JP2004254694A - グルコースおよびペントースの混合物の発酵によりｌ−アミノ酸を産生する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】エシェリヒア属に属する細菌を用いてＬ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−スレニオンおよびＬ−トリプトファンのようなＬ−アミノ酸を生産する方法の提供。
【解決手段】培地中でＬ−アミノ酸の生合成に関する遺伝子の発現が高められた細菌を培養すること、および生成および蓄積されるべき前記Ｌ−アミノ酸を前記培地から回収することを含み、ここで前記培地はグルコースならびにアラビノースおよびキシロースのようなペントース糖の混合物を含有する。
【選択図】なし

Description

発明の背景
本発明は、バイオテクノロジー、具体的にはペントース発酵によりＬ−アミノ酸を産生する方法、より具体的には炭素源としてグルコースと共にアラビノースおよび／またはキシロースの混合物を用いた発酵によりＬ−アミノ酸を産生する方法に関する。セルロース系バイオマスからのヘミセルロース画分のヘキソースおよびペントースの混合物を含む高価でない炭素源は、Ｌ−アミノ酸、例えば、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−スレオニンンおよびＬ−トリプトファンの商業生産に利用することができる。

従来、Ｌ−アミノ酸は、種々の微生物株を用いた発酵プロセスにより工業的に生産されてきた。このプロセスに用いる発酵培地は、十分な量の種々の炭素源および窒素源を含有している必要がある。

伝統的には、炭素源としてヘキソース、ペントース、トリオースのような各種炭水化物、各種有機酸およびアルコールが使用される。ヘキソースとしては、グルコース、フルクトース、マンノース、ソルボース、ガラクトース等が挙げられる。ペントースとしては、アラビノース、キシロース、リボース等が挙げられる。しかし、上述の炭水化物、および、産業的に使用される、糖蜜、トウモロコシ、サトウキビ、デンプン、その加水分解物等のような他の従来の炭素源は、依然として多少高価であり、生産されるＬ−アミノ酸の価格の低下が望まれている。

セルロース系バイオマスは、草木のような、種々の生物学的−商業的プロセスに由来する廃物を含んでおり、それが容易に入手可能であり、かつ炭水化物、トウモロコシ、サトウキビまたは他の炭素源よりも安価であることから、Ｌ−アミノ酸産生用の好適な原料である（http://www.ott.doe.gov/biofuels/glossary.html）。バイオマス中のセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの通常のレベルは、およそセルロース４０〜６０％、ヘミセルロース２０〜４０％、リグニン１０〜２５％、他の構成成分１０％である。セルロース画分は、ヘキソース糖であるグルコースのポリマーから構成される。ヘミセルロース画分は、キシロースおよびアラビノースを含むペントース糖から主として構成される。種々のバイオマス供給源の組成を表１に示す（http://www.ott.doe.gov/biofuels/understanding_biomass.html）。

１５０以上のバイオマスサンプルの組成に関するより詳細な情報が、「バイオマス原料組成および特性データベース（Biomass Feedstock Composition and Property Database）」に要約されている（http://www.ott.doe.gov/biofuels/progs/search1.cgi）。

使用可能な発酵原料（通常は炭水化物の混合物）へのセルロース系バイオマスの効果的
な変換のための工業プロセスは、ごく近い将来に開発されると予測される。したがって、有用な化合物の生産のためのセルロースおよびヘミセルロースのような再生可能なエネルギー源の利用は、極めて近い将来に増加すると予測される（Aristidou A., Pentila. M.,
Curr. Opin. Biotechnol, 2000, Apr., 11:2, 187-198）。しかし、大部分の公表論文および特許（または特許出願）は、代替燃料であると期待されるエタノールの産生のための生体触媒（細菌および酵母）によるセルロース系バイオマスの利用について記載している。かかるプロセスとしては、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）の種々の改変株（Deanda K. et al, Appl. Environ. Microbiol., 1996 Dec., 62:12, 4465-70; Mohagheghi A. et al, Appl. Biochem. Biotechnol., 2002, 98-100:885-98; Lawford H.G.,
Rousseau J.D., Appl. Biochem. Biotechnol, 2002, 98-100:429-48; ＰＣＴ出願WO95/28476号、同WO98/50524号）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）の改変株（Dien B.S. et al, Appl. Biochem. Biotechnol, 2000, 84-86:181-96; Nichols N.N. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001 Jul, 56:1-2, 120-5; 米国特許第5,000,000号）を用いたセルロール系バイオマスの発酵が含まれる。キシリトールは、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）を用いたヘミセルロース糖からのキシロースの発酵により生産することができる（Walthers T. et al, Appl. Biochem. Biotechnol., 2001, 91-93:423-35）。１，２−プロパンジオールは、アラビノース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、スクロース、キシロース、およびそれらの組合せの組換えエシェリヒア・コリ菌株を用いた発酵により生産することができる（米国特許第６，３０３，３５２号）。また、３−デヒドロシキミ酸は、エシェリヒア・コリ菌株を用いたグルコース／キシロース／アラビノース混合物の発酵により得ることができ、キシロースまたはグルコースのいずれかを単独で炭素源として使用した場合に対して、グルコース／キシロース／アラビノース混合物を炭素源として使用した場合に、３−デヒドロシキミ酸の最高濃度および収率が得られることが示された（Kai Li and J.W. Frost, Biotechnol. Prog., 1999, 15, 876-883）。エシェリヒア・コリは、Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロースのようなペントースを利用することができることが知られている。細胞へのＬ−アラビノースの輸送は、２つの誘導系、すなわちａｒａＥによりコードされる低親和性パーミアーゼ（Ｋ_m 約０．１ｍＭ）およびａｒａＦＧオペロンによりコードされる高親和性（Ｋ_m １〜３μＭ）系により行われる。ａｒａＦ遺伝子は、走化性受容体機能を有するペリプラズム結合タンパク質（３０６個のアミノ酸）をコードし、ａｒａＧ遺伝子座は、内膜タンパク質をコードする。糖は、ａｒａＢＡＤオペロンによりコードされる酵素セット、すなわちアルドースをＬ−リブロースへ可逆的に変換するイソメラーゼ（ａｒａＡ遺伝子によりコードされる）、ケトースをＬ−リブロース５−リン酸へリン酸化するキナーゼ（ａｒａＢ遺伝子によりコードされる）、およびＤ−キシロース５−リン酸の形成を触媒するＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ（ａｒａＤ遺伝子によりコードされる）により代謝される（Escherichia coli and Salmonella, Second Edition,
Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）。

エシェリヒア・コリのほとんどの株がＤ−キシロース上で生育するが、Ｋ−１２株がその化合物上で生育するには突然変異が必要である。このペントースの利用は、２つの誘導性パーミアーゼ（Ｄ−リボース上でもＤ−アラビノース上でも活性でない）による細胞質膜を横切った輸送、Ｄ−キシルロースへの異性化、およびＤ−キシルロース５−リン酸を生じるペンツロースのＡＴＰ依存性リン酸化に関与する誘導性かつ異化代謝産物抑制性経路によるものである。高親和性（Ｋ_m ０．３〜３μＭ）輸送系はペリプラズム結合タンパク質（３７，０００Ｄａ）に依存し、おそらく高エネルギー化合物により駆動される。低親和性（Ｋ_m 約１７０μＭ）系は、プロトン輸送力により作動される。このＤ−キシロース−プロトン共輸送系は、ｘｙｌＥ遺伝子によりコードされる。Ｄ−キシロースの利用を規定する主な遺伝子クラスターはｘｙｌＡＢ（ＲＴ）である。ｘｙｌＡ遺伝子はイソメラーゼ（５４，０００Ｄａ）をコードし、ｘｙｌＢ遺伝子はキナーゼ（５２，０００Ｄａ）をコードする。このオペロンは２つの転写開始点を有し、その一方はｘｙｌＢオープ
ンリーティングフレームの前に位置している。しかし、それはここでは必須ではない。低親和性パーミアーゼは未関連のｘｙｌＥにより規定されるため、ｘｙｌＴ遺伝子座はおそらく高親和性輸送系をコードし、したがって少なくとも２つの遺伝子（一方はペリプラズムタンパク質に関する遺伝子、もう一方は内在性膜タンパク質に関する遺伝子）を含有しているはずである（Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）。

トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼに加えて、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース５−リン酸４−エピメラーゼ、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする上記のエシェリヒア・コリ遺伝子の導入により、ザイモモナス・モビリスのような微生物が、アラビノースおよびキシロースをエタノールへと代謝させることが可能となる（WO/9528476号、WO98/50524号）。一方、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）およびピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＨ）をコードするザイモモナス属の遺伝子は、エシェリヒア・コリ菌株によるエタノール生産に有用である（Dien B.S. et al, Appl. Biochem. Biotechnol, 2000, 84-86:181-96; 米国特許第5,000,000号）。

しかし、現在のところ、グルコース、および、アラビノースおよびキシロースのようなペントースの混合物の発酵によりＬ−アミノ酸を生産する方法について記載している報告は存在しない。

発明の概要
本発明の目的は、糖の混合物を含有する培地中でＬ−アミノ酸産生微生物を培養することにより、グルコースのようなヘキソース糖およびキシロースまたはアラビノースのようなペントース糖の混合物からＬ−アミノ酸を生産する方法を提供することである。セルロース系バイオマスから得られる発酵原料は、培地のための炭素源として使用され得る。発酵原料上で生育することが可能であり、Ｌ−アミノ酸の生産に有効な微生物は、炭素源としてグルコースと共にキシロースおよびアラビノースから構成される発酵原料を用いたＬ−アミノ酸の産生に使用することができる。
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アミノ酸を生産する細菌を培地に培養し、生成および蓄積しＬ−アミノ酸を前記培地から回収することを含み、前記培地はグルコースおよびペントース糖の混合物を含有する、Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記ペントース糖はアラビノースおよびキシロースである、前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記糖の混合物は、セルロース系バイオマスから得られる糖の原料混合物である、前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記Ｌ−アミノ酸を生産する細菌がエシェリヒア属に属する細菌である、前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記Ｌ−アミノ酸を生産する細菌は、ペントース糖の利用の割合が増加するように改変された、前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記Ｌ−アミノ酸がＬ−イソロイシンである前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記細菌は、Ｌ−イソロイシン生合成に関する遺伝子の発現が高められた、前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記Ｌ−アミノ酸がＬ−ヒスチジンである前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記細菌は、Ｌ−ヒスチジン生合成に関する遺伝子の発現が高められた、前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記Ｌ−アミノ酸がＬ−スレニオンである前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記細菌は、Ｌ−スレニオン生合成に関する遺伝子の発現が高められた、前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、産生される前記Ｌ−アミノ酸はＬ−トリプトファンである、前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記細菌は、Ｌ−トリプトファン生合成に関する遺伝子の発現が高められた、前記方法を提供することである。

本発明者等は、既知のＬ−アミノ酸産生株がグルコースと一緒に効果的にペントース糖を利用することができ、グルコースの発酵により生産されるＬ−アミノ酸の量に匹敵する量でＬ−アミノ酸を生産することができることを見い出した。Ｌ−アミノ酸産生株の例としては、エシェリヒア属細菌が挙げられる。

言換えれば、本発明は、木材の主要部分および食用に不適な植物の部分を代表するセルロースおよびヘミセルロースのようなバイオマスの十分に利用されていない供給源からＬ−アミノ酸を生産するための単一な生物の組換え株の使用について記載する。
かくして、本発明は完成された。

Ｌ−アミノ酸を生産する方法は、グルコース、並びに、アラビノースおよびキシロースのようなペントース糖の混合物の発酵によるＬ−イソロイシンの生産を包含する。同様に、Ｌ−アミノ酸を生産する方法は、グルコース、並びに、アラビノース、および、キシロースのようなペントース糖の混合物の発酵によるＬ−ヒスチジンの生産を包含する。同様に、Ｌ−アミノ酸を生産する方法は、グルコース、並びに、アラビノース、および、キシロースのようなペントース糖の混合物の発酵によるＬ−スレニオンの生産を包含する。同様に、Ｌ−アミノ酸を生産する方法は、グルコース、並びに、アラビノースおよびキシロースのようなペントース糖の混合物の発酵によるＬ−トリプトファンの生産を包含する。このような、発酵原料として使用されるグルコースおよびペントース糖の混合物は、植物バイオマスの十分に利用されていない供給源から得ることができる。

本発明を、以下に詳細に説明する。
本発明においては、「Ｌ−アミノ酸を生産する細菌」とは、本発明の細菌う培地中で培養した場合、培地中にＬ−アミノ酸を蓄積する能力を有する細菌を意味する。Ｌ−アミノ酸生産能は、育種により付与され得るか、または増強され得る。本明細書中で使用される「Ｌ−アミノ酸を生産する細菌」という用語はまた、野生株たは親株よりも多量にＬ−アミノ酸を生成し、培地中に蓄積することが可能な細菌を意味し、好ましくは微生物が０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量の目的Ｌ−アミノ酸を培地中に生成および蓄積することが可能であることを意味する。Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレニオン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンおよびＬ−バリンが挙げられる。

「エシェリヒア属に属する細菌」という用語は、細菌が微生物学の当業者に既知の分類に従ってエシェリヒア属として分類されることを意味する。本発明で使用されるエシェリヒア属に属する微生物の例としては、エシェリヒア・コリ（E. coli）が挙げられる。
エシェリヒア属に属するＬ−アミノ酸を生産する細菌の例を以下に記載する。

Ｌ−イソロイシン産生細菌
Ｌ−イソロイシン生産能を有するエシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリＡＪ１２９１９株（日本国特許出願公開第８−４７３９７号）、エシェリヒア・コリＶＬ１８９２株およびＫＸ１４１株（ＶＫＰＭ Ｂ−４７８１）（ＵＳ５，６５８，７６６号）、エシェリヒア・コリＨ−９１４６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５０５５）およびＨ−９１５６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５０５６）（ＵＳ５，６９５，９７２号）、エシェリヒア・コリＨ−８６７０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４０５１）およびＨ−８６８３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４０５２）（ＵＳ５，４６０，９５８号）、エシェリヒア・コリＦＥＲＭ ＢＰ−３７５７株（ＵＳ５，４７４，９１８号）等が含まれる。ｉｌｖオペロンが増幅されたＶＫＰＭ Ｂ−３９９６株（ＴＤＶ５株）もまた、好適なＬ−イソロイシン産生細菌である（Hashiguchi K. et al, Biosci. Biotechnol. Biochem., 1999, 63(4), 672-9）。

Ｌ−ヒスチジン産生細菌
Ｌ−ヒスチジン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌としては、エシェリヒア・コリ２４株（ＶＫＰＭ Ｂ−５９４５、ＲＵ２００３６７７号）、エシェリヒア・コリ８０株（ＶＫＰＭ Ｂ−７２７０、ＲＵ２１１９５３６号）、エシェリヒア・コリＮＲＲＬ
Ｂ−１２１１６株〜Ｂ−１２１２１株（ＵＳ４３８８４０５号）、エシェリヒア・コリＨ−９３４２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６７５）およびＨ−９３４３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６７６）（ＵＳ６３４４３４７号）、エシェリヒア・コリＨ−９３４１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６７４）（ＥＰ１０８５０８７号）、エシェリヒア・コリＡＩ８０／ｐＦＭ２０１株（ＵＳ６２５８５５４号）等が含まれる。

Ｌ−スレニオン産生細菌
Ｌ−スレニオン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌としては、エシェリヒア・コリＴＤＨ６／ｐＶＩＣ４０株（ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６）（米国特許第５，１７５，１０７号、米国特許第５，７０５，３７１号）、エシェリヒア・コリＮＲＲＬ−２１５９３株（米国特許第５，９３９，３０７号）、エシェリヒア・コリＦＥＲＭ ＢＰ−３７５６株（米国特許第５，４７４，９１８号）、エシェリヒア・コリＦＥＲＭ ＢＰ−３５１９株およびＦＥＲＭ ＢＰ−３５２０株（米国特許第５，３７６，５３８号）、エシェリヒア・コリＭＧ４４２株（Gusyatiner et al., Genetika（ロシア） 14, 947-956 (1978)）、エシェリヒア・コリＶＬ６４３株およびＶＬ２０５５株（ＥＰ１１４９９１１Ａ号）等が含まれる。

Ｌ−トリプトファン産生細菌
Ｌ−トリプトファン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌としては、変異ｔｒｐＳ遺伝子によりコードされるトリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼを欠損したエシェリヒア・コリＪＰ４７３５／ｐＭＵ３０２８株（ＤＳＭ１０１２２）およびＪＰ６０１５／ｐＭＵ９１株（ＤＳＭ１０１２３）（米国特許第５，７５６，３４５号）、セリンによるフィードバック阻害が解除されたｓｅｒＡ対立遺伝子を有するエシェリヒア・コリＳＶ１６４（ｐＧＨ５）株（米国特許第６，１８０，３７３号）、酵素トリプトファナーゼを欠損したエシェリヒア・コリＡＧＸ１７（ｐＧＸ４４）株（ＮＲＲＬ Ｂ−１２２６３）およびＡＧＸ６（ｐＧＸ５０）ａｒｏＰ（ＮＲＲＬ Ｂ−１２２６４）（米国特許第４，３７１，６１４号）、ホスホエノールピルビン酸生産能が高められたエシェリヒア・コリＡＧＸ１７／ｐＧＸ５０株，ｐＡＣＫＧ４−ｐｐｓ株（ＷＯ９７／０８３３３号、米国特許第６，３１９，６９６号）等が含まれる。

上記Ｌ−アミノ酸生産株は、当業者によく知られた広汎な方法により、ペントース同化割合の増強のため、又はＬ−アミノ酸生合成能の増強のために、さらに改変されてもよい。

ペントース糖の利用割合は、アラビノースに対してはａｒａＦＧおよびａｒａＢＡＤ遺伝子、ならびにキシロースに対してはｘｙｌＥおよびｘｙｌＡＢ（ＲＴ）遺伝子）のようなペントース同化作用遺伝子の増幅により、あるいはｐｔｓＧ変異のような、グルコース同化系（ＰＴＳおよび非ＰＴＳ）における突然変異により高めることができる（Nichols N.N. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, Jul. 56:1-2, 120-5）。

Ｌ−アミノ酸を生産する細菌の生合成能は、Ｌ−アミノ酸生合成に関与する１つまたは複数の遺伝子発現の増強によりさらに向上し得る。そのような遺伝子としては、Ｌ−イソロイシン産生細菌については、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが例示され、同オペロンは好ましくは、Ｌ−イソロイシンによる阻害から実質的に解放されたスレニオンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含む（米国特許第５９９８１７８号）。同様に、前記遺伝子としては、Ｌ−ヒスチジン産生細菌については、ヒスチジンオペロンが挙げられ、同オペロンは好ましくは、Ｌ−ヒスチジンによるフィードバック阻害が脱感作されたＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｈｉｓＧ遺伝子を含む（ロシア国特許第２００３６７７号および同第２１１９５３６号）。同様に、前記遺伝子としては、Ｌ−スレニオン産生細菌については、スレニオンオペロンが挙げられ、同オペロンは好ましくは、Ｌ−スレニオンによるフィードバック阻害が脱感作されたアスパラギン酸キナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む（日本国特許広報第１−２９５５９号）。また、前記遺伝子としては、Ｌ−トリプトファン細菌については、ｔｒｐＥＤＣＢＡオペロンが挙げられ、同オペロンは好ましくは、Ｌ−トリプトファンによるフィードバック阻害から解放されたアントラニル酸シンターゼをコードするｔｒｐＥ遺伝子、セリンによるフィードバック阻害から解放されたｓｅｒＡ遺伝子、芳香族酸の共通経路にホスホエノールピルビン酸を供給するｐｐｓ遺伝子を含む。同様に、細菌のＬ−トリプトファンを生産する能力は、細菌にＬ−トリプトファンを利用する酵素を欠損させることによりさらに改善されていてもよく、同細菌は好ましくは、変異ｔｒｐＳ遺伝子によりコードされる欠損型トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼ、または変異ａｒｏＰ遺伝子によりコードされる欠損型トリプトファナーゼを含む。

本発明の方法は、Ｌ−アミノ酸を生産する細菌を培地中で培養して、同培地中にＬ−アミノ酸を生成および蓄積させる工程、および前記培地からＬ−アミノ酸を回収する工程を含む、Ｌ−アミノ酸を生産する方法を包含し、ここで前記培地は、グルコースおよびペントース糖の混合物を含有する。同様に、本発明の方法は、Ｌ−イソロイシン産生細菌を培地中で培養して、同培地中にＬ−イソロイシンを生成および蓄積させる工程、および前記培地からＬ−イソロイシンを回収する工程を含む、Ｌ−イソロイシンを生産する方法を包含し、ここで前記培地は、グルコースおよびペントース糖の混合物を含有する。同様に、本発明の方法は、本発明のＬ−ヒスチジン産生細菌を培地中で培養して、同培地中にＬ−ヒスチジンを生成および蓄積させる工程、および前記培地からＬ−ヒスチジンを回収する工程を含む、Ｌ−ヒスチジンを生産する方法を包含し、ここで前記培地は、グルコースおよびペントース糖の混合物を含有する。同様に、本発明の方法は、本発明のＬ−スレニオン産生細菌を培地中で培養して、同培地中にＬ−スレニオンを生成および蓄積させる工程、および前記培地からＬ−スレニオンを回収する工程を含む、Ｌ−スレニオンを生産する方法を包含し、ここで前記培地は、グルコースおよびペントース糖の混合物を含有する。同様に、本発明の方法は、本発明のＬ−トリプトファン産生細菌を培地中で培養して、同培地中にＬ−トリプトファンを生成および蓄積させる工程、および前記培地からＬ−トリプトファンを回収する工程を含む、Ｌ−トリプトファンを生産する方法を包含し、ここで前記培地は、グルコースおよびペントース糖の混合物を含有する。

キシロースおよびアラビノースのようなペントース糖、及びグルコースのようなヘキソース糖との混合物は、バイオマスの十分に利用されていない供給源から得ることができる
。グルコース、キシロース、アラビノースおよび他の炭水化物は、蒸気および／または濃酸加水分解、希酸加水分解、セルラーゼのような酵素を用い加水分解、又はアルカリ処理により、植物バイオマスから遊離され得る。基質がセルロース系材料である場合、セルロースは同時にまたは個々に糖に加水分解されて、またＬ−アミノ酸に発酵され得る。ヘミセルロースは一般にセルロースよりも糖へ加水分解され易いため、セルロース系材料を予め加水分解してペントースを分離し、続いて蒸気、酸、アルカリ、セルラーゼまたはそれらの組合せによる処理によりセルロースを加水分解して、グルコースを生成させることが好ましい。

植物加水分解産物から潜在的に得ることができるグルコースおよびペントースの原料混合物の組成に近づけるために、種々の比のグルコース／キシロース／アラビノースから構成される混合物がこの研究に使用される。混合物中の各ペントースの比は、総炭水化物含有量の１２％から５０％までと多様であった（実施例の項を参照）。
本発明では、培養、Ｌ−アミノ酸の培地からの回収および精製等は、微生物を用いてアミノ酸を生産する従来の発酵プロセスに類似した様式で実施され得る。培養に使用される培地は、培地が炭素源および窒素源ならびに無機塩類、および必要である場合には微生物の生育に要する適切な量の栄養分を含む限りは、合成培地または天然の培地のいずれであってもよい。

炭素源としては、Ｌ−アミノ酸を生産する細菌が炭素源として利用し得る、グルコース、スクロース、アラビノース、キシロースならびの他のペントース糖およびヘキソース糖のような種々の炭水化物が挙げられる。グルコース、キシロース、アラビノースおよび他の炭水化物は、セルロース系バイオマスから得られる糖の原料混合物の一部であってもよい。本発明においては、グルコースとペントース糖の割合は、好ましくは１０：０．５〜５０、より好ましくは１０：１〜２５、特に好ましくは１０：２〜１０である。

本発明による発酵に適したペントース糖としては、キシロースおよびアラビノースが挙げられるが、これらに限定されない。ペントース糖としてキシロース及びアラビノースを用いる場合、キシロースとアラビノースの割合は、好ましくは１：０．５〜１０、より好ましくは１：１〜５、特に好ましくは１：２〜３である。

窒素源としては、アンモニアおよび硫酸アンモニウムのような種々のアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトン、ダイズ加水分解産物および消化発酵微生物のような天然窒素源が使用され得る。無機塩類としては、一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等が使用され得る。必要に応じて、幾つかのさらなる栄養分を培地に添加することができる。例えば、微生物が生育にスレニオンを要する場合（スレニオン栄養要求性）、十分量のスレニオンを培養用培地に添加することができる。

培養は、好ましくは振とう培養および通気しながらの攪拌培養のような好気性条件下で、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３８℃の温度で実施される。培地のｐＨは通常、５〜９、好ましくは６．５〜７．２である。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基および緩衝液により調整することができる。通常、１〜５日の培養によって液体培地中に目的Ｌ−アミノ酸が蓄積する。

培養後、細胞のような固形物は、遠心分離または膜濾過により液体培地から除去することができ、続いて目的Ｌ−アミノ酸をイオン交換、濃縮および結晶化法により回収ならびに精製することができる。

以下の限定されない実施例を参照して、本発明を以下により具体的に説明する。

実施例１：グルコースおよびペントースの混合物の発酵におけるＬ−イソロイシン産生細菌によるＬ−イソロイシンの生産
Ｌ−イソロイシン産生エシェリヒア・コリＴＤＶ５株を、グルコースおよびペントースの混合物の発酵によるＬ−イソロイシンの生産用の菌株として使用した。ＴＤＶ５株は、エシェリヒア・コリＴＤＨ６／ｐＶＩＣ４０株（ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６）の誘導体であり、同株ではさらにｉｌｖオペロンが増幅されている（プラスミドｐＭＷＤ５）（Hashiguchi K. et al, Biosci. Biotechnol. Biochem., 1999, 63(4), 672-9）。
種培養物を得るために、前記菌株をＬＢブロス中で３７℃で７時間培養して、１／２０（ｖ／ｖ）の割合で発酵培地に添加した。種培養物２ｍｌを、種々の糖およびそれらの混合物を含有する発酵培地の入った２０×２００ｍｍの試験管に移し、ロータリーシェーカーを用いて３７℃で７２時間培養した。培養後、培地中に蓄積されたＬ−イソロイシン量をＴＬＣにより決定した。蛍光指示薬なしの０．１１ｍｍのＳｏｒｂｆｉｌシリカゲル層をコーティングした１０×１５ｃｍのＴＬＣプレート（Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russia）を使用した。移動相：プロパン−２−オール：酢酸エチル：２５％アンモニア水：水＝８０：８０：２５：５０（ｖ／ｖ）を用いて、Ｓｏｒｂｆｉｌプレートを展開した。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を可視化試薬として使用した。結果（少なくとも３回の別個の実験データ）を表２に示す。

発酵培地の組成（ｇ／ｌ）：
炭水化物 ４０．０
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １８．０
Ｋ₂ＨＰＯ₄ ２．０
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂ Ｏ １．０
チアミンＨＣｌ ０．０２
ＣａＣＯ₃ ２５．０
グルコースおよび硫酸マグネシウムは別々に滅菌される。ＣａＣＯ₃は１８０℃で２時間乾熱滅菌される。ｐＨは７．０に調整される。

Ｌ−イソロイシン産生エシェリヒア・コリＴＤＶ５株は、グルコースと混合されたペントース糖を効果的に利用することができ、グルコースを単独で用いた発酵により生産されるＬ−イソロイシンの量に匹敵する量でＬ−イソロイシンを生産することができることが表２からわかる。

実施例２：グルコースおよびペントースの混合物の発酵におけるＬ−ヒスチジン産生細菌
によるＬ−ヒスチジンの生産
Ｌ−ヒスチジン産生エシェリヒア・コリ８０株を、グルコースおよびペントースの混合物の発酵によるＬ−ヒスチジンの生産用の菌株として使用した。エシェリヒア・コリ８０株（ＶＫＰＭ Ｂ−７２７０）は、ロシア国特許ＲＵ２１１９５３６号に記載されている。

種培養物を得るために、３％グルコースを含有するＬブロス２ｍｌを含む４０ｍｌの試験管（直径φ１８ｍｍ）中で２７℃で６時間、ロータリーシェーカー（２５０ｒｐｍ）上で前記菌株を生育させた。続いて、発酵培地に種培養物２ｍｌ（５％）を接種した。発酵は、発酵培地２ｍｌを含む４０ｍｌの試験管中で２７℃で６５時間、ロータリーシェーカー（２５０ｒｐｍ）上で実施した。

培養後、培地中に蓄積されたＬ−ヒスチジン量を、ペーパークロマトグラフィにより決定した。移動相の組成は、ブタノール：酢酸エチル：水＝４：１：１（ｖ／ｖ）である。ニンヒドリンのアセトン溶液（０．５％）を可視化試薬として使用した。結果を表３に示す。

発酵培地の組成（ｇ／ｌ）：
炭水化物 １００．０
豆濃 ＴＮとして０．２
（ダイズ蛋白加水分解物）
Ｌ−スレニオン ０．８
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２５．０
Ｋ₂ＨＰＯ₄ ２．０
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １．０
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０．０１
チアミンＨＣｌ ０．００１
ベタイン ２．０
ＣａＣＯ₃ ６．０
グルコース、Ｌ−スレニオンおよび硫酸マグネシウムは別々に滅菌される。ＣａＣＯ₃は１１０℃で３０分乾熱滅菌される。ｐＨは、滅菌前にＫＯＨによって６．０に調整される。

Ｌ−ヒスチジン産生エシェリヒア・コリ８０株は、グルコースと混合されたペントース
糖を効果的に利用することができ、グルコースを単独で用いた発酵により生産されるＬ−ヒスチジンの量に匹敵する量でＬ−ヒスチジンを生産することができることが表３からわかる。

実施例３：グルコースおよびペントースの混合物の発酵におけるＬ−スレニオン産生細菌によるＬ−スレニオンの生産
Ｌ−スレニオン産生エシェリヒア・コリＴＤＨ６／ｐＶＩＣ４０株（ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６）を、グルコースおよびペントースの混合物の発酵によるＬ−スレニオンの生産用の株として使用した。エシェリヒア・コリＴＤＨ６／ｐＶＩＣ４０株は、米国特許第５，１７５，１０７号に詳述されている。

種培養物を得るために、４％グルコースを含有するＬブロス２ｍｌを含む４０ｍｌの試験管（φ１８ｍｍ）中で３２℃で１８時間、ロータリーシェーカー（２５０ｒｐｍ）上で前記菌株を生育させた。続いて、発酵培地に種培養物２ｍｌ（５％）を接種した。発酵は、発酵培地２ｍｌを含む４０ｍｌの試験管中で３２℃で２４時間、ロータリーシェーカー（２５０ｒｐｍ）上で実行した。
培養後、培地中に蓄積されたＬ−スレニオン量をＴＬＣにより決定した。移動相：プロパン−２−オール：アセトン：水：２５％アンモニア水＝２５：２５：７：６（ｖ／ｖ）を用いてＳｏｒｂｆｉｌプレート（Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russia）を展開した。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を可視化試薬として使用した。結果（少なくとも３回の別個の実験データ）を表４に示す。

発酵培地の組成（ｇ／ｌ）：
炭水化物 ４０．０
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １０．０
Ｋ₂ＨＰＯ₄ １．０
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．４
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０２
ＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０．０２
チアミンＨＣｌ ０．０００２
酵母エキス １．０
ＣａＣＯ₃ ２０．０
グルコースおよび硫酸マグネシウムは別々に滅菌される。ＣａＣＯ₃は１８０℃で２時間乾熱滅菌される。ｐＨは７．０に調整される。抗生物質は、滅菌後培地に導入される。

Ｌ−スレニオン産生エシェリヒア・コリＴＤＨ６／ｐＶＩＣ４０株は、グルコースと混
合されたペントース糖を効果的に利用することができ、グルコース単独を用いた発酵により生産されるＬ−スレニオンの量に匹敵する量で生産することができることが表４からわかる。
実施例４：グルコースおよびペントースの混合物の発酵におけるＬ−トリプトファン産生細菌によるＬ−トリプトファンの生産
トリプトファン産生エシェリヒア・コリＳＶ１６４（ｐＧＨ５）株を、グルコースおよびペントースの混合物の発酵によるトリプトファンの生産用の株として使用した。エシェリヒア・コリＳＶ１６４（ｐＧＨ５）株は、米国特許第６，１８０，３７３号またはヨーロッパ特許第０６６２１４３号に詳述されている。

種培養物を得るために、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（ｐＧＨ５プラスミドのマーカー）を添加した４％グルコースを含有するＬブロス３ｍｌを含む４０ｍｌの試験管（φ１８ｍｍ）中で３７℃で１８時間、ロータリーシェーカー（２５０ｒｐｍ）上で前記菌株を生育させた。続いて、２０×２００ｍｍの試験管中にテトラサイクリン（２０μｇ／ｍｌ）を含有する発酵培地３ｍｌに、得られた種培養物０．３ｍｌを接種し、２５０ｒｐｍでロータリーシェーカーを用いて３７℃で４８時間培養した。

発酵培地の組成を表５に示す。

培養後、培地中に蓄積されたトリプトファン量をＴＬＣにより決定した。蛍光指示薬なしの０．１１ｍｍのＳｏｒｂｆｉｌシリカゲル層をコーティングした１０×１５ｃｍのＴＬＣプレート（Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russia）を使用した。移動相：プロパン−２−オール：酢酸エチル：２５％アンモニア水：水＝４０：４０：７：１６（
ｖ／ｖ）を用いてＳｏｒｂｆｉｌプレートを展開した。ニンヒドリンのアセトン溶液（２％）を可視化試薬として使用した。得られたデータ（少なくとも３回の別個の実験データ）を表６に示す。

Ｌ−トリプトファン産生エシェリヒア・コリＳＶ１６４（ｐＧＨ５）株は、グルコースと混合されたペントース糖を効果的に利用することができ、グルコースを単独で用いた発酵により生産されるＬ−トリプトファンの量に匹敵する量で生産することができることが表６からわかる。
本発明をその好適な実施形態を参照して記載したが、本発明の範囲を逸脱しない範囲で種々の改変を行うことができ、均等なものが適用されることは、当業者には明らかであろう。外国の優先権書類すなわちロシア特許出願２００３１０５２６９を含む上述の文献は、援用してそのままここに取り込まれる。

Claims (13)

1. Ｌ−アミノ酸を生産する細菌を培地に培養し、生成および蓄積しＬ−アミノ酸を前記培地から回収することを含み、前記培地はグルコースおよびペントース糖の混合物を含有する、Ｌ−アミノ酸の製造方法。
2. 前記ペントース糖はアラビノースおよびキシロースである、請求項１に記載の方法。
3. 前記糖の混合物は、セルロース系バイオマスから得られる糖の原料混合物である、請求項２に記載の方法。
4. 前記Ｌ−アミノ酸を生産する細菌がエシェリヒア属に属する細菌である、請求項１に記載の方法。
5. 前記Ｌ−アミノ酸を生産する細菌は、ペントース糖の利用の割合が増加するように改変された、請求項４に記載の方法。
6. 前記Ｌ−アミノ酸がＬ−イソロイシンである請求項１に記載の方法。
7. 前記細菌は、Ｌ−イソロイシン生合成に関する遺伝子の発現が高められた、請求項６に記載の方法。
8. 前記Ｌ−アミノ酸がＬ−ヒスチジンである請求項１に記載の方法。
9. 前記細菌は、Ｌ−ヒスチジン生合成に関する遺伝子の発現が高められた、請求項８に記載の方法。
10. 前記Ｌ−アミノ酸がＬ−スレニオンである請求項１に記載の方法。
11. 前記細菌は、Ｌ−スレニオン生合成に関する遺伝子の発現が高められた、請求項１０に記載の方法。
12. 産生される前記Ｌ−アミノ酸はＬ−トリプトファンである、請求項１に記載の方法。
13. 前記細菌は、Ｌ−トリプトファン生合成に関する遺伝子の発現が高められた、請求項１２に記載の方法。