CN1260837A

CN1260837A - 植物grab蛋白

Info

Publication number: CN1260837A
Application number: CN98805828A
Authority: CN
Inventors: C·古蒂尔雷兹－阿门塔; X·戚; A·桑兹－布尔戈斯
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 1997-06-12
Filing date: 1998-06-09
Publication date: 2000-07-19
Also published as: AU8216098A; CA2289863A1; WO1998056811A3; EP0989997A2; JP2002506345A; ES2132025A1; ZA985135B; WO1998056811B1; ES2132025B1; NZ500529A; AU753798B2; WO1998056811A2; BR9809447A; WO1998056811A8

Abstract

提供了控制植物细胞和植物病毒生长和/或复制、植物细胞周期、分化、发育和/或衰老的方法,其特征在于包括在植物细胞中提高或降低非Rb(成视网膜细胞瘤)蛋白的GRAB(双生病毒RepA结合)蛋白水平或结合能力。

Description

植物GRAB蛋白

本发明涉及：控制植物细胞周期的方法，特别是为了控制植物细胞和植物病毒生长和/或复制、分化、发育和/或衰老的目的；在这样的方法中使用以前未鉴定和/或未分离的蛋白和/或核酸；在这样的方法中使用以前天然功能未知的已知蛋白或核酸；未鉴定和/或未分离的蛋白和核酸本身以及它们的浓缩、分离、无细胞和/或重组形式；以及包含这样的重组核酸的植物。

已经有许多文件证明病毒复制循环在被感染细胞内的成功完成通常需要细胞因子的参与。这在具有仅编码几个蛋白的小基因组的病毒的情况下特别明显。例如，动物DNA肿瘤病毒利用细胞机器进行它们的转录过程和DNA复制过程。此外，已经有一个或多个病毒编码蛋白演化出来，这些蛋白直接冲击被感染细胞的细胞生理以创造一个适于病毒复制的细胞环境。一个典型的例子是由动物DNA肿瘤病毒编码的癌蛋白，即SV40 T抗原、腺病毒E1A或人乳头瘤病毒E7蛋白，这些蛋白通过干扰成视网膜细胞瘤途径而激活被感染细胞的细胞周期(26，28，45)。

相似的策略看起来已经在植物双生病毒(一群独特的植物DNA病毒)中演化出来。根据不同的亚群，双生病毒基因组包含1或2个小型(2.6-3.0kb)环状单链DNA分子(11，24)。小麦矮双生病毒(WDV)属于亚群I，亚群I的成员具有最小的基因组，即一个单个的长2750个核苷酸的单链DNA分子，仅编码几种蛋白。在这些蛋白中，只有RepA(又称C1)和Rep(又称C1∶C2)是病毒转录和复制所需的WDV蛋白(24)。RepA由单一转录物上翻译得到，其中所述转录物在互补义(complementary-sense)启动子的控制下产生。该mRNA经过剪接后，产生了Rep蛋白(37)。WDV Rep是病毒DNA复制所绝对必需的，并且与所有双生病毒的Rep蛋白同源。已经显示双生病毒的Rep蛋白具有体外DNA切口连接活性、复制起点识别能力和ATP酶活性。然而，RepA蛋白是WDV双生病毒亚群所独有的，并且已经暗示其调节与Rep活性、结合植物成视网膜细胞瘤(Rb)蛋白(45，46)以及刺激病毒粒意义(virion-sense)的基因表达有关。此外，最近我们展示了在WDV中，Rb结合蛋白(RepA)与起始子蛋白(Rep)在病毒DNA复制中起协同作用。

双生病毒DNA复制在被感染细胞的核内发生，并且由于缺乏病毒基因组编码的复制酶，病毒DNA的复制需要S期的功能。与此相一致的是复制中间体在S期的核中的积累(1)。双生病毒通常感染非增殖细胞，但有趣的是，它们诱导S期典型的细胞蛋白出现，如增殖细胞核抗原(PCNA)(29)，而这种蛋白在其它情况下在非增殖细胞中是检测不到的。亚群I双生病毒如WDV，编码参与双生病毒冲击细胞周期激活回路的机制的蛋白，这些蛋白包含一个在RepA蛋白中介导蛋白与Rb相互作用的能力的LXCXE基序(45)。这些观察提供了分离全长cDNA编码的ZmRb1(一种植物Rb蛋白)的基础，其中所述ZmRb1可以在植物细胞中作为一种G1/S转变的调节物(46)。与这种功能相一致，在培养的植物细胞中植物Rb(以及人Rb)的超量表达显著抑制WDV的DNA复制(45，46)。因此，看起来双生病毒用于促进DNA复制的机制中的至少一种机制，通过螯合Rb并因此干扰Rb的负反细胞生长活性(negative cell growth activity)，成为被感染细胞中S期的触机。

植物中细胞周期、细胞生长和分化的调节是调节物的复杂的相互作用的结果，所述调节物的活性是对广泛种类信号的应答，所述信号如激素、营养可得性或环境条件(20，39)。例如，D型细胞周期蛋白mRNA的水平迅速提高以应答蔗糖或细胞分裂素处理(41)，而依赖于细胞周期蛋白的激酶(cdc2)mRNA的水平依赖于生长素的存在。其它植物细胞周期调节物的分子本质以及它们与细胞生长和分化相关的功能还是大部分未知的。因此，鉴定参与这些控制途径的细胞因子以阐明决定植物细胞对生长信号的应答的分子机制是非常重要的。

由于细胞因子对于完成双生病毒复制是绝对必需的，所以本发明人推测，双生病毒可能通过干扰Rb途径的机制以外的机制来调控细胞生理，并且这样的效应可能是双生病毒蛋白将目前未知的细胞因子作为目标的结果。他们使用了一种实验策略，以鉴定与RepA(WDV的Rb结合蛋白)功能性相互作用的蛋白，并且现在已经提供了几个编码以前未鉴定的蛋白的cDNA克隆并确定了它们的功能。

根据氨基酸序列分析，已经确定这些蛋白具有共同的N端域，该N端域是与病毒RepA蛋白相互作用所需的，而它们的C端域则是各自独特的。它们可能代表了一个可能具有转录调控活性的大得多的蛋白家族的成员，该家族与激素应答和营养应答的调节物、分生组织发育以及植物衰老有关。

因此，本发明的第一方面提供了一种控制植物细胞周期的方法，其特征在于包括在植物细胞中提高或降低GRAB(双生病毒RepA结合)蛋白或肽的水平，或提高或降低GRAB蛋白或肽的结合能力。这样的控制特别是允许控制植物细胞生长和/或复制、植物病毒在细胞内的生长、植物细胞的分化、发育和/或衰老。人们将会理解，这样的蛋白和肽不是Rb(成视网膜细胞瘤)蛋白，而具体是下文所述的按照序列表的蛋白和肽以及它们的功能性变异体。

提高或降低GRAB蛋白肽的水平可以通过在植物细胞中超量产生或过低产生所述蛋白或肽而获得，也就是说相对于细胞内产生所述蛋白或肽的正常水平而言。降低天然GRAB的结合活性可以通过如应用GRAB蛋白或肽结合剂，如WDV RepA或其有功能的部分或其变异体而获得。

具体地说，这种方法中使用的GRAB蛋白或肽是那些包含如本文所示的氨基酸序列SEQ ID No 2或4的蛋白或肽，或其能够结合双生病毒RepA的功能性变异体。优选的蛋白或肽与SEQ ID No 2或4的氨基酸序列具有至少70％的同源性，更优选有至少90％的同源性，最优选有至少95％的同源性。具体地说，GRAB蛋白是那些前200个N端氨基酸能够结合病毒RepA蛋白的蛋白；更优选的是那些前170个N端氨基酸能够结合病毒RepA蛋白的蛋白；最优选的是那些前150个N端氨基酸能够结合病毒RepA蛋白的蛋白。

这些方法可以包括将这样的GRAB蛋白或肽直接应用于植物细胞或整株植物，但将更方便地包括使用相应的GRAB蛋白或肽编码核苷酸或反义核苷酸，换句话说就是将核酸置于细胞内，特别是通过使用重组核酸如重组DNA，所述重组DNA包含在细胞内置于一个启动子之后的GRAB蛋白或肽的编码序列，所述启动子能够支持GRAB蛋白或肽表达或反义RNA的产生。GRAB蛋白的编码核酸可用于在所需的地方产生GRAB，如在GRAB通常并不表达的组织(如营养性组织或茎组织，诸如木质部或韧皮部)中异位表达。一种可替代的策略可以包括表达一种GRAB蛋白结合肽(如双生病毒RepA)、所述肽的功能性变异体或其GRAB蛋白结合部分，如C端部分。这样的一种肽将结合天然GRAB蛋白并抑制它们的活性。人们将会认识到，不是由整个完整的双生病毒产生的RepA，特别是仅仅RepA的GRAB蛋白结合部分，如带有截短N端的RepA，其在转基因植物中任何表达将是新颖的。位于DNA或RNA载体或DNA构建物中的功能性连接启动子或其它调节序列的RepA编码cDNA，将会对这样的目的特别有用。

人们将会认识到，传送本发明的蛋白或肽进入植物细胞的一种最有效的方法是原位表达编码它们的核酸。这样的方法的实施按常规是将其序列编码所述肽或蛋白的寡核苷酸或多核苷酸引入植物细胞DNA。这样的核苷酸也可用于通过基因沉默共表达(6)或通过反义策略而负调节天然GRAB的表达。通过使用诱变技术，如SDM，可以设计并产生本发明的核苷酸以编码蛋白或肽，所述蛋白或肽是本发明的功能性变异体或在其它方面过分激活或失活(如有关于结合的)。

本领域内的技术人员将会认识到，合适的启动子可以是持续活动的或是可诱导的。本领域的技术人员将会赞同诱导型启动子具有优势，这是就它们能仅在需要时提供前述GRAB蛋白活性的改变而言择，如当受到病毒感染威胁时，或当植物在其它情况下特别易受伤害时，或在细胞发育的特定阶段。这样的启动子可以例如被下列条件诱导：环境条件，诸如胁迫诱导条件，如由干旱或冰冻引起的水可得性的降低；或复杂物质，诸如植物激素，如植物对植物的信号胁迫激素；或更简单的物质，诸如特定的阳离子或阴离子，如金属离子。设想对启动子的类型没有具体限制。

用来通过插入缀合了合适调节序列的cDNA而产生转基因植物的方法的多种具体实例对本领域内的技术人员是已知的。例如，植物转化载体已经由Denecke等人(1992)EMBO J.11，2345-2355描述，进一步应用它们产生生产海藻糖的转基因植物由美国专利申请系列第08/290,301号描述。EP 0339009 B1和US 5250515描述了将异源基因插入植物的策略(见US 5250515的第8到26栏)。对花粉电穿孔以产生转基因单子叶和双子叶植物由US 5629183、US 7530485和US 7350356描述。其它细节可以在参考书中找到，如《重组基因表达方法》(1997)Rocky S.Tuan编辑，Humana Press.ISBN 0-89603-333-3；0-89603-480-1。人们将会认识到预期对要提供的转基因植物的类型没有具体限制；所有种类的植物(单子叶植物或双子叶植物)都可以以引入本发明的核酸的转基因形式产生，以便所述植物中的GRAB活性被组成性改变、异位改变或暂时改变。

本发明第一方面的一个最佳实施方案提供了在植物细胞中产生或抑制衰老的方法，包括提高或降低植物细胞中GRAB蛋白或肽的水平或活性，所述GRAB蛋白或肽特别是SEQ ID No 10的GRAB1蛋白或其能在N.bentamiana植物中诱导衰老的功能性变异体。这样的提高或降低也是通过引入核酸(在这个例子中是SEQ ID No 9)或其功能性变异体而最有效地获得，或者可以通过使用RepA编码DNA而获得。

本发明的第二方面提供了新型GRAB蛋白或肽本身以及浓缩、分离、无细胞和/或重组产生的形式的GRAB蛋白或肽。这样的蛋白或肽可以是天然存在的，或可以是如下所述的其保守取代同源物。优选的蛋白或肽具有与本文所述的GRAB1或GRAB2的N端200个(更优选前170个，最优选前150个)氨基酸有90％或更高同源性的N端序列，更优选有95％或更高的同源性，最优选有98％或更高的同源性。优选的肽包含这些序列或它们的保守取代变异体中任何一个的前150到200个氨基酸的序列。优选的肽包含不具有如本文所附的图4所示的SENU、NAM、ATAF1或ATAF 2的C端序列的序列。

具体地说，所述GRAB蛋白和肽是那些包含如本文所示的氨基酸序列SEQ ID No 3或4的蛋白或肽，或是它们的功能性变异体，这些功能性变异体能够结合双生病毒RepA并且与SEQ ID No 3或4的氨基酸序列具有至少70％的同源性，更优选有至少90％的同源性，最优选有至少98％的同源性。更优选它们包含SEQ ID No 6或8或有这样的同源性限制的功能性变异体，最优选包含SEQ ID No 10或12或有这样的同源性限制的功能性变异体。其中所述蛋白或肽包含SEQ ID No 3或4，而不是SENU、NAM、ATAF1或ATAF2的序列。

蛋白或肽可以由已经用诱变技术，如用化学诱变或诱变PCR改变的天然蛋白或肽的编码DNA得到。

本发明的第三方面提供了GRAB蛋白或肽编码核酸和反义核酸本身以及浓缩、分离、无细胞和/或重组形式的核酸。具体地说，提供的是单独的寡核苷酸或多核苷酸形式的共有DNA和反义DNA，前提条件是所述DNA并不编码如图4所示的SENU、NAM、ATAF1或ATAF2的全长氨基酸序列。

具体提供的是如核苷酸形式、但最好是重组DNA或cRNA(mRNA)形式的核酸，所述核酸编码N端序列与本文所述的GRAB1或GRAB2的前200个N端氨基酸具有至少60％同源性的GRAB蛋白的表达，即核酸的前200个密码子具有这样的同源性。所述同源性优选是至少75％，最优选是至少90％。

优选的核酸是包含SEQ ID No 1、2、5、7、9或11的DNA或RNA或是其具有如上所述的同源性限制的功能性变异体。更优选的是SEQID No 9或11的DNA或其功能性变异体。

关于本发明的说明书和权利要求书，下面的技术术语按照下面的定义使用，除非另外说明。

肽、蛋白、核苷酸或多核苷酸的“功能性变异体”是可以由原始肽、蛋白、核苷酸或多核苷酸的氨基酸序列或碱基序列通过置换、缺失和/或添加一个或更多氨基酸残基或碱基而得到的氨基酸序列或碱基序列，并且所述置换、缺失和/或添加虽然改变了氨基酸序列或碱基序列，但所述功能性变异体至少保留了可被本领域的技术人员检测到的原始肽、蛋白、核苷酸或多核苷酸的至少一种生物活性的部分活性。一种功能性变异体与可以衍生出它的天然或合成序列通常至少50％同源(即它们的氨基酸序列或碱基序列有50％相同)，但有利的是至少70％同源，甚至更有利的是至少90％同源。一种蛋白的任何有功能的部分或其变异体也被称为功能性变异体。

术语“超量产生”在本文中以可能的最常用意义使用。如果一种特定类型的分子(通常是一种蛋白、多肽或寡肽或一种RNA)在细胞内以比天然水平显著并可检测到的更高水平(如20％更高)产生，就被描述为在细胞内“超量产生”。一种分子在细胞内的超量产生可以通过传统的突变和选择技术以及遗传操作方法获得。

术语“异位表达”在本文中用于指定超量产生的一种特定实现，其意义是，例如，一种异位表达的蛋白是在植物内一个它天然完全不(或检测不到地)表达的空间位点产生，也就是说，所述蛋白或肽在所述位点超量产生。

术语“过低产生”规定为包括肽、多肽、蛋白或mRNA以显著低于天然水平的水平(如20％或更低)、特别是以检测不到的水平产生。

本发明的DNA或RNA可以具有在编码GRAB蛋白或肽(如GRAB1或GRAB2)的序列的密码子核苷酸中具有简并置换的序列，其中RNA的U置换了DNA的T。优选的DNA或RNA本身可以与编码GRAB1或GRAB2的多核苷酸在低严格性条件下杂交，最好这样的杂交也能够在高严格性条件下进行。

术语“低严格性条件”和“高严格性条件”当然为本领域的技术人员所充分理解，但可以方便地由US 5202257，第9和10栏说明。在进行修饰的情况下，它们应导致蛋白的表达，所述蛋白带有与那些GRAB蛋白序列的相应氨基酸属于同一类的不同氨基酸；也就是说，这些置换是保守置换。这样的置换对于本领域的技术人员是已知的(如见US 5380712)，并且只有在所述蛋白具有GRAB蛋白的活性时才会加以考虑。

本发明的第四方面提供了上述第二方面所提到的由重组DNA或RNA表达的蛋白或肽、由所述DNA或RNA得到的新型蛋白或肽、以及通过诱变方法(如使用诱变聚合酶链式反应引物)改变的天然DNA或RNA所产生的蛋白或肽。这一方面还提供了产生本发明的蛋白或肽的方法，其特征在于包括使用本发明的DNA或RNA从细胞中表达所述蛋白或肽。

本发明的第五方面提供了核酸探针和引物，所述探针或引物与下文鉴定为SEQ ID No 5、7、9或11的DNA序列、或它们的互补序列、或对应于它们的RNA序列(特别是这样的序列前150个N端编码DNA碱基)中任意15个或更多的连续碱基互补。使用如DNA印迹或RNA印迹，这些寡核苷酸和多核苷酸形式的探针和引物也可以用于进一步鉴定天然存在或合成产生的GRAB肽或蛋白。

用作探针的寡核苷酸方便地包含本文序列SEQ ID No 5、7、9或11的至少18个连续碱基，它们最好是30到100个碱基长，但可以是直到整个序列或甚至更长的任何长度。为用作PCR或LCR引物，所述寡核苷酸最好是10到20个碱基长，但可以更长。引物应该是单链的，但探针可以是双链的，即包含互补序列。

本发明的第六方面提供了包含本发明第三方面的DNA或RNA的载体。

本发明的第七方面提供了产生包含本发明核酸的转化细胞的方法，包括将所述核酸以载体形式引入细胞。

本发明的第八方面提供了产生包含本发明核酸的转化细胞的方法，包括将所述核酸通过如电穿孔或粒子轰击直接引入细胞。具体提供的方法是电穿孔花粉细胞。

本发明的第九方面提供了包含本发明重组核酸(特别是本发明的DNA或RNA)的细胞，特别是植物细胞，如包括花粉细胞和种子细胞，以及包含这样的细胞的植物。

包含编码用于本文所述的GRAB蛋白GRAB 1和GRAB 2表达的DNA的质粒已经按照1977年国际承认微生物保存布达佩斯条约的规定保藏；这些质粒于1997年6月11日在西班牙典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CECT 4889(该保藏物包含GRAB 1序列)和CECT 4890(该保藏物包含GRAB 2序列)。序列表

SEQ ID No 1和2分别展示了编码GRAB1和GRAB 2的保守域N1到N5的核苷酸序列，间插碱基用N表示。

SEQ ID No 3和4展示了分别对应于SEQ ID No 1和2的氨基酸序列。

SEQ ID No 5和7分别展示了跨越GRAB1和GRAB2的N1到N5的全长核苷酸序列。

SEQ ID No 6和8展示了SEQ ID No 5和7的对应氨基酸序列。

SEQ ID No 9和11分别展示了包含GRAB1和GRAB2编码区的分离cDNA的全长序列。

SEQ ID No 10和12展示了蛋白GRAB1和GRAB2的对应氨基酸序列。

附图简述

图1展示了对GRAB 1和GRAB 2的转录物进行RNA印迹分析的结果。

图2展示了为鉴定GRAB 1和GRAB 2参与结合WDV RepA的区而进行的研究的结果。

图3展示了为鉴定WDV RepA参与结合GRAB蛋白的区而进行的研究的结果。

图5展示了用于本发明方法的各种蛋白序列的序列对比，这些蛋白以前已知或未知，具有GRAB蛋白域N1到N5。

图6展示了这些蛋白的电荷分布。

本发明现在将通过参考下面非限制性实施例而进一步地描述，这些实施例仅为了进行说明。根据这些实施例，处于权利要求范围内的其它实施方案将由本领域内的技术人员想到。

在下面的实施例中使用了以下方法。材料与方法DNA操作

蛋白酶K、限制性内切核酸酶和其它用于DNA操作的酶得自Merck、Boehringer Mannheim、New England Biolabs和Promega。标准DNA操作技术如[34]所述应用。使用一台Applied Biosystem自动测序仪进行DNA测序。寡核苷酸得自Isogen Bioscience BV(Maarsen，TheNetherlands)。DNA和RNA的纯化

基本如[4]所述，研磨事先冻存在液氮中的小麦叶、根和悬浮培养细胞，从上述材料中分离基因组DNA和总RNA。将粉末与提取缓冲液(50mM Tris-HCl，pH6.0、10mM EDTA、2％ SDS、100mM LiCl)混合，与酚在65℃加热(1∶1，65℃)后，涡旋搅拌20秒，4℃下于12,000rpm离心15分钟。上清液用等体积的酚∶氯仿抽提两次并用一倍体积的4M LiCl沉淀。离心之后，将RNA沉淀重悬浮于TE缓冲液，在液相中加入两倍体积的乙醇以沉淀基因组DNA。poly(A)⁺mRNA的纯化如[47]所述进行。从小麦培养细胞构建酵母双杂种cDNA文库

将五微克从小麦悬浮培养细胞分离得到的poly(A)⁺mRNA用作cDNA合成的底物，cDNA合成使用一种cDNA合成试剂盒(Stratagene)按照厂家的指示进行。得到的双链DNA含有EcoRI和XhoI末端，平均大小为1.3Kb。将这种cDNA的样品(500ng)与750ng EcoRI/XhoI消化的pGAD-GH载体(Clontech)在8℃连接48小时。连接之后，将该文库对蒸馏水透析并电穿孔进大肠杆菌DH10B(Gibco)。为了方便，将该cDNA文库分为五个各包含约6×10⁵初级转化体的子文库。将初级转化体平板接种到50个添加了氨苄青霉素的150-mm LB平板上，获得总文库DNA。将菌落刮入LB(+Amp)培养基，并如[34]所述制备质粒DNA。筛选酵母双杂种

双杂种筛选中使用了包含两个报告基因LacZ和HIS3的酵母株HF7c(MATa ura3-52 his3-200 ade2-101 lys2-801 trp1-901 leu2-3，112gal4-542 gal80-538 LYS2∷GALI_UAS-GAL1_TATA-HIS3 URA3∷GAL417mers(x3)-CyCl_TATA-LacZ；[15])[4，16]。用pBWRepA如[38]所述第一次转化酵母，pBWRepA是一种质粒，包含在pGBT8载体中与Gal4DNA结合域(BD；TRP1标记)融合的完整WDV RepA可读框。然后用pGAD-GH(AD；LEU2标记)小麦cDNA文库转化酵母。将转化混合物平板接种在酵母退出(drop-out)选择培养基上，这种培养基缺乏色氨酸、亮氨酸和组氨酸，并且补充了5mM和10mM 3-氨基-三唑(3-AT；[5])以减少假阳性生长集落的出现。转化体一般在3到8天期间回收，并在高至20mM 3-AT的存在下检查生长。为证实这两种融合蛋白之间的相互作用，如[7]所述通过影印滤膜测定来测定β-半乳糖苷酶活性。通过将质粒DNA转化入大肠杆菌MH4，由于该菌株是leuB^-，而pGAD-GH质粒中存在的LEU2基因可以补足这一缺陷，因此可将它们从阳性克隆中回收。使用ApaI(1-253)、SalI(1-208)、SacI(1-52)和SacII(80-287)限制位点构建GRAB1的缺失，使用XhoI(1-149)、BglII(1-108)、SalI(1-55)和SmaI(66-351)限制位点构建GRAB2的缺失。GST融合蛋白的产生及体外结合实验

为产生GST-GRAB融合蛋白，分别用寡核苷酸GRAB1-ATG(5’GGATCCATGGTGATGGCAGCGG)和T7引物，以及寡核苷酸GRAB2-ATG(5’GGATCCATGGCGGACGTGACGGCGGTG)和T7引物通过PCR扩增GRAB1和GRAB2的编码区。然后将产物符合读框地克隆进pGEX-KG载体。通过将WDV RepA可读框符合读框地克隆进pGEX-KG载体，产生GST-RepA。将大肠杆菌BL21(DE3)转化体培养到OD₆₀₀为0.6到0.9，然后通过加入IPTG达到1mM的浓度，在37℃处理30分钟，诱导其表达该融合蛋白。使用谷胱甘肽-琼脂糖颗粒(Pharmacia)纯化GST融合蛋白。用小麦胚提取物(Promega)在35S-甲硫氨酸的存在下，按照厂家的条件，通过体外转录和翻译(IVT)获得标记的RepA蛋白。将从GRAB1和GRAB2基因得到的同样PCR产物克隆进质粒pBluescriptKS并用T7 RNA聚合酶转录后，用TNT网织红细胞裂解物(Promega)产生标记GRAB1和GRAB2。植物细胞培养物

栽培一粒小麦(Triticum monococcum)悬浮培养物得自P.Mullineaux(John Innes Center，UK)并如[46]所述维持。N.benthamiana植物的接种

PVX衍生的pP2C2S载体[10]用于GRAB蛋白在N.benthamiana植物中的瞬间表达。为GRAB1的构建，将包含完整GRAB1 cDNA的1.1Kb SmaI-XhoI片段克隆进NruI/SalI消化的pP2C2S载体以产生质粒pP2-GRAB1。为构建GRAB1移码突变体(GRAB1^Fs)，将质粒pP2-GRAB1用SacII部分消化，然后用T4 DNA聚合酶处理后重连接。为GRAB2的构建，将包含完整GRAB2 cDNA的1.35Kb SmaI-XhoI片段克隆进NruI/SalI消化的pP2C2S载体，产生质粒pP2-GRAB2。为构建移码突变(GRAB2^Fs)，将质粒pP2-GRAB2用BstEII消化，然后用克列诺酶处理后重连接。使用T7 Cap Scribe试剂盒(BoeringherMannheim)，体外转录用SpeI消化的质粒DNA，获得感染性RNA。将RNA转录物稀释于5mM Na₃PO₄(pH7.0)，并用金刚砂如[10，17]所述接种3周大的N.benthamiana植株(每种情况有四株)。通过粒子轰击转染小麦培养细胞

1000rpm离心3分钟沉淀细胞并去除上清液。用匙突将约0.20-0.25ml堆积的细胞涂布于一张Whatman #1滤纸上，将滤纸置于补充了0.25M甘露醇[30]并用0.8％琼脂(轰击介质)固化的CHS培养基上。DNA吸附和粒子轰击的条件如[43，46]所述。通过将GRAB蛋白的编码序列克隆进一个质粒[47]并处于CaMV 35S启动子控制之下，在小麦培养细胞中超量表达GRAB蛋白。将GRAB1的1.1Kb EcoRI-XhoI片段和GRAB2的1.3Kb EcoRI-ApaII片段克隆进EcoRI/NdeI消化的质粒p35S.ZmRb1[47]，产生p35S.GRAB1和p35S.GRAB2。这些质粒包含ZmRb1的3’非翻译区。每个实验时间点对应于每一次单独转染的细胞平板。实验重复至少两次。WDV DNA复制分析

基本如[43，46]所述分析WDV DNA复制。将细胞在液氮中研磨并基本如[41]所述分离DNA(Soni等人，1994)。DNA在0.7％琼脂糖凝胶中电泳，然后转移到尼龙膜(Biodyne A)上，按照厂家(DIG DNA标记和检测试剂盒，Boehringer Manmheim)建议的条件，与用洋地黄毒苷-11-dUTP标记的探针杂交以进行检测。实施例1编码GRAB蛋白的cDNA的分离

利用酵母双杂种方法(Field和Song，1989；Fields，1993)，从由活跃生长的小麦细胞培养物制备的mRNA构建cDNA文库。利用融合了Gal4 DNA结合域的WDV RepA进行筛选。非常大量的cDNA克隆允许共转化体在选择培养基(-his，+3AT)中的生长。在那些转化后前6天出现的转化体中，那些共转化体展示了更强的相互作用，这是根据它们在≥20mM 3AT下生长以及产生强烈的β-半乳糖信号的能力判断的。部分DNA序列分析揭示了一组7个cDNA克隆的存在，虽然根据限制酶切分析推断它们代表不同的克隆，但这组克隆的5’-序列显著相关。根据它们与WDV RepA相互作用的能力，由这组cDNA克隆编码的蛋白被称为GRAB蛋白(双生病毒RepA结合)。本文描述了两种GRAB蛋白，GRAB1和GRAB2。

每一种克隆的cDNA都编码在酵母中强烈结合WDV RepA的蛋白。GRAB-1和GRAB-2 cDNA克隆长约1.1Kb并各自包含一个单个的可读框，包括一个推定的ATG翻译起始位点。这两种GRAB蛋白的完整cDNA序列和推断的氨基酸序列在序列表中以SEQ ID No 9到12显示。分离的克隆包含全长的编码区以及第一个推定的甲硫氨酸附近的序列，该序列显示了良好的共有翻译起始序列。

GRAB1和GRAB2蛋白的氨基酸序列分析揭示了一些惊人的特征。第一，虽然这两种蛋白在跨越它们170个N端残基的区内显示高度相关，可以检测到显著程度的同源性(58％)，但它们的C端部分是完全不相关的。有趣的是，带电荷的残基的分布并不是随机的。GRAB1和GRAB2的各自独特的C端域分别包含19％和15％的负电荷残基(D，E)，而它们相关的N端域包含很大比例的带电荷残基(分别是30％和33％)，显示对正电荷残基有少许偏倚(R，K，H；分别是18％和20％)

此外，RNA印迹分析揭示了具有各自预期的长度并具有分别编码GRAB1和GRAB2的潜力的mRNA的存在。两种mRNA在小麦培养细胞中都是少量存在，而在分化的细胞类型，也就是说根和叶中甚至更少。实施例2GRAB蛋白的N端介导与WDV RepA的结合

为鉴定GRAB蛋白中涉及与WDV RepA形成复合物的区，构建一系列的缺失并分析它们在酵母中与病毒RepA相互作用的能力。C端域的大部分缺失(在GRAB1中)或全部缺失(在GRAB2中)并不减弱GRAB-RepA的结合(图2)。甚至仅包含N端149个残基的截短的GRAB2蛋白仍然保留了显著的RepA结合能力(图2)。相反，相当小的GRAB1的N端缺失(80个氨基酸)或GRAB2的N端缺失(66个氨基酸)完全消除了相互作用(图2)。因此，可以得到结论：两种蛋白中存在的N端域赋予它们与WDV RepA形成复合体的能力。此外，GRAB蛋白的大部分N端区看起来对与WDV RepA形成复合体的贡献最大。实施例3WDV RepA的C端域介导与GRAB蛋白的相互作用

进行一个类似的缺失研究，鉴定WDV RepA蛋白中负责结合GRAB蛋白的序列。如图3所示，缺失RepA N端一半(约150残基)的大部分并不减弱其与GRAB蛋白相互作用的能力。然而，仅去除RepA的C端37个氨基酸残基就完全破坏了与GRAB1的结合以及与GRAB2的结合(图3)，表明RepA的这个小域包含对结合至关重要的残基。同时分析了GRAB与WDV Rep蛋白的相互作用，WDV Rep是另一种WDV早期蛋白，由编码RepA的同一种mRNA产生，但在此之前所述mRNA经过一次剪切(Schalk等人，1989)。这样一来，RepA和Rep的210个N端残基是相同的，但这两种病毒蛋白具有各不相同的C端域。与WDV RepA的C端介导与GRAB的结合的看法一致，WDV Rep不能与GRAB形成复合体。这些结果以及WDV RepA和Rep与ZmRb1的差示结合的数据(Xie等人，1989)强烈暗示RepA是一种独特的蛋白，有可能参与干扰细胞生理以创造利于病毒复制的细胞环境。

为确定并延伸酵母双杂种相互作用的结果，进行拆分(pull-down)实验评价使用纯化蛋白的相互作用。将等量的纯化GST-RepA(0.2μg)与体外翻译的(IVT)GST-GRAB1或GST-GRAB2温育后，从结合gluthation-琼脂糖珠粒的组分中回收了加入的35S-标记GRAB蛋白的组分(图4)。使用GST-GRAB1和GST-GRAB2以及IVT WDV RepA蛋白得到了相似的结果(图4)。因此，可以得到结论：GRAB蛋白和双生病毒RepA之间的相互作用可以在缺乏其它细胞蛋白的条件下发生。实施例4GRABmRNA的表达限于根和胚的小部分细胞

为获得GRAB蛋白在细胞内可能具有的功能的一些了解，通过原位杂交分析它们的表达模式。RNA分析表明GRAB转录物并不十分丰富(见图1)。GRABmRNA在根分生组织中的出现看起来限制于一小部分细胞。在S期细胞特有的组蛋白H4转录物中也观察到了相似的斑状模式(patch pattern)。具体地说，GRAB1的表达限于中柱内的部分细胞，并且实际上不存在于皮层细胞或表皮细胞。在一些根冠原始细胞中也检测到GRAB1 mRNA。在发育中的胚中观察到相似的情况。

总的来说，我们对于在不同生长条件下GRAB表达模式的分析使我们得出结论：GRAB1和GRAB2 mRNA的水平都是对培养物中的(可能)一个亚群细胞的生长信号的改变作出应答而升高，并且它们的水平很大程度上取决于营养可得性。此外，它们增强了以下看法：GRAB蛋白可以作为立即早期应答的一部分起不同作用，其中立即早期应答可能是将外部信号与细胞生长和/或分化的调节联系起来的转导途径的一部分。

这样，根据与RepA(植物双生病毒科一个成员WDV的Rb结合蛋白)形成复合体的能力，鉴定了一组植物蛋白。根据数据库检索的结果，我们得出结论：GRAB1和GRAB2不是任何已知蛋白的同系物，因此分离的cDNA编码以前未鉴定的蛋白。然而，该研究揭示：根据一级序列，它们在整个N端区是相关的。使用GRAB1或GRAB2的氨基酸序列，结果显示这些蛋白与几种功能未知的植物蛋白有显著的同源性。有趣的是，同源性也限于N端的前150-170个残基，正如开始在该组GRAB蛋白本身中所观察到的一样(图10A)。那些在图10A中显示的蛋白对应于在其它情况下明显不相关的蛋白。第一，两个拟南芥属(Arabidopsis)cDNA克隆ATAF1和ATAF2，根据它们在酵母中激活35S花椰菜花叶病毒(CAMV)启动子的能力而被分离(H.Hirt，个人通讯)。第二，SENU5 CDNA，在研究番茄的叶衰老中分离(GenbankAcc.No.)。第三，NAM蛋白，即矮牵牛属无顶端分生组织(nam)基因的产物，这种蛋白是芽顶端分生组织的正常发育所需的，已经有人提出这种蛋白决定分生组织的定位(Souer等人，1996)。实施例5GRAB1的表达诱导坏死表型

作为了解GRAB蛋白的细胞作用的第一步，我们测定了在N.Benthamiana植物中表达GRAB1或GRAB2的效果。为此目的，我们利用了一种基于马铃薯X病毒(PCX)的表达载体，这种载体在给定时间并在缺乏染色体效应的情况下保证高水平的系统表达[6]。该系统已经成功地用于分析瞬时表达的外源蛋白的效应[18，31，32]。

用体外转录的PVX RNA接种N.Benthamiana植物时，典型症状的出现(在接种后10天(dpi)特别明显)表明PVX表达载体与模拟接种的植株相比的有效扩增。由于GRAB1表达载体的高水平扩增，用PVX-GRAB1构建物接种的植物在接种后12天已经被系统感染。这已经被叶中PVX-GRAB1 RNA的水平所证实，这个水平与野生型PVX感染的植物中PVX RNA水平相当。有趣的是，所有表达高水平GRAB1的植物在接种后12天都显示有已发生衰退过程的趋势，正如它们老叶的形态学所揭示的。此外，一个明显的坏死区域出现在植株气生部分基部的附近，特别是在接种后28天。在该阶段，叶和根发育的显著退化也是明显的。为确定整株植物上观察到的效应是否依赖于全长GRAB1蛋白的表达，我们用一种PVX构建物接种植物，该构建物表达在N端附近带有一个移码突变的GRAB1 mRNA。这样，PVX-GRAB1^Fs包含一个在78位氨基酸带有一个移码突变的cDNA插入片段，该cDNA插入片段保留了两个最接近N端的保守区组(N1和N2)，并能够产生一个159个残基的截短的蛋白。GRAB1^Fs的表达并不产生任何在表达全长GRAB1蛋白的植物中观察到的效应。

用GRAB2构建物进行了一个相似的研究。用PVX-GRAB2构建物感染的植物在PVX载体的扩增中表现出延迟的动力学。这阻碍了接种后12天的GRAB2的高水平表达，并且植物具有与模拟接种的植物相似的形态。然而，接种之后较晚时，PVX载体以高水平积累。有趣的是，这些表达GRAB2的植物显示比用野生型PVX感染的植物更轻微的症状。没有一株发生在表达GRAB1的植物中观察到的衰退过程。我们还测试了表达GRAB2的截短形式的效应。在这种情况下，PVX-GRAB2^Fs产生了一个在33位氨基酸带有一个移码突变的GRAB2cDNA，这样就产生了一个50个氨基酸长的仅保留了最接近N端(N1)的同源区组的截短的GRAB2蛋白。用PVX-GRAB2^Fs构建物接种的植物具有高水平的PVX RNA和GRAB2^Fs RNA。总起来看，表达截短形式GRAB蛋白的结果表明，GRAB1对坏死区域的诱导和GRAB2对症状出现的延迟依赖于全长蛋白的表达，并且强烈暗示这些特定的结果可以由GRAB1和GRAB2蛋白各自独特的C端域介导。

图4所示的序列对比揭示了在这些相关的蛋白中几个高度保守的氨基酸基序的存在。这样，我们注意到了N端域中五个基序(N1到N5)的出现，这五个基序可以对应于对蛋白活性至关重要的区。其中两个最接近N端的基序(N1和N2)表现净负电荷，而其它基序带正电荷。根据我们的缺失分析，虽然N5并非绝对必需，而N1看起来贡献很大，但所有这些基序都是与WDV RepA的有效相互作用所需的(图3)。C端域虽然在该家族的各个蛋白的一级序列上是各自独特的，但都具有带高净负电荷的特性(15-20％的残基不是D就是E)。这在GRAB蛋白和两个ATAF成员中特别明显。本文报道的两种GRAB蛋白，特别是GRAB2，在它们的C端域具有一个富含Q的域，可能参与已经在其它实施例的情况中展示的转录调节。此外，用GRAB蛋白的N端作为查询，检索出从拟南芥属s和水稻的随机测序EST得到的一些部分cDNA(未显示)。令人惊讶的是，在该检索中没有检索出得自酵母或动物来源的蛋白序列。

这组蛋白的一个惊人的特性是具有一个看来在每一种中均出现的相关N端域的大量成员。例如，至少5个成员与NAM相关(Souer等人，1996)，至少7个成员与GRAB相关(本研究)。这样一种丰富性提出了问题：它们是否实际上具有不同的功能。一个已经针对一些NAM相关蛋白提出的可能性是在胚后期发育中它们在植物的不同位点具有丰余功能(Souer等人，1996)。

考虑到在PVX感染的植物中GRAB超量表达对症状出现的后果，有可能WDV和PVX共同具有目前未知的受GRAB影响的途径，虽然这些病毒科使用非常不同的复制策略。一种可替代的可能性是GRAB超量表达可能直接或间接地触发了一个通用的防御途径，或更简单地说，产生一种细胞环境，保护细胞免受其它类型的感染。实施例6GRAB蛋白在小麦培养细胞中的超量表达抑制WDV DNA复制

为进一步研究在与WDV RepA蛋白相互作用的基础上分离的GRAB蛋白的可能功能，我们测定了表达GRAB蛋白对双生病毒DNA表达的影响。该测定被证明可以用于评价植物Rb(ZmRb1)在病毒DNA复制中的影响[47]。这样，使用相似的策略，我们用下列质粒的组合共转染小麦培养细胞：(i)一个于35S CaMV启动子控制下表达GRAB1或GRAB2的质粒，所述质粒在所使用的小麦细胞中是活跃的[47]，(ii)第二种质粒，也是于35S CaMV启动子控制下表达病毒DNA的有效复制所必需的WDV蛋白(RepA和Rep)，以及(iii)第三种质粒(pWoriΔΔ)，为pWori的一种衍生物[43，46]，用于监测WDV DNA复制，可以在反式提供病毒蛋白时有效复制[35，47]。在小麦培养细胞中GRAB1或GRAB2的表达严重抑制WDV DNA的复制，而GRAB2显示作用更强。这些结果表明，在细胞培养条件下WDV DNA的复制受到GRAB蛋白的影响。

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序列表(1)一般资料

(i)申请人：

(A)姓名：CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS

(B)街道：SERRANO，113

(C)域市：马德里

(E)国家：西班牙

(F)邮政编码(ZIP)：28006

(A)姓名：CRISANTO GUTIERREZ-ARMENTA

(B)街道：CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR，CSIC-UAM

(C)城市：马德里

(E)国家：西班牙

(F)邮政编码(ZIP)：28049

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(B)街道：CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR，CSIC-UAM

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(E)国家：西班牙

(F)邮政编码(ZIP)：28049

(A)姓名：ANDRES SANZ-BURGOS

(B)街道：CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR，CSIC-UAM

(C)城市：马德里

(E)国家：西班牙

(F)邮政编码(ZIP)：28049

(ii)发明名称：植物GRAB蛋白

(iii)序列数：12

(iv)计算机可读形式

(A)媒体类型：软盘

(B)计算机：IBM兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/Ms-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0，版本#1.30(EPO)

(vi)在先申请数据

(A)申请号：ES 9701292

(B)申请日：1997年6月12日(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：459个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假说：无(iv)反义：否(vi)原始来源：

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(A)长度：462个碱基对

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(A)生物：栽培一粒小麦(ix)特征

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(A)长度：153个氨基酸

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20 25 30Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Trp Xaa Leu Pro Xaa

35 40 45Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Trp Tyr Phe Phe Xaa Xaa Xaa Xaa

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130 135 140Trp Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Lys145 150(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：

(A)长度：154个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(A)生物：栽培一粒小麦

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Leu Pro Xaa Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Tyr Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

20 25 30Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Trp Xaa Leu Pro Xaa

35 40 45Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Trp Phe Phe Phe Xaa Xaa Xaa Xaa

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(A)长度：459个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(A)生物：栽培一粒小麦(ix)特征

(G)名称/关键字：CDS

(H)位置：1..459(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：CTG CCG CCG GGG TTC CGG TTC CAC CCG ACG GAC GAG GAG CTG GTG GCG48Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Ala1 5 10 15GAC TAC CTC TGC GCG CGC GCG GCC GGC CGC GCG CCG CCG GTG CCC ATC96Asp Tyr Leu Cys Ala Arg Ala Ala Gly Arg Ala Pro Pro Val Pro Ile

20 25 30ATC GCC GAG CTC GAC CTC TAC CGG TTC GAC CCG TGG GAG CTC CCG GAG144Ile Ala Glu Leu Asp Leu Tyr Arg Phe Asp Pro Trp Glu Leu Pro Glu

35 40 45CGG GCG CTC TTC GGG GCG CGG GAG TGG TAC TTC TTC ACG CCG CGG GAC192Arg Ala Leu Phe Gly Ala Arg Glu Trp Tyr Phe Phe Thr Pro Arg Asp

50 55 60CGC AAG TAC CCC AAC GGC TCC CGC CCC AAC CGG GCC GCC GGG GGC GGC240Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn Arg Ala Ala Gly Gly Gly65 70 75 80TAC TGG AAG GCC ACC GGC GCC GAC AGG CCC GTG GCG CGC GCG GGC AGG288Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp Arg Pro Val Ala Arg Ala Gly Arg

85 90 95ACC GTC GGG ATC AAG AAG GCG CTC GTC TTC TAC CAC GGC AGG CCG TCG336Thr Val Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr His Gly Arg Pro Ser

100 105 110GCG GGG GTC AAG ACG GAC TGG ATC ATG CAC GAG TAC CGC CTC GCC GGC384Ala Gly Val Lys Thr Asp Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Ala Gly

115 120 125GCC GAC GGA CGC GCC GCC AAG AAC GGC GGC ACG CTC AGG CTT GAC GAA432Ala Asp Gly Arg Ala Ala Lys Asn Gly Gly Thr Leu Arg Leu Asp Glu

130 135 140TGG GTG CTC TGC CGC CTA TAC AAC AAG459Trp Val Leu Cys Arg Leu Tyr Asn Lys145 150(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：

(A)长度：153个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Ala1 5 10 15Asp Tyr Leu Cys Ala Arg Ala Ala Gly Arg Ala Pro Pro Val Pro Ile

20 25 30Ile Ala Glu Leu Asp Leu Tyr Arg Phe Asp Pro Trp Glu Leu Pro Glu

35 40 45Arg Ala Leu Phe Gly Ala Arg Glu Trp Tyr Phe Phe Thr Pro Arg Asp

50 55 60Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn Arg Ala Ala Gly Gly Gly65 70 75 80Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp Arg Pro Val Ala Arg Ala Gly Arg

85 90 95Thr Val Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr His Gly Arg Pro Ser

100 105 110Ala Gly Val Lys Thr Asp Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Ala Gly

115 120 125Ala Asp Gly Arg Ala Ala Lys Asn Gly Gly Thr Leu Arg Leu Asp Glu

130 135 140Trp Val Leu Cys Arg Leu Tyr Asn Lys145 150(2)SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征：

(A)长度：462个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(A)生物：栽培一粒小麦(ix)特征

(I)名称/关键字：CDS

(J)位置：1..462(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：CTT CCA CCG GGG TTC CGG TTC CAC CCC ACC GAC GAG GAG GTG GTC ACC48Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Val Val Thr

155 160 165CAC TAC CTC ACC CGC AAG GTC CTC CGC GAA TCC TTC TCC TGC CAA GTG96His Tyr Leu Thr Arg Lys Val Leu Arg Glu Ser Phe Ser Cys Gln Val170 175 180 185ATC ACC GAC GTC GAC CTC AAC AAG AAC GAG CCG TGG GAG CTC CCG GGC144Ile Thr Asp Val Asp Leu Asn Lys Asn Glu Pro Trp Glu Leu Pro Gly

190 195 200CTC GCG AAG ATG GGC GAG AAG GAG TGG TTC TTC TTC GCG CAC AAG GGT192Leu Ala Lys Met Gly Glu Lys Glu Trp Phe Phe Phe Ala His Lys Gly

205 210 215CGG AAG TAC CCG ACG GGG ACG CGC ACC AAC CGG GCG ACG AAG AAG GGG240Arg Lys Tyr Pro Thr Gly Thr Arg Thr Asn Arg Ala Thr Lys Lys Gly

220 225 230TAC TGG AAG GCG ACG GGG AAG GAC AAG GAG ATC TTC CGC GGC AAG GGC288Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys Asp Lys Glu Ile Phe Arg Gly Lys Gly

235 240 245CGG GAC GCC GTC CTT GTC GGC ATG AAG AAG ACG CTC GTC TTT TAC ACC336Arg Asp Ala Val Leu Val Gly Met Lys Lys Thr Leu Val Phe Tyr Thr250 255 260 265GGC CGC GCC CCC AGC GGC GGG AAG ACG CCG TGG GTG ATG CAC GAG TAC384Gly Arg Ala Pro Ser Gly Gly Lys Thr Pro Trp Val Met His Glu Tyr

270 275 280CGC CTC GAG GGC GAG CTG CCC CAT CGC CTT CCC CGC ACC GCC AAG GAC432Arg Leu Glu Gly Glu Leu Pro His Arg Leu Pro Arg Thr Ala Lys Asp

285 290 295GAT TGG GCT GTT TGC CGG GTG TTC AAC AAA462Asp Trp Ala Val Cys Arg Val Phe Asn Lys

300 305(2)SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特征：

(A)长度：154个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Val Val Thr1 5 10 15His Tyr Leu Thr Arg Lys Val Leu Arg Glu Ser Phe Ser Cys Gln Val

20 25 30Ile Thr Asp Val Asp Leu Asn Lys Asn Glu Pro Trp Glu Leu Pro Gly

35 40 45Leu Ala Lys Met Gly Glu Lys Glu Trp Phe Phe Phe Ala His Lys Gly

50 55 60Arg Lys Tyr Pro Thr Gly Thr Arg Thr Asn Arg Ala Thr Lys Lys Gly65 70 75 80Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys Asp Lys Glu Ile Phe Arg Gly Lys Gly

85 90 95Arg Asp Ala Val Leu Val Gly Met Lys Lys Thr Leu Val Phe Tyr Thr

100 105 110Gly Arg Ala Pro Ser Gly Gly Lys Thr Pro Trp Val Met His Glu Tyr

115 120 125Arg Leu Glu Gly Glu Leu Pro His Arg Leu Pro Arg Thr Ala Lys Asp

130 135 140Asp Trp Ala Val Cys Arg Val Phe Asn Lys145 150(2)SEQ ID NO：9的信息：(i)序列特征：

(A)长度：1090个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(A)生物：栽培一粒小麦(ix)特征

(K)名称/关键字：CDS

(L)位置：94..954(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：AATTCGGCAC GAGACAGTCC ACCACGCACG TGCAGCAGCA CCAGCGCCCG AGAATCCCAT60TCCCATCGAC GGAGAAGAAG AAGTGAAGAA ACA ATG GTG ATG GCA GCG GCG GAG114

Met Val Met Ala Ala Ala Glu

155 160CGG CGG GAC GCG GAG GCG GAG CTG AAC CTG CCG CCG GGG TTC CGG TTC162Arg Arg Asp Ala Glu Ala Glu Leu Asn Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe

165 170 175CAC CCG ACG GAC GAG GAG CTG GTG GCG GAC TAC CTC TGC GCG CGC GCG210His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Ala Asp Tyr Leu Cys Ala Arg Ala

180 185 190GCC GGC CGC GCG CCG CCG GTG CCC ATC ATC GCC GAG CTC GAC CTC TAC258Ala Gly Arg Ala Pro Pro Val Pro Ile Ile Ala Glu Leu Asp Leu Tyr

195 200 205CGG TTC GAC CCG TGG GAG CTC CCG GAG CGG GCG CTC TTC GGG GCG CGG306Arg Phe Asp Pro Trp Glu Leu Pro Glu Arg Ala Leu Phe Gly Ala Arg210 215 220 225GAG TGG TAC TTC TTC ACG CCG CGG GAC CGC AAG TAC CCC AAC GGC TCC354Glu Trp Tyr Phe Phe Thr Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser

230 235 240CGC CCC AAC CGG GCC GCC GGG GGC GGC TAC TGG AAG GCC ACC GGC GCC402Arg Pro Asn Arg Ala Ala Gly Gly Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala

245 250 255GAC AGG CCC GTG GCG CGC GCG GGC AGG ACC GTC GGG ATC AAG AAG GCG450Asp Arg Pro Val Ala Arg Ala Gly Arg Thr Val Gly Ile Lys Lys Ala

260 265 270CTC GTC TTC TAC CAC GGC AGG CCG TCG GCG GGG GTC AAG ACG GAC TGG498Leu Val Phe Tyr His Gly Arg Pro Ser Ala Gly Val Lys Thr Asp Trp

275 280 285ATC ATG CAC GAG TAC CGC CTC GCC GGC GCC GAC GGA CGC GCC GCC AAG546Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Ala Gly Ala Asp Gly Arg Ala Ala Lys290 295 300 305AAC GGC GGC ACG CTC AGG CTT GAC GAA TGG GTG CTC TGC CGC CTA TAC594Asn Gly Gly Thr Leu Arg Leu Asp Glu Trp Val Leu Cys Arg Leu Tyr

310 315 320AAC AAG AAG AAC CAG TGG GAG AAG ATG CAG CGG CAG CGG CAG GAG GAG642Asn Lys Lys Asn Gln Trp Glu Lys Met Gln Arg Gln Arg Gln Glu Glu

325 330 335GAG GCG GCG GCC AAG GCT GCG GCG TCA CAG TCG GTC TCC TGG GGT GAG690Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ser Gln Ser Val Ser Trp Gly Glu

340 345 350ACG CGG ACG CCG GAG TCC GAC GTC GAC AAC GAT CCG TTC CCG GAG CTG738Thr Arg Thr Pro Glu Ser Asp Val Asp Asn Asp Pro Phe Pro Glu Leu

355 360 365GAC TCG CTG CCG GAG TTC CAG ACG GCA AAC GCG TCA ATA CTG CCC AAG786Asp Ser Leu Pro Glu Phe Gln Thr Ala Asn Ala Ser Ile Leu Pro Lys370 375 380 385GAG GAG GTG CAG GAG CTG GGC AAC GAC GAC TGG CTC ATG GGG ATC AGC834Glu Glu Val Gln Glu Leu Gly Asn Asp Asp Trp Leu Met Gly Ile Ser

390 395 400CTC GAC GAC CTG CAG GGC CCC GGC TCC CTG ATG CTG CCC TGG GAC GAC882Leu Asp Asp Leu Gln Gly Pro Gly Ser Leu Met Leu Pro Trp Asp Asp

405 410 415TCC TAC GCC GCC TCG TTC CTG TCG CCG GTG GCC ACG ATG AAG ATG GAG930Ser Tyr Ala Ala Ser Phe Leu Ser Pro Val Ala Thr Met Lys Met Glu

420 425 430CAG GAC GTC AGC CCA TTC TTC TTC TGAGCTCTCA ATACTCTCAC GGTCGCACTG984Gln Asp Val Ser Pro Phe Phe Phe

435 440TTGTGTGCGG CGTAACTGTA GATAGTTCAC ATTTGTTCAG GATTTATTTG TAACGTTGCT1044TCTTTTATAC GATACTCTCT TCCTTTCTAA AAAAAAAAAA AAAAAA1090(2)SEQ ID NO：10的信息：(i)序列特征：

(A)长度：287个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Met Val Met Ala Ala Ala Glu Arg Arg Asp Ala Glu Ala Glu Leu Asn1 5 10 15Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Ala

20 25 30Asp Tyr Leu Cys Ala Arg Ala Ala Gly Arg Ala Pro Pro Val Pro Ile

35 40 45Ile Ala Glu Leu Asp Leu Tyr Arg Phe Asp Pro Trp Glu Leu Pro Glu

50 55 60Arg Ala Leu Phe Gly Ala Arg Glu Trp Tyr Phe Phe Thr Pro Arg Asp65 70 75 80Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn Arg Ala Ala Gly Gly Gly

85 90 95Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp Arg Pro Val Ala Arg Ala Gly Arg

100 105 110Thr Val Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr His Gly Arg Pro Ser

115 120 125Ala Gly Val Lys Thr Asp Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Ala Gly

130 135 140Ala Asp Gly Arg Ala Ala Lys Asn Gly Gly Thr Leu Arg Leu Asp Glu145 150 155 160Trp Val Leu Cys Arg Leu Tyr Asn Lys Lys Asn Gln Trp Glu Lys Met

165 170 175Gln Arg Gln Arg Gln Glu Glu Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ser

180 185 190Gln Ser Val Ser Trp Gly Glu Thr Arg Thr Pro Glu Ser Asp Val Asp

195 200 205Asn Asp Pro Phe Pro Glu Leu Asp Ser Leu Pro Glu Phe Gln Thr Ala

210 215 220Asn Ala Ser Ile Leu Pro Lys Glu Glu Val Gln Glu Leu Gly Asn Asp225 230 235 240Asp Trp Leu Met Gly Ile Ser Leu Asp Asp Leu Gln Gly Pro Gly Ser

245 250 255Leu Met Leu Pro Trp Asp Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Phe Leu Ser Pro

260 265 270Val Ala Thr Met Lys Met Glu Gln Asp Val Ser Pro Phe Phe Phe

275 280 285(2)SEQ ID NO：11的信息：(i)序列特征：

(A)长度：1295个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(A)生物：栽培一粒小麦(ix)特征

(M)名称/关键字：CDS

(N)位置：109..1161(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：ATTCGGCACG AGATCACCTC TAACATCTCG ATCTACCTCT TCCTCCTCCT CAGCTCTCGT60TCCATCAGGT TCTTCCACAG CGTAGCAAGG CAATCTAGTA GATCCTCC ATG TCG GAC117

Met Ser Asp

290GTG ACG GCG GTG ATG GAT CTG GAG GTG GAG GAG CCG CAG CTG GCG CTT165Val Thr Ala Val Met Asp Leu Glu Val Glu Glu Pro Gln Leu Ala Leu

295 300 305CCA CCG GGG TTC CGG TTC CAC CCC ACC GAC GAG GAG GTG GTC ACC CAC213Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Val Val Thr His

310 315 320TAC CTC ACC CGC AAG GTC CTC CGC GAA TCC TTC TCC TGC CAA GTG ATC261Tyr Leu Thr Arg Lys Val Leu Arg Glu Ser Phe Ser Cys Gln Val Ile

325 330 335ACC GAC GTC GAC CTC AAC AAG AAC GAG CCG TGG GAG CTC CCG GGC CTC309Thr Asp Val Asp Leu Asn Lys Asn Glu Pro Trp Glu Leu Pro Gly Leu

340 345 350GCG AAG ATG GGC GAG AAG GAG TGG TTC TTC TTC GCG CAC AAG GGT CGG357Ala Lys Met Gly Glu Lys Glu Trp Phe Phe Phe Ala His Lys Gly Arg355 360 365 370AAG TAC CCG ACG GGG ACG CGC ACC AAC CGG GCG ACG AAG AAG GGG TAC405Lys Tyr Pro Thr Gly Thr Arg Thr Asn Arg Ala Thr Lys Lys Gly Tyr

375 380 385TGG AAG GCG ACG GGG AAG GAC AAG GAG ATC TTC CGC GGC AAG GGC CGG453Trp Lys Ala Thr Gly Lys Asp Lys Glu Ile Phe Arg Gly Lys Gly Arg

390 395 400GAC GCC GTC CTT GTC GGC ATG AAG AAG ACG CTC GTC TTT TAC ACC GGC501Asp Ala Val Leu Val Gly Met Lys Lys Thr Leu Val Phe Tyr Thr Gly

405 410 415CGC GCC CCC AGC GGC GGG AAG ACG CCG TGG GTG ATG CAC GAG TAC CGC549Arg Ala Pro Ser Gly Gly Lys Thr Pro Trp Val Met His Glu Tyr Arg

420 425 430CTC GAG GGC GAG CTG CCC CAT CGC CTT CCC CGC ACC GCC AAG GAC GAT597Leu Glu Gly Glu Leu Pro His Arg Leu Pro Arg Thr Ala Lys Asp Asp435 440 445 450TGG GCT GTT TGC CGG GTG TTC AAC AAA GAC TTG GCG GCG AGG AAT GCG645Trp Ala Val Cys Arg Val Phe Asn Lys Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ala

455 460 465CCC CAG ATG GCG CCG GCG GCC GAC GGT GGC ATG GAG GAC CCG CTC GCC693Pro Gln Met Ala Pro Ala Ala Asp Gly Gly Met Glu Asp Pro Leu Ala

470 475 480TTC CTC GAT GAC TTG CTC ATC GAC ACC GAC CTG TTC GAC GAC GCG GAC741Phe Leu Asp Asp Leu Leu Ile Asp Thr Asp Leu Phe Asp Asp Ala Asp

485 490 495CTG CCG ATG CTC ATG GAC TCT CCG TCT GGC GCT GAC GAC TTC GCC GGC789Leu Pro Met Leu Met Asp Ser Pro Ser Gly Ala Asp Asp Phe Ala Gly

500 505 510GCT TCG AGC TCC ACC TGC AGC GCG GCC CTG CCG CTT GAG CCG GAC GCG837Ala Ser Ser Ser Thr Cys Ser Ala Ala Leu Pro Leu Glu Pro Asp Ala515 520 525 530GAG CTA CCG GTG CTG CAT CCG CAG CAG CAG CAG AGC CCC AAC TAC TTC885Glu Leu Pro Val Leu His Pro Gln Gln Gln Gln Ser Pro Asn Tyr Phe

535 540 545TTC ATG CCG GCG ACG GCC AAC GGC AAT CTT GGC GGC GCC GAG TAC TCA933Phe Met Pro Ala Thr Ala Asn Gly Asn Leu Gly Gly Ala Glu Tyr Ser

550 555 560CCC TAC CAG GCT ATG GGG GAC CAG CAG GCC GCG ATC CGC AGG TAC TGC981Pro Tyr Gln Ala Met Gly Asp Gln Gln Ala Ala Ile Arg Arg Tyr Cys

565 570 575AAG CCG AAG GCG GAG GTA GCG TCT TCG TCG GCG CTG CTG AGC CCT TCG1029Lys Pro Lys Ala Glu Val Ala Ser Ser Ser Ala Leu Leu Ser Pro Ser

580 585 590CTG GGC TTG GAC ACG GCG GCG CTT GCC GGC GCG GAG ACC TCC TTC CTG1077Leu Gly Leu Asp Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Glu Thr Ser Phe Leu595 600 605 610ATG CCG TCA TCG CGG TCG TAC CTC GAT CTG GAG GAG CTG TTC CGG GGC1125Met Pro Ser Ser Arg Ser Tyr Leu Asp Leu Glu Glu Leu Phe Arg Gly

615 620 625GAG CCT CTC ATG GAC TAC TCC AAC ATG TGG AAG ATC TGATGTGGAA1171Glu Pro Leu Met Asp Tyr Ser Asn Met Trp Lys Ile

630 635GATCTGGAGC GTCTCAGTTT GCTGGTAGCT ATAGATGGGT ATTTGGTTGA TGCTAGCTCT1231TCGACTGATT AGTTGCTTCA TTAACTTTCG ATTAAGGATT GAGTTAAAAA AAAAAAAAAA1291AAAA1295(2)SEQ ID NO：12的信息：(i)序列特征：

(A)长度：351个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：Met Ser Asp Val Thr Ala Val Met Asp Leu Glu Val Glu Glu Pro Gln1 5 10 15Leu Ala Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Val

20 25 30Val Thr His Tyr Leu Thr Arg Lys Val Leu Arg Glu Ser Phe Ser Cys

35 40 45Gln Val Ile Thr Asp Val Asp Leu Asn Lys Asn Glu Pro Trp Glu Leu

50 55 60Pro Gly Leu Ala Lys Met Gly Glu Lys Glu Trp Phe Phe Phe Ala His65 70 75 80Lys Gly Arg Lys Tyr Pro Thr Gly Thr Arg Thr Asn Arg Ala Thr Lys

85 90 95Lys Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys Asp Lys Glu Ile Phe Arg Gly

100 105 110Lys Gly Arg Asp Ala Val Leu Val Gly Met Lys Lys Thr Leu Val Phe

115 120 125Tyr Thr Gly Arg Ala Pro Ser Gly Gly Lys Thr Pro Trp Val Met His

130 135 140Glu Tyr Arg Leu Glu Gly Glu Leu Pro His Arg Leu Pro Arg Thr Ala145 150 155 160Lys Asp Asp Trp Ala Val Cys Arg Val Phe Asn Lys Asp Leu Ala Ala

165 170 175Arg Asn Ala Pro Gln Met Ala Pro Ala Ala Asp Gly Gly Met Glu Asp

180 185 190Pro Leu Ala Phe Leu Asp Asp Leu Leu Ile Asp Thr Asp Leu Phe Asp

195 200 205Asp Ala Asp Leu Pro Met Leu Met Asp Ser Pro Ser Gly Ala Asp Asp

210 215 220Phe Ala Gly Ala Ser Ser Ser Thr Cys Ser Ala Ala Leu Pro Leu Glu225 230 235 240Pro Asp Ala Glu Leu Pro Val Leu His Pro Gln Gln Gln Gln Ser Pro

245 250 255Asn Tyr Phe Phe Met Pro Ala Thr Ala Asn Gly Asn Leu Gly Gly Ala

260 265 270Glu Tyr Ser Pro Tyr Gln Ala Met Gly Asp Gln Gln Ala Ala Ile Arg

275 280 285Arg Tyr Cys Lys Pro Lys Ala Glu Val Ala Ser Ser Ser Ala Leu Leu

290 295 300Ser Pro Ser Leu Gly Leu Asp Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Glu Thr305 310 315 320Ser Phe Leu Met Pro Ser Ser Arg Ser Tyr Leu Asp Leu Glu Glu Leu

325 330 335Phe Arg Gly Glu Pro Leu Met Asp Tyr Ser Asn Met Trp Lys Ile

340 345 350

权利要求书

1.控制植物细胞周期的方法，其特征在于包括在植物细胞中提高或降低GRAB(双生病毒RepA结合)蛋白或肽的水平或其双生病毒RepA结合能力，特征在于所述GRAB蛋白或肽包含本文图5所示的N1、N2、N3、N4和N5域，具有SEQ ID No 3和SEQ ID 4所示的指定氨基酸。

2.权利要求1所要求保护的方法，其特征在于对植物细胞周期的控制包括对植物细胞或植物病毒生长和/或复制、植物细胞分化、发育和/或衰老的一种或多种控制。

3.前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，其中所述GRAB蛋白或肽具有能结合病毒RepA蛋白的前150个N端氨基酸。

4.前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，其特征在于所述GRAB蛋白或肽包含如本文所示的氨基酸序列SEQ ID No 3或4或其能够结合双生病毒RepA的功能性变异体。

5.前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，其特征在于包括在植物细胞中超量产生或过低产生所述蛋白或肽。

6.权利要求1到5中任何一项所要求保护的方法，其特征在于包括通过应用一种结合GRAB蛋白或肽的因子而降低天然GRAB的结合活性。

7.前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，其特征在于所述GRAB蛋白或肽的氨基酸序列与SEQ ID No 3或4的氨基酸序列有至少70％的同源性。

8.前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，包括将相应的GRAB蛋白或肽的编码核苷酸或反义核苷酸放入所述植物细胞。

9.权利要求8所要求保护的方法，其特征在于所述核苷酸是重组核酸的形式，包含GRAB蛋白或肽的编码序列。

10.权利要求9所要求保护的方法，其特征在于所述序列置于一个启动子之后，所述启动子能够支持GRAB蛋白或肽的表达或反义RNA的产生。

11.权利要求1到10中任何一项所要求保护的方法，其特征在于所述蛋白或肽异位应用或产生。

12.权利要求11所要求保护的方法，其特征在于所述组织是营养组织或茎组织。

13.前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，包括在所述细胞内表达能结合GRAB蛋白或肽的蛋白或肽或其功能性变异体。

14.任一前述权利要求所要求保护的方法，其特征在于包括通过基因沉默共表达或通过反义策略负调节天然GRAB的表达。

15.前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，其特征在于包括在植物细胞中产生或抑制衰老，其中包括提高或降低植物细胞中GRAB蛋白或肽的水平或活性，其中所述GRAB蛋白或肽包含SEQ IDNo 10的序列或其能在N.bentamiana植物中诱导衰老的功能性变异体。

16.权利要求15所要求保护的方法，包括引入核酸，所述核酸编码RepA、N端截短的RepA或它们其中之一的功能性变异体。

17.GRAB蛋白或肽本身、或浓缩、分离、无细胞和/或重组产生形式的GRAB蛋白或肽，所述GRAB蛋白或肽包含本文图5所示的N1、N2、N3、N4和N5域，具有SEQ ID No 3和SEQ ID 4所示的指定氨基酸，前提条件是所述蛋白或肽不是SENU、NAM、ATAF1或ATAF2的其中之一。

18.权利要求17所要求保护的蛋白或肽，其特征在于其N端序列与本文所述的GRAB1或GRAB2或其保守取代变异体的前150个N端氨基酸有90％或更多的同源性。

19.权利要求17所要求保护的GRAB蛋白或肽，其特征在于它包含如所示的SEQ ID No 3或4或其功能性变异体的氨基酸序列，所述功能性变异体的氨基酸序列与所述序列有至少70％的同源性，且能够结合双生病毒RepA。

20.权利要求19所要求保护的蛋白或肽，其特征在于包含SEQID No 6或8或其功能性变异体的氨基酸序列，所述功能性变异体的氨基酸序列与所述序列有至少70％的同源性。

21.权利要求20所要求保护的蛋白或肽，其特征在于包含如所示的SEQ ID No 10或12或其功能性变异体的氨基酸序列，所述功能性变异体的氨基酸序列与所述序列有至少70％的同源性。

22.GRAB蛋白或肽的编码核酸或反义核酸本身，或浓缩、分离、无细胞和/或重组形式的GRAB蛋白或肽的编码核酸或反义核酸，所述GRAB蛋白或肽包含本文图5所示的N1、N2、N3、N4和N5域，具有SEQ ID No 3和SEQ ID 4所示的指定氨基酸，前提条件是所述核酸或反义核酸不编码SENU、NAM、ATAF1或ATAF2的全长氨基酸序列。

23.权利要求22的核酸，其特征在于它是重组DNA或cRNA(mRNA)形式，编码用于GRAB蛋白或肽的表达，所述GRAB蛋白或肽的N端序列与本文所述的GRAB1或GRAB2的前200个N端氨基酸有至少60％同源性。

24.权利要求23所要求保护的核酸，其特征在于它是DNA或RNA多核苷酸，包含SEQ ID No 1、2、5、7、9或11中的一个或多个序列或其功能性变异体。

25.权利要求18到23中任何一项所要求保护的产生蛋白或肽的方法，其特征在于包括表达如权利要求23或24所述的DNA或RNA。

26.核酸探针或引物，其特征在于包含与以下序列的任意15个或更多连续碱基互补的序列的寡核苷酸或多核苷酸：本文以下鉴定为SEQ ID No 5、7、9或11的DNA序列、或互补序列、或与它们对应的RNA序列。

27.核酸转化载体，其特征在于它包含如权利要求8到16或22到24中任何一项所述的DNA或RNA。

28.一种方法，用于产生包含如权利要求8到16或22到24中任何一项所述或所要求保护的核酸的转化细胞，所述方法包括将所述核酸由载体或以游离形式引入所述细胞。

29.权利要求28所要求保护的方法，特征在于所述核酸通过电穿孔或粒子轰击直接引入。

30.包含重组核酸的细胞，所述重组核酸如权利要求8到16或22到24中任何一项所述或声明。

31.包含如权利要求30所要求保护的细胞的转基因植物或其部分。

32.一种质粒，包含编码本文所述的GRAB蛋白GRAB1和GRAB2表达的DNA，所述质粒已经按照1977年国际承认微生物保存布达佩斯条约的规定保藏；这些质粒于1997年6月11日在西班牙典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CECT 4889和CECT 4890。

Claims

1.控制植物细胞周期的方法，其特征在于包括在植物细胞中提高或降低GRAB(双生病毒RepA结合)蛋白或肽的水平或其双生病毒RepA结合能力。

3.权利要求1或2所要求保护的方法，其特征在于所述GRAB蛋白或肽包含如本文图4所示的N1、N2、N3、N4和N5域。

4.前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，其中所述GRAB蛋白或肽具有能结合病毒RepA蛋白的前150个N端氨基酸。

5.前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，其特征在于所述GRAB蛋白或肽包含如本文所示的氨基酸序列SEQ ID No 3或4或其能够结合双生病毒RepA的功能性变异体。

6.前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，其特征在于包括在植物细胞中超量产生或过低产生所述蛋白或肽。

7.权利要求1到6中任何一项所要求保护的方法，其特征在于包括通过应用一种结合GRAB蛋白或肽的因子而降低天然GRAB的结合活性。

8.前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，其特征在于所述GRAB蛋白或肽的氨基酸序列与SEQ ID No 3或4的氨基酸序列有至少70％的同源性。

9.前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，包括将相应的GRAB蛋白或肽的编码核苷酸或反义核苷酸放入所述植物细胞。

10.权利要求9所要求保护的方法，其特征在于所述核苷酸是重组核酸的形式，包含GRAB蛋白或肽的编码序列。

11.权利要求10所要求保护的方法，其特征在于所述序列置于一个启动子之后，所述启动子能够支持GRAB蛋白或肽的表达或反义RNA的产生。

12.权利要求1到11中任何一项所要求保护的方法，其特征在于所述蛋白或肽异位应用或产生。

13.权利要求12所要求保护的方法，其特征在于所述组织是营养组织或茎组织。

14.前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，包括在所述细胞内表达能结合GRAB蛋白或肽的蛋白或肽或其功能性变异体。

15.任一前述权利要求所要求保护的方法，其特征在于包括通过基因沉默共表达或通过反义策略负调节天然GRAB的表达。

16.前述权利要求中任何一项所要求保护的方法，其特征在于包括在植物细胞中产生或抑制衰老，其中包括提高或降低植物细胞中GRAB蛋白或肽的水平或活性，其中所述GRAB蛋白或肽包含SEQ IDNo 10的序列或其能在N.bentamiana植物中诱导衰老的功能性变异体。

17.权利要求16所要求保护的方法，包括引入核酸，所述核酸编码RepA、N端截短的RepA或它们其中之一的功能性变异体。

18.GRAB蛋白或肽本身、或浓缩、分离、无细胞和/或重组产生形式的GRAB蛋白或肽，前提条件是所述蛋白或肽不是SENU、NAM、ATAF1或ATAF2的其中之一。

19.权利要求18所要求保护的蛋白或肽，其特征在于其N端序列与本文所述的GRAB1或GRAB2或其保守取代变异体的前150个N端氨基酸有90％或更多的同源性。

20.权利要求18所要求保护的GRAB蛋白或肽，其特征在于它包含如所示的SEQ ID No 3或4或其功能性变异体的氨基酸序列，所述功能性变异体的氨基酸序列与所述序列有至少70％的同源性，且能够结合双生病毒RepA。

21.权利要求20所要求保护的蛋白或肽，其特征在于包含SEQID No 6或8或其功能性变异体的氨基酸序列，所述功能性变异体的氨基酸序列与所述序列有至少70％的同源性。

22.权利要求21所要求保护的蛋白或肽，其特征在于包含如所示的SEQ ID No 10或12或其功能性变异体的氨基酸序列，所述功能性变异体的氨基酸序列与所述序列有至少70％的同源性。

23.GRAB蛋白或肽的编码核酸或反义核酸本身，或浓缩、分离、无细胞和/或重组形式的GRAB蛋白或肽的编码核酸或反义核酸，前提条件是所述核酸或反义核酸不编码SENU、NAM、ATAF1或ATAF2的全长氨基酸序列。

24.权利要求23的核酸，其特征在于它是重组DNA或cRNA(mRNA)形式，编码用于GRAB蛋白或肽的表达，所述GRAB蛋白或肽的N端序列与本文所述的GRAB1或GRAB2的前200个N端氨基酸有至少60％同源性。

25.权利要求24所要求保护的核酸，其特征在于它是DNA或RNA多核苷酸，包含SEQ ID No 1、2、5、7、9或11中的一个或多个序列或其功能性变异体。

26.权利要求18到23中任何一项所要求保护的产生蛋白或肽的方法，其特征在于包括表达如权利要求24或25所述的DNA或RNA。

27.核酸探针或引物，其特征在于包含与以下序列的任意15个或更多连续碱基互补的序列的寡核苷酸或多核苷酸：本文以下鉴定为SEQ ID No 5、7、9或11的DNA序列、或互补序列、或与它们对应的RNA序列。

28.核酸转化载体，其特征在于它包含如权利要求9到17或23到25中任何一项所述的DNA或RNA。

29.一种方法，用于产生包含如权利要求9到17或23到25中任何一项所述或所要求保护的核酸的转化细胞，所述方法包括将所述核酸由载体或以游离形式引入所述细胞。

30.权利要求29所要求保护的方法，特征在于所述核酸通过电穿孔或粒子轰击直接引入。

31.包含重组核酸的细胞，所述重组核酸如权利要求9到17或23到25中任何一项所述或声明。

32.包含如权利要求31所要求保护的细胞的转基因植物或其部分。

33.一种质粒，包含编码本文所述的GRAB蛋白GRAB 1和GRAB 2表达的DNA，所述质粒已经按照1977年国际承认微生物保存布达佩斯条约的规定保藏；这些质粒于1997年6月11日在西班牙典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CECT 4889和CECT 4890。