CN103710320B

CN103710320B - 组合物及甲硫氨酸的生产方法

Info

Publication number: CN103710320B
Application number: CN201310495693.1A
Authority: CN
Inventors: 布莱恩·布鲁泽; 张眞淑; 赵光命; 赵英郁; 默文·德苏泽; 霍利·J·杰森; 金素影; 牛伟; 费尔南多·A·桑切斯-列拉; 申容旭; 严惠媛
Original assignee: CJ Corp
Current assignee: CJ Corp
Priority date: 2007-04-11
Filing date: 2007-04-11
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2027-04-11
Also published as: CN103710319B; CN103710320A; CN103710319A

Abstract

本发明公开了一种以内源基因的转硫途径，同时以外源基因的定向巯基化途径生产甲硫氨酸和相关产物的微生物；还公开了这些新型基因可用于甲硫氨酸和SAMe的生产。

Description

组合物及甲硫氨酸的生产方法

本申请是2007年4月11日提交的分案申请中国专利申请No.201210144544.6的分案申请，该分案申请是2007年4月11日提交的中国专利申请No.200780052545.5的分案申请。

技术领域

本发明公开了组合物，以及用如微生物、酶和化学物质生产甲硫氨酸及相关产物的方法。

背景技术

甲硫氨酸是动物食谱中的必需氨基酸。长期以来，甲硫氨酸的制备是采用丙烯醛、甲硫醇和氰化物作为起始物质，通过各种多步化学反应合成的。有两种产物形式：D,L甲硫氨酸及其羟基类似物。与其它氨基酸不同，D-甲硫氨酸在体内转化为必需的L-异构体。据报导，由于家禽需求量的增加和近来作为猪饲料添加剂，饲料级甲硫氨酸的市场在不断扩大。甲硫氨酸的主要生产商(DegussaAG,Adisseo和Novus)满足市场需求的能力取决于原料供应。中间产物丙烯醛和甲硫醇必须转化为3-甲基硫丙醛(3-methylthiopropionaldehyde，MMP)并通过氢氰酸进一步转化成甲硫氨酸。所有这三家生产商都计划增加甲硫氨酸的生产设备并与原料生产相结合(Chem.MarketingReporterApril7,2003)。

对大量生物体的甲硫氨酸的生物合成途径（天冬氨酸家族成员）的研究显示出相似和差异。最初确定的反应步骤为高丝氨酸在高丝氨酸酰基转移酶（homoserineacyltransferase）的催化作用下发生酰化反应，除了发生转移的酰基有所不同，它普遍存在于所有生物体中。metA催化作用的产物为乙酰高丝氨酸或琥珀酰高丝氨酸。乙酰高丝氨酸随后通过转硫途径或定向巯基化途径转化为高半胱氨酸。

两种途径都被报导存在和作用于酵母、真菌、绿色植物和棒状杆菌属（Corynebacteriumglutamicum）的细菌中。大肠杆菌（E.coli）仅采用转硫途径。转硫途径以胱硫醚作为中间产物并由半胱氨酸作为硫供体。定向巯基化途径包括将硫化物直接整合到酰基高丝氨酸。该途径中的最后一步为高半胱氨酸在高半胱氨酸转甲基酶（homocysteinemethyltransferase，由metE或metH基因编码）的催化作用下转化为甲硫氨酸。

其它用于动物饲料的重要的氨基酸，如赖氨酸、苏氨酸和色氨酸通过发酵制备。因此，这些氨基酸可由葡萄糖和其它再生资源作为起始物质生成。遗憾的是通过发酵的方法生产甲硫氨酸并不成功，至今仍采用甲硫氨酸的化学合成。这其中部分原因是由于缺少有效构建的生产甲硫氨酸的生物合成途径及生产甲硫氨酸的合适生产宿主。

下面公开了改良的甲硫氨酸生物合成途径及其生产宿主。

发明内容

概述

通过发酵的方法生产甲硫氨酸及相关产物如S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAMe)的过程在此描述。基因工程化的含有重组DNA分子并生产甲硫氨酸的微生物也描述于此。

本发明描述了含有具有定向巯基化活性的外源核酸序列编码的肽(EC2.5.1.49,EC4.2.99.-)，并含有具有转硫活性的内源核酸序列编码的肽(EC2.5.1.48和4.4.1.8)的微生物。该微生物能产生甲硫氨酸及相关产物。在一些例子中，该微生物能产生至少0.1，1，2，5，10，50，75，90或100g/L胞外浓度的甲硫氨酸或SAMe。

在一些例子中，存在不止一种甲硫氨酸的生物合成途径，较之在缺少外源核酸序列（其编码的肽具有定向巯基化活性）的条件下，允许生物体产生更多的甲硫氨酸。

在其它的例子中，在生物体中活跃着两种以上的甲硫氨酸生物合成途径。在这些例子中，一个或多个外源核酸序列编码的肽具有定向巯基化活性。其中的一种肽能够以O-琥珀酰高丝氨酸作为底物，另一种肽能够以O-乙酰高丝氨酸作为底物。

在一些例子中，构建的产甲硫氨酸及相关产物，如SAMe的微生物，所产生的至少10%的甲硫氨酸来自于转硫生物合成途径。在另一些例子中，它们产生的至少20，30，40或50%的产物来自于转硫生物合成途径。

在一些例子中，构建的产甲硫氨酸及相关产物，如SAMe的微生物，由定向巯基化生物合成途径活性，产生至少10%的甲硫氨酸。在另一些例子中，它们由定向巯基化生物合成途径，产生至少20，30，40或50%的产物。

在一些例子中，构建产甲硫氨酸及相关产物的微生物，以减毒由基因如metD，metK，metJ，thrB，serA编码的肽或其制品的活性。在另一些例子中，微生物还被构建成过表达一个或多个基因，如metA，metB，metC，metE，metY，metZ，metX，metH，cysPWUA，cysD，cysN，cysC，cysH，cysI，cysJ，cysG，csyK和cysM。

本发明还提供生产甲硫氨酸和SAMe的方法。这些方法包括培养构建的生产甲硫氨酸及相关产物的微生物并分离产物。在一些例子中，微生物可以是大肠杆菌（E.coli）,假单胞菌属（Pseudomonassp.）或棒状杆菌属（Corynebacteriumglutamicum.）。

在此还描述了新的核酸序列及相应的氨基酸序列(SEQIDNOS:1和2)。这些核酸序列和片段以及这些核酸序列的可用于在重组微生物中产生肽。这些肽用于产生甲硫氨酸和SAMe。这些肽及其变化形式和其片段还用于产生专门的结合剂，如抗体。

省略中间产物磷酸腺苷酰硫酸(phosphoadenylylsulfate，PAPS)改善硫的同化过程的方法也描述于此。该方法可用于任何产甲硫氨酸的微生物。该方法是通过在微生物中引入重组的核酸序列，其允许一个或多个腺苷酰硫酸还原酶（adenylylsulfatereductases）(EC1.8.99.2或1.8.4.9)的过量表达。过量表达可以通过引入改变的重组核酸序列，或通过引入新的控制因子，如启动子或增强子，其增强了内源腺苷酰硫酸还原酶的表达或增强了编码腺苷酰硫酸还原酶的重组核酸序列的表达。

通过下面的详细描述和具体实施例，本发明及其它方面是显而易见的。

附图说明

图1表明各种微生物产甲硫氨酸的三种途径。所有的途径都部分依赖于采用天冬氨酸作为生产甲硫氨酸的起始物质。天冬氨酸经过多步反应转化为高丝氨酸，高丝氨酸通过MetA或MetX转化为O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸。一些微生物，如大肠杆菌和假单胞菌属（Pseudomonassp.）利用MetA多肽产生O-琥珀酰高丝氨酸，而其它微生物，如棒状杆菌属和钩端螺旋体属（Corynebacterium和Leptospirasp.）利用MetX产生O-乙酰高丝氨酸。O-琥珀酰高丝氨酸和O-乙酰高丝氨酸随后通过巯基化途径完全转化为高半胱氨酸，或者通过转硫途径转化为高半胱氨酸（两个反应均在此处做详细描述）。与转硫途径有关的酶以**表示，与巯基化途径有关的酶以*表示。

图2表示甲硫氨酸在TF4076BJF中的累积量，仅通过转硫途径表达(TF4076BJF)，仅通过巯基化途径表达(TF4076BJF-A)，或由两种途径同时表达(TF4076BJFmetYX(Lm)。

图3示意性表示用于识别反馈抑制抵抗剂metA基因突变体的筛选方法（每个例子中的产品表达以阴影椭圆标出）。

图4表示甲硫氨酸的表达受到反馈抑制抵抗剂metA基因的抑制随时间变化的曲线。

图5表示大肠杆菌中甲硫氨酸的转运模型。

图6表明天然的硫同化途径及新的备选的硫同化途径。

序列表

序列表中所示的核酸及氨基酸序列采用标准字体缩写，3个字符编码用于氨基酸。仅显示出每个核酸序列的一条链，其互补链可以参考已知链得出。

SEQIDNOS:1-10为来自于E.coli的各种突变基因metA的核酸序列和相应的氨基酸序列。

SEQIDNOS:11-34为实施例中所用的各种引物序列。

发明详述

缩写和术语

下面术语和方法的解释较好地描述了本发明并指导本领域的技术人员进行实施。除文中另外明确指定以外，在此所用的“包含，包括”表示“包括”，单数形式的“一”包括复数形式，例如，参见“包含一细胞”表明包括一个或多个这样的细胞，文中提及“包含高半胱氨酸合酶”表明包括一个或多个高半胱氨酸合酶，并等同于本领域技术人员的公知技术等等。除文中另外明确指定以外，术语“或”表示可选择所述备选要素中的单一要素，或两个或多个要素的结合。例如，“高半胱氨酸合酶活性或胱硫醚γ-合酶活性”表示高半胱氨酸合酶活性，胱硫醚γ-合酶活性，或高半胱氨酸合酶活性与胱硫醚γ-合酶活性的结合。

有另外说明的除外，在本发明中使用的所有技术和科学术语与本领域已知的常规技术相同。尽管与本发明描述的相似或等同的方法和材料可用于实施或检验本发明，合适的方法和材料描述如下。所述的材料、方法和实施例仅用于解释说明，并不能限制本发明的范围。通过如下详细的描述及权利要求中的描述，本发明的其它特征和优点是显而易见的。

登录号（AccessionNumbers）:本发明中的登录号来自于NCBI数据库(NationalCenterforBiotechnologyInformation)，其由美国国立卫生研究院（theNationalInstituteofHealth,U.S.A.）维护。数据库提供登录号的日期为2007年2月20日。

EC号(EnzymeClassificationnumbers，酶分类号)：本发明中的EC号来自于KEGG配合基数据库，由基因和基因组京都百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomics）维护，部分由东京大学主办。数据库提供EC号的日期为2007年2月20日。

减毒（Attenuate）：减轻某物的影响、活性或强度。例如，减毒特定酶对反馈抑制或由化合物（该化合物不是产物或反应物）导致的抑制的敏感度（非特定途径反馈，non-pathwayspecificfeedback），使得该酶活性不受化合物存在的影响。例如，metA基因及其相应的氨基酸序列（如以序列SEQIDNOS:2所示为例）显示出几个突变，减毒了其反馈抑制的敏感度。在实施例3.B中详细描述了MetA敏感度的减毒。另一个例子，酶的活性降低可认为是减毒。

cDNA(互补DNA)：一条无间隔序列、非编码区（内含子）和调控序列，决定转录的DNA。cDNA可以从细胞中提取的信使RNA通过反转录生成。

缺失，去除（Deletion）：从核酸分子中去除一个或多个核苷酸，或从蛋白分子中去除一个或多个氨基酸，将去除后的两端连接。

可检测，可见（Detectable）：可检测到的或确定的存在。例如，如果由产物或反应物产生的信号足以检测到，由反应物生成的产物，如O-琥珀酰高丝氨酸或高半胱氨酸的产生，是可以检测到的。

定向巯基化活性（Directsulfhydrylationactivity）：OSHS或OAHS与S^2-直接反应生成高半胱氨酸的能力。具有该活性的肽包括诸如高半胱氨酸合酶（EC4.2.99.-,EC2.5.1.49），其由基因metZ和metY编码。

DNA：脱氧核糖核酸。DNA为长链聚合物，其包括大部分活有机体的遗传物质（一些病毒的基因含有核糖核酸，RNA）。DNA聚合物的重复单位为四个不同的核苷酸，其中每个核苷酸为四个碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶之一与脱氧核糖结合并带有一个磷酸基团。在DNA分子中由三个核苷酸组成密码子，为氨基酸编码。术语密码子还用于由DNA序列转录得到的mRNA中的三个核苷酸相应的（和互补的）序列。

内源（Endogenous）：在此用于表示核酸分子以及特定细胞或微生物，说明细胞中的核酸序列或肽序列没有利用重组构建技术，也没有利用重组构建技术植入细胞。如细胞最初从自然界中分离出来时其中的基因。如果通过重组技术，如启动子或增强子引发转录或翻译，调控序列发生改变，仍认为基因是内源的。

外源（Exogenous）：在此用于表示核酸分子以及特定细胞，是指任一核酸分子不是来自于自然界发现的特定细胞中。因此，非天然产生的核酸分子一旦导入细胞内，将被认为对细胞来说是外源的。天然产生的核酸分子对于特定细胞来说也可以成为外源的。例如，从细胞X中分离出的完整编码序列，一旦将该编码序列导入细胞Y中，则对于细胞Y来说，该编码序列是外源的，即使X和Y是同一类型的细胞。

表达（Expression）：基因编码的信息转化为细胞的结构和功能的过程，如蛋白质、转运RNA或核糖体RNA。表达的基因包括转录成mRNA，然后翻译成蛋白质，以及那些转录成RNA，但不翻译成蛋白质（例如，转运RNA和核糖体RNAs）的基因。

功能缺失（FunctionalDeletion）：基因序列的突变、部分或全部缺失、插入或其它变化，其减少或抑制基因产物的产生或使基因产物丧失功能。例如，E.coli中基因metJ的功能缺失，降低了对甲硫氨酸生物合成途径的抑制。在另一个例子中，E.coli中基因thrB的功能缺失，降低了苏氨酸生物合成途径中对高丝氨酸的利用。在一些例子中，功能缺失表示敲除突变。

分离（Isolated）：“分离的”生物成分（如核酸分子、蛋白质或细胞）表示从天然存在的成分中与其它生物成分完全分离或纯化出来，如其它的染色体以及染色体体外DNA、RNA和蛋白质。“分离”出的核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法而纯化出来的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达以及通过化学合成方法所产生的核酸分子和蛋白质。

在一个例子中，分离表示天然产生的核酸分子不直接与序列的两端邻接，来自于生物体天然产生的基因组其核酸分子是直接邻接的（一端与5’端相连，另一端与3’端相连）。

核酸分子（Nucleicacidmolecule）：包括RNA和DNA分子，并不限于cDNA、基因组DNA和mRNA。包括合成的核酸分子，如那些通过化学合成的或重组产生的核酸分子。该核酸分子可以为双链或单链。单链的核酸分子可以是有义链或反义链。此外，核酸分子可以是环状的或线性的。

可操作地连接（Operablylinked）：当第一个核酸序列与第二个核酸序列具有功能上的关系，可将第一个核酸序列可操作地连接到第二个核酸序列。例如，如果启动子影响到编码序列的转录或表达，将该启动子与该编码序列可操作地连接。一般情况下，可操作地连接的DNA序列是邻接的，其对于在同一阅读框中连接两个蛋白编码区是必须的。各自基因的构象串联转录为单一的信使RNA，称为操纵子。这样将基因的位置邻近，例如在质粒载体中，通过单个启动子的转录调控，形成了一个合成的操纵子。

开放阅读框ORF(openreadingframe)：一系列的三个核苷酸（密码子）编码肽、多肽或氨基酸，无任何终止密码子。这些序列通常可翻译成肽。

纯化（Purified）：术语纯化并非指绝对纯化；它表示相对的概念。因此，例如纯化肽的制备，如琥珀酰辅酶A高丝氨酸酰基转移酶或高半胱氨酸合酶的制备，所得到的肽浓度要比细胞中肽浓度大。例如，纯化的肽从其可能结合的细胞成分中完全分离出来（核酸、脂类、碳水化合物以及其它肽）。在另一个例子中，纯化的肽的制备是从污染物，如那些可能存在于所述肽的化学合成的污染物中完全游离出来。

在一个例子中，当样品中肽的重量百分比至少占大约50%时，例如至少占大约60%，70%，80%，85%，90%，92%，95%，98%，99%或更多时，肽是纯化的。可用于纯化肽的方法的例子，包括但不限于Sambrook等公开的方法(MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NewYork,1989,Ch.17)。蛋白纯度可以通过，例如将蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着在染色的聚丙烯酰胺凝胶上呈现出单一的肽的条带来测定；通过高压液相色谱测定；通过测序或其它常规方法测定。

重组（Recombinant）：重组的核酸分子或蛋白指天然不存在的序列，其序列是通过将两个单独的序列片段人工地结合。该人工结合是可以实现的，例如通过化学合成或通过人工操作将分离的核酸分子或蛋白片段结合，如遗传工程技术。重组还用于描述经过人工操作的核酸分子，但含有与生物体中发现的相同的调控序列和编码区。

序列同一性/相似性（Sequenceidentity/similarity）：两个或多个核酸序列的同一性/相似性，或两个或多个氨基酸序列的同一性/相似性，可表示为序列同一性或相似性。序列同一性可以通过相同序列的百分数来测定；高百分数表示高序列同一性。序列相似性可以通过相似序列的百分数来测定（考虑到保守氨基酸的替换）；高百分数表示高序列相似性。采用标准方法进行比对，同源（Homologs）或直系同源（orthologs）的核酸或氨基酸序列具有相对高的序列同一性/相似性。

比较序列间差异的比对方法是本领域公知的。各种程序和比对运算法则描述于此：Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981;Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970;Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444,1988;Higgins&Sharp,Gene,73:237-44,1988;Higgins&Sharp,CABIOS5:151-3,1989;Corpet等,Nuc.AcidsRes.16:10881-90,1988;Huang等ComputerAppls.intheBiosciences8,155-65,1992;andPearson等,Meth.Mol.Bio.24:307-31,1994.Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-10,1990,提供了详细的序列比对方法和同源性预测。

NCBIBasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)(Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-10,1990)可以通过几种资源获得，包括美国国立信息中心(NCBI,NationalLibraryofMedicine,Building38A,Room8N805,Bethesda,MD20894)及因特网，根据比对序列的不同，采用序列分析程序blastp,blastn,blastx,tblastn和tblastx。其它信息可参见NCBI网站。

BLASTN用于比较核酸序列，BLASTP用于比较氨基酸序列。比较两种核酸序列，选项可设置成：-i设置成包含要进行比对的第一条核酸序列的文件（如C:\seq1.txt）；-j设置成包含要进行比对的第二条核酸序列的文件（如C:\seq2.txt）；-p设置成blastn；-o设置成任何想要的文件名（如C:\output.txt）；-q设置成–1；-r设置成2；其它选项为默认设置。例如，下面的命令可用于生成含有两个序列比对结果的输出文件：C:\Bl2seq–ic:\seq1.txt–jc:\seq2.txt–pblastn–oc:\output.txt–q–1–r2。

比较两个氨基酸序列，Bl2seq的选项可设置成：-i设置成包含要进行比对的第一条氨基酸序列的文件（如C:\seq1.txt）；–j设置成包含要进行比对的第二条氨基酸序列的文件（如C:\seq2.txt）；–p设置成blastp；-o设置成任何想要的文件名（如C:\output.txt）；其它选项为默认设置。例如，下面的命令可用于生成含有两个氨基酸序列比对结果的输出文件：C:\Bl2seq–ic:\seq1.txt–jc:\seq2.txt–pblastp–oc:\output.txt。如果两个比对的序列具有同源性，指定的输出文件将列出所比对序列的同源区域。如果两个比对的序列不具有同源性，指定的输出文件将不显示比对的序列。

一旦进行比对，匹配的数量由存在于两个序列中的相同核苷酸或氨基酸的数量来决定。序列同一性的百分数由区分匹配的数量决定，或者通过设定比对序列的长度进行区分，或者通过连接长度（如从比对序列中设定100个连续的核苷酸或氨基酸残基）进行区分，将得到的结果值乘以100。例如，当与具有1554个核苷酸的测试序列进行比对，核酸序列具有1166个匹配的核苷酸，即75.0%的序列同一性(1166÷1554×100=75.0)。序列同一性百分数的值采用四舍五入。例如，75.11，75.12，75.13和75.14四舍五入为75.1，而75.15，75.16，75.17，75.18和75.19四舍五入为75.2。长度值总是保持为整数。

比较大于30个氨基酸的序列，采用Blast2序列功能，通过BLOSUM62矩阵设置系统默认参数（开放间隔值11，每个残基间隔值1）。采用NCBIBasicBlast2.0，间隔的blastp来自如nr或swissprot数据库，同源性通常是比对的全长氨基酸序列中，有70%的序列相同。通过blastn程序搜索后的结果经DUST过滤(HancockandArmstrong,1994,Comput.Appl.Biosci.10:67-70)。其它程序使用SEG。此外，可进行人工比对。采用该方法进行评估，蛋白的相似性越高，序列同一性百分数值越大，如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少97%或至少99%的与主序列（即有登录号的序列或其它的序列）相同的序列，同时具有主序列的活性。在一些例子中，主序列比天然序列具有更高的活性，而在另一些例子中，主序列活性较低。

进行短肽序列比对（小于约30个氨基酸），采用Blast2序列功能完成比对，通过PAM30矩阵设置系统默认参数（开放间隔值9，延伸空位罚分为1）。采用该方法进行评估，蛋白与参考序列的同源性越高，序列同一性百分数值越大，如至少60%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，98%，99%的序列同一性。对非全长的序列进行比对时，10-20个氨基酸的序列同源性为至少75%的序列同一性，序列同一性取决于和参考序列的同一性，为至少85%，90%，95%或98%。评价短序列同一性的方法参见NCBI网站。

由于遗传密码的退化机制，不具有高度同一性的核酸序列编码相同的或相似的（保守的）氨基酸序列。利用这一退化机制，使得核酸序列发生变化产生出大量的核酸分子，所有的这些核酸分子编码相同的蛋白。这类同源的核酸序列为，例如，具有至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，至少98%或至少99%的与主序列（即有登录号的序列或其它的序列）相同的序列。

本领域的技术人员应当以这些相同序列的范围值仅作为指导；落在此范围外的，其序列可能具有同源性。

转化细胞（Transformedcell）：利用诸如生物技术导入核酸分子的细胞，如琥珀酰辅酶A高丝氨酸酰基转移酶或高半胱氨酸合酶的核酸分子。转化指所有的可以将核酸分子导入细胞中的技术，包括但不限于病毒载体的转染，接合，质粒转化，以及通过电穿孔，脂质体转化和基因枪的方法将裸DNA导入。

转硫活性（Transsulfurationactivity）：通过中间产物胱硫醚产生甲硫氨酸或SAMe的活性。具有这种活性的肽包括胱硫醚γ合酶(EC2.5.1.48)和胱硫醚β裂解酶(EC4.4.1.8)，这些肽分别由基因metB和metC编码。任何结合了胱硫醚γ合酶(EC2.5.1.48)和胱硫醚β裂解酶(EC4.4.1.8)的肽，能够使微生物具有转硫活性。

允许产物生产的条件（Underconditionsthatpermitproductproduction）：任何使微生物能够产生所需产物，如甲硫氨酸或SAMe产物的发酵条件。这些条件通常包括温度、通气和培养基。培养基可以是肉汤培养基或凝胶培养基。一般地，培养基包括碳源，如葡萄糖、果糖、纤维素或其它的能够被微生物直接利用的物质，或用于培养基中促进碳源利用的酶。为确定培养条件是否可以生成产物，将微生物培养24、36或48小时后取样。例如，为检测甲硫氨酸或SAMe的存在，采用了实施例中提供的检验方法。

载体（Vector）：用以将核酸分子导入到细胞中，由此形成转化细胞。载体含有能够允许其在细胞中复制的核酸序列，如复制起点。载体还含有一个或多个选择性标记基因以及本领域已知的其它遗传要素。

发明详述

I.甲硫氨酸生产途径

如图1所示，可采用多种生物合成途径来制备甲硫氨酸或其中间产物，如天冬氨酰磷酸（aspartylphosphate）、天冬氨酸半醛、高丝氨酸、O-琥珀酰高丝氨酸(OSHS)、O-乙酰高丝氨酸(OAHS)、胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸，以及S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)。为了达到本发明的目的，根据其内容，中间产物可被认为是反应物或产物。例如，当讨论利用天冬氨酸激酶将天冬氨酸转化为天冬氨酰磷酸时，天冬氨酸为反应物，而天冬氨酰磷酸为产物。同理，当说明书描述采用天冬氨酸半醛脱氢酶将天冬氨酰磷酸转化为天冬氨酸半醛时，天冬氨酰磷酸为反应物，天冬氨酸半醛为产物。本领域的普通技术人员可以理解图1所示的多种生物合成途径，因为在提供的每种酶族中都有多种酶能够用于将反应物转化为产物，从而构成途径。此外，这些反应可在体内或体外，或通过体内反应和体外反应的结合进行，诸如体外反应，包括非酶化学反应。

在途径中，也可通过包括将中间产物作为发酵进料，为宿主微生物提供中间产物。这样，如果生物合成途径制备的特定中间产物的量少于所需量，就可以将该中间产物添加到进料中。在连续发酵设备和间歇发酵设备中，这种方式都可以实现。

本领域的普通技术人员可以认识到生产宿主可利用除葡萄糖以外的碳源。备选的碳源包括诸如蔗糖、果糖、纤维素、半纤维素、淀粉或甘油。当使用备选的碳源时，需要包括在发酵介质中转化碳源的酶。

A.葡萄糖转化为天冬氨酸

微生物通常以葡萄糖制备天冬氨酸，本领域的普通技术人员可以理解，有很多提高生产菌株中天冬氨酸浓度的方法。例如，提高丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的表达，改变乙醛酸支路（glyoxylateshunt）或排除消耗丙酮酸生成其它产物，如乙酸盐或乙醇。

此外，可将天冬氨酸包括在发酵进料中，在甲硫氨酸的生物合成途径中用作反应物，由微生物吸收。

天冬氨酸也可在赖氨酸、苏氨酸和天冬酰胺酸生物合成途径中作为中间产物。因此，有必要减毒或去除（敲除）这些途径，从而使更多的天冬氨酸被用于甲硫氨酸生产途径中。

B.天冬氨酸转化为天冬氨酰磷酸

生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产天冬氨酰磷酸或过度生产天冬氨酰磷酸。如可采用WO04069996A2公开的反馈抑制天冬氨酸激酶替代内源性天冬氨酸激酶或与内源性天冬氨酸激酶共存。

本发明中采用的天冬氨酸激酶包括EC(EnzymeClassificationnumbers酶分类号)2.7.2.4的肽，以及其它能够将天冬氨酸催化为天冬氨酰磷酸的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些天冬氨酸激酶肽也可催化其它反应，例如一些天冬氨酸激酶肽还可接受除天冬氨酸以外的其它底物。因此也包括这种非特异天冬氨酸激酶肽。天冬氨酸激酶序列是公众可获得的。如GenBank登录号：NZ_AAVY01000022、NC_006958和NZ_AAWW01000055公开了天冬氨酸激酶核酸序列；GenBank登录号：NP_418448、NP_599504和ZP_01638096公开了天冬氨酸激酶肽序列。确定特定肽的天冬氨酸激酶活性特征的分析法是本领域公知的。如，由Cohen,GN（MethodsinEnzymology,113:596:600,1985）描述的分析法可用于确定特异肽的活性特征。

C.天冬氨酰磷酸转化为天冬氨酸半醛

生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产天冬氨酸半醛，或过度生产天冬氨酸半醛。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的天冬氨酸半醛脱氢酶。

本发明中采用的天冬氨酸半醛脱氢酶包括天冬氨酸半醛脱氢酶多肽（EC1.2.1.11），以及其它能够将天冬氨酰磷酸催化为天冬氨酸半醛的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些天冬氨酸半醛脱氢酶肽也可催化其它反应。例如一些天冬氨酸半醛脱氢酶肽还可接受除天冬氨酰磷酸以外的其它底物，因此也包括这种非特异天冬氨酸半醛脱氢酶肽。天冬氨酸半醛脱氢酶序列是公众可获得的。如GenBank登录号：NC_006958、NZ_AAVY01000015和NZ_AAWW01000010公开了天冬氨酸半醛脱氢酶的核酸序列；GenBank登录号：NP_417891、NP_599505和ZP_0164))72公开了天冬氨酸半醛脱氢酶肽序列。确定特定肽的天冬氨酸半醛脱氢酶活性特征的分析法是本领域公知的。如，由Cohen,GN（MethodsinEnzymology,113:600-602,1985）描述的分析法可用于确定特异肽的活性特征。

D.天冬氨酸半醛转化为高丝氨酸

生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产高丝氨酸，或过度生产高丝氨酸。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的天冬氨酸半醛脱氢酶。

本发明中采用的高丝氨酸脱氢酶包括高丝氨酸脱氢酶肽（EC1.1.1.3），以及其它能够将天冬氨酸半醛催化为高丝氨酸的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些高丝氨酸脱氢酶多肽也可催化其它反应，如一些高丝氨酸脱氢酶肽还可接受除天冬氨酸半醛以外的其它底物。因此也包括这种非特异高丝氨酸脱氢酶肽。高丝氨酸脱氢酶肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号：NC_006958、NZ_AAVY01000013和NZ_AAWW01000033公开了高丝氨酸脱氢酶核酸序列；GenBank登录号：NP_414543、ZP_01639819和NP_600409公开了高丝氨酸脱氢酶肽序列。确定特定肽的高丝氨酸脱氢酶活性特征的分析法是本领域公知的。如，由Patte.等（Biochem.Biophys.Acta128:426-439,1966）描述的分析法可用于确定特异肽的活性特征。

E.高丝氨酸转化为O-琥珀酰高丝氨酸(OSHS)

生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产O-琥珀酰高丝氨酸(OSHS)，或过度生产OSHS。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶（homoserineO-succinyltransferase）肽或采用高丝氨酸O-琥珀酰转移酶肽的反馈抑制不敏感形式。

本发明中采用的琥珀酰辅酶A高丝氨酸酰基转移酶包括高丝氨酸O-琥珀酰转移酶肽（EC2.3.1.46），以及其它能够将高丝氨酸催化为OSHS的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些高丝氨酸O-琥珀酰转移酶肽也可催化其它反应，如一些琥珀酰辅酶A-高丝氨酸酰基转移酶肽还可接受除高丝氨酸以外的其它底物。因此也包括这种非特异琥珀酰辅酶A-高丝氨酸酰基转移酶肽。高丝氨酸O-琥珀酰转移酶肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号：NZ_AAWW01000055公开了高丝氨酸O-琥珀酰转移酶核酸序列；GenBank登录号：AAC76983公开了高丝氨酸O-琥珀酰转移酶肽序列。确定琥珀酰辅酶A-高丝氨酸酰基转移酶的活性特征的分析法是本领域公知的。如，由Lawrence（J.Bacteriol.,109:8-11,1972）描述的分析法可用于确定特异肽的活性特征。基因编码的琥珀酰辅酶A-高丝氨酸酰基转移酶肽在本发明中是指metA。

F.高丝氨酸转化为O-乙酰高丝氨酸(OAHS)

生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产O-乙酰高丝氨酸(OAHS)，或过度生产OAHS。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的高丝氨酸O-乙酰转移酶肽（EC2.3.1.31）。

本发明中采用的高丝氨酸O-乙酰转移酶包括高丝氨酸O-乙酰转移酶肽（EC2.3.1.31），以及其它能够催化为OAHS的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些高丝氨酸O-乙酰转移酶肽也可催化其它反应，如一些高丝氨酸O-乙酰转移酶肽还可接受除高丝氨酸以外的其它底物。因此也包括这种非特异高丝氨酸O-乙酰转移酶肽。高丝氨酸O-乙酰转移肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号：Y10744区域:2822..3961、NZ_AAAH02000004区域:166057..167193，以及NZ_AAAY02000081区域:补体(11535..12605)公开了高丝氨酸O-乙酰转移酶核酸序列；GenBank登录号：CAA71733、ZP_00766367和ZP_00107218公开了高丝氨酸O-乙酰转移酶肽序列。确定特定肽的高丝氨酸脱氢酶活性特征的分析法是本领域公知的。如，由Lawrence（J.Bacteriol.,109:8-11,1972）描述的分析法可用于确定特异肽的活性特征。基因编码的高丝氨酸O-乙酰转移酶肽在本发明中是指metX。

G.巯基化

通过定向巯基化途径，以高半胱氨酸合酶（homocysteinesynthaseenzyme）完成高半胱氨酸的生产，其中一些酶采用OSHS为底物，一些酶采用OAHS为底物。此外，有些酶采用OSHS或OAHS为底物。

1.O-琥珀酰高丝氨酸(OSHS)转化为高半胱氨酸

生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产高半胱氨酸，或过度生产高半胱氨酸。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的高半胱氨酸合酶肽（EC4.2.99.-）。

本发明中采用的高半胱氨酸合酶包括高半胱氨酸合酶肽（EC4.2.99.-），以及其它能够将O-琥珀酰高丝氨酸(OSHS)催化为高半胱氨酸的肽。OSHS通过与硫化物反应转化为高半胱氨酸在本发明中是指定向巯基化。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些高半胱氨酸合酶肽也可催化其它反应，如一些高半胱氨酸合酶肽还可接受除OSHS以外的其它底物。因此也包括这种非特异高半胱氨酸合酶肽。高半胱氨酸合酶肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号：AE004091公开了高半胱氨酸合酶（O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶）核酸序列；GenBank登录号：AAG06495公开了高半胱氨酸合酶（O-琥珀酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶）氨基酸序列。确定特定肽的高半胱氨酸合酶活性特征的分析法是本领域公知的。如，由Yamagata（MethodsinEnzymology,143:478,1987）描述的分析法，采用适当的底物，可用于确定特异肽的活性特征。基因编码的高半胱氨酸合酶肽在本发明中是指metZ。

2.O-乙酰高丝氨酸(OAHS)转化为高半胱氨酸

生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产高半胱氨酸，或过表达高半胱氨酸。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的高半胱氨酸合酶肽（EC2.5.1.49）。

本发明中采用的高半胱氨酸合酶包括高半胱氨酸合酶肽（EC2.5.1.49），以及其它能够将O-琥珀酰高丝氨酸(OAHS)催化为高半胱氨酸的肽。OAHS通过与硫化物反应转化为高半胱氨酸在本发明中是指定向巯基化。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些高半胱氨酸合酶肽也可催化其它反应，如一些高半胱氨酸合酶肽还可接受除OSHS以外的其它底物，如实施例2提及的高半胱氨酸合酶，就可以选择OSHS或OAHS作为底物，因此也包括这种非特异高半胱氨酸合酶肽。高半胱氨酸合酶肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号：AE004091区域:5655648..5656925、Y10744区域:1485..2813、NZ_AAAH02000004区域:164536..165990以及NZ_AAAY02000081区域:补体(12750..14054)公开了高半胱氨酸合酶（O-乙酰-L-高丝氨酸硫化氢解酶）核酸序列；GenBank登录号：AAG08410、CAA71732、ZP_00766366和ZP_00107219公开了高半胱氨酸合酶（O-乙酰-高丝氨酸硫化氢解酶）氨基酸序列。确定特定肽的高半胱氨酸合酶活性特征的分析法是本领域公知的。如，由Yamagata（MethodsinEnzymology,143:478,1987）描述的分析法，采用适当的底物，用于确定特异肽的活性特征。基因编码的高半胱氨酸合酶肽在本发明中是指metY。

H.转硫作用

1.O-琥珀酰高丝氨酸(OSHS)或乙酰高丝氨酸(OAHS)转化为胱硫醚

生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产胱硫醚，或过度生产胱硫醚。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的胱硫醚γ-合酶肽（EC2.5.1.48）。

本发明中采用的胱硫醚γ-合酶包括胱硫醚γ-合酶肽（EC2.5.1.48），以及其它能够将OSHS或OAHS催化为胱硫醚的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些胱硫醚γ-合酶肽也可催化其它反应，如一些胱硫醚γ-合酶肽还可接受除OSHS或OAHS以外的其它底物，因此也包括这种非特异胱硫醚γ-合酶肽。胱硫醚γ-合酶肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号：NC_006958、NZ_AAWW01000006和NC_004129公开了胱硫醚γ-合酶核酸序列；GenBank登录号：NP_418374、YP_348978和NP_601979公开了胱硫醚γ-合酶肽序列。确定特定肽的胱硫醚γ-合酶活性特征的分析法是本领域公知的。如，MethodsinEnzymology,17:425-433,1971描述的分析法，可用于确定特异肽的活性特征。基因编码的胱硫醚γ-合酶肽在本发明中是指metB。

2.胱硫醚转化为高半胱氨酸

生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产高半胱氨酸，或过度生产高半胱氨酸。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的胱硫醚β-裂解酶肽（EC4.4.1.8）。

本发明中采用的胱硫醚β-裂解酶包括胱硫醚β-裂解酶肽（EC4.4.1.8），以及其它能够将胱硫醚催化为高半胱氨酸的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些胱硫醚β-裂解酶肽也可催化其它反应，如一些胱硫醚β-裂解酶肽还可接受除胱硫醚以外的其它底物，因此也包括这种非特异胱硫醚β-裂解酶肽。胱硫醚β-裂解酶肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号：NZ_AAWW01000001、NC_006958和NZ_AAVY01000004公开了胱硫醚β-裂解酶核酸序列；GenBank登录号：NP_746463、YP_226552和NP_417481公开了胱硫醚β-裂解酶肽序列。确定特定肽的胱硫醚β-裂解酶活性特征的分析法是本领域公知的。如，MethodsinEnzymology,143:483-486,1987描述的分析法可用于确定特异肽的活性特征。基因编码的胱硫醚β-裂解酶肽在本发明中是指metC。

I.高半胱氨酸转化为甲硫氨酸

生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产甲硫氨酸，或过度生产甲硫氨酸。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物，如甲硫氨酸或SAMe产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的高半胱氨酸甲基酶肽（homocysteinemethlyasepeptide）（EC2.1.1.14和2.1.1.13）。

本发明中采用的高半胱氨酸甲基酶包括高半胱氨酸甲基酶肽（EC2.1.1.14和2.1.1.13），以及其它能够将高半胱氨酸催化为甲硫氨酸的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些高半胱氨酸甲基酶肽也可催化其它反应，如一些高半胱氨酸甲基酶肽还可接受除高半胱氨酸以外的其它底物。因此也包括这种非特异高半胱氨酸甲基酶肽。高半胱氨酸甲基酶肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号：NC_004129、NC_006958和NC_000913公开了高半胱氨酸甲基酶核酸序列；GenBank登录号：AP_004520、YP_225791和CAK16133公开了高半胱氨酸甲基酶肽序列。确定特定肽的高半胱氨酸甲基酶活性特征的分析法是本领域公知的。如，AnalyticalBiochemistry,228,323-329,1995描述的分析法，可用于确定特异肽的活性特征。基因编码的高半胱氨酸甲基酶肽在本发明中是指metH或metE。

J.甲硫氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸

生产宿主可采用公知的多肽构建，以生产S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)，或过度生产SAMe。在甲硫氨酸生物合成途径中提高产物产量的一种方法是通过过表达或表达更高活性形式的甲硫氨酸腺苷转移酶肽（methionineadenosyltransferasepeptides）（EC2.2.1.6）。本领域普通技术人员可以理解，当甲硫氨酸是所需产物时，需要减毒由metK编码的甲硫氨酸腺苷转移酶肽（EC2.2.1.6）的活性或表达。

本发明中采用的甲硫氨酸腺苷转移酶包括甲硫氨酸腺苷转移酶肽（EC2.2.1.6），以及其它能够将甲硫氨酸催化为SAMe的肽。此外，本领域普通技术人员可以理解，一些甲硫氨酸腺苷转移酶肽也可催化其它反应，如一些甲硫氨酸腺苷转移酶肽还可接受除甲硫氨酸以外的其它底物。因此也包括这种非特异甲硫氨酸腺苷转移酶肽。甲硫氨酸腺苷转移酶肽序列是公众可获得的。如GenBank登录号：NC_002516、NC_006958和NC_000913公开了甲硫氨酸腺苷转移酶核酸序列；GenBank登录号：NP_747070、CAI37180和NP_600817公开了甲硫氨酸腺苷转移酶肽序列。确定特定肽的甲硫氨酸腺苷转移酶活性特征的分析法是本领域公知的。如，MethodsinEnzymology,94:219-222,1983描述的分析法，可用于确定特异肽的活性特征。基因编码的甲硫氨酸腺苷转移酶肽在本发明中是指metK。

II.将生产菌株基因工程化以提高甲硫氨酸的产量

天冬氨酸的产量可采用本领域公知的任何方法提高。例如，天冬氨酸的产量可采用几种不同的方式，通过提高由细胞产出的草酰乙酸的产量来提高天冬氨酸的产量。（Gokarn等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,56:188-95,2001;Sanchez等,MetabolicEng.,8:209-226,2006）。

产物的产量也可通过过表达L-甲硫氨酸生物合成途径中的各种基因来提高。例如，可将诸如metA、metB、metC、metE和metH，以及cysD、cysN、cysC、cysH、cysI、cysJ、cysK和cysM的基因设置在各种启动子的控制之下，以提高所生产的酶的量。

metA基因编码高丝氨酸琥珀酰转移酶，该酶是以高丝氨酸进行甲硫氨酸生物合成途径的第一种酶，是甲硫氨酸生产的调控点。metA蛋白是温度敏感性蛋白，具有186个氨基酸残基，计算分子量为35.7kDa。由终产物，甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸抑制metA活性是公知的（Lee等,J.Biol.Chem.241:5479-5780,1966）。这两种产物的反馈抑制具有协同作用，即低浓度的甲硫氨酸单独只具有轻微抑制作用，而组合后具有强效抑制作用。因此，生产菌株能够从反馈抑制抵抗剂metA活性中受益。

在甲硫氨酸生产菌株中，另一种能够减毒或去除的基因是metJ。metJ编码的肽调控甲硫氨酸生物合成途径中几个基因的表达。metJ编码的蛋白连接在S-腺苷甲硫氨酸上，并阻抑metA、metC和metF基因。

由metF基因编码的蛋白，5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolatereductase）参与N(5)-亚甲基四氢叶酸的合成，后者为高半胱氨酸生产L-甲硫氨酸的甲基供体（Sheppard等，J.Bacteriol.181:718-25,1999）。US2002/0049305公开了可通过提高棒状菌（Corynebacteria）中5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(metF)的表达来改进L-甲硫氨酸的生产。因此，本发明中所述的工程化的微生物也可经工程化以提高metF的产量。

metK基因的调控也可提高甲硫氨酸和SAMe的产量，在所有有机体中，S-腺苷甲硫氨酸（SAMe）是主要的甲基供体，参与多胺生物合成（polyaminebiosynthesis）。SAMe也是甲硫氨酸腺苷转移酶（methionineadenosyltransferase）（MAT或MetK，EC2.5.1.6）。MetK催化唯一公知的SAMe生物合成途径。完整的三聚磷酸盐链从ATP断开，形成锍（sulfonium）化合物。

SAMe的形成降低了甲硫氨酸的浓度，减毒了通过MetA反馈抑制的甲硫氨酸生物合成途径的活性。因此，metK的功能性缺失或减毒可提高甲硫氨酸的生产。

本领域的普通技术人员可以理解，任何制备甲硫氨酸的细胞利用硫的效率是非常重要的，尤其是对在硫同化过程中利用磷酸腺苷酰硫酸（phosphoadenylylsulfate(PAPS)）作为中间产物的微生物，因为制备PAPS需要消耗1摩尔ATP。

硫酸盐相当不活跃，为了能被细胞利用，必须首先将其转化为更活跃的形式。在大肠杆菌（E.coli）中，通过胞质输运系统，其由三个细胞质膜成分和位于胞质中的底物特异性结合蛋白组成，将硫酸盐吸收进细胞。硫酸盐渗透酶的三个膜成分由cysT、cysW和cysA(cysA基因座)基因编码。调控cysA基因座的产物，使其与其他硫-同化途径一致，作为cys调节子的一部分。然后通过连接到核苷激活硫酸盐，以通过与大多数有机体相似的途径得到高能核苷磷酰硫酸。

如图6所示，微生物，如大肠杆菌利用将硫酸盐转化为腺苷酰硫酸（adenylylsulfate（APS））的途径，其通过利用硫酰酶肽（sulfateadenylyltransferasepeptide）(EC2.7.7.4，由cysNcysD编码)。然后APS通过APS激酶(EC2.7.1.25由cysC编码)转化为PAPS。此步骤需要一个ATP。PAPS通过PAPS还原酶(EC1.8.4.8，由cysH编码)转化为亚硫酸盐，随后亚硫酸盐通过NADPH-亚硫酸盐还原酶(EC1.8.1.2，由cysIcysJcysG编码)转化为硫化物。备选的途径如图6右侧所示，采用腺苷酰硫酸还原酶（EC1.8.99.2或1.8.4.9）将APS直接转化为亚硫酸盐。本领域的普通技术人员可以理解，任何可将APS转化为亚硫酸盐的腺苷酰硫酸还原酶都可以使用。例如，源于枯草杆菌（Bacillussubtilis，登录号CAA04409）或铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa，登录号NP_250447）的腺苷酰硫酸还原酶。

编码核酸序列的腺苷酰硫酸还原酶可被引入任何用于生产甲硫氨酸的微生物中。例如，本发明中描述的菌株，以及由MetabolicExplorer在WO2005/108561和WO2006138689中描述的菌株，以及由Kumar和Gomes在（BiotechnologyAdvances23:41-61,2005）描述的菌株都可以受益于本发明中公开的省略PAPS的途径，从而在硫酸同化中少需要一个ATP分子。

具体实施方式

实施例1.甲硫氨酸生产的多途径之一，采用外源性表达的核酸序列利用定向巯基化。

A.同时具有metABC（转硫作用）和metAZ（定向巯基化）的微生物的构建

如前所述，主要通过转硫反应产生大肠杆菌中甲硫氨酸的内源性产物。本实施例描述了大肠杆菌的工程化以增加定向巯基化，同时也保留了内源性metAZ途径。

通过克隆O-琥珀酰硫化氢解酶（O-succinylsulfhydrylase）（EC4.2.99.-）（其通过与硫化氢反应可将O-琥珀酰高丝氨酸转化成高半胱氨酸）增加定向巯基化。这种酶由metZ编码，并可在一些假单胞菌属（Pseudomonasspecies）中找到（Vermeij和Kertesz,JBacteriol.181:5833–5837,1999以及Inoue等，J.Bacteriol.179:3956–3962,1997）。

更具体地说，来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa）的metZ被克隆为菌株TF4076BJF的甲硫氨酸营养缺陷型，该菌株由苏氨酸生产菌株TF4076产生，（下面的实施例3中进一步描述了由thrB和metJ的缺失形成的其他修饰，以及在pTrc启动子的控制下metF的插入）。这些营养缺陷型具有metB基因缺失，或metB和metC基因缺失。来自铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）的metZ增强了metB和metBC缺失突变体在基本培养基中的生长。如表1所示，即使在烧瓶培养中甲硫氨酸生产没有完全恢复，metZ表达还是诱导了metBC缺失突变体中高达～100mg/L的甲硫氨酸生产。这表明metZ负责细胞中高半胱氨酸的生产。

由metZ转化的缺失突变体的甲硫氨酸的低产量可能是由于受到了细胞内成分中硫化物的限制（下面提供了增加硫化物浓度的方法）。由metZ转化的metBC缺失突变体的生长在2mM硫化钠的存在下在M9培养基中增强的发现支持了这种说法。在体外分析中，O-琥珀酰硫化氢解酶具有低硫化物亲和力。通过定向进化，有可能发展成具有更高硫化物亲和力和更高活性的改良的O-琥珀酰硫化氢解酶。在甲硫氨酸途径中，高活性O-琥珀酰硫化氢解酶可以替代metB和metC，或者可以补助该途径，增加甲硫氨酸的碳通量（carbonflux）。

表1TF4076BFJ-　BC的生长互补和甲硫氨酸生产

pCL-metB：pCL1920中metB与其自己的启动子

pCL-metB-metC：pCL1920中metB和metC与它们自己的启动子

pPro-Z：pProLar载体(ClonTech)中来自铜绿假单胞菌的metZ

B.同时具有metABC（转硫作用）和metXZ（定向巯基化）的微生物的构建

本实施例显示了在大肠杆菌中，以两种途径同时进行甲硫氨酸生产。第一种途径是内源性metABC途径，第二种途径允许通过来自不同有机体的metY和metX的表达进行定向巯基化。

如图1所示，大肠杆菌利用转硫作用途径基因metA、metB和metC并通过OSHS，内源性地生产甲硫氨酸。通过采用向大肠杆菌中克隆和表达基因metX和metY的基因工程，向大肠杆菌添加其他途径，其产生了同时通过转硫作用和定向巯基化制备甲硫氨酸的宿主有机体。

以下描述了从钩端螺旋体菌（Leptospirameyeri）、抗辐射菌（Deinococcusradiodurans）、橙色绿屈挠菌（Chloroflexusaurantiacus）、扩展短杆菌（Brevibacteriumlinens）、念珠藻（Nostocpunctiforme）和铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）DNA中克隆用于构建异源性途径的metX和metY基因，构建了几种不同的菌株来分析添加这些基因对甲硫氨酸生产的影响。还克隆并检测了来自谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）和啤酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）的高半胱氨酸合酶。证明了这两种途径同时发生，这种添加改善了甲硫氨酸生产。

为了评价钩端螺旋体菌metX和metY酶是否能辅助大肠杆菌甲硫氨酸营养缺陷型的生长，将钩端螺旋体菌metYX基因菌群从质粒metXY-pCR2.0-TOPO中扩大，并克隆到pPRO-Nde-del载体中。在该质粒中metYX基因的转录由位于载体上的lac/ara启动子启动。

评价了包括W3110ΔmetA(停止OSHS的生成)、TF4076BJF(增加高丝氨酸生产)、TF4076BJFΔmetA(停止OSHS的生成)和TF4076BJFΔmetAmetB(停止OSHS和来自OAHS或OSHS的胱硫醚的生成)在内的四种大肠杆菌菌株。菌株TF4076BJF是苏氨酸营养缺陷型，为生产甲硫氨酸，以增加碳通量到高丝氨酸下调，其中高丝氨酸能够通过大肠杆菌天然途径产生甲硫氨酸。

菌株能够分别由克隆载体和含有metYX的质粒转化，然后将转化体划线接种到含有葡萄糖（2g/L）、异亮氨酸（0.15g/L）、苏氨酸（0.3g/L）、卡那霉素（50mg/L）和IPTG的M9基本平板培养基。来自钩端螺旋体菌的metYX基因菌群在24小时内补助W3110ΔmetA的生长。仅表达metX的W3110ΔmetA菌株在M9基本培养基上不能生长。因此，大肠杆菌W3110缺少利用O-乙酰基-L-高丝氨酸作为前体生物合成甲硫氨酸的有效酶。如WO2006113897中所述，菌株W3110ΔmetA由对照空白载体pPRO-Nde-del转化，在48小时之内没有生长。当由克隆载体或者含有来自钩端螺旋体菌的metYX的质粒转化时，菌株TF4076BJF能够在基本平板培养基上生长。

还检测了可选的metYX基因用于基本培养基的生长互补。在从抗辐射菌、橙色绿屈挠菌、扩展短杆菌、念珠藻中克隆metYX基因时，由于缺少与下游基因metX相邻的有效的大肠杆菌核糖体结合位点（rbs），metX基因的翻译与由位于载体上的rbs启动的metY基因的翻译一起进行。

来自钩端螺旋体菌、抗辐射菌和橙色绿屈挠菌的metYX基因菌群对于补助甲硫氨酸营养缺陷型菌株的生长是最有效的。在甲硫氨酸营养缺陷型中也观察到了生长互补，其中metY（钩端螺旋体菌）被钩端螺旋体菌metYX基因菌群中的metY（铜绿假单胞菌）替代。这些细胞显示了与表达钩端螺旋体菌metYX的相同甲硫氨酸营养缺陷型有关的降低的生长率。

实施例3中描述了利用摇瓶法测定甲硫氨酸的产量。简言之，培养物在补充了150mg/L甲硫氨酸（以改善初始生长）的培养基中在30℃下生长50小时，采用HPLC测定甲硫氨酸。表2显示与那些仅有转硫作用或者定向巯基化相比，在具有两种途径的菌株中甲硫氨酸的产量更高。

表2甲硫氨酸产量

在大肠杆菌菌株中甲硫氨酸的合成需要基因metA和metB。当任一基因失活时，大肠杆菌就失去了从头生产甲硫氨酸的能力。上面的数据表明metYX操纵子的添加能使甲硫氨酸生产恢复到与甲硫氨酸原养型获得的甲硫氨酸相似的水平。当细胞获得两种途径时，某些情况下甲硫氨酸产量会多于两倍。这些结果证明了两种途径不是互相排斥的，高丝氨酸可以通过这两种途径转化成甲硫氨酸。

为了进一步证明这种双途径的益处，实施例3中描述了采用发酵法在5L发酵罐中对各种菌株进行对比。在大约24小时之后，甲硫氨酸开始累积，并持续到停止进料。由来自大多数有机体的metY基因编码的酶被高浓度的甲硫氨酸反馈抑制。在某些情况下，由metX基因编码的酶也被反馈抑制。结果在这些发酵中观察到了高丝氨酸和OAHS的明显累积。发酵罐中甲硫氨酸生产的对比如图2所示，数据概述于表3中。这些结果证实了在烧瓶中所见的观察，通过异源性定向巯基化途径的适当表达，可显著提高甲硫氨酸的产量；如果酶被适当的表达，这种途径可负责大多数甲硫氨酸生产。

表3定向巯基化途径的异源性表达

为了增加转化为甲硫氨酸的产物量，可以使用反馈抑制抵抗剂metY和metX。还可以调节metX的表达水平和metH的表达以使高丝氨酸更快的转化为甲硫氨酸。

甲硫氨酸生产的差异表明metXY途径在大肠杆菌中更有效，在诸如这种下调菌株中添加metXY途径，可以导致多于两倍的甲硫氨酸的累积。

实施例2.利用O-乙酰基-L-高丝氨酸(OAHS)或O-琥珀酰基-L-高丝氨酸(OSHS)的高半胱氨酸合酶

本实施例描述了用于分离由来自铜绿假单胞菌(ATCC47085)的metY编码的高半胱氨酸合酶的方法。这种酶可被L-甲硫氨酸和S-腺苷-L-甲硫氨酸二者抑制。根据Yamagata,MethodsinEnzymology,143:478,1987分析酶活性。对该方法稍作改变，采用了多个样本点，使用胍来终止反应，在分析metA时采用DTNB（5,5-二硫双(2-硝基苯甲酸)SigmaD8130）检测高半胱氨酸的生成，见实施例3.B中的描述。一个酶单位（U）被定义为室温下每分钟一微摩尔高半胱氨酸的生成。

采用17.5μg纯蛋白（N-标记的）表达和分析来自铜绿假单胞菌的MetY。相对于来自钩端螺旋体菌的metY和大多数其他公开的高半胱氨酸合酶，这种酶在乙酰高丝氨酸和琥珀酰高丝氨酸下都有活性。对这两种底物，酶的活性相似，其被甲硫氨酸和SAMe反馈抑制，反馈抑制水平似乎低于OSHS作为底物时的情况。在1mM甲硫氨酸下观察到了一些抑制。OAHS作为底物时，在10、50和100mM下含有的酶活性分别约为不存在甲硫氨酸时的50%、19%和9%。当5和10mMSAMe存在时，其活性约为最初活性的72%和21%。当OSHS作为底物时，在50和100mM甲硫氨酸存在时，其活性下降到53%和31%，在5和10mMSAMe存在时，其活性下降到86%和19%。

实施例3.遗传构建宿主菌株以增加甲硫氨酸产量的方法

除了如实施例1中描述的向宿主有机体添加甲硫氨酸生物合成途径之外，还可以进一步通过对宿主有机体遗传构建来减少对甲硫氨酸生物合成途径抑制，增加反应物的利用率和/或减少产物的分解代谢。

A.甲硫氨酸通用阻抑物和苏氨酸激酶的灭活，连同增强5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的表达来增加甲硫氨酸生产。

制备甲硫氨酸生产菌株的一种方法是修饰已经构建用以生产氨基酸，如苏氨酸的菌株。例如，可以使用韩国专利公开号No.92-8365(KFCC10718)中描述的苏氨酸生产菌株TF4076，即使它是甲硫氨酸营养缺陷型。另外的示例菌株包括被描述为苏氨酸过剩生产者的在ATCC(13070，13071，21148，21149，21150，21151，21272，21277，21278，21318，21319，21320)中列出的菌株。

采用菌株TF4076作为起始点，通过使thrB基因缺失以避免苏氨酸生产和使metJ基因缺失以释放甲硫氨酸生物合成途径的表达阻抑，来提高甲硫氨酸产量。还可以修饰菌株以过表达metF基因。

thrB缺失

采用loxP-氯霉素(loxP-Cm)盒(Gene2000vol.247，p255–264)使thrB缺失。采用引物序列1和2(SEQIDNOS:5和6)，将大肠杆菌K12的染色体作为模板，通过PCR克隆thrB基因。PCR条件为94℃30秒；然后在94℃30秒循环25次，55℃30秒，72℃3分钟；72℃7分钟，采用HLPCRPremix(BioneerCo，韩国)。用凝胶洗脱PCR产物，并克隆到pCR2.1-topo克隆试剂盒(Invitrogen，USA)，命名为pCR-thrB。采用pflMI消化pCR-thrB，并插入loxP-Cm盒。从质粒中，采用引物1和2(SEQIDNOS:11和12)经PCR扩增含有loxP-Cm盒的thrB基因。PCR产物经凝胶纯化。PCR片段经电穿孔进入TF4076菌株，选择氯霉素抗性菌落并证实thrB缺失。从鉴定的菌落中去除氯霉素标记，将最终获得的菌株命名为TF4076B。在不含苏氨酸时，该菌株在M9基本培养基(DIFCO)中不生长，这表明该菌株是苏氨酸营养缺陷型。

1.thrBSEQIDNO:11

5'-GCTAGCcatggttaaagtttatgccccg-3'

2.thrBSEQIDNO:12

5'-GAGCTCttagttttccagtactcgtgcgc-3'

metJ缺失

采用FRT一步缺失法使甲硫氨酸通用阻抑物metJ基因缺失(Datsenko和WannerPNAS97:6640-6645,2000)。采用引物序列3、4(SEQIDNOS:13和14)和模板pKD3扩增PCR片段(见Datsenko和Wanner,PNAS97:6640-6645,2000)。PCR条件为94℃30秒；然后在94℃30秒循环25次，55℃30秒，72℃1分钟；72℃7分钟，采用HLPCRPremix(BioneerCo,韩国)。选择氯霉素抗性菌落，采用PCR引物序列5和6(SEQIDNOS:15和16)证实metJ基因缺失。采用pCP20质粒转化，去除氯霉素标记基因，采用PCR证实去除。将获得的菌株命名为TF4076BJ。

3.metJ+氯霉素SEQIDNO:13

5’-atggctgaatggagcggcgaatatatcagcccatacgctgagcacggcaaggtgtaggctggagctgcttc-3’

4.metJ+氯霉素SEQIDNO:14

5’-gtattcccacgtctccgggttaatccccatctcacgcatgatctccatatgaatatcctccttag-3’

5.metJSEQIDNO:15

5’-gggctttgtcggtgaaatg-3’

6.metJSEQIDNO:16

5’-actttgcgatgagcgagag-3’

metF整合

为了补助TF4076BJ的甲硫氨酸营养缺陷型，用菌株TF4076BJ表达metF基因。采用引物序列7和8(SEQIDNOS:17和18)扩增metF基因，将大肠杆菌K12菌株的染色体作为模板。PCR条件为94℃30秒，然后在94℃30秒循环25次，55℃30秒，72℃1分钟，72℃7分钟，采用HLPCRPremix(BioneerCo，韩国)。用凝胶洗脱PCR片段，将其插入pSE380载体(InvitrogenCo.)中的NheI和SacI位点。将质粒命名为pSE380-metF。将pSE380-metF转化为TF4076BJ菌株。转化子在含有苏氨酸和异亮氨酸的M9基本培养基(Difco)中生长，表明补助甲硫氨酸营养缺陷型。

测定了在两种不同启动子的控制下metF基因的表达水平。这两种启动子为pCJ1启动子(PCT/KR2005/004338)和p苏氨酸启动子。采用引物序列9和10(SEQIDNOS:19和20)扩增metF基因，将大肠杆菌K12菌株的染色体作为模板。PCR条件为94℃30秒，然后在94℃30秒循环25次，55℃30秒，72℃1分钟，72℃7分钟，采用HLPCRPremix(BioneerCo，韩国)。用凝胶洗脱PCR片段，并连接到含有pCJ1启动子或者p苏氨酸启动子的pCL1920载体(Lerner和Inouye,NucleicacidsResearch18:4631,1990)的PvuII和HindIII位点。采用引物序列11和12(SEQIDNOS:21和22)对pCJ1启动子进行PCR扩增，采用引物序列13和14(SEQIDNOS:23和24)从大肠杆菌K12染色体扩增p苏氨酸启动子。用凝胶洗脱PCR片段，并整合入pCL1920载体的KpnI和EcoRV位点。PCR条件同上。含有在pCJ1启动子的控制下的metF基因的质粒被命名为pCL-pCJ1-metF，在p苏氨酸启动子的控制下含有metF基因的质粒被命名为pCL-pThr-metF。每个质粒都被转化为TF4076BJ菌株，测量甲硫氨酸产量。

用于检测菌株的摇瓶培养法如下：在由10g酵母提取物、6gNa₂HPO₄·12H₂O、0.5gNaCl、3gKH₂PO₄、2g葡萄糖、0.49gMgSO₄·7H₂O和0.015gCaCl₂·2H₂O组成的培养基（1L）中，将种子培养物在31℃孵育6小时。然后用下面的培养基（1L）接种烧瓶：17g(NH₄)₂SO₄、1gMgSO₄·7H₂O、2g酵母提取物、0.3gL-苏氨酸、10mgMnSO₄·7H₂O、10mgFeSO₄·7H₂O、10mgZnSO₄、30gCaCO₃、40g葡萄糖和2gKH₂PO₄pH7.2。烧瓶在31℃以250rpm振摇孵育64至72小时。离心后，分离培养物上清液用于甲硫氨酸分析。

对于含有pSE380-metF质粒的细胞培养，向培养基中加入100μg/L氨苄西林和0.5mMIPTG。如表4所示，在pCJ1启动子的控制下的metF基因产生的甲硫氨酸最多。

表4含有不同metF表达盒的细胞中甲硫氨酸产量

为了更稳定的表达metF基因，将pTrc、pCJ1和p苏氨酸启动子下的metF基因整合到TF4076BJ染色体的lacZ基因座上。每个metF基因均从各自质粒经PCR扩增并插入到pBrint载体的NsiI位点(Borgneetal.,Gene223:213-219,1998)。将载体转化到TF4076BJ菌株中，选择37℃下在含有氯霉素的培养基中生长的转化子，用于证实metF基因整合到染色体的LacZ基因座中。选择的菌落由pJW168转化，去除氯霉素标记。不能获得含有pCJ1-metF基因的细胞，含有pThr-metF盒的转化子也生长不佳。只有在LacZ基因座含有pTrc-metF基因的细胞生长的很好。当培养基中存在0.5mMIPTG时，这种菌株的烧瓶培养显示甲硫氨酸的产量为～600mg/L。含有pTrc-metF基因的最终菌株被命名为TF4076BJF，并被进一步分析。

总之，由产生菌株TF4076的苏氨酸衍生TF4076BJF菌株，其中通过thrB和metJ的缺失和在pTrc启动子的控制下metF的插入对菌株TF4076进行修饰。表5示出由TF4076BJF产生的高丝氨酸和甲硫氨酸的产量。

表5菌株TF4076BJF的甲硫氨酸产量

7.metFSEQIDNO:17

5'-GCTAGCcatgagcttttttcacgccag-3'

8.metFSEQIDNO:18

5'-GAGCTCttataaaccaggtcgaaccc-3'

9.metFSEQIDNO:19

5'-CAGCTGatgagcttttttcacgccag-3'

10.metFSEQIDNO:20

5'-AAGCTTttataaaccaggtcgaaccc-3'

11.CJ1启动子SEQIDNO:21

5'-cggggtaccaccgcgggcttattccattacat-3'

12.CJ1启动子SEQIDNO:22

5'-acgcgatatcttaatctcctagattgggtttc-3'

13.苏氨酸启动子SEQIDNO:23

5'-cggggtacctggttacaacaacgcctgg-3'

14.苏氨酸启动子SEQIDNO:24

5'-catgatatctacctcgttacctttggtcg-3'

按照下述方法使菌株TF4076BJF在5L发酵罐中生长，在96小时内获得的甲硫氨酸产量大约为2.2g/L。

按照下面的方法进行5L发酵。为了比较不同基因克隆在大肠杆菌菌株中的效果，采用5L罐的基本发酵法。接种物在25mL培养基中生长，该培养基由10.0g酵母提取物、4.49gNa₂HPO₄·7H₂O、0.5gNaCl、3.0gKH₂PO₄、0.49gMgSO₄·7H₂O、0.015gCaCl₂·2H₂O和2g/L葡萄糖配成1L体积制得。根据待测菌株的耐药性使用50mg/L的适当抗生素。在31℃和250rpm振摇孵育8-24小时后，将培养物转移至200mL相同的培养基中，在相同条件下孵育16至20小时。该培养物用于接种含2.5L培养基的发酵罐。

发酵培养基的组成为：17.0g/L(NH₄)₂SO₄、2.0g/L酵母提取物、2.0g/LKH₂PO₄、1.0g/LL-苏氨酸、0.3g/L异亮氨酸、0.01g/LMnSO₄-H₂O、0.01g/LFeSO₄-7H₂O、0.01g/LZnSO₄-7H₂O、1.0g/LMgSO₄-7H₂O、2mg/L吡哆醛、2mg/L维生素B12和40g/L葡萄糖。根据将要生长的菌株添加抗生素和IPTG。发酵温度维持在31℃，溶解氧饱和度大于30%，用28%NH₄OH控制初始的pH。葡萄糖耗尽后，pH将升高。在那一时刻，开始连续稳定的进料，或者根据升高的pH在一定时间添加100–150mL的进料。进料由4.0g/L酵母提取物、33g/L(NH₄)₂SO₄、3.0g/LKH₂PO₄、1.5g/LL-苏氨酸、1.0g/LMgSO₄-7H₂O、2mg/L维生素B12和400g/L葡萄糖组成。根据菌株可以对培养基和进料进行一些微小的改变。发酵过程总计72至96小时。通过光密度和葡萄糖利用率测定甲硫氨酸的全程浓度以及细胞生长。

B.用于甲硫氨酸生产的高丝氨酸巯基化反馈抗性的产生

构建缺失了metA和metB基因的大肠杆菌菌株。该菌株由于MetA活性丧失而显示累积高丝氨酸。当野生型metA盒（metAcassette）在该菌株中表达时，在缺少甲硫氨酸的情况下由MetA活性产生OSHS。然而，当将甲硫氨酸添加到培养基中时，含有wt-metA盒的菌株由于MetA活性的反馈抑制而再次累积高丝氨酸。因此，在甲硫氨酸存在下，通过检测O-琥珀酰高丝氨酸的累积能够鉴别反馈抵抗剂metA基因。在培养基中存在大量甲硫氨酸时，产生更多OSHS的突变体中含有的反馈抑制抵抗剂metA最多。

筛选方法的示意图见图3。

metB缺失突变体的构建

采用FRT一步缺失法(Datsanko和Wanner,PNAS97:6640-6645,2000)在TF4076BJF中制备metB缺失突变体。采用引物序列15和16(SEQIDNOS:25和26)对PCR片段进行扩增，将模板pKD3电穿孔于TF4073BJF细胞中。PCR条件为94℃30秒，在94℃30秒循环25次，55℃30秒，72℃1分钟，然后72℃7分钟，采用HLPCRPremix(韩国，BioneerCo)。选择氯霉素抗性菌落，并采用PCR证实metB基因缺失。采用pCP20质粒转化去除氯霉素标记基因，通过PCR证实去除。将本步骤所获得的菌株命名为TF4076BJF-B。

15.metB+氯霉素SEQIDNO:25

5’-TTACTCTGGTGCCTGACATTTCACCGACAAAGCCCAGGGAACTTCATCACgtgtaggctggagctgcttc-3’

16.metB+氯霉素SEQIDNO:26

5’-TTACCCCTTGTTTGCAGCCCGGAAGCCATTTTCCAGGTCGGCAATTAAATcatatgaatatcctccttag-3’

metA缺失突变体的构建

采用FRT一步缺失法(PNAS.97:6640-6645,2000)在TF4076BJF-B中制备metA缺失突变体。采用引物序列17和18(SEQIDNOS:27和28)对PCR片段进行扩增，将模板pKD3电穿孔于TF4073BJF-B细胞中。PCR条件为94℃30秒，在94℃30秒循环25次，55℃30秒，72℃1分钟，然后72℃7分钟，采用HLPCRPremix(韩国，BioneerCo)。选择氯霉素抗性菌落，并采用PCR证实metA基因缺失。采用pCP20质粒转化去除氯霉素标记基因，通过PCR证实去除。将本步骤所获得的菌株命名为TF4076BJF-BA。

17.metA+氯霉素SEQIDNO:27

5’-CAATTTCTTGCGTGAAGAAAACGTCTTTGTGATGACAACTTCTCGTGCGTgtgtaggctggagctgcttcc-3’

18.metA+氯霉素SEQIDNO:28

5’-AATCCAGCGTTGGATTCATGTGCCGTAGATCGTATGGCGTGATCTGGTAGcatatgaatatcctccttag-3’

metA表达载体的构建

为了制作metA基因库，构建了metA表达载体。采用引物序列19和20(SEQIDNOS:29和30)对metA基因进行扩增，将来自大肠杆菌K12菌株的染色体作为模板。PCR条件为94℃30秒，在94℃30秒循环25次，55℃30秒，72℃1分钟，然后72℃7分钟，采用HLPCRPremix(韩国，BioneerCo)。用凝胶洗脱PCR片段，并连接到pCL1920的SmaI位点。将质粒命名为pA-CL。将pA-CL质粒转移到TF4076BJF-AB菌株中，并在含有和不含甲硫氨酸的情况下进行烧瓶培养。采用与上述测量甲硫氨酸相同的方法测量OSHS和高丝氨酸。如表6所示，在不存在甲硫氨酸时，含有pA-CL质粒的细胞产生3.8g/LOSHS和0.24g/L高丝氨酸。然而，当存在1g/L甲硫氨酸时，细胞产生5.8g/LOSHS及4.9g/L高丝氨酸。OSHS量的增加是由于添加了甲硫氨酸，促进了生长，而高丝氨酸的增加是由于甲硫氨酸对metA活性的反馈抑制。

表6含有pA-CL质粒的TF4076BJF-AB菌株中O-琥珀酰高丝氨酸及高丝氨酸的产量

19:metASEQIDNO:29

5’-aatggatccTGCCGTGAGCGGCGAATAC-3’

20:metASEQIDNO:30

5’-agctctagaCTGCTGAGGTACGTTTCGG-3’

pA-CL突变体基因库的构建

采用易错聚合酶链反应（error-pronePCR）制作pA-CL突变体基因库。将pA-CL质粒作为模板，采用引物序列21和22(SEQIDNOS:31和32)进行易错聚合酶链反应。PCR条件为94℃30秒，在94℃30秒循环25次，55℃30秒，68℃2分钟，然后72℃7分钟，采用BD变化PCR诱变试剂盒（BD，USA）。PCR片段被BamHI和XbaI消化，并连接到pCL1920。将基因库转移到菌株TF4076BJF-AB中，并收集～30,000转化子用于进一步分析。

21:pCL1920SEQIDNO:31

5’-CGAAGTAATCGCAACATCCG-3’

22:pCL1920SEQIDNO:32

5’-GTCTGCTATGTGGTGCTATC-3’

MetB酶粗提物的制备

为了通过酶法测量OSHS，采用了来自大肠杆菌的MetB酶。MetB酶与OSHS和半胱氨酸以1：1的比例反应，生成胱硫醚。DTNB（5,5-二硫双(2-硝基苯甲酸)SigmaD8130）试剂与半胱氨酸的游离SH基反应，形成黄色，其可在415nm处检测到。在MetB反应前，半胱氨酸与DTNB反应变为黄色。在MetB反应后，半胱氨酸转化成不能与DTNB结合的胱硫醚。反应发生后，随着415nm处OD的减少，可以测得反应混合物中OSHS的量。

对于MetB酶的过表达，PCR扩增的来自大肠杆菌K12染色体的metB基因被BamHI和HindIII消化，并被克隆到pCDF-Duet载体中(Novagene，USA)。将大肠杆菌K12染色体作为模板，采用引物序列23和24(SEQIDNOS:33和34)进行PCR反应。PCR条件为94℃30秒，在94℃30秒循环25次，55℃30秒，72℃1分钟，然后72℃7分钟，采用HLPCRPremix(Bioneer，韩国)。使用Tuner细胞将含有metB基因的质粒转移到大肠杆菌中，转化子在含有50μg/mL大观霉素（spectinomycin）的LB培养基中过夜生长。用含有50μg/mL大观霉素的LB培养基稀释过夜培养肉汤培养基，在37℃孵育直到在600nm处OD达到0.6，此时添加IPTG至最终浓度为0.2mM，培养物在30℃孵育4小时。通过12,000rpm离心收获细胞，在0.1M磷酸氢二钾缓冲液中(pH7.5)重悬，通过声裂法（5x30秒）使其断裂。以12,000rpm离心20分钟获得细胞粗提物，然后将上清液用于酶分析。

23:metBSEQIDNO:33

5’-gccaggatccgATGACGCGTAAACAGGCCAC-3’

24:metBSEQIDNO:34

5’-ccgcaagcttTTTACCCCTTGTTTGCAGCC-3’

反馈抑制剂metA的筛查

通过将含有pA-CL突变体的TF4076BJF-AB菌株接种到含有微发酵培养基的96孔板中，在31℃振摇培养48小时，鉴别反馈抑制剂metA突变。微发酵培养基为实施例3中描述的1体积摇瓶培养基和含有5g/LL-甲硫氨酸的1体积0.05M磷酸氢二钾缓冲液pH6.5。

然后将96孔板在3,000rpm离心10分钟，采用上述（MetB粗提物的制备）酶法在上清液中测量OSHS。将50μL培养物的上清液与50μL反应缓冲液混合（反应缓冲液：0.1M磷酸氢二钾缓冲液(pH7.5)+2.5mM半胱氨酸+1/50010mMPLP（吡哆醛5’-磷酸盐水合物，SigmaP9255）+1/100MetB粗提物(5mg/mL)）。反应在37℃孵育10分钟。加入100μLDTNB(4mg/10mL0.1M磷酸氢二钾缓冲液，pH7.5)，得到415nm处的OD。从每个96孔板中选择在415nm处显示最低吸收的1或2个菌落，将它们划线于含有50μg/mL大观霉素的LB培养基上。将得到的菌落接种到另一个含有微发酵培养基的96孔板上，进行第二轮筛查。然后将选择的菌株在上述的摇瓶培养条件下检测，向培养基中添加5g/L甲硫氨酸，测量O-琥珀酰高丝氨酸的产量。

在12,000个菌落中选择了24个突变体用于摇瓶培养，选择14个突变体用于筛查。从中鉴别出5个新的突变体。其余具有相同突变的9个突变体已有报道。摇瓶培养中14个突变体O-SHS和高丝氨酸的累积量如表7所示，所选突变体在metA序列中氨基酸的变化如表8所示。

表7所选突变体的摇瓶性能

表8所选突变体的序列分析

突变体metA的反馈抗性

因为在摇瓶培养中存在5g/L甲硫氨酸时，所有反馈抑制抵抗剂metAs均能产生相似量的OSHS，所以将更高浓度的甲硫氨酸添加到摇瓶培养基中，测定OSHS的产量。以30g/LL-甲硫氨酸培养64小时后，OSHS的产量仅在#37突变体样品中下降，其他样品均表现出与5g/L甲硫氨酸存在时相似的OSHS产量水平。表9中呈现的这些结果表明反馈抑制抵抗剂metAs对高达30g/L的甲硫氨酸的浓度有抗性。

表930g/L甲硫氨酸存在时突变体metAs的OSHS产量

突变体metA蛋白质的体外特性

采用PCR扩增，然后将鉴别为pCL-A#10、pCL-A#11、pCL-A#32、pCL-A#37和pCL-A#41的五个metA突变体基因克隆到pET30a载体中。将所有构建体经过DNA序列分析以证实突变体的存在。用C-末端His标签克隆基因用于酶纯化。如Lawrence,J.Bacteriol.,109:8-11,1972.中描述，将酶过表达、纯化，在不同水平甲硫氨酸和SAMe的存在下测定活性。对该分析仅有的改变是采用了多个样本点，并用胍来终止反应。表10概括了来自不同突变体的活性，并清晰表明当与野生型酶比较时，所有突变体均为反馈抑制抵抗剂，并且突变体#10和#11对甲硫氨酸和SAM抑制均具有最大抗性。

表10突变体和野生型MetA酶的特性

比活性保留的%	w.t.	#10	#11	#32	#37	#41
							对照品	100	100	100	100	100	100
w/100mM Met	7.6	97	94	79	83	74
							w/300mM Met	-	70	56	-	-	-
w/10mM SAM	2.9	85	82	28	27	34

*其中U为室温下每分钟形成1微摩尔CoA

选择突变体metA#10和metA#11(分别为SEQIDNOS:5和7)用于进一步分析。实验中采用300mM甲硫氨酸对metA突变体#10和#11的抑制缺乏进行分析。甲硫氨酸的浓度接近了分析条件能够达到的最高浓度。30℃下甲硫氨酸在水中的溶解度为5.6g/100mL，相当于375mM的浓度。在300mM甲硫氨酸的存在下，突变体metA#10保留了其比活性的70%，突变体metA#11保留了其比活性的55%。因此，metA#10和#11突变体可被用在甲硫氨酸中产生微生物。

含反馈抑制抵抗剂metA的甲硫氨酸生产

将metA#10和metA#11单独地克隆到甲硫氨酸产生菌株TF4076BJF中。MetA#10还与来自钩端螺旋体菌的metYX一起被克隆。按照实施例3A中描述的发酵法对克隆进行检测。发酵78小时后对甲硫氨酸浓度进行评估，结果见表11。在任何发酵中均无O-琥珀酰高丝氨酸累积。甲硫氨酸生产的时间过程如图4所示。

表11甲硫氨酸累积量

菌株	最终甲硫氨酸滴度(g/L)
		TF4076BJF	2.1
TF4076BJF metA#10	6.3
		TF4076BJF metA#11	4.5
TF4076BJF metA#10+metYX(Lm)	6.6

这些结果表明反馈抑制抵抗剂metAs的表达能提高甲硫氨酸产量，定向巯基化途径与反馈抑制抵抗剂metABC途径的结合比在天然MetA中观察到的具有更少的协同作用。观察到的更少的协同作用表明甲硫氨酸的累积可以抑制MetY。为了进一步提高甲硫氨酸产量，可以使用反馈抑制抵抗剂MetY。

C.减毒大肠杆菌中MetK活性的策略

如前所述，SAMe的形成减少了甲硫氨酸的浓度，并降低了通过metA反馈抑制的甲硫氨酸生物合成途径的活性。

一些甲硫氨酸-抵抗剂突变体具有降低metK水平并过生产甲硫氨酸的观察结果使得在metK基因中突变体的分离很容易。表12列出了被描述为导致MetK活性降低的不同metK突变。按下述方法构建这些突变体。

克隆来自大肠杆菌(登录号AP_003499或BAE77005)的metK基因，并在pET28b载体中与N-末端或C-末端His标签过表达。采用C-末端His标记的metK克隆进行位点定向的诱变，以产生所需的突变体。证实突变体MetK蛋白的表达。

纯化MetK突变体（采用C-末端His标签），并进行体外分析。将野生型C-末端His标记的MetK蛋白作为对照。采用放射性分析对突变体进行分析。分析条件如下：

分析混合物：

1.0mL0.5MHEPES/KOH，pH8.0

0.5mL1.0MKCl

0.2mL1.0MMgCl₂

1.0mL100mMATP(二钠盐，用KOH将pH调节为8.0)

0.1mL50mM甲硫氨酸

0.1mLNEN[甲基-¹⁴C]甲硫氨酸

6.6mLH₂O

用25mMEDTApH8.0来终止分析。

将45μl分析混合物和5μL酶加入到Eppendorf管中（标准化数据见表13）。将反应在室温下(或25℃)培养所需的时间（1至10分钟）。加入150μL25mMEDTA使反应停止。将100μL反应液加到直径为2.5cm的WhatmanP-81磷酸纤维素圆形滤纸片上（用铅笔标记）。用3L蒸馏水洗涤滤纸，气干并置于含水溶胶的闪烁瓶中。用从¹⁴C延伸到约0的窗口计数发射量。通过加入已知计数量的纯¹⁴C-SAM并在整个程序中运算，测定分析效率和停止水平。背景一般<100cpm（按照反应，总计数计算值为10⁵cpm）。

表12标准化活性

*WT对照品MetK蛋白也是用C－末端His标记的，用于与标记的突变体metK蛋白进行比较。当与未标记的MetK蛋白活性相比较时，观察到标记的WTMetK蛋白活性大约降低了6倍。

**报告5分钟反应时间的活性

MetK反应的产物SAMe是MetK的非竞争性抑制剂。因此，反应动力学的分析很复杂，人们期望野生型与突变型活性的差异更高些。通过了解不同突变体MetK酶的活性，可以定义适当的产物宿主。

D.SAMe转运蛋白调节

在所有有机体中均可用作初级甲基基团供体的S-腺苷Met(SAMe)用于多胺生物合成，是细胞生长的关键。S-腺苷转移酶（MetK，EC2.5.1.6）在大肠杆菌中催化仅有的已知的SAMe生物合成途径，因为该有机体不能从生长培养基中摄取SAMe。如上所述下调metK的可选方法是提供具有摄取SAMe的活性并同时能敲除metK基因的大肠杆菌，以减少或避免通过那种途径使用甲硫氨酸。然后通过向发酵培养基中添加SAMe可以控制细胞生长。

已经鉴别出立克次氏体高亲和力SAMe转运系统(Rickettsiahigh-affinitySAMetransportsystem，Tucker等,J.Bact.185:3031-3035,2003)。这种SAMe转运蛋白的K_T值为2-8μM，与来自啤酒酵母菌(3.3μM)、肉毒碱(4.5μM)和大鼠肝脏(8.9μM)的转运蛋白的值具有可比性。此外已经报道了立克次氏体转运蛋白系统能够补助大肠杆菌metK缺失突变体(Driskell等,J.Bact.187:5719-5722,2005)。

菌株W3110和TF4076BJF由含有上述提到的SAM转运蛋白的质粒转化。将来自W3110的metK基因敲除，并通过PCR证实。根据这些修饰，仅在SAM存在时能生长新的菌株，但不存在SAM时，不会生长新的菌株。然而，存在和不存在外源性SAM的情况下，它都能继续生长。

E.在发酵培养基中敲除甲硫氨酸摄取转运蛋白以增加甲硫氨酸

在大肠杆菌中鉴别出两个L-甲硫氨酸转运蛋白，一个具有非常高的亲和力(Km=0.1-0.13μM)，第二个具有较低的亲和力(Km=20-40μM)。高亲和力转运蛋白系统的基因座被定义为metD，因为metD突变体不能运载D-甲硫氨酸并利用其作为甲硫氨酸源。metD基因座与abc(metN)、yaeE(metI)和yaeC(metQ)基因相对应，这些基因编码对L-甲硫氨酸和D-甲硫氨酸摄取所必须的ABC转运蛋白。metN编码推定的ATP酶，metI编码metDABC转运蛋白的膜-跨越区。人们期望第三个组分metQ编码底物-绑定区域。因为L-甲硫氨酸存在时，metI、metN和metQ缺失突变体还能生长，这被认为是低亲和力metP系统存在的间接证据。

如图5所示，metD输入D-和L-甲硫氨酸，而遗传学上不具有特征的转运蛋白metP仅输入L-甲硫氨酸。MetD代表典型的ABC转运蛋白，其有三个组分：分别代表abc(ATP酶)、yaeE(渗透酶)、yaeC(D-甲硫氨酸-结合蛋白)的A、E和C。(Merlin等，J.Bacteriol.184:5513-5517,2002)。

通用甲硫氨酸阻抑物蛋白metJ显示编码metD基因座的操纵子的阴性对照表达。甲硫氨酸的剥夺使得metJ辅阻抑物：metD基因的转录增加。在细胞中伴随着metJ缺失，转运蛋白被更高的表达，而不会被甲硫氨酸阻抑(Merlin等,J.Bacteriol.184:5513-5517,2002)。一般地，甲硫氨酸生产菌株会减毒metJ序列或metJ的缺失以增加产量，因此这对减少甲硫氨酸输入活性尤其重要。通过敲除甲硫氨酸摄取系统可以修饰这些菌株。这将会阻止甲硫氨酸摄取并避免潜在的浪费能量的摄取/排泄的无益循环。

敲除metD会导致发酵肉汤中甲硫氨酸的累积增加25%，与上述实施例3中描述的摇瓶法所测量的结果一致。

F.metH的过表达

本文描述的由于对菌株进行修饰，通过甲硫氨酸途径所致的碳通量增加，能够导致高半胱氨酸在细胞内的累积。高半胱氨酸对细胞的毒性很大。为了避免累积，并使高半胱氨酸转化成甲硫氨酸，具有分别由metE和metH编码的、非常活跃的高半胱氨酸甲基酶活性（EC2.1.1.13和2.1.1.14）非常重要。达到该目的的一种途径就是通过在强启动子的控制下在质粒系统中或放置染色体副本来过表达这些基因。

来自大肠杆菌的天然metH基因在菌株中在几种不同启动子下过表达，所述菌株含有双途径metABC和metXY，在我们的标准摇瓶法中还测量了甲硫氨酸产量。metH过表达所用的三种载体为pCL-P(cysK)、pCL-P(pro)和pCL-P(CJ-1)，它们是用大肠杆菌cysK基因的启动子、来自市售载体pPROLar的启动子和CJ公司专有的启动子CJ1分别替代Plac启动子，对市售可获得的质粒pCL1920进行修饰得到的。大肠杆菌metH基因的ORF恰好位于这些启动子的下游。获得的结果如下面的表13所示。可以很清晰的看出在摇瓶法中，即使甲硫氨酸的累积相对低水平，高浓度的高半胱氨酸甲基酶的存在对甲硫氨酸的产量也具有非常显著的积极效果。在发酵罐中，这一效果甚至更加明显。

表13metH过表达对甲硫氨酸生产的效果

G.在甲硫氨酸生产有机体中改善硫酸盐摄取和增加APS池

本实施例描述了在内源性硫同化途径中，将大肠杆菌工程化以省略中间产物PAPS的方法。构建的新途径要求一个用于将每个硫酸盐分子减化为硫化物的小于ATP的分子，因此，其能效更高（见图6）。

如前所述，图6显示了利用可选的硫同化途径的两种方法。一种方法是克隆腺苷酰硫酸还原酶，来自杆菌或铜绿假单孢菌的cysH(EC1.8.4.9)基因，并将其整合到大肠杆菌基因组或者使其从质粒中表达。这能够将APS在单一步骤中转化成亚硫酸盐，因此避免了由大肠杆菌APS激酶(cysC)催化的由APS到PAPS的转化。第二种方法是基于细菌的cysH同系物使大肠杆菌PAPS还原酶产生变种，以便使其底物特异性地由PAPS变为APS。

将来自枯草杆菌168（登录号AJ000974区域：548..1249）和铜绿假单孢菌PA01(登录号NC_002516区域：1895692..1896495)的cysH基因克隆到质粒中，并检测以确定它们是否能补助大肠杆菌cysC或cysH敲除突变体，这两种突变体都是半胱氨酸和甲硫氨酸的营养缺陷型。

简言之，将来自枯草杆菌168和铜绿假单孢菌PA01的cysH基因转化成BL21(DE3)ΔcysH（即敲除cysH的BL21(DE3)）以检测互补作用。使用来自下面四种菌株的单一菌落来接种含有来自Novagen的过夜表达培养基（OnEX：定义为以氨基酸但非半胱氨酸或甲硫氨酸补充的培养基）的5mL培养基。

在恒定振摇下在30℃将培养物孵育48小时。表14中的结果表明来自枯草杆菌和铜绿假单孢菌的cysH基因都能在大肠杆菌中补助cysH敲除以及维持生长。

表14ΔcysH互补作用实验中600nm处的光密度

菌株	OD₆₀₀
		BL21(DE3)(野生型菌株)	5.2
BL21(DE3)ΔcysH(cysH缺失)	0
		BL21(DE3) 　cysH+pET23BscysH(杆菌cysH的添加)	7.2
BL21(DE3.)　 cysH+pET23PacysH(假单孢菌cysH的添加)	6.8

同样的，使用敲除cysC基因的菌株来检测枯草杆菌和铜绿假单孢菌cysH基因的互补作用。菌株BL21(DE3.)　cysC分别由质粒pET23a、pET23a（枯草杆菌）+cysH和pET23a+cysH（铜绿假单孢菌）转化。上述三种菌株的单一菌落与BL21(DE3)一起在含有除L-半胱氨酸和L-甲硫氨酸外的氨基酸的5mLOnEx培养基中接种。将细胞在37℃下振摇培养48h，通过OD_600nm测量其生长。表15中显示的结果表明，来自枯草杆菌和铜绿假单孢菌的cysH编码的APS还原酶能够补助BL21(DE3)的cysC突变，论证了可能省略PAPS的形成。

表15ΔcysC互补作用实验中600nm处的光密度

菌株	OD_600nm ^a
		BL21(DE3)	4.5
BL21(DE3) 　cysC+pET23a	0.0
		BL21(DE3.) 　cysC+pET23a+cysH(枯草杆菌)	2.5
BL21(DE3.) 　cysC+pET23a+cysH(铜绿假单孢菌)	4.2

^a结果为三次培养的平均值。

硫同化作用途径中酶的过表达

如上所述，为了增加甲硫氨酸的产量，具有高效的硫同化作用会很有帮助。为了使酰基高丝氨酸的定向巯基化变得容易，SH₂的可用性是很必要的。在甲硫氨酸生产菌株TF4076BJF中硫同化作用的所有主要基因均被克隆和过表达。基因过表达为：

cysPUWA:硫酸盐渗透酶

cysDN:ATP硫酰酶(EC2.7.7.4)

CysCCysH:APS激酶和PAPS硫转移酶(EC2.7.1.25和EC1.8.4.8)

CysIJCysG:NADPH-亚硫酸盐还原酶(EC1.8.1.2)

CysB:转录激活剂

这些基因在含有双途径metABC和metXY的菌株中被过表达，在我们的标准摇瓶法中测量甲硫氨酸产量。将前述五组硫酸盐同化基因分别克隆到载体pCL-(Prmf)中，该载体通过将质粒pCL1920的Plac启动子替换为大肠杆菌rmf基因的启动子而构建。获得的结果见下面的表16。

表16不同硫同化途径酶的过表达结果

菌株	OD	Met	Met/OD
						mg/L
TF4076BJF metYX(Lm)	8.0	934	116
				TF4076BJF metYX(Lm)cysPUWA	4.2	206	49
TF4076BJF metYX(Lm)cysDN	10.3	1271	123
				TF4076BJF metYX(Lm)cysCcysH	9.9	1348	136
TF4076BJF metYX(Lm)cysJIcysG	7.7	1038	134
				TF4076BJF metYX(Lm)cysB	9.4	425	45

转运酶的过表达以及调节剂的转录可致低产量的甲硫氨酸，每单位细胞质量的甲硫氨酸的量也显著下降。增加硫酰酶、APS激酶和硫转移酶的活性，都导致了每单位细胞的甲硫氨酸产量的增加以及产生的总甲硫氨酸的增加。假定在隐含两种不同质粒的菌株中观察到这些增加，则可预期一旦调整和优化酶的表达，将会更进一步改善结果。

实施例4.甲硫氨酸生产菌株示例

如前所述，本发明描述的各种遗传修饰可以通过独立于染色体的重组体DNA序列的整合来完成，或者重组体DNA序列可以被结合到生产菌株染色体中。重组体DNA序列可以作为单一副本或以多重副本结合到宿主细胞中。

i）一种微生物，如大肠杆菌ATCC#13070或TF4076，经工程化形成thrB和metJ的功能性缺失，以便减毒基因。这种微生物表达metX和metY基因，以及可以表达导致天然metH基因过表达的重组体核酸序列。metX和metY的表达在大肠杆菌中引入了附加途径，天然metH基因的过表达导致由高半胱氨酸到甲硫氨酸的通量增加。

ii)通过对i)中描述的微生物进行下面的修饰构建另一种生产菌株。i)中描述的微生物通过用活性metZ基因（如来自铜绿假单胞菌的基因）编码的重组体DNA分子将该微生物转化而被进一步修饰。

iii)通过对i)中描述的微生物进行下面的修饰构建又一种生产菌株。i)中描述的微生物通过用反馈抑制抵抗剂metA基因（诸如实施例3中描述的那些基因）代替天然metA基因而被进一步修饰。

iv)通过对iii)中描述的微生物进行下面的修饰构建另一种生产菌株。用活性metZ基因转化iii)中描述的微生物。

v)通过对i)中描述的微生物进行下面的修饰构建另一种生产菌株。i)中描述的过表达metF基因产物的微生物被再修饰以减毒转录阻抑物基因lacI。

vi)通过对本发明中描述的任一种生产菌株进行下面的修饰构建另一种生产菌株。将生产菌株经遗传构建以过表达基因cysDN、cysIJ或cysCH或其结合来改善硫同化。可选地，这些生产菌株可以被再修饰，用来自铜绿假单胞菌或枯草杆菌的单一cysH基因替代来自大肠杆菌的天然cysC和cysH。

vii)通过对本发明中描述的任一种生产菌株进行修饰构建另一种生产菌株，以减毒甲硫氨酸输入基因metD。

Claims

1.具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的分离多肽，其显示对于由L-甲硫氨酸引起的反馈抑制的敏感性降低，并且其由SEQIDNO：8的氨基酸序列组成。

2.编码权利要求1所述的分离多肽的分离核苷酸。

3.根据权利要求2所述的分离核苷酸，其由SEQIDNO:7的核苷酸序列组成。

4.含有权利要求2所述的分离核苷酸的质粒。

5.用权利要求4所述质粒转化的微生物菌株。

6.制备L-甲硫氨酸的方法，其包括：在允许L-甲硫氨酸产生的条件下培养根据权利要求5所述的微生物；以及分离因此产生的L-甲硫氨酸。