CN101128479B - 可在肠杆菌科中自主复制的新质粒 - Google Patents

Abstract

本发明描述基因，所述基因从选自泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌的微生物分离，并且编码Rep蛋白或其同源物。本发明还描述含有该基因的质粒，其在肠杆菌科细菌中可自主复制。本发明还描述含有该质粒的肠杆菌科微生物。

Description

可在肠杆菌科中自主复制的新质粒

技术领域

本发明涉及新质粒，其可在来自肠杆菌科(family Enterobacteriaceae)的微生物中自主复制，本发明还涉及使用该质粒和含有该质粒的微生物的方法。

背景技术

目前，正在进行通过DNA重组技术对来自肠杆菌科的微生物，包括大肠杆菌的培育和改进。为了通过DNA重组技术培育和改进微生物，常常使用源自不同属微生物的质粒和广谱宿主载体(broad host spectrum vector)。然而，一般使用来自具有相似特性的微生物的质粒。

源自肠杆菌科的微生物的质粒包括小质粒例如pBR322、均源自大肠杆菌的RSF1010(Gene，vol.75，(2)pp.271-288，1989)和pUC(Gene，Oct.1982，19(3)：259-68)、源自沙门氏菌属(Salmonella)细菌的pHCM2(Plasmid，May 2002，47(3)：159-71)、均源自耶尔森氏菌属(Yersinia)细菌的pCD1(Infect.Immun.，Mar.1986，51(3)：788-94)和pMT1(J.Bacteriol.，Jul.2000，182(14)：3924-8)等。尽管已知pS来自泛菌属(Pantoea)细菌(WO98/59054)，然而当转入微生物中时，能够在酸性条件下改进微生物生长的质粒是未知的。

发明内容

本发明的目的是提供新质粒，其用于培育和改进属于肠杆菌科的微生物。

本发明的发明人发现Pantoea ananatis AJ13601(FERM BP-7207)含有新质粒，并且成功地鉴定了这种质粒。因此，他们完成了本发明。

本发明的一个目的是提供源自微生物的基因，所述微生物选自下组：泛菌属细菌、欧文氏菌属(Erwinia)细菌和肠杆菌属(Enterobacter)细菌，并且其中所述基因编码具有氨基酸序列的Rep蛋白，所述氨基酸序列选自下组：SEQID NO：2和与SEQ ID NO：2至少80％同源的氨基酸序列。

本发明的另一个目的是提供质粒，其包含如上定义的基因，并且其中所述质粒在肠杆菌科细菌中可自主复制。

本发明的另一个目的是提供如上所述的质粒，其中所述质粒还包含标记基因。

本发明的另一个目的是提供如上所述的质粒，其中该质粒来自选自下组的泛菌属细菌：Pantoea ananatis FERM BP-7207、BP-6614和BP-6615，并且该质粒为大约320kbs。

本发明的另一个目的是提供如上所述的质粒，其中该质粒是pEA320，并且具有选自图1、2、3、4和5中所示的限制酶图谱。

本发明的另一个目的是提供肠杆菌科微生物，已将其用包含基因的质粒转化，该基因分离自选自下组的微生物：泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌，并且其中所述基因编码具有氨基酸序列的Rep蛋白，所述氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO：2和与SEQ ID NO：2至少80％同源的氨基酸序列。

本发明的另一个目的是提供如上所述的微生物，其中所述质粒来自选自下组的泛菌属细菌：Pantoea ananatis FERM BP-7207、BP-6614和BP-6615，并且该质粒为大约320kbs。

本发明的另一个目的是提供如上所述的微生物，其中该质粒是pEA320，并且具有选自图1、2、3、4和5中所示的限制酶图谱。

本发明的另一个目的是提供如上所述的微生物，其中所述质粒还包含标记基因，并且该质粒在肠杆菌科微生物中可自主复制。

本发明的另一个目的是提供如上所述的微生物，其中所述肠杆菌科微生物选自下组：埃希氏菌属细菌、泛菌属细菌、肠杆菌属细菌、欧文氏菌属细菌、克雷伯氏菌属(Klebsiella)细菌、沙雷氏菌属(Serratia)细菌、沙门氏菌属细菌和摩根氏菌属(Morganella)细菌。

本发明的另一个目的是提供如上所述的微生物，其能够产生有用的物质。

本发明的另一个目的是提供用于产生有用的物质的方法，其包括在培养基中培养如上所述的微生物，并且从该培养基或微生物中收集所述有用的物质。

本发明的另一个目的是提供如上所述方法，其中有用的物质是L-氨基酸。

本发明的另一个目的是提供用于产生具有改进的耐酸性的微生物的方法，其包括用如上所述的质粒转化肠杆菌科微生物。

本发明的另一个目的是提供如上所述方法，其中具有改进的耐酸性的微生物与不含有该质粒的菌株相比，在pH 3-5显示改善的生长。

附图简述

图1显示质粒pEA320的NotI限制酶图谱。

图2显示质粒pEA320的Sse8387I限制酶图谱。

图3显示质粒pEA320的SwaI限制酶图谱。

图4显示质粒pEA320的PmeI限制酶图谱。

图5显示质粒pEA320的AscI限制酶图谱。

图6显示用质粒pEA320转化的大肠杆菌在中性和酸性条件下生长的图。

图7显示用质粒pEA320转化的大肠杆菌在酸性条件下生长的图。

实施本发明的最佳方式

以下，将详细说明本发明。

<1>本发明的基因和质粒

本发明的基因是源自或分离自泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌或肠杆菌属细菌的基因。这种基因(rep基因)编码Rep蛋白，该蛋白具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：2至少80％同源的氨基酸序列。本发明的质粒含有本发明的基因。

通过分析pEA320质粒鉴定本发明的基因。pEA320为大约320kbs并且源自或分离自选自下组的细菌：Pantoea ananatis AJ13601(FERM BP-7207)、Pantoea ananatis AJ 13355(FERM BP-6614)、Pantoea ananatis AJ 13356(FERM BP-6615)，如后面所述。泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌是归类于γ-proteobacteria的微生物，并且它们在分类学上彼此非常相似(J.Gen.Appl.Microbiol.，Dec.1997，43(6)，355-361；International Journal ofSystematic Bacteriology，1993，pp.162-173；和International Journal ofSystematic Bacteriology，Oct.1997，pp.1061-1067)。近年来，基于16S rRNA的核苷酸序列分析等，将一些来自肠杆菌属的微生物重新归类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)等，并且将某些来自欧文氏菌属的微生物重新归类于菠萝泛菌(Pantoea ananas)或斯氏泛菌(参见International Journal of Systematic Bacteriology，Oct.1997，pp.1061-1067)。

此外，它们通常显示以下生理学特性(美国专利编号6,331,419和6,197,559)：

(1)革兰氏染色：阴性

(2)对氧气特性：兼性厌氧菌

(3)氧化酶：阳性

(4)福格斯-普里斯考尔反应(voges-proskauer reaction)：阳性

(5)甲基红试验：阴性

(6)脲酶：阴性

(7)吲哚产生：阳性

(8)TSI培养基中的硫化氢产生：微弱活性

(9)β-半乳糖苷酶：阳性

(10)糖可同化性：

阿拉伯糖：阳性

蔗糖：阳性

乳糖：阳性

木糖：阳性

山梨糖醇：阳性

肌醇：阳性

海藻糖：阳性

麦芽糖：阳性

蜜二糖(Melibiose)：阳性

侧金盏糖醇(Adonitol)：阴性

棉子糖(Raffinose)：阳性

水杨苷(Salicin)：阴性

蜜二糖：阳性

(11)柠檬酸可同化性：阳性

(12)精氨酸脱水酶：阴性

(13)鸟氨酸脱羧酶：阴性

(14)生长pH：在pH 4.5-7良好生长

因此，本发明的基因能够从天然存在于泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌中的巨大质粒(giant plasmid)获得，所述巨大质粒特别是从这些细菌的野生型菌株获得的巨大质粒。含有这种巨大质粒的泛菌属细菌的典型菌株包括Pantoea ananatis、斯氏泛菌和成团泛菌。此外，这些欧文氏菌属细菌的典型菌株包括菠萝欧文氏菌(Erwinia ananas)和草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)。此外，这些肠杆菌属细菌的典型菌株包括成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。

另外，基于16S rRNA的核苷酸序列分析等，最近将成团肠杆菌的一些菌株重新分类为成团泛菌、Pantoea ananatis、斯氏泛菌等。在本发明中，所述基因和质粒可源自或分离自肠杆菌属、泛菌属和欧文氏菌属之一，只要该微生物归类为肠杆菌科。当通过遗传工程技术培育Pantoea ananatis菌株时，能够使用Pantoea ananatis AJ13355菌株(FERM BP-6614)、AJ13356菌株(FERM BP-6615)、AJ13601菌株(FERM BP-7207)和它们的衍生物。当将它们分离并且作为成团肠杆菌保藏时，将这些菌株鉴定为成团肠杆菌。然而，基于16S rRNA的核苷酸测序等，最近将它们重新归类为Pantoea ananatis。

具体来说，本发明的基因能够从Pantoea ananatis AJ13601(FERMBP-7207)菌株获得(EP1078989A)。将Pantoea ananatis AJ13601菌株于1999年8月18日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science andTechnology，Ministry of Economy，Trade and Industry)(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(the International Patent OrganismDepositary，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，地址：Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)并且给予保藏号FERM P-17516。根据布达佩斯条约的规定将该保藏于2000年7月6日转为国际保藏并且给予保藏号FERM BP-7207。

此外，本发明的基因还能够从菠萝欧文氏菌和草生欧文氏菌获得。菠萝欧文氏菌的实例包括菠萝欧文氏菌ATCC 33244和草生欧文氏菌IAM1595。ATCC 33244菌株能够使用指定登记号从美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)获得(地址：P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，UnitedStates ofAmerica)(参见www.atcc.org/)。每个菌株的登记号列于美国典型培养物保藏中心的目录中。IAM1595储存在IAM Culture Collection，Laboratory ofBioresources，Institute of Molecular and Cellular Biosciences，The University ofTokyo，并且能够通过登记号订购该菌株。每个菌株的登记号列于IAM目录(IAM Catalogue of Strain，Third Edition，2004)中。

此外，本发明的基因还能够从成团肠杆菌和产气肠杆菌获得。成团肠杆菌的实例是ATCC 12287，产气肠杆菌的实例是ATCC 13048。

发现前述Pantoea ananatis含有大约320kbs的质粒，将其鉴定并且命名为pEA320。这种质粒作为双链环状DNA存在于Pantoea ananatis的细胞中。pEA320中所含rep基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，并且该氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

当用典型限制酶消化时，从pEA320获得的片段的数目和大小示于表1。此外，pEA320的限制酶图谱示于图1-5。编码rep蛋白的基因位于pEA320酶图谱上的110606-109728。

表1

将由本发明的基因编码的Rep蛋白定义为具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或其同源物(homologue)。将这种Rep蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)和已知的肠杆菌科细菌的质粒的Rep蛋白的氨基酸序列进行比较以确定同源性。由此，通过比较所编码的Rep蛋白的同源性，能够将本发明的基因区别于已知的肠杆菌科细菌的基因。本发明的基因包括编码Rep蛋白的同源物，其与SEQ ID NO：2的整个氨基酸序列具有80％或更高，优选90％或更高，更优选95％或更高，最优选97％或更高的同源性，并且其中所述蛋白质或同源物参与到质粒的复制中。如本文中计算的同源性是使用基因分析软件Genetyx(其能够从Genetyx，Inc.购买)分析和计算的，并且显示精确匹配的氨基酸残基的比率。能够通过使用，例如Karlin和Altschul(P ro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993))的算法BLAST或FASTA(Methods Enzymol.，183，63(1990))测定氨基酸序列和核苷酸序列的同源性(同一性)。已基于此算法BLAST开发了称为BLASTN和BLASTX的程序(参考www.ncbi.nlm.nih.gov)。

此外，取决于泛菌属、欧文氏菌属和肠杆菌属细菌的菌种或菌株，rep基因的核苷酸序列中可能存在差别。因此，Rep蛋白可具有氨基酸序列，其包含取代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸残基，只要该Rep蛋白功能不因这种变化而改变。取代、缺失、插入或添加的氨基酸可为，例如，1-20个，优选1-10个，更优选1-5个。氨基酸残基的上述取代、缺失、插入或添加是保守的，并且将不影响质粒的正常复制。典型的保守氨基酸改变是保守取代。被认为是保守的取代包括用Ser或Thr取代Ala，用Gln、His或Lys取代Arg，用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，用Asn、Glu或Gln取代Asp，用Ser或Ala取代Cys，用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，用Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，用Pro取代Gly，用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，用Leu、Met、Val或Phe取代Ile，用Ile、Met、Val或Phe取代Leu，用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，用Ile、Leu、Val或Phe取代Met，用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr，和用Met、Ile或Leu取代Val。

此外，编码Rep蛋白的基因还可以是在严紧条件下能够与SEQ ID NO：1的核苷酸序列或能够从这种核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，只要其编码的蛋白保持复制质粒的功能。“严紧条件”包括那些在该条件下，形成所谓的特异性杂合体，而不形成非特异性杂合体的条件。严紧条件的实例包括，例如，那些在该条件下，例如，具有不少于80％同源性的DNA相互杂交，而显示低于80％同源性的DNA不相互杂交。具体实例包括在1xSSC、0.1％SDS和60℃，优选0.1xSSC、0.1％SDS和60℃，更优选0.1xSSC、0.1％SDS和68℃的盐浓度和温度下洗涤一次，优选两次或三次，其为典型的Southern杂交洗涤条件。尽管取决于杂交条件合适地选择探针的长度，但其通常为100bps-1kbps。

本发明的质粒天然存在于泛菌属、欧文氏菌属和肠杆菌属细菌中，能够在肠杆菌科微生物，例如泛菌属和埃希氏菌属细菌中自主复制。因此，如果将目标基因插入该质粒或其保持自主复制能力的修饰形式的任何位置，并且用这种重组质粒转化宿主微生物，那么在该宿主微生物中表达目标基因是可能的。

用本发明的质粒转化的肠杆菌科微生物的实例包括埃希氏菌属、泛菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、沙门氏菌属或摩根氏菌属细菌。具体而言，能够使用根据NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)数据库中描述的分类法的肠杆菌科细菌。

具体而言，能够使用Neidhardt等(Neidhardt，F.C.et al.，Escherichia coli andSalmonella Typhimurium，American Society for Microbiology，Washington D.C.，1029，表1)提到的埃希氏菌属细菌。在这些之中，例如能够使用大肠杆菌。大肠杆菌的实例具体包括大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等，和源自原型(prototype)野生型菌株K12菌株的那些菌株。

肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌、产气肠杆菌等。具体而言，能够使用在欧洲专利Publication No.952221A中例示的菌株。如上所述，基于16SrRNA的核苷酸序列分析等，将成团肠杆菌的一些菌株最近重新归类为成团泛菌、Pantoea ananatis、斯氏泛菌等。

泛菌属细菌的典型菌株包括Pantoea ananatis、斯氏泛菌、成团泛菌和柠檬泛菌(Pantoea citrea)。具体地，能够使用在欧洲专利Publication No.955368A中例示的菌株。

欧文氏菌属细菌的典型菌株包括菠萝欧文氏菌和草生欧文氏菌，而克雷伯氏菌属细菌的典型菌株包括植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。具体而言，能够使用欧洲专利Publication No.955368A中例示的菌株。

沙雷氏菌属细菌的典型菌株包括液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)，沙门氏菌属细菌的典型菌株包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，而摩根氏菌属的典型菌株包括摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)。具体而言，作为属于沙雷氏菌属的细菌，能够使用在欧洲专利Publication No.952221A中例示的菌株。

本发明的质粒包括天然存在于泛菌属、欧文氏菌属和肠杆菌属细菌中的巨大质粒的部分，和该巨大质粒本身，或其部分，以及另外的DNA序列，只要在该质粒中包含本发明的基因。如果仅使用巨大质粒的部分，那么必须包括对于质粒自主复制关键的区域。即使将除了对质粒自主复制关键的区域(复制控制区域)之外，例如，除了含有复制起点和对复制必需的区域之外的部分或全部区域去除，而且该质粒由于这种去除而变得较小，该质粒也能够在宿主微生物中自主复制。所以，优选将它用作载体。此外，如果将标记基因例如药物抗性基因并入(incorporate)本发明的质粒，其变得易于通过利用在转化体中的标记基因的表型来检测转化体。能够在宿主中使用的这种标记基因的实例包括氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、四环素抗性基因、红霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、壮观霉素(spectinomycin)抗性基因等。

对于抗生素抗性基因，可仅将对于上述巨大质粒复制必需的区域分离并且连接于抗生素抗性基因，或可将该抗生素抗性基因转移入不参与复制的巨大质粒的部分。作为将抗生素抗性基因引入这种质粒的方法，可使用Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.，“Molecular Cloning A LaboratoryManual，Second Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中描述的方法等。这些方法是本领域技术人员熟知的。例如，可使用Datsenko和Wanner开发的使用单链DNA的方法，其被称为“Red-驱动整合”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，pp.6640-6645)，以及将抗生素抗性基因引入转座子并且转移该转座子的方法，如日本专利申请公开(Kokai)No.2-109985中所述。

尽管将巨大质粒的实例pEA320通过图1-5所示的限制酶图谱表征，但本发明的质粒不必具有这些限制酶图谱，可将任何限制酶位点缺失，只要不影响自主复制能力。此外，可将不存在于pEA320的限制酶位点引入本发明的质粒。

能够以与常规已知制备克隆载体、表达载体等相同的方式制备如上所述的这种质粒。为了制备修饰的质粒，优选已测定该巨大质粒的核苷酸序列。可通过已知的方法例如双脱氧法(dideoxy method)测定核苷酸序列。

为了将目标基因插入本发明的质粒中，将其插入到该质粒或其衍生物的限制酶位点是方便的。选择的限制酶位点对于该质粒应该是唯一的，并且应通过相应的限制酶切割。为了插入目标基因，可用这些限制酶部分或全部地消化作为目标基因来源的质粒和基因组DNA等而留下相应的粘端，其与例如相同的限制酶是相容的，并且能够将它们在合适的条件下连接。或者可将它们平端连接。

可使用DNA的消化和连接、转化等，和本领域技术人员熟知的常规方法制备质粒DNA。这些方法在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)等中描述。为了提取巨大质粒，能够使用J.Bacteriol，Mar.1981，Vol.145，No.3，pp.1365-1373中所述的方法。

还能够通过接合转移(conjugative transfer)将本发明的质粒从含有本发明质粒的微生物转入另外的微生物。

能够通过使用通常适于转化肠杆菌科微生物的系统进行质粒的接合转移。通常，制备含有质粒的供体微生物，所述质粒具有oriT、tra基因和mob基因，或经修饰以含有这些。随后将该质粒转移至受体微生物。此外，如果该质粒具有oriT，但不包含tra和/或mob基因，则能够通过使用确实含有这些基因的辅助质粒(helper plasmid)将该质粒从供体微生物转移至受体微生物。即，具有tra基因和/或mob基因的辅助质粒可分别包含于供体微生物，并且与oriT质粒一起转化(参考J.Bacteriol.，Aug.1995；177(15)：4350-5)。oriT是转移的起点。Mob蛋白是在oriT产生切口(nick)的核酸酶。Tra蛋白是通过使用在oriT的切口将DNA接合转移至另一个细胞的蛋白质。

在下文中，将举例说明用本发明的质粒转化肠杆菌科微生物的方法。本发明所述质粒天然存在于泛菌属、欧文氏菌属或肠杆菌属细菌中，其通常非常大(例如，pEA320具有大约320kbs的大小)，并因此优选使用接合转移方法以将其转移至另外的微生物。为方便起见，将天然含有本发明所述质粒的泛菌属、欧文氏菌属或肠杆菌属细菌在本文中称为供体菌株，而将用本发明所述质粒转化的肠杆菌科细菌称为受体菌株。

优选使用本发明所述质粒和辅助质粒进行接合转移，该辅助质粒能够促进接合转移。通过这种操作，能够将本发明的质粒的修饰最小化，即使修饰可以是或可以不是必需的。辅助质粒优选含有mob基因和tra基因，其均为接合转移所必需的。具体地，pRK2013(可从CLONTECH和Biomedal获得)或其衍生物优选作为辅助质粒(参考Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，76：1648-1652，1979，该序列可从NCCB质粒数据库获得)。此外，本发明的质粒优选携带原先不存在于受体菌株中的标记基因，从而在其转移至受体菌株中时能够进行显性选择(dominant selection)。标记基因如上所述。

如果本发明的质粒不具有标记基因，能够将一种标记基因通过常规方法例如同源重组插入其中。在下文中，将举例说明将抗生素抗性基因插入本发明的质粒。尽管插入位置可以是不影响质粒的复制和稳定性的任何位置，具体而言，能够使用邻近3-羟基丁酮/丁二醇(acetoin/butanediol)生物合成基因bud操纵子的区域。首先，可使用公知的重叠延伸PCR方法扩增和克隆突变的bud基因。这种方法使用来自供体菌株的染色体DNA作为模板，以及含有突变并且与目标区域互补的PCR引物(Urban，A.，Neukirchen，S.and Jaeger，K.E.，A rapid and efficient method for site-directed mutagenesis using one-stepoverlap extension PCR，Nucleic Acids Res.，25，2227-8，1997)。将克隆的突变型bud操纵子并入pUT399(pUT-Δbud)，并且用这种质粒转化具有λ-pir的S17-1λpir菌株(可从Biomedal获得，参考R.Simon.，et al.，BIO/TECHNOLOGY，NOVEMBER 1983，784-791(1983))。pUT399具有R6K复制起点、氯霉素抗性基因和mob区域，该mob区域是接合转移所必需的。pUT399质粒不能在不具有pir基因的菌株中复制。接合转移在所得菌株和供体菌株之间进行，所得的菌株具有并入供体菌株中的pEA320的质粒(pUT-Δbud)。

在下文中，将举例说明使用上述辅助质粒和抗生素抗性基因的接合转移。通过将四环素抗性基因插入质粒pRK2013中的Tn5之内获得含有Tn5::Tet基因的pRK-Tet质粒。质粒pRK2013具有tra基因，其是接合转移所必需的。这些方法使用Epicentre的Transposomics^TM&EZ::TN^TM完成。进行pRK-Tet至供体菌株的接合转移。将pRK-Tet从已用pRK-Tet转化的大肠杆菌菌株转移至供体菌株。随后，将这种含有pRK-Tet的供体菌株和肠杆菌科细菌(受体菌株)接合，并且能够基于氯霉素抗性进行选择以获得具有本发明的质粒的受体菌株。

<2>利用本发明质粒的方法

(2-1)作为载体使用

当将目标基因插入本发明的质粒的任何位置，并且用所得的重组质粒以常规方式转化宿主微生物时，在宿主微生物中表达目标基因是可能的。此外，可插入在另外的宿主中复制所必需的区域以制备穿梭载体(shuttle vector)。

宿主微生物可以是任何微生物，只要其属于肠杆菌科细菌，并且能够产生有用的物质。有用的物质无具体的限制，只要其能够由微生物产生。实例包括，例如，蛋白质、氨基酸、核酸、维生素、糖、有机酸、脂质等。此外，目标基因优选与上述有用的物质相关，并且包括，例如，编码有用的物质例如蛋白质的基因，涉及氨基酸、核酸、维生素、糖、有机酸、脂质等的生物合成系统的基因。

L-氨基酸的实例包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸，并且因此宿主微生物的例子包括产生L-氨基酸的肠杆菌科细菌，例如大肠杆菌和Pantoea ananatis(欧洲专利Publication No.1078989A、美国专利No.6,331,419)。

例如，产生L-谷氨酸的细菌包括以下微生物：

Pantoea ananatis AJ 13601(FERM BP-7207)

植生克雷伯氏菌AJ13410(FERM BP-6617)

Pantoea ananatis AJ13355(FERM BP-6614)

草生欧文氏菌IAM1595/RSFCPG(参考美国专利No.6,197,559)

植生克雷伯氏菌AJ13399/RSFCPG(参考美国专利No.6,197,559)

液化沙雷氏菌ATCC14460/RSFCPG(参考美国专利No.6,331,419)

大肠杆菌AJ12628(日本专利申请公开号H05-244970)

大肠杆菌AJ12624(日本专利申请公开号H05-244970)

Pantoea ananatis AJ13601菌株于1999年8月18日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，Japan)(以前是通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所)并且给予保藏号FERM P-17516。然后，根据布达佩斯条约的规定将该保藏于2000年7月6日转为国际保藏，并且给予保藏号FERM BP-7207。将Pantoea ananatis AJ13355和AJ13356菌株于1998年2月19日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，Japan)(以前是通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所)，并且分别给予保藏号FERM P-16644和FERM P-16645。然后，根据布达佩斯条约的规定将该保藏于1999年1月11日转为国际保藏，并且分别给予保藏号FERM BP-6614和FERM BP-6615。

有机酸的实例包括D-葡糖酸、2-酮基-D-葡糖酸、2，5-二酮基-D葡糖酸和琥珀酸，其宿主微生物的实例包括泛菌属、欧文氏菌属、肠杆菌属(国际公开No.WO98/59504、WO02/12468等)和埃希氏菌属细菌(WO99/06532等)(美国专利No.6,448,061)。此外，维生素或维生素前体的实例包括类胡萝卜素、泛酸和抗坏血酸，其宿主微生物的实例包括泛菌属和埃希氏菌属细菌(国际公开No.WO02/072855)。

此外，为了使用本发明的质粒作为载体，可引入多克隆限制位点以促进目标基因的插入，或可在目标基因上游的位点引入强启动子并且在目标基因下游的位点引入强终止子。此外，本发明的质粒还可用作表达载体，其能够表达在合适位置含有标记(tag)的蛋白质，该标记用于蛋白质的亲和纯化。

可通过如下方法获得有用的物质：用本发明的质粒转化能够产生该有用的物质的肠杆菌科微生物；将其在培养基中，在能够在培养基或微生物中产生该有用物质的条件下培养；以及从培养基或微生物中收集该有用的物质。

能够使用常规用于通过微生物发酵产生有用的物质的培养基。即，能够使用含有碳源、氮源、无机离子和(如果需要的话)其它有机成分的常规培养基。作为碳源，能够使用糖例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解物，醇例如甘油和山梨醇，以及有机酸例如富马酸、柠檬酸和琥珀酸。作为氮源，能够使用无机铵盐例如硫酸铵、氯化铵和磷酸按，有机氮例如大豆水解物，氨气，以及氨水。作为有机痕量营养物，优选添加适量的所需物质例如维生素B₁和L-赖氨酸或酵母提取物等。除了这些之外，根据需要少量添加磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。此外，用于本发明的培养基可以是天然的或合成的培养基，只要该培养基含有碳源、氮源、无机离子和根据需要的其它有机痕量成分。

培养通常在需氧条件下进行1-7天。培养温度通常为24-37℃，培养期间pH通常为5-9。为了控制pH，能够使用无机的或有机的、酸性或碱性的物质，氨气等。当从微生物产生和分泌有用的物质时，在培养完成之后，将沉淀例如细胞从培养物中去除，然后可通过已知方法，如离子交换、沉淀和其它方法的组合来分离和纯化有用的物质。此外，当有用的物质在微生物之内积累时，例如，可将细胞用超声处理等破坏，并且可通过离子交换树脂方法等从离心分离等之后的上清液中收集有用的物质。

此外，本发明的质粒或其衍生物还可用作破坏肠杆菌科微生物的目标基因的载体。例如，可将这种突变引入SEQ ID NO：2的氨基酸序列中，因此该质粒能够在低培养温度复制，但不能在高温复制，并且在突变基因的DNA片段和具有同源序列并且存在于肠杆菌科微生物染色体上的基因之间诱发同源重组。通过这种操作得到了具有将该DNA片段并入染色体的肠杆菌科微生物。为了使本发明的质粒成为温度敏感的，例如，用羟胺处理DNA得到具有突变的质粒，其使该质粒在低温可自主复制，但在高温不可复制(参见美国专利No.6,303,383)。

(2-2)赋予耐酸性

本发明的质粒天然存在于泛菌属、欧文氏菌属或肠杆菌属细菌中，该质粒能够增加微生物的耐酸性。除了上述作为载体使用，本发明的质粒还适合于增加微生物的耐酸性，只要将其修饰不会使增加微生物耐酸性的效果下降。

在本发明中，“增加耐酸性”的意思是当将含有本发明质粒的微生物在酸性条件下培养时，与不含本发明的质粒的亲本菌株相比，生长率改善或生长的临界pH降低。亲本菌株的实例包括野生型菌株，例如，大肠杆菌MG1655等。在这种情况下，培养基中的pH是6或更低，优选5.5或更低，更优选4.9或更低。尽管只要能够生长pH的下限没有限制，但由于用本发明质粒的转化，该pH是例如3或更高。

与亲本菌株生长进行比较的方法的实例包括在580-660nm波长测量培养基的吸光度，在该培养基中培养了亲本菌株和本发明的菌株，并且将吸光度进行比较。

此外，当使用本发明的质粒如上所述来赋予耐酸性时，可将其同时(concomitantly)用作载体。即，当使用包含携带目标基因的本发明质粒的菌株时，该菌株在酸性条件下的生长得到改进，并且有用的物质的生产力(productivity)也可以得到改进。

在下文中，将参考以下非限制性实施例进一步说明本发明。

实施例1

因为pEA320非常大(大约320kbs)，因此难以作为环状DNA分离并且难以用于转化菌株。此外，由于该质粒上既不存在药物抗性基因，也不存在能够显性选择的标记，所以有必要引入标记基因使显性选择成为可能。因此，构建pUT399以使同源重组能够发生，并且因此，能够使用氯霉素选择菌株(美国专利申请公开No.20040180404)。

如下构建pUT399。使用pUT-miniTn5-Cm(其能够从Biomedal购买)作为模板，以及P7(SEQ ID NO：9)和P8(SEQ ID NO：10)作为引物进行PCR，从而扩增R6K的复制起点和RP4的mob基因。此外，当将pHSG399(TaKaRa)用作模板，以及P9(SEQ ID NO：11)和P10(SEQ ID NO：12)用作引物时，扩增了含有氯霉素抗性基因和多克隆位点的区域。将这些分别用限制酶BglII处理，然后通过使用T4DNA连接酶连接。

pUT399含有R6K的复制起点和接合转移所需的mob区域。此外，pUT399不能在缺少pir基因的菌株中复制。因此，可通过构建将pEA320中存在的序列携带于pUT399上的质粒，通过接合用该质粒转化P.ananatis并且用氯霉素进行筛选，来获得含有质粒的P.ananatis菌株，在该质粒中在同源区域内发生重组，并且由此将pUT399引入pEA320。

具体方法将在下面描述。尽管由于该质粒非常大(320kbs)，通过常规的碱-SDS方法分离pEA320是困难的，但可在以常规方式分离染色体的过程中将其与染色体一起收集。在该实验中，将budAB操纵子的基因选择作为pEA320上的基因。为了缺失budA下游大约370bps和budB基因上游大约500bps，合成引物P1(SEQ ID NO：3)和P2(SEQ ID NO：4)，或P3(SEQ ID NO：5)和P4(SEQ ID NO：6)，并且与作为模板的AJ13355菌株(FERM BP-6614)一起使用以进行第一次PCR。然后，使用上述PCR产物作为模板和引物P5(SEQID NO：7)和P6(SEQ ID NO：8)通过重叠延伸PCR扩增大约2.3kbs的片段。然后，将所得扩增片段并入pCR2.1(Invitrogen)，并且将该质粒用EcoRI处理，以获得具有EcoRI位点的插入片段。最终，将该片段并入已用EcoRI处理的pUT399，并且用于转化S17-1λpir菌株(其能够从Biomedal购买，参考Simon.，R.，et al.，BIO/TECHNOLOGY，NOVEMBER 1983，784-791(1983))。

将所得的菌株，S17-1λpir/pUT-Δbud菌株，和P.ananatis NP106菌株接合以获得NP106/pEA320-bud::Cm菌株，其中将pUT-Δbud通过同源重组并入pEA320上的基因区域。通过从Pantoea ananatis AJ13601菌株(FERM BP-7207菌株)消除天然质粒RSFCPG和pSTVCB获得P.ananatis NP106。在此构建中，将全长budAB基因和破坏型的(disrupted-type)budAB基因，以及pUT399的整个区域，并入pEA320。然后，将具有pRK-Tet质粒的大肠杆菌DH5α菌株(由TaKaRa Bio制备)用作供体菌株，并且将pRK-Tet质粒通过接合转入NP106/pEA320-bud::Cm菌株中。通过将Tn5::Tet基因引入pRK2013(Biomedal)来构建pRK-Tet质粒，所述pRK2013具有接合转移所需的tra基因。通过使用Epicentre的Transposomics^TM&EZ::TN^TM进行该构建。然后，将这种NP106/pEA320-bud::Cm，pRK-Tet菌株和MG1655菌株接合，并且通过在含有25mg/L氯霉素的M9葡萄糖琼脂培养基上选择，获得含有转移的pEA320的MG1655，pEA320-bud::Cm菌株。

实施例2

<含有pEA320的大肠杆菌在酸性条件下的生长>

检测了含有pEA320的大肠杆菌MG1655菌株在酸性条件下的生长。

具体而言，将野生型菌株MG1655和pEA320转化菌株MG1655/pEA320-bud::Cm分别在L培养基(10g Bacto胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl和15g琼脂于1L纯化水中，pH 7.0)中预培养(preculture)，其中对pEA320转化菌株培养物补加25mg/L氯霉素。然后将细胞用无菌水洗涤两次并且以OD 660nm＝0.05的密度接种到含有30g/L谷氨酸和5g/L葡萄糖并用氨水调节至pH 7.0或4.5的M9基本培养基(2mM硫酸镁、3g磷酸二氢钾(monopotassium phosphate)、0.5g氯化钠、1g氯化铵和6g磷酸氢二钠于1L纯化水中)中。随时间测定培养基的OD。对于培养和OD测定，使用由ADVANTEC制造的TN1506。

如图6所示，尽管在pH 7.0可以看到生长几乎没有区别，但在pH 4.5生长是显著改善的。即，pEA320赋予耐酸性。

然后，为了更具体地分析这种现象，使用发酵缸(jar fermenter)在pH受控条件下进行培养。将野生型菌株MG1655和pEA320转化菌株MG1655/pEA320-bud::Cm各自分别在L培养基(10g Bacto胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl和15g琼脂于1L纯化水中，pH 7.0)中预培养，其中对pEA320转化菌株培养物补加25mg/L氯霉素。对于每种菌株将一个平板上的细胞接种到装入发酵缸的300mL培养基中，所述培养基具有如下所示的组成。在如下条件下进行培养：37℃和pH 4.9或4.7及1/1vvm通气和在34℃为5％或更高的氧浓度，其通过搅拌来控制，并且通过在培养期间添加氨气将pH调节至4.9和4.7。

如图7所示，含有pEA320的MG1655甚至能够在pH 4.7和4.9生长，而MG1655不能在这些pH生长。由此证实用pEA320的转化改进了耐酸性。

表2

主培养的培养基组合物

葡萄糖         50g/L

(NH₄)₂SO₄      5.0g/L

MgSO₄·7H₂O    0.4g/L

GD113          0.1mL/L

酵母提取物     6.0g/L

KH₂PO₄         6.0g/L

NaCl           1.5g/L

FeSO₄·7H₂O    0.02g/L

MnSO₄·5H₂O    0.02g/L

氯霉素         25mg/L

二水合氯化钙   0.75g/L

工业实用性

根据本发明，提供了用于培育和改进肠杆菌科微生物的新质粒。本发明所述质粒能够用于培育肠杆菌科微生物以及用于产生有用的物质，并且能够改善微生物酸性条件下的生长。

尽管已参照本发明的示例性实施方案详细描述了本发明，但对于本领域的技术人员显而易见的是，可在不背离本发明范围的前提下，进行各种改变和使用等价物。每篇上述文献通过引用完整地并入本文。

序列表

<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)

 

<120>肠杆菌科中可自主复制的新质粒

 

<130>C460-C5055

 

<150>JP 2005-051163

<151>2005-02-25

 

<160>12

 

<210>1

<211>930

<212>DNA

<213>Pantoea ananatis

 

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(927)

 

<400>1

atg gca gat aaa gat agt gaa aac aaa gcg tta cta gag cct ttt ctg    48

Met Ala Asp Lys Asp Ser Glu Asn Lys Ala Leu Leu Glu Pro Phe Leu

1               5               10                      15

tct gtg acc aaa aac agt ggt gaa gtt att cag ctt cat ccc aac aaa    96

Ser Val Thr Lys Asn Ser Gly Glu Val Ile Gln Leu His Pro Asn Lys

            20                  25                  30

aat aat acc gtt cag ccc gtg gcc tta atg cgt ctg gga ctc ttt gtt    144

Asn Asn Thr Val Gln Pro Val Ala Leu Met Arg Leu Gly Leu Phe Val

        35                  40                  45

ccc acg ctt aaa tcc aca gcg cgg ggc att tct ggt gct atg gct tca    192

Pro Thr Leu Lys Ser Thr Ala Arg Gly Ile Ser Gly Ala Met Ala Ser

    50                  55                  60

acc gat gcc acc aaa gag ctt aaa aac ctc tct ctg gtt aaa gcg gaa    240

Thr Asp Ala Thr Lys Glu Leu Lys Asn Leu Ser Leu Val Lys Ala Glu

65                  70                  75                  80

ggt tat gaa aag att acc atc acc ggt gcc aga ctg gat atg gat aat    288

Gly Tyr Glu Lys Ile Thr Ile Thr Gly Ala Arg Leu Asp Met Asp Asn

                85                  90                  95

gac ttt aag acc tgg gcc ggt att att cag tct ttt tcc cgt tac cct    336

Asp Phe Lys Thr Trp Ala Gly Ile Ile Gln Ser Phe Ser Arg Tyr Pro

            100                 105                 110

aca cag ggt gat acg gta acc ctg cct ttt att gat ttc gtg aag atg    384

Thr Gln Gly Asp Thr Val Thr Leu Pro Phe Ile Asp Phe Val Lys Met

        115                 120                 125

tgc ggt att ccc tcc gcc aac tcc tct gcc gca ttg cgt aag cga ctc    432

Cys Gly Ile Pro Ser Ala Asn Ser Ser Ala Ala Leu Arg Lys Arg Leu

    130                 135                 140

gac gct tcg tta cgc cgt att gcg acg aac act ctc tct ttt gaa ggt    480

Asp Ala Ser Leu Arg Arg Ile Ala Thr Asn Thr Leu Ser Phe Glu Gly

145                 150                 155                 160

aac ggt aag gcc tat cat acg cat ctg gta cag tca gct tat tac gat    528

Asn Gly Lys Ala Tyr His Thr His Leu Val Gln Ser Ala Tyr Tyr Asp

                165                 170                 175

cgt gaa aaa gac att gtc cgc ata cag gct gat ccc aag ctc ttt gag    576

Arg Glu Lys Asp Ile Val Arg Ile Gln Ala Asp Pro Lys Leu Phe Glu

            180                 185                 190

ctg tat aac ttc gac cac aag gtt tta ctg cag ctg agg gct atc tcc    624

Leu Tyr Asn Phe Asp His Lys Val Leu Leu Gln Leu Arg Ala Ile Ser

        195                 200                 205

cgc ctt aag cgt aaa gaa tcg gct cag gcg ctt tat acg ttc ctg gag    672

Arg Leu Lys Arg Lys Glu Ser Ala Gln Ala Leu Tyr Thr Phe Leu Glu

    210                 215                 220

agc ctg ccg acc aac cct gcg ccc att tct ctt gcc cgc tta cgt atg    720

Ser Leu Pro Thr Asn Pro Ala Pro Ile Ser Leu Ala Arg Leu Arg Met

225                 230                 235                 240

cgg ctc aat ctt ggc tca aag att acc acg cag aat cac gtg gta cga    768

Arg Leu Asn Leu Gly Ser Lys Ile Thr Thr Gln Asn His Val Val Arg

                245                 250                 255

cgc gcg atg gaa cag ctt aaa gag att ggc tac ctt gat tac tct gaa    816

Arg Ala Met Glu Gln Leu Lys Glu Ile Gly Tyr Leu Asp Tyr Ser Glu

            260                 265                 270

gtc aaa cga ggc cgc tcc gta ttt ttc atc att cac agc aga aca ccg    864

Val Lys Arg Gly Arg Ser Val Phe Phe Ile Ile His Ser Arg Thr Pro

        275                 280                 285

aaa ctc gat gga atc agt aac ctg gaa gga atc gat acg ctc gat gac    912

Lys Leu Asp Gly Ile Ser Asn Leu Glu Gly Ile Asp Thr Leu Asp Asp

    290                 295                 300

atc gat ttt gaa gac tga                                            930

Ile Asp Phe Glu Asp

305

 

<210>2

<211>309

<212>PRT

<213>Pantoea ananatis

 

<400>2

Met Ala Asp Lys Asp Ser Glu Asn Lys Ala Leu Leu Glu Pro Phe Leu

1               5                   10                 15

Ser Val Thr Lys Asn Ser Gly Glu Val Ile Gln Leu His Pro Asn Lys

            20                  25                  30

Asn Asn Thr Val Gln Pro Val Ala Leu Met Arg Leu Gly Leu Phe Val

        35                  40                  45

Pro Thr Leu Lys Ser Thr Ala Arg Gly Ile Ser Gly Ala Met Ala Ser

    50                  55                  60

Thr Asp Ala Thr Lys Glu Leu Lys Asn Leu Ser Leu Val Lys Ala Glu

65                  70                  75                  80

Gly Tyr Glu Lys Ile Thr Ile Thr Gly Ala Arg Leu Asp Met Asp Asn

                85                  90                  95

Asp Phe Lys Thr Trp Ala Gly Ile Ile Gln Ser Phe Ser Arg Tyr Pro

            100                 105                 110

Thr Gln Gly Asp Thr yal Thr Leu Pro Phe Ile Asp Phe Val Lys Met

        115                 120                 125

Cys Gly Ile Pro Ser Ala Asn Ser Ser Ala Ala Leu Arg Lys Arg Leu

    130                 135                 140

Asp Ala Ser Leu Arg Arg Ile Ala Thr Asn Thr Leu Ser Phe Glu Gly

145                 150                 155                 160

Asn Gly Lys Ala Tyr His Thr His Leu Val Gln Ser Ala Tyr Tyr Asp

                165                 170                 175

Arg Glu Lys Asp Ile Val ArgIle Gln Ala Asp Pro Lys Leu Phe Glu

            180                 185                 190

Leu Tyr Asn Phe Asp His Lys Val Leu Leu Gln Leu Arg Ala Ile Ser

        195                 200                 205

Arg Leu Lys Arg Lys Glu Ser Ala Gln Ala Leu Tyr Thr Phe Leu Glu

    210                 215                 220

Ser Leu Pro Thr Asn Pro Ala Pro Ile Ser Leu Ala Arg Leu Arg Met

225                 230                 235                 240

Arg Leu Asn Leu Gly Ser Lys Ile Thr Thr Gln Asn His Val Val Arg

                245                 250                 255

Arg Ala Met Glu Gln Leu Lys Glu Ile Gly Tyr Leu Asp Tyr Ser Glu

            260                 265                 270

Val Lys Arg Gly Arg Ser Val Phe Phe Ile Ile His Ser Arg Thr Pro

        275                 280                 285

Lys Leu Asp Gly Ile Ser Asn Leu Glu Gly Ile Asp Thr Leu Asp Asp

    290                 295                 300

Ile Asp Phe Glu Asp

305

 

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>3

gcgcgcaaac aggcaactga caataagctc                                       30

 

<210>4

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>4

cggctgatca acgatatcct gtgggtgcac aaaactggtt gtcggagg                   48

 

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>5

ccacaggata tcgttgatca gcc                                              23

 

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>6

ttaaagtaac tggctgagat gaagctgccc                                       30

 

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

 

<400>7

gacaataagc tcatacagac tggg                                          24

 

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>8

ccatcagcaa gtggttatcg gcg                                           23

 

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>9

tcatagatct tttagattga tttatggtgc                                    30

 

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>10

ccacagatct aattcccatg tcagccgtta                                    30

 

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>11

ataaagatct gtgtccctgt tgataccggg                                    30

 

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>12

ggggagatct tgcaaggcga ttaagttggg                                    30

Claims (14)

1.从选自泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌的微生物分离的基因，其中所述基因编码Rep蛋白，该蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.包含根据权利要求1的基因的质粒，其中所述质粒在肠杆菌科细菌中可自主复制。

3.根据权利要求2的质粒，其进一步包含标记基因。

4.根据权利要求2的质粒，其中所述质粒来自选自下组的泛菌属细菌：Pantoea ananatis FERM BP-7207、BP-6614和BP-6615。

5.根据权利要求2的质粒，其中所述质粒是pEA320，并且具有选自图1、2、3、4和5中所示的限制酶图谱。

6.已用包含基因的质粒转化的肠杆菌科微生物，所述基因从选自下组的微生物分离：泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌，并且其中所述基因编码Rep蛋白质，该蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求6的微生物，其中所述质粒来自选自下组的泛菌属细菌：Pantoea ananatis FERM BP-7207、BP-6614和BP-6615。

8.根据权利要求6的微生物，其中所述质粒是pEA320，并且具有选自图1、2、3、4和5中所示的限制酶图谱。

9.根据权利要求6的微生物，其中所述质粒还包含标记基因，并且在肠杆菌科微生物中可自主复制。

10.根据权利要求6的微生物，其中所述肠杆菌科微生物选自下组：埃希氏菌属细菌、泛菌属细菌、肠杆菌属细菌、欧文氏菌属细菌、克雷伯氏菌属细菌、沙雷氏菌属细菌、沙门氏菌属细菌和摩根氏菌属细菌。

11.根据权利要求6的微生物，其能够产生有用的物质。

12.用于产生有用的物质的方法，其包含在培养基中培养根据权利要求11的微生物，和从该培养基或微生物中收集该有用的物质，其中所述有用的物质是L-氨基酸。

14.用于产生具有改进的耐酸性的微生物的方法，其包含用根据权利要求4的质粒转化肠杆菌科微生物。

15.根据权利要求14的方法，其中与不含该质粒的菌株相比，所述具有改进的耐酸性的微生物在pH 3-5显示改善的生长。

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