二酰-CoA合成途径是抑制TCA循环中编码柠檬酸脱氢酶的gltA基因的表达，并过表达编码乙酸激酶的acs基因和编码乙酰-CoA羧化酶的ACC基因。
5.一种动态响应对香豆酸含量的生物传感器，其特征在于，包括对香豆酸响应的调控蛋白PadR和受PadR调控的启动子PPadC，所述启动子PPadC包括PPadC(608-1)、PPadC(608-496)、PPadC(608-476)、PPadC(608-456)、PPadC(216-1)、PPadC(216-39)、PPadC(216-79)或PPadC(216-123)；所述调控蛋白PadR的氨基酸序列如NCBI-Protein ID:NP_388715所示。
6.一种动态响应对香豆酸含量的载体，其特征在于，含有权利要求5所述的生物传感器。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述载体是以pRSM3为基础构建的。
8.一种动态响应对香豆酸含量的工程菌株，其特征在于，以权利要求7所述载体为表达载体。
9.如权利要求8所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株以大肠杆菌为宿主，过表达acs和ACC基因，抑制gltA基因的表达。
10.权利要求5所述的生物传感器在食品或制药领域中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114668752A (zh) * 2022-03-29 2022-06-28 南开大学 对香豆酸修饰延伸因子在抑制细菌生长中的应用
CN117025499A (zh) * 2023-05-24 2023-11-10 汕头市中心医院 香豆酸在促进细菌代谢生成小分子肽和促进细菌生长中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1539930A2 (en) * 2002-07-29 2005-06-15 ES Cell International Pte Ltd. Multi-step method for the differentiation of insulin positive, glucose
CN104160015A (zh) * 2012-01-06 2014-11-19 Cj第一制糖株式会社 生产喹啉酸的重组微生物及利用该微生物的喹啉酸生产方法
CN108728470A (zh) * 2017-04-14 2018-11-02 中国科学院微生物研究所 产β-丙氨酸的重组菌及其构建方法与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1539930A2 (en) * 2002-07-29 2005-06-15 ES Cell International Pte Ltd. Multi-step method for the differentiation of insulin positive, glucose
CN104160015A (zh) * 2012-01-06 2014-11-19 Cj第一制糖株式会社 生产喹啉酸的重组微生物及利用该微生物的喹啉酸生产方法
CN108728470A (zh) * 2017-04-14 2018-11-02 中国科学院微生物研究所 产β-丙氨酸的重组菌及其构建方法与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李田等: "植物启动子研究进展", 《生物技术通报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114668752A (zh) * 2022-03-29 2022-06-28 南开大学 对香豆酸修饰延伸因子在抑制细菌生长中的应用
CN114668752B (zh) * 2022-03-29 2024-04-19 南开大学 对香豆酸修饰延伸因子在抑制细菌生长中的应用
CN117025499A (zh) * 2023-05-24 2023-11-10 汕头市中心医院 香豆酸在促进细菌代谢生成小分子肽和促进细菌生长中的应用

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