JPH07114700B2 - プラスミドを含有する微生物を用いたｌ―セリンの製造方法 - Google Patents
プラスミドを含有する微生物を用いたｌ―セリンの製造方法Info
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- JPH07114700B2 JPH07114700B2 JP62215459A JP21545987A JPH07114700B2 JP H07114700 B2 JPH07114700 B2 JP H07114700B2 JP 62215459 A JP62215459 A JP 62215459A JP 21545987 A JP21545987 A JP 21545987A JP H07114700 B2 JPH07114700 B2 JP H07114700B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明はＬ−セリンの製造方法を改良しうる新技術に
関する。Ｌ−セリンは養毛剤などの化粧品や輸液などの
アミノ酸系医薬品の成分、あるいはＬ−トリプトファン
などの製造原料として有用な物質である。
関する。Ｌ−セリンは養毛剤などの化粧品や輸液などの
アミノ酸系医薬品の成分、あるいはＬ−トリプトファン
などの製造原料として有用な物質である。
グルコースまたはDL−グリセリン酸を用いたＬ−セリン
の生成蓄積に関しては醗酵による方法（特公昭42−1772
8,同46−29191,同48−6558,同51−34476,同59−13194）
が知られている。
の生成蓄積に関しては醗酵による方法（特公昭42−1772
8,同46−29191,同48−6558,同51−34476,同59−13194）
が知られている。
しかし、Ｌ−セリン生合成酵素、ホスホグリセリン酸デ
ヒドロゲナーゼ（以下PGDHと略記）、ホスホセリンアミ
ノトランスフェラーゼ（以下PSATと略記）ホスホセリン
ホスファターゼ（以下PSPと略記）が遺伝子操作により
増強された微生物を用いたＬ−セリンの製造法は知られ
ていない。一方これらの酵素遺伝子が組み込まれたプラ
スミドを含有するトリプトファン生産性エシェリヒア属
微生物を培養してトリプトファン生産量を高める方法が
知られているが、直線Ｌ−セリンの生産量が増加したこ
とは示されていない。
ヒドロゲナーゼ（以下PGDHと略記）、ホスホセリンアミ
ノトランスフェラーゼ（以下PSATと略記）ホスホセリン
ホスファターゼ（以下PSPと略記）が遺伝子操作により
増強された微生物を用いたＬ−セリンの製造法は知られ
ていない。一方これらの酵素遺伝子が組み込まれたプラ
スミドを含有するトリプトファン生産性エシェリヒア属
微生物を培養してトリプトファン生産量を高める方法が
知られているが、直線Ｌ−セリンの生産量が増加したこ
とは示されていない。
本発明の目的は該酵素を遺伝子操作により増強したエシ
ェリヒア属微生物を用い、更に安価にＬ−セリンまたは
ホスホセリンを製造する方法を確立することにある。
ェリヒア属微生物を用い、更に安価にＬ−セリンまたは
ホスホセリンを製造する方法を確立することにある。
本発明者らは従来エシェリヒア属微生物のＬ−セリン生
合成経路を利用したＬ−セリンの生産が成功しなかった
のは、PGDHのＬ−セリンによる強いフィードバック阻害
が存在すること、PGDH、PSAT、PSPが全て構成酵素でリ
プレッションがないために、各種物質の要求性や耐性な
どの変異株採取という方法では比活性を上昇させること
ができないこと、及び一般にＬ−セリンの分解活性が強
く、著量蓄積させることが困難であることの３点が主な
原因と判断し、これらを解決するべく鋭意検討の結果本
発明を完成するに到った。
合成経路を利用したＬ−セリンの生産が成功しなかった
のは、PGDHのＬ−セリンによる強いフィードバック阻害
が存在すること、PGDH、PSAT、PSPが全て構成酵素でリ
プレッションがないために、各種物質の要求性や耐性な
どの変異株採取という方法では比活性を上昇させること
ができないこと、及び一般にＬ−セリンの分解活性が強
く、著量蓄積させることが困難であることの３点が主な
原因と判断し、これらを解決するべく鋭意検討の結果本
発明を完成するに到った。
かかる本発明は、PSPが欠損しPGDH及びPSATの両遺伝子
領域が組み込まれかつエシェリヒア属微生物の体内で複
製可能なプラスミドを含有するエシェリヒア属微生物産
生する酵素系の存在下で３−ホスホグリセリン酸及びＬ
−グルタミン酸を反応させることによる３−ホスホセリ
ンを生成させ、これにセリンヒドロキシメチルトランス
フェラーゼ、スレオニンデヒドラターゼ及びＬ−セリン
デヒドラターゼの欠損したエシェリヒア属微生物の産生
する酵素系の存在下で３−ホスホセリンを反応させるこ
とによるＬ−セリンの製造法よりなる。
領域が組み込まれかつエシェリヒア属微生物の体内で複
製可能なプラスミドを含有するエシェリヒア属微生物産
生する酵素系の存在下で３−ホスホグリセリン酸及びＬ
−グルタミン酸を反応させることによる３−ホスホセリ
ンを生成させ、これにセリンヒドロキシメチルトランス
フェラーゼ、スレオニンデヒドラターゼ及びＬ−セリン
デヒドラターゼの欠損したエシェリヒア属微生物の産生
する酵素系の存在下で３−ホスホセリンを反応させるこ
とによるＬ−セリンの製造法よりなる。
ホスホグリセン酸デヒドロゲナーゼ（PGDH）及びホスホ
セリンアミノトランスフェラーゼ（PSAT）の遺伝子領域
が組込まれかつエシェリヒア属微生物の中で複製可能な
プラスミドは例えばエシェリヒア・コリ菌体から次のよ
うにして取得することができる。大腸菌のPGDHは一般に
Ｌ−セリンによって強いフィードバック阻害を受けるこ
とが知られている（J.Biol Chen,243,2081,2090（196
8）が、本発明では野生型の遺伝子で良く阻害の程度を
軽減するように変異する必要は全くない。もちろん変異
されたものでも良い。プラスミドの取得方法としてはま
ず染色体遺伝子の抽出を行う。染色体遺伝子の抽出は常
法によって行えばよく、例えばリゾチーム等で溶菌し、
フェノール処理法等で染色体遺伝子を抽出すればよい。
セリンアミノトランスフェラーゼ（PSAT）の遺伝子領域
が組込まれかつエシェリヒア属微生物の中で複製可能な
プラスミドは例えばエシェリヒア・コリ菌体から次のよ
うにして取得することができる。大腸菌のPGDHは一般に
Ｌ−セリンによって強いフィードバック阻害を受けるこ
とが知られている（J.Biol Chen,243,2081,2090（196
8）が、本発明では野生型の遺伝子で良く阻害の程度を
軽減するように変異する必要は全くない。もちろん変異
されたものでも良い。プラスミドの取得方法としてはま
ず染色体遺伝子の抽出を行う。染色体遺伝子の抽出は常
法によって行えばよく、例えばリゾチーム等で溶菌し、
フェノール処理法等で染色体遺伝子を抽出すればよい。
次のこの染色体遺伝子を適当な制限酵素例えばBamH I,S
au3A等で切断する。
au3A等で切断する。
次に切り出された染色体遺伝子のフラグメントをエシェ
リヒア属微生物の体内で複製可能でかつプロモーター活
性をもつベクターに接続する。具体的に例示すればpBR3
22,pBR325,pBR328,pUC18,pUC19,pUC118,pUC119,pSC101,
pKK223−3,pKK233−2,などがあげられる。ベクターDNA
の開裂は、当該DNAを一箇所で切断する制限酵素を用い
て切断するか、複数部位を切断する制限酵素を用いて部
分的に切断することにより行う。
リヒア属微生物の体内で複製可能でかつプロモーター活
性をもつベクターに接続する。具体的に例示すればpBR3
22,pBR325,pBR328,pUC18,pUC19,pUC118,pUC119,pSC101,
pKK223−3,pKK233−2,などがあげられる。ベクターDNA
の開裂は、当該DNAを一箇所で切断する制限酵素を用い
て切断するか、複数部位を切断する制限酵素を用いて部
分的に切断することにより行う。
ベクターDNAは、染色体遺伝子を切断した際に用いられ
た制限酵素により切断され、または染色体DNA切断フラ
グメント及び切断されたベクターDNAのそれぞれの両端
に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを接続
せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体DNAフラ
グメントとのライゲーション反応に付される。ライゲー
ション反応は大腸菌のリガーゼやT4ファージのリガーゼ
を用いて常法により行えばよい。こうして得られた染色
体DNAとベクターの結合した組換DANをエシェリヒア属菌
等の受容菌に導入してクローニングを行いPGDHの遺伝子
領域を含むプラスミドを保有する菌及びPSATの遺伝子領
域を含むプラスミドを保有する菌を分離する。前記受容
菌にPGDH遺伝子領域の欠損株及びPSAT遺伝子領域の欠損
株を用いて形質転換させることにより両DNAのクローニ
ングを行うことができる。
た制限酵素により切断され、または染色体DNA切断フラ
グメント及び切断されたベクターDNAのそれぞれの両端
に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを接続
せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体DNAフラ
グメントとのライゲーション反応に付される。ライゲー
ション反応は大腸菌のリガーゼやT4ファージのリガーゼ
を用いて常法により行えばよい。こうして得られた染色
体DNAとベクターの結合した組換DANをエシェリヒア属菌
等の受容菌に導入してクローニングを行いPGDHの遺伝子
領域を含むプラスミドを保有する菌及びPSATの遺伝子領
域を含むプラスミドを保有する菌を分離する。前記受容
菌にPGDH遺伝子領域の欠損株及びPSAT遺伝子領域の欠損
株を用いて形質転換させることにより両DNAのクローニ
ングを行うことができる。
前記組換えDNAをエシェリヒア属に属する受容菌へ導入
する形質転換は、エシェリヒア・コリＫ−12について報
告されている様な（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Bio
l.,53,159（1970）受容菌細胞を塩化カルシウムで処理
してDNAの透過性を増やす方法などにより可能である。
また、前記受容菌にはＬ−セリン生合成系の各構造遺伝
子が変異を受けて酵素が活性を失ないそのためにＬ−セ
リン要求性を示すようになっている変異株を用い、この
Ｌ−セリン要求性を消失した菌株を分離することにより
目的のプラスミドを保有する菌を取得することができ
る。
する形質転換は、エシェリヒア・コリＫ−12について報
告されている様な（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Bio
l.,53,159（1970）受容菌細胞を塩化カルシウムで処理
してDNAの透過性を増やす方法などにより可能である。
また、前記受容菌にはＬ−セリン生合成系の各構造遺伝
子が変異を受けて酵素が活性を失ないそのためにＬ−セ
リン要求性を示すようになっている変異株を用い、この
Ｌ−セリン要求性を消失した菌株を分離することにより
目的のプラスミドを保有する菌を取得することができ
る。
次に、分離した菌体からPGDHの遺伝子領域を含むプラス
ミドとPSATの遺伝子領域を含むプラスミドをそれぞれ抽
出し、それぞれを制限酵素で切断後必要により分画して
精製を行う（分画法の例）それから各遺伝子領域を含む
フラグメントを前記リガーゼ等で結合させ前記分画法等
で分画精製することによりPGDH及びPSATの遺伝子領域が
組込まれかつエシェリヒア属微生物の体内で複製可能な
プラスミドを取得することができる。
ミドとPSATの遺伝子領域を含むプラスミドをそれぞれ抽
出し、それぞれを制限酵素で切断後必要により分画して
精製を行う（分画法の例）それから各遺伝子領域を含む
フラグメントを前記リガーゼ等で結合させ前記分画法等
で分画精製することによりPGDH及びPSATの遺伝子領域が
組込まれかつエシェリヒア属微生物の体内で複製可能な
プラスミドを取得することができる。
このPGDH及びPSATの遺伝子領域が組込まれかつエシェリ
ヒア属微生物の体内で複製可能なプラスミドは第１図の
pserAC3及びpserAC4に示す如く大腸菌DNAのserA領域及
びserC領域を含みさらに前記のエシェリヒア属微生物の
体内で複製可能でかつプロモーター活性をもつベクター
を含むものである。
ヒア属微生物の体内で複製可能なプラスミドは第１図の
pserAC3及びpserAC4に示す如く大腸菌DNAのserA領域及
びserC領域を含みさらに前記のエシェリヒア属微生物の
体内で複製可能でかつプロモーター活性をもつベクター
を含むものである。
こうして得られたPGDH及びPSATの遺伝子領域が組込まれ
かつエシェリヒア属微生物の体内で複製可能なプラスミ
ドをエシェリヒア属微生物に導入する。この微生物を用
いてホスホセリンを製造するためにはこの微生物はホス
ホセリンホスファターゼ（PSP）の欠損したものが適当
である。このような微生物の例としてE.coliCGSC5409
（serB）を挙げることができる。また、プラスミドベク
ターとしては、適当な薬剤耐性マーカーを有するものを
用いればその薬剤耐性を利用して形質転換して前記プラ
スミドを取込んだ微生物を容易に分離することができ
る。このプラスミドを導入する形質転換は常法によって
行えばよい。該プラスミドを取込んだエシェリヒア属微
生物の例としてエシェリヒアコリSAC4（AL12344）FERMP
−9448を挙げることができる。尚、この菌の菌学的性質
はPGDH及びPSATの遺伝子を持つプラスミドを含有する以
外宿主と何らかわるところがない。即ちグラム陰性
桿菌胞子を形成しないグルコースを醗酵し、ガス
（V2＋H2）を生成する等の宿主と同じ性質を維持してい
る。
かつエシェリヒア属微生物の体内で複製可能なプラスミ
ドをエシェリヒア属微生物に導入する。この微生物を用
いてホスホセリンを製造するためにはこの微生物はホス
ホセリンホスファターゼ（PSP）の欠損したものが適当
である。このような微生物の例としてE.coliCGSC5409
（serB）を挙げることができる。また、プラスミドベク
ターとしては、適当な薬剤耐性マーカーを有するものを
用いればその薬剤耐性を利用して形質転換して前記プラ
スミドを取込んだ微生物を容易に分離することができ
る。このプラスミドを導入する形質転換は常法によって
行えばよい。該プラスミドを取込んだエシェリヒア属微
生物の例としてエシェリヒアコリSAC4（AL12344）FERMP
−9448を挙げることができる。尚、この菌の菌学的性質
はPGDH及びPSATの遺伝子を持つプラスミドを含有する以
外宿主と何らかわるところがない。即ちグラム陰性
桿菌胞子を形成しないグルコースを醗酵し、ガス
（V2＋H2）を生成する等の宿主と同じ性質を維持してい
る。
これらの形質転換株の培養は炭素源、窒素源などを含む
エシェリヒア属微生物を培養できる通常の培地で好気的
条件下で行えばよい。pH5から９の範囲の適当なpHで25
から37℃の範囲の適当な温度に調節しつつ培養するのが
望ましい。
エシェリヒア属微生物を培養できる通常の培地で好気的
条件下で行えばよい。pH5から９の範囲の適当なpHで25
から37℃の範囲の適当な温度に調節しつつ培養するのが
望ましい。
こうして得られる培養液、該培養液から遠心分離などに
より採取した生菌体、あるいは菌体処理物（例えば菌体
磨砕物，菌体の超音波処理物，菌体抽出液，該抽出液よ
り得らた酵素区分）などを酵素源として利用することに
より３−ホスホグリセリン酸及びＬ−グルタミン酸から
３−ホスホセリンを生成蓄積させることができる。その
際、補酵素としてNADが必要である。これらは直接反応
液に添加してもよくまた、反応液中でこれらを生成する
前駆物質の形で加えてもよい。例えばグルコース、グル
コース−６−リン酸、フラクトース−１、６−ジリン酸
あるいはグリセリン酸から前記酵素源中に含まれる解糖
系酵素群の作用により３−ホスホグリセリン酸を生成さ
せてこれを使用することができる。また、Ｌ−グルタミ
ン酸も２−ケトグルタル酸とアンモニアからやはり前記
酵素源中に含まれるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ等の
作用によりＬ−グルタミン酸を生成させてこれを使用す
ることができる。Ｌ−グルタミン酸は反応液中に別途添
加されたグルタミン酸デヒドロゲナーゼの作用により２
−ケトグルタル酸とアンモニアから生成させることもで
きる。
より採取した生菌体、あるいは菌体処理物（例えば菌体
磨砕物，菌体の超音波処理物，菌体抽出液，該抽出液よ
り得らた酵素区分）などを酵素源として利用することに
より３−ホスホグリセリン酸及びＬ−グルタミン酸から
３−ホスホセリンを生成蓄積させることができる。その
際、補酵素としてNADが必要である。これらは直接反応
液に添加してもよくまた、反応液中でこれらを生成する
前駆物質の形で加えてもよい。例えばグルコース、グル
コース−６−リン酸、フラクトース−１、６−ジリン酸
あるいはグリセリン酸から前記酵素源中に含まれる解糖
系酵素群の作用により３−ホスホグリセリン酸を生成さ
せてこれを使用することができる。また、Ｌ−グルタミ
ン酸も２−ケトグルタル酸とアンモニアからやはり前記
酵素源中に含まれるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ等の
作用によりＬ−グルタミン酸を生成させてこれを使用す
ることができる。Ｌ−グルタミン酸は反応液中に別途添
加されたグルタミン酸デヒドロゲナーゼの作用により２
−ケトグルタル酸とアンモニアから生成させることもで
きる。
反応液の３−ホスホグリセリン酸及びＬ−グルタミン酸
の濃度は0.1〜20％程度でよい。PGDHの作用により３−
ホスホグリセリン酸とNADを反応させて３−ホスホヒド
ロキシピルビン酸を生成する反応と、PSATの作用により
この３−ホスホヒドロキシピルビン酸とＬ−グルタミン
酸を反応させて３−ホスホセリンを生成する反応は別の
場で行わせてもよいが同一溶液内で連続的に反応を進行
させる方法が簡便である。
の濃度は0.1〜20％程度でよい。PGDHの作用により３−
ホスホグリセリン酸とNADを反応させて３−ホスホヒド
ロキシピルビン酸を生成する反応と、PSATの作用により
この３−ホスホヒドロキシピルビン酸とＬ−グルタミン
酸を反応させて３−ホスホセリンを生成する反応は別の
場で行わせてもよいが同一溶液内で連続的に反応を進行
させる方法が簡便である。
３−ホスホセリンからＬ−セリンを合成するにはセリン
ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、スレオニンデヒ
ドラターゼ及びＬ−セリンデヒドラターゼの欠損したエ
シェリヒア属微生物を用いる。この微生物は上記各酵素
の欠損に応じ上記の順にグリシン要求株、Ｌ−セリンを
唯一の炭素源として利用できない株、イソロイシン要求
株に相当するからこれらの要求をすべて満たす菌株を選
択すればよい。このような微生物の例としてE.coli IGS
26（ilvA,glyA,lsd）を挙げることができる。この微生
物にエシェリヒアコリの染色体より得たPSP遺伝子領域
が組込まれていてかつエシェリヒア属微生物の中で複製
可能なプラスミドを導入する。このプラスミドはクロー
ニングにPSP遺伝子領域の欠損したエシェリヒア属受容
菌を用いる他は前記のPGDHの遺伝子領域を含むプラスミ
ドと同様にして取得することができる。また、このプラ
スミドを導入する形質転換も前述と同様にして行えばよ
い。
ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、スレオニンデヒ
ドラターゼ及びＬ−セリンデヒドラターゼの欠損したエ
シェリヒア属微生物を用いる。この微生物は上記各酵素
の欠損に応じ上記の順にグリシン要求株、Ｌ−セリンを
唯一の炭素源として利用できない株、イソロイシン要求
株に相当するからこれらの要求をすべて満たす菌株を選
択すればよい。このような微生物の例としてE.coli IGS
26（ilvA,glyA,lsd）を挙げることができる。この微生
物にエシェリヒアコリの染色体より得たPSP遺伝子領域
が組込まれていてかつエシェリヒア属微生物の中で複製
可能なプラスミドを導入する。このプラスミドはクロー
ニングにPSP遺伝子領域の欠損したエシェリヒア属受容
菌を用いる他は前記のPGDHの遺伝子領域を含むプラスミ
ドと同様にして取得することができる。また、このプラ
スミドを導入する形質転換も前述と同様にして行えばよ
い。
形質転換されたE.coli SB3（AJ 12345）FERM P−9447の
菌学的性質はPSPの遺伝子を有するプラスミドを含有す
る以外は宿主の性質と同じである。即ち、グラム陰性
桿菌胞子を形成しないグルコースを醗酵し、ガス
（V2＋H2）を生成する亜硝酸を還元する等の宿主と同
じ性質を示した。
菌学的性質はPSPの遺伝子を有するプラスミドを含有す
る以外は宿主の性質と同じである。即ち、グラム陰性
桿菌胞子を形成しないグルコースを醗酵し、ガス
（V2＋H2）を生成する亜硝酸を還元する等の宿主と同
じ性質を示した。
この形質転換株の培養は炭素源、窒素源などを含むエシ
ェリヒア属微生物を培養できる通常の培地で好気的条件
下で行えばよい。pH5から９の範囲の適当なpHで25から3
7℃の範囲の適当の範囲に調節しつつ培養するのが望ま
しい。
ェリヒア属微生物を培養できる通常の培地で好気的条件
下で行えばよい。pH5から９の範囲の適当なpHで25から3
7℃の範囲の適当の範囲に調節しつつ培養するのが望ま
しい。
こうして得られる培養液、該培養液から遠心分離などに
より採取した生菌体、あるいは菌体処理物（例えば菌体
磨砕物、菌体の超音波処理物、菌体抽出液、該抽出液よ
り得られた酵素区分）などを酵素源として利用すること
により３−ホスホセリンからＬ−セリンを生成蓄積させ
ることができる。
より採取した生菌体、あるいは菌体処理物（例えば菌体
磨砕物、菌体の超音波処理物、菌体抽出液、該抽出液よ
り得られた酵素区分）などを酵素源として利用すること
により３−ホスホセリンからＬ−セリンを生成蓄積させ
ることができる。
本発明の酵素反応はpH5〜９程度において、温度20〜50
℃程度で、静置、振盪もしくは攪拌下に行うのが好まし
い。
℃程度で、静置、振盪もしくは攪拌下に行うのが好まし
い。
反応系中に生成したＬ−セリンの単離は、イオン交換樹
脂を用いる方法など、通常の方法で行うことができる。
脂を用いる方法など、通常の方法で行うことができる。
３−ホスホグリセリン酸とＬ−グルタミン酸とNADから
Ｌ−セリンを生成する酵素的経路は以下に示される通り
である。
Ｌ−セリンを生成する酵素的経路は以下に示される通り
である。
PSPの活性を失い、そのためにＬ−セリン要求性を示す
ようになっている変異株はＬ−セリンを生合成できな
い。これを利用するとPGDHがＬ−セリンによって阻害さ
れないので、効率良く３−ホスホセリンを生成蓄積する
ことができる。さらに、これを受容菌としてPGDHとPSAT
の少なくとも一方の比活性を遺伝子操作によって増強す
ると生産量を高めることができる。この時増強する遺伝
子は野生型で良く、セリンによるフィードバック阻害の
程度を軽減するような変異操作を全く必要としない。
ようになっている変異株はＬ−セリンを生合成できな
い。これを利用するとPGDHがＬ−セリンによって阻害さ
れないので、効率良く３−ホスホセリンを生成蓄積する
ことができる。さらに、これを受容菌としてPGDHとPSAT
の少なくとも一方の比活性を遺伝子操作によって増強す
ると生産量を高めることができる。この時増強する遺伝
子は野生型で良く、セリンによるフィードバック阻害の
程度を軽減するような変異操作を全く必要としない。
このようにしてＬ−セリン製造用原料などに用いれらる
３−ホスホセリンを効率良く生産することができる。
３−ホスホセリンを効率良く生産することができる。
Ｌ−セリンは、３−ホスホセリンからPSPによって生産
することができる。このときPSPを遺伝子操作によって
増強すると生産量を高めることができる。さらにセリン
分解活性の弱化した変異株を用いれば、PSPの精製やセ
リン分解活性の失活などの操作を全く必要とせずに効率
良くＬ−セリンを生産することができる。
することができる。このときPSPを遺伝子操作によって
増強すると生産量を高めることができる。さらにセリン
分解活性の弱化した変異株を用いれば、PSPの精製やセ
リン分解活性の失活などの操作を全く必要とせずに効率
良くＬ−セリンを生産することができる。
１ PGDH遺伝子（serA）、PSAT遺伝子（serC）、PSP遺
伝子（serB）、クローニング １−１ E.coliのserA,serC,serBを含む染色体DNAの調
製 E.coli C600を250mlのLB培地（バクトトリプトン10g/
，酵母エキス5g/,NaCl 10g/を含みpH7.5に調製し
たもの）に植菌し、30℃で約３時間振盪培養を行い、対
数増殖期の菌体を集めた。
伝子（serB）、クローニング １−１ E.coliのserA,serC,serBを含む染色体DNAの調
製 E.coli C600を250mlのLB培地（バクトトリプトン10g/
，酵母エキス5g/,NaCl 10g/を含みpH7.5に調製し
たもの）に植菌し、30℃で約３時間振盪培養を行い、対
数増殖期の菌体を集めた。
この菌体をリゾチーム・SDSで溶菌させたのち、通常の
フェノール処理法により、染色体DNAを抽出精製し、最
終的に3.5mgのDNAを得た。
フェノール処理法により、染色体DNAを抽出精製し、最
終的に3.5mgのDNAを得た。
１−２ 染色体DNA断片のベクターへの挿入１−１で得
た染色体DAN10μを制限酵素sau3AIで、一方ベクター
プラスミドとしてpBR322（アンピシリン耐性（Ampr）、
テラサイクリン耐性（Tcr））５μを制限酵素BamH I
でそれぞれを37℃で一時間反応させて切断した。
た染色体DAN10μを制限酵素sau3AIで、一方ベクター
プラスミドとしてpBR322（アンピシリン耐性（Ampr）、
テラサイクリン耐性（Tcr））５μを制限酵素BamH I
でそれぞれを37℃で一時間反応させて切断した。
65℃に10分間加熱した後、両反応液を混合し、ATP及び
ジチオスレイトール存在下、T4ファージ由来のDANリガ
ーゼによって10℃に24時間保持しDNA鎖を連結した。
ジチオスレイトール存在下、T4ファージ由来のDANリガ
ーゼによって10℃に24時間保持しDNA鎖を連結した。
１−３ serA,serC,serBを含むプラスミドによる形質転
換E.coliCGSC856（serA,thi）、E.coliCGSC4297（ser
C）E.coliCGSC5409（serB,thr,argF,purA）をそれぞれs
erA,serC,serBクローニング用のDAN受容菌として用い
た。これらを常法に従って塩化カルシウム処理し、コン
ピテントセル（DNAの取込能を増した細胞）を調製し
た。このコンピテントセル懸濁液に１−２で得たDNA溶
液を加えて常法に従って形質転換反応を完了させた後、
細胞懸濁液をアンピシリン100μ/ml含有最小培地プレ
ート（Na2HPO4 6g/l,KH2PO4 3g/l,NH4Cl 1g/l,NaCl 0.5
g/l,MgSo4 2mM,CaCl2 0.1mM,glucose 0.2％（pH7.2）を
基本最小培地としてこれに寒天15％及び使用菌の栄養要
求物質（CGSC856用にはビタミンB11mg/、そしてCGSC5
409用にはＬ−スレオニンとＬ−アルギニンを各々100ml
/、アデニンとグアニンを各々10mg/を添加する。）
に塗沫し37℃で培養した。24〜40時間後に出現したコロ
ニーはアンピシリン耐性でかつＬ−セリン要求性の消失
した形質転換株である。CGSC856を用いた区分から１
株、CGSC4297を用いた区分から８株、CGSC5409を用いた
区分から３株を得た。
換E.coliCGSC856（serA,thi）、E.coliCGSC4297（ser
C）E.coliCGSC5409（serB,thr,argF,purA）をそれぞれs
erA,serC,serBクローニング用のDAN受容菌として用い
た。これらを常法に従って塩化カルシウム処理し、コン
ピテントセル（DNAの取込能を増した細胞）を調製し
た。このコンピテントセル懸濁液に１−２で得たDNA溶
液を加えて常法に従って形質転換反応を完了させた後、
細胞懸濁液をアンピシリン100μ/ml含有最小培地プレ
ート（Na2HPO4 6g/l,KH2PO4 3g/l,NH4Cl 1g/l,NaCl 0.5
g/l,MgSo4 2mM,CaCl2 0.1mM,glucose 0.2％（pH7.2）を
基本最小培地としてこれに寒天15％及び使用菌の栄養要
求物質（CGSC856用にはビタミンB11mg/、そしてCGSC5
409用にはＬ−スレオニンとＬ−アルギニンを各々100ml
/、アデニンとグアニンを各々10mg/を添加する。）
に塗沫し37℃で培養した。24〜40時間後に出現したコロ
ニーはアンピシリン耐性でかつＬ−セリン要求性の消失
した形質転換株である。CGSC856を用いた区分から１
株、CGSC4297を用いた区分から８株、CGSC5409を用いた
区分から３株を得た。
上記12株からプラスミドを抽出したところ、いずれのプ
ラスミドもベクタープラスミドp3R322よりも明らかに大
きく、CGSC856を用いた区分から得た組換えプリスミド
をpserA1,CGSC4297を用いた区分から得た組換プラスミ
ドをpserC1〜8,CGSC5409を用いた区分から得た組換えプ
ラスミドをpserB1〜3,と名付けた。
ラスミドもベクタープラスミドp3R322よりも明らかに大
きく、CGSC856を用いた区分から得た組換えプリスミド
をpserA1,CGSC4297を用いた区分から得た組換プラスミ
ドをpserC1〜8,CGSC5409を用いた区分から得た組換えプ
ラスミドをpserB1〜3,と名付けた。
２ PGDH遺伝子（serA）とPSAT遺伝子（serC）の連結
２−1serAとserCの遺伝子領域の決定 １で作成したプラスミドpserA1とpserC6を各々２〜３カ
所で切断する制限酵素を用いて切断し、そのままライゲ
ーションを行った後、各々を１で用いたserA欠損株とse
rC欠損株に導入した。これをアンピシリン100μ/ml含
有LBプレート（酵母エキス5g/，ポリペプトン10g/,
Nacl 5g/（pH7.5）に寒天1.5％を添加したもの）に塗
沫し、37℃で一夜培養した。出現したコロニーを実施例
１で用いたアンピシリ100μ/ml含有最小培地プレート
にレプリカし、生育の有無を判定した。各各生育した株
と生育しなかった株からプラスミドを抽出したもとのプ
ラスミドと比較して各々の酵素活性発現に必要な遺伝子
領域を決定した（第１図）。
２−1serAとserCの遺伝子領域の決定 １で作成したプラスミドpserA1とpserC6を各々２〜３カ
所で切断する制限酵素を用いて切断し、そのままライゲ
ーションを行った後、各々を１で用いたserA欠損株とse
rC欠損株に導入した。これをアンピシリン100μ/ml含
有LBプレート（酵母エキス5g/，ポリペプトン10g/,
Nacl 5g/（pH7.5）に寒天1.5％を添加したもの）に塗
沫し、37℃で一夜培養した。出現したコロニーを実施例
１で用いたアンピシリ100μ/ml含有最小培地プレート
にレプリカし、生育の有無を判定した。各各生育した株
と生育しなかった株からプラスミドを抽出したもとのプ
ラスミドと比較して各々の酵素活性発現に必要な遺伝子
領域を決定した（第１図）。
２−２ serA遺伝子を含むDNA断片のserC遺伝子を含む
フラスミドへの連結 serA欠損株を相補するプラスミド
pserA1から第１図に示したserA遺伝子領域を含むEcoRV
−Hpa1の約2.9Kbの断片を分画しEcoRVとHPa Iで切断し
たpserC6のserC遺伝子領域を含む約6.4Kbの断片に連結
しこの組換プラスミドでE.coliのserA欠損株とserC欠損
株を形質転換した結果各々のＬ−セリン要求性が消失し
た。約2.9KbのEcoRV−Hpa1の断片の挿入方向が互いに逆
の組換プラスミドをそれぞれpserAC3,pserAC4と名付け
た（第１図）。
フラスミドへの連結 serA欠損株を相補するプラスミド
pserA1から第１図に示したserA遺伝子領域を含むEcoRV
−Hpa1の約2.9Kbの断片を分画しEcoRVとHPa Iで切断し
たpserC6のserC遺伝子領域を含む約6.4Kbの断片に連結
しこの組換プラスミドでE.coliのserA欠損株とserC欠損
株を形質転換した結果各々のＬ−セリン要求性が消失し
た。約2.9KbのEcoRV−Hpa1の断片の挿入方向が互いに逆
の組換プラスミドをそれぞれpserAC3,pserAC4と名付け
た（第１図）。
３ E.coliCGSC5409（serB）のＬ−セリン生合成酵素PG
DH、PSATの強化 E.coliCGSC5409を各々pserA1、pserC6、pserAC4で形質
転換しアンピシリン耐性を指標として各々形質転換株を
選択した。こうして得られた形質転換株を各SA1、SC6、
エシェリヒアコリSAC4（AJ 12344）FERM P−9448と名付
けた。各々のPGDH,PSAT活性をPizerらの方法（Meth,Enz
ymol.,17B,325（1971））およびHirschらの方法（j.Bio
l.Chem.,242,2283（1976））を用いて測定したところ、
第１表に示す結果を得た。
DH、PSATの強化 E.coliCGSC5409を各々pserA1、pserC6、pserAC4で形質
転換しアンピシリン耐性を指標として各々形質転換株を
選択した。こうして得られた形質転換株を各SA1、SC6、
エシェリヒアコリSAC4（AJ 12344）FERM P−9448と名付
けた。各々のPGDH,PSAT活性をPizerらの方法（Meth,Enz
ymol.,17B,325（1971））およびHirschらの方法（j.Bio
l.Chem.,242,2283（1976））を用いて測定したところ、
第１表に示す結果を得た。
４ 下記の反応液組成に対してCGSC5409、SA1,SC6の培
養菌体の超音波破砕物を添加して37℃に８時間保温して
３−ホスホセリンを生産し、第２表に示す結果を得た。
養菌体の超音波破砕物を添加して37℃に８時間保温して
３−ホスホセリンを生産し、第２表に示す結果を得た。
〈反応液組成〉 0.1 M ３−オスホグリセリン酸 0.1 M Ｌ−グルタミン酸 １ mM NAD １ mM DTT １ mM EDTA 0.1 M リン酸カリウムバッファー（ph7.5） ５ ４の反後液のＬ−グルタミン酸を10mMにし、ウシ肝
臓のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（1U/ml）とアンモ
ニア（0.1M）を添加した。SA1とSC6の培養菌体の超音波
破砕物を添加して37℃に24時間保温した時の３−ホスセ
リン生成量は18.8mMだった。
臓のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（1U/ml）とアンモ
ニア（0.1M）を添加した。SA1とSC6の培養菌体の超音波
破砕物を添加して37℃に24時間保温した時の３−ホスセ
リン生成量は18.8mMだった。
６ ４の反後液の３−ホスホグリセリン酸のかわりにグ
ルコース６−リン酸を添加した。SA1とSC6の培養菌体の
超音波破砕物を添加して37℃に８時間保温した時の３−
ホスホセリン生成量は16.1mMだった。
ルコース６−リン酸を添加した。SA1とSC6の培養菌体の
超音波破砕物を添加して37℃に８時間保温した時の３−
ホスホセリン生成量は16.1mMだった。
７ ６の反応液に添加した酵素をSAC4から調製したもの
にかえたところ３−ホスホセリン生成量はと37.7mMだっ
た。
にかえたところ３−ホスホセリン生成量はと37.7mMだっ
た。
８ ４の３−ホスホグリセリン酸をグルコースにかえ
て、SA1とSC6の培養菌体の５％ベンゼン処理菌体を用い
たところ８時間で5.1mMの３−ホスホセリンが生成し
た。
て、SA1とSC6の培養菌体の５％ベンゼン処理菌体を用い
たところ８時間で5.1mMの３−ホスホセリンが生成し
た。
９ ３−ホスホセリンからＬ−セリンの生産 ９−１ Ｌ−セリン分解活性弱化株の育種 CGSC1255（ilvA）親株として変異処理を行いCGSC1255か
らセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼおよびセ
リンデヒドラターゼ欠損株を誘導しIGS26と命名した。
らセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼおよびセ
リンデヒドラターゼ欠損株を誘導しIGS26と命名した。
９−２ IGS26のホスホセリンホスファターゼ（PSP）の
強化 IGS26をPSP遺伝子（serB）を有するプラスミドpS
B3で形質転換し、アンピシリン耐性を指標として形質転
換株を選択した。得られた形質転換株をエシェリヒアコ
リSB3（AJ12345）FERM P−9447と命名した。
強化 IGS26をPSP遺伝子（serB）を有するプラスミドpS
B3で形質転換し、アンピシリン耐性を指標として形質転
換株を選択した。得られた形質転換株をエシェリヒアコ
リSB3（AJ12345）FERM P−9447と命名した。
９−３ ３−ホスホセリンからＬ−セリンの生産 下記の反応液組成に対して１で得たCGSC5409pSB3及び上
記の形質転換株SB3の菌体の超音波破砕物それぞれ添加
して37℃に24時間保温してＬ−セリンを生産し、第３表
に示す結果を得た。
記の形質転換株SB3の菌体の超音波破砕物それぞれ添加
して37℃に24時間保温してＬ−セリンを生産し、第３表
に示す結果を得た。
〈反応液組成〉 0.1 M ３−ホスホセリン酸 １ mM DTT １ mM EDTA 0.1 M リン酸カリウムバッファー（ph7.5） 〔発明の効果〕 本発明により３−ホスホセリン及びＬ−セリンを容易に
効率よくかつ著量生産することができる。
効率よくかつ著量生産することができる。
第１図は本発明のプラスミドの合成径路を示す図であ
る。
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:185） Ｃ１２Ｒ 1:185）
Claims (1)
- 【請求項１】ホスホセリンホスファターゼが欠損しホス
ホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ及びホスホセリンアミ
ノトランスフェラーゼの遺伝子領域が組み込まれ、かつ
エシェリヒア属微生物の中で複製可能なプラスミドを含
有するエシェリヒア属微生物の培養液、菌体又は菌体処
理物の存在下で３−ホスホグリセリン酸及びＬ−グルタ
ミン酸を反応させて３−ホスホセリンを生成させる第１
工程と、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、
スレオニンデヒドラターゼ及びＬ−セリンデヒドラター
ゼが欠損しているエシェリヒア属微生物の培養液、菌体
又は菌体処理物と前記第１工程で得られた３−ホスホセ
リンを反応させてＬ−セリンを生成させる第２工程とか
らなることを特徴とするＬ−セリンの製造法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62215459A JPH07114700B2 (ja) | 1987-08-31 | 1987-08-31 | プラスミドを含有する微生物を用いたｌ―セリンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62215459A JPH07114700B2 (ja) | 1987-08-31 | 1987-08-31 | プラスミドを含有する微生物を用いたｌ―セリンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6460383A JPS6460383A (en) | 1989-03-07 |
| JPH07114700B2 true JPH07114700B2 (ja) | 1995-12-13 |
Family
ID=16672724
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62215459A Expired - Fee Related JPH07114700B2 (ja) | 1987-08-31 | 1987-08-31 | プラスミドを含有する微生物を用いたｌ―セリンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07114700B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20200255874A1 (en) * | 2016-09-21 | 2020-08-13 | KOHJIN Life Sciences Co., Ltd. | Method for producing l-cysteine |
| KR102221040B1 (ko) * | 2019-05-09 | 2021-03-03 | 씨제이제일제당 주식회사 | L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산을 생산하는 방법 |
-
1987
- 1987-08-31 JP JP62215459A patent/JPH07114700B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＣＡＮ．Ｊ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．，２７（８）（１９８１），Ｐ．８０８−８１４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6460383A (en) | 1989-03-07 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |