KR20030006794A - 써머스 칼도필러스 지케이 24 유래의 내열성파이로포스파타제 유전자 및 그의 아미노산 서열 - Google Patents

Abstract

본 발명은 써머스 칼도필러스 GK24 (Thermus caldophilus GK24) 유래의 내열성 파이로포스파타제 (pyrophosphatase)에 관한 것으로서, 써머스 칼도필러스 GK24로부터 유래하는 내열성 파이로포스파타제를 코딩하는 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열에 관한 것이다. 본 발명자들은 써머스 써머필러스 HB8 (Thermus thermophilus HB8)의 파이로포스파타제 (이하 ‘Tth Ppase'라 함)의 유전자를 프로브로 사용하여 써머스 칼도필러스 GK24에서 써머스 칼도필러스 GK24의 파이로포스파타제 (이하 ‘Tca Ppase'라 함)의 유전자를 클로닝하고, 클로닝된 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정한 결과, Tca Ppase 유전자는 종지코돈을 포함하여 총 528 bp이며, 175개의 아미노산으로 구성된 단백질을 코딩하는 것으로 확인되었다. 또한 이 Tca Ppase 유전자는 대장균에서 발현시킨 후, 정제하여 특성을 조사하였다.

본 발명의 Tca Ppase는 DNA 씨퀀싱(sequencing)의 효율 증진과 PCR (polymerase chain reaction)에 의한 DNA 증폭 효율을 높이기 위해 내열성 DNA 중합효소와 함께 각종 유전공학연구 및 유전병 진단 등에 유용하게 활용된다.

Description

써머스 칼도필러스 지케이 24 유래의 내열성 파이로포스파타제 유전자 및 그의 아미노산 서열 {A Gene Coding for Thermostable Pyrophosphatase from Thermus caldophilus GK24 and Amino Acid Sequence Deduced Therefrom}

본 발명은 써머스 칼도필러스 GK24(Taguch, H. et al ., J. Biochem.91, 1343-1348(1982))유래의 내열성 파이로포스파타제 (pyrophosphatase)에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 써머스 칼도필러스 GK24 유래의 내열성 파이로포스파타제를 코딩하는 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열에 관한 것이다.

파이로포스파타아제 (Inoranic pyrophosphatase, 이하, ‘Ppase'라 함)는 파이로포스페이트를 포스페이트로 가수분해를 촉매하는 효소이다 (Lahti, R., Microbiol. Rev. 47: 169-179 (1983)). Ppase는 박테리아, 효모, 식물 등에 폭넓게 분포하고 있는 효소로써 활성을 나타내기 위해서는 Mg2+등을 비롯한 2가 양이온이 필요하다. Ppase는 대장균을 비롯한 효모나 기타 다른 종에서 활발히 연구되고 있는 효소의 한 종류로써 세포의 에너지 대사와 관련하여 매우 중요한 역할을 하는 효소이다.

Ppase의 활성부위(active site) 구조나 촉매 기작은 여러 종에서 매우 잘 보존되어 있고, 촉매는 인산화된 효소(phsphorylated enzyme)의 생성 없이 진행되며 높은 활성을 갖기 위해서는 2가 양이온이 반드시 필요하다.

이러한 Ppase는 분자생물학 연구에 있어 염기서열을 결정하는 DNA염기서열검정(DNA sequencing)이나, PCR에 의한 DNA 증폭시에 DNA 중합효소와 함께 사용하므로써 DNA 중합반응에 의해 생성되는 파이로포스페이트를 쉽게 제거시키므로서 반응 효율을 높일 수 있기 때문에 산업적으로 유용하다. 실제로 DNA 씨퀀싱에 DNA 중합효소와 Ppase를 함께 사용하여 파이로포스포롤리시스(로pyrophosphorolysis)에 의한 터미네이션 피크( termination peak)의 탈락을 방지하여 씨퀀싱 효율을 높인 결과가 보고되어 있다 (참조: Tabor, S. and Richardson, C. C., J. Biol. Chem., 265: 8322-8328 (1990)).

그러나, 종래의 Ppase들은 대부분 중온균 유래의 효소이므로 고온에서 반응시키는 DNA 씨퀀싱이나, PCR에서 쉽게 활성을 잃어버린다. 따라서 고온에서 안정한 내열성 Ppase가 필요하게 되었다. 현재까지 보고된 내열성 Ppase에 대한 연구로는 주로 70-75℃에서 생육하는 써머스(Thermus) 속에서, 특히 써머스 써머필러스 (Thermus thermophilus) HB8 등에서 상세히 보고되었다 (Satoh, T., et al., J.Biochem. 124: 79-88 (1988)).

그러나, 중온균들로부터 생성되는 Ppase의 연구에 비하여, 내열성 유래의 Ppase에 관한 연구는 미미할 정도이다. 따라서 써머스속에서 고온에 안정하고 반응성이 좋은 새로운 내열성 Ppase를 개발하여야할 필요성이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 써머스 속에서 고온에 안정하고 반응성이 좋은 Ppase를 개발하는데 있어 기존의 Ppase와는 다른 새로운 내열성 Ppase를 코딩하는 유전자를 분리하고자 연구 노력한 결과, 써머스 칼도필러스 GK24 (Thermus caldophilus)로부터 내열성 Ppase 유전자를 분리한 데 이어, 전기 유전자의 염기서열과 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정하여 종래의 Ppase와는 상이한 염기서열을 가지는 새로운 효소임을 확인하고, 또 대장균에서 전기 유전자를 발현시킨 후, 열처리 등의 방법으로 정제하여 특성을 조사한 결과 내열성을 갖는 Tca Ppase임을 다시 한번 확인하게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 써머스 칼도필러스 GK24 (Thermus caldophilus)로 부터 유래하는 새로운 내열성 Ppase를 코딩하는 유전자 서열과 그 서열로부터 유추되는 아미노산 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기의 유전자를 이용하여 유전공학 기술에 의한 대량생산이 가능하게 하여 보다 저렴한 가격으로 상기 효소의 다양한 활용을 가능하게 하는데 있다.

도 1의 (A)는 써머스 칼도필러스 GK24 염색체 DNA를 BamHI, HindIII, SacI의 제한효소를 절단하여 전기 영동한 결과이다. (B)는 써머스 서머필러스 HB8의 파이로포스파타제 (이하 ‘Tth Ppase'라 함) 유전자를 프로브로 사용하여 BamHI, HindIII, SacI의 제한효소를 처리하여 아가로스 젤 전기영동한 써머스 칼도필러스 GK24 염색체 DNA를 하이브리다이제이션을 한 결과이다. 도 1에서 lane B는 BamHI , lane H는 HindIII, lane S는 SacI으로 절단한 것을 각각 나타낸다.

도 2는 써머스 칼도필러스 GK24의 파이로포스타제 (이하 ‘Tca Ppase’라 함)의 유전자를 포함하고 있는 1.5kb BamHI 절단 DNA 단편이 삽입된 클론의 제한효소 지도를 나타낸다.

도 3은 Tca Ppase의 아미노산 서열을 다른 종의 Ppase의 아미노산 서열과 비교하여 나타낸 것이다. 아퀴펙스 에오리쿠스의 Ppase는 Aae, 대장균의 Ppase는 Eco로 각각 나타내었으며, 박스부분은 아미노산 서열 보존부위이다.

도 4는 Tca Ppase 유전자를 발현 벡터에 클로닝하여 대장균에서 Tca Ppase 생산을 위한 재조합 플라스미드 pTIPP를 구축한 그림이다.

도 5는 Tca Ppase를 정제단계별로 SDS-PAGE 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

도 6은 정제된 Tca Ppase의 온도에 따른 상대적인 활성을 나타내는 그래프이다.

도 7은 정제된 Tca Ppase의 pH에 따른 상대적인 활성을 나타내는 그래프이다.

도 8은 정제된 Tca Ppase의 2가 양이온들에 따른 상대적인 활성을 나타낸 도표이다.

본 발명자들은 이미 염기서열이 결정된 써머스 서머필러스 HB8 (Thermus thermophilus HB8)의 Tth Ppase 유전자를 코딩하고 있는 부위의 5‘말단과 3’말단의 프라이머를 제작한 후 PCR을 이용해 Tth Ppase유전자를 증폭시킨후, Tca Ppase유전자를 찾기 위한 프로브로 사용하였다. 먼저 써머스 칼도필러스 GK24 (Thermus caldophilus)의 제노믹 DNA를 여러가지 제한효소를 처리하여 전기영동한 후, 전기의 프로브로 하이브리다이제이션(hybridization)을 수행한 결과, 약 1.5kb의 BamHI 절단단편과 약 0.8kb의 SacI 절단단편에서 프로브와 하이브리다이제이션하는 시그널(signal)을 확인하였다. 전기의 BamHI의 2kb와 SacI의 약 0.8kb절편을 각각 클로닝하여, 전체 Tca Ppase 유전자를 클로닝하고, 염기서열을 결정 한 다음 , 컴퓨터 프로그램인 피씨진(PCGENE) 및 NCBI-블라스트 서치(NCBI-blast search)로 분석하여, Tca Ppase 유전자임을 확인하였다. Tca Ppase 유전자는 총 528bp (종지코돈 포함 531bp)의 염기서열을 포함하는 Tca Ppase 유전자의 리딩프레임(reading frame)으로 구성되었고, 전기의 염기서열로부터 유추되는 아미노산서열은 175개의 아미노산으로 구성된 단백질을 코딩하는 것으로 확인되었다.

본 발명자들은 결정된 Tca Ppase 유전자의 염기서열로부터 5‘-말단 및 3’-말단 염기서열에 각각 상보적인 프라이머를 합성하여 PCR 방법으로 Tca Ppase 유전자를 증폭시켜, 발현벡터 pJR에 클로닝하여 Tca Ppase 생산을 위한 재조합 플라스미드 pTIPP를 구축하였다. 이 플라스미드를 대장균에 형질전환시킨 후, 대장균에서 가장 많이 Tca Ppase가 발현되는 콜로니를 선별하였다. 대장균에서 발현된 Tca Ppase를 열처리와 DEAE-sephacel을 이용하여 정제한 후, 여러 가지 특성을 조사하였다. Tca Ppase의 SDS-PAGE에서 결정한 분자량은 약 22,500달톤(Da)이였다. 최적온도는 75-85℃에 이르기가지 넓은 범위에서 활성을 나타내었으며, pH도 6.8에서 8.8에 이르기가지 넓게 활성을 지녔지만 그 중 pH 8.4에서 가장 높은 활성을 보였다. 최적활성을 위해서는 마그네슘이나 코발트, 아연 등의 2가 양이온은 반드시 필요로 하며 이들의 최적농도는 1 mM정도이다.

한편, 전기의 Tca Ppase 유전자는 다른 종의 Ppase의 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, Tca Ppase가 다른 종들로부터 유래한 Ppase들과는 상이한 아미노산 서열을 지니고 있는 새로운 Ppase임이 확인되었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하고자 한다.

이들 실시에는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예1: 써머스 써머필러스 GK24 제노믹 DNA분리

제노믹 DNA분리는 마머(Marmur)의 방법을 다음과 같이 약간 변형하여 수행하였다 (참조: Marmur, J., J. Mol. Biol., 3: 208-218 (1961)). 200㎖의 진탕배양한균체를 원심분리로 회수하고 SETB(20% sucrose/50mM Tris-HCl(pH7.6)/50mM EDTA) 완충용액(buffer) 4㎖로 현탁시켜 5회 동결(freezing)과 해동(thawing)으로 세포막을 약화 시킨 후 최종 10㎎/㎖로 라이조자임(lysozyme)과 100㎍/㎖의 RNase A를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 여기에 3㎖의 크롤로포름/이소아밀알콜(chloroform/isoamylalchol)(24:1) 을 첨가하여 37℃에서 하룻밤 천천히 진탕(shaking)하고 TE포화 페놀(phenol) 및 chloroform/isoamylalchol로 DNA를 추출하여 1/10배의 3M 소디움아세테이트(sodium acetate)(pH5.2)와 2배의 에탄올을 가하여 DNA를 추출하였다. 추출한 제노믹 DNA를 70% 에탄올로 3회 세정(washing)하여 진공건조시킨 후 TE (10mM Tris-HCl (pH7.6)/1mM EDTA) 완충용액(buffer)으로 녹이고 100㎍/㎖로 프로티나아제(proteinase) K를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응 후 페놀(phenol)로 추출하고 에탄올 침전을 하여 TE buffer(완충용액)에 녹인 후 광학밀도(O.D) 260nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하여 사용하였다.

실시예2 : 서던 블롯 하이브리다이제이션

써머스 써머필러스 GK24의 제노믹 DNA로부터 Tca Ppase 유전자를 선별하기 위한 서던블롯의 프로브로 사용하고자, 이미 전체 염기서열이 결정된 써머스 써머필러스 HB8 제노믹 DNA를 이용하였다. 전기의 제노믹 DNA와 Tth Ppase유전자를 코딩하고 있는 부위의 5‘말단과 3’말단의 프라이머를 합성하여 PCR 방법으로 TthPpase유전자를(참조: 유전자은행(GenBank) 번호 AB010580)를 증폭하였다.

전기의 증폭된 Tth Ppase유전자의 방사선 동위원소의 라벨링은 베링거 만하임사(Boehringer mannheim)의 랜덤 프라임드 디엔에이 레이블링 키트(random primed DNA labelling kit)을 이용하였다. 전기의 증폭된 Tth Ppase유전자 0.25 ug을 100℃에서 5분간 끓인 후 얼음에서 급냉시켜 3㎕ dATP, dGTP, dTTP 혼합물(mixture)를 3㎕, 반응 혼합물(reaction mixture)를 2㎕, 50μCi［α-32P］dCTP 6㎕첨가하여 최종 볼륨이 20㎕가 되게 하여 여기에 1 ㎕ 클레노우 엔자임(Klenow enzyme)을 넣어 37℃에서 16시간 반응시켜 표지하고 세파덱스 G-25 미니컬럼(Sephadex G-25 mini-column)으로 미반응의 [α-32P］dCTP를 제거한 후, 프로브로 이용하였다. 전기에서와 같이 분리한 써머스 써머필러스 GK24의 제노믹 DNA를 BamHI, HindIII, SacI 제한효소로 각각 처리하고 0.7% 아가로오스 젤에 전기영동하여 분리한 다음 UV 램프하에서 사진을 찍었다 (참조: 도 1 (A)). 도 1에서 lane B는 BamHI, lane H는 HindIII, lane S는 SacI으로 절단한 것을 각각 나타낸다. 다음으로, 이 gel을 0.5N NaOH/0.1N NaCl 수용액으로 60분간 변성시켜 증류수로 30분간 세척한 후 이 젤을 페이퍼 타올 사이에 넣고 압축하여 수분을 가능한 제거하여 약 1mm 두께가 된 젤을 와트만(whatman) 3MM 페이퍼에 옮기고 60℃, 30분간 진공건조시켜 멤브레인(membrane) 상태로 만든다 (참조: 권석태 등, 분자생물학노트-유전공학실험서, 한국과학기술연구원 유전공학연구소 발행, 도서출판 한림원 인쇄 (1991)). 이 아가로스 젤 멤브레인을 증류수로 세정(washing)한 후, 프리하이브리다이제이션(prehybridization) 용액 (6X SSC, 5X Denhardt'ssolution, 50mM sodium phosphate buffer (pH6.5), sonicated salmon testes DNA (Sigma, typeIII Na salt) 100㎍/㎖) 내에 담구어 65℃로 1시간 프리하이브리다이제이션 반응시킨 후, 이 아가로스 젤 멤브레인을 프로브를 첨가한 하이브리다이제이션 용액(프리하이브리다이제이션 용액과 동일함)에 넣어 45℃에서 16시간 하이브리다이제이션을 수행하였다.

하이브리다이제이션 하지 않은 프로브를 세척하기위해 실온에서 2X SSC 용액으로 10분씩 2회, 1X, 0.5X, 0.1X SSC 용액으로 각각 10분씩 수행하였다. 이것을 공기 중에 건조시킨 후 오토레디오그래피를 수행하였다. 필름을 현상한 결과, 도 1 (B)와 같이 BamHI 으로 절단한 경우에는 약1.5kb, SacI으로 절단한 경우에는 약0.8kb에서 각각 하이브리다이제이션된 양성 시그널이 나타났다.

실시예3: Tca Ppase 유전자의 클로닝

전기 BamHI와 SacI으로 절단한 써머스써머필러스 GK24의 제노믹DNA를 저융점 아가로오스젤에 제한효소로 절단한 DNA와 DNA 마커를 같이 전기영동하고, 전개된 젤 상에서 원하는 크기 DNA에 해당하는 부분 즉 BamHI 1.5kb, SacI 0.8kb절편들을 각각 회수하여, 이렇게 얻은 젤 조각을 65℃로 가열하여 완전히 녹이고 동량의 TE 완충용액(buffer)를 가한 후 다시 5분간 가열한다. 이 DNA/agarose가 녹은 용액에 동량의 페놀(phenol)로 2회, 클로로포름/이소아밀알코올(chloroform/isoamylalchol)(24:1) 혼합용액으로 1회 처리하고, 1/10배 5M 포테슘 아세테이트(potassium acetate), 2배의 에탄올(ethanol)을 가하여 -70℃에서 30분간 방치한 후, 원심분리에 의해 DNA 단편을 회수하였다. 저융점 아가로스 젤로 부터 회수한 목적의 DNA 단편을 pBluescript SK+의 동일한 제한효소 부위에 각각 삽입하여 샘브룩(Sambrook)의 방법에 준하여 T4 DNA 리가아제(ligase)를 사용하여 16℃에서 하룻밤 라이게이션(ligation)을 하였다 (참조: Sambrook, J., et al., in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY). 또 라이게이션된 플라스미드의 대장균내 형질 전환은 일렉트로포레이터를 이용하였고, 전기의 조작된 pBluescript SK+ 플라스미드로 대장균을 형질전환시켜 각각 약 1000개 이상의 콜로니를 얻었으며, 상기 실시예 1의 서던블롯에 사용한것과 동일한 프로브를 사용하여 콜로니 하이브리다이제이션 (hybridization)을 다음과 같이 수행하였다.

콜로니 하이브리다이제이션은 Douglas Hanahan(더글러스 하나한)의 방법 (참조: Hanahan, D. and Meselson, M., Gene 10: 63-67 (1980)에 따라 앰피실린(ampicillin) (100 ug/ml)이 첨가된 LB 플레이트(plate)에 니트로세룰로스 필터(nitrocellulose filter)를 깔고 그 위에 형질 전환체(transformant)인 콜로니를 형성시켜 콜로니가 약 1mm 크기로 생육하였을때 이것을 주형으로 사용하여 또 다른 니트로세룰로스 필터위에 레플리카(replica)를 찍어 앰피실린(ampicillin)(100 ug/ml)이 첨가된 새로운 LB 플레트에서 생육시킨다. 이렇게 레플리카를 찍어 니트로세룰로스 필터위에서 생육된 콜로니들을 0.5N NaOH로 5분간 변성시킨 후, 1M Tris-HCl (pH7.6)/1.5M NaCl로 중화시켜서 80℃에서 2시간고정화(baking)한 다음, 위의 아가로스젤 멤브레인 하이브리다이제이션에서 기술한 동일한 방법으로 프리하이브리다이제이션 및 하이브리다이제이션을 수행하였다. 또 전기에 기술한 동일한 방법으로 멤브레인을 세척하여 공기중에 건조시킨 후 오토레디오그래피를 수행하여 프로브와 하이브리다이제이션을 하는 콜로니를 선별한 결과 BamHI절편이 삽입된 콜로니에서 24개, SacI 절편이 삽입된 콜로니에서 13개의 양성 클론(positive clone)을 각각 얻을 수 있었다.

전기의 양성 클론들을 재확인하기 위해 샘브룩(Sambrook)의 방법에 준하여 다음과 같이 플라스미드를 분리하였다. 양성 클론을 함유하고 있는 각각 10개 씩의 균주들를 항생제 앰피실린(ampicillin)(100 ug/ml)이 첨가된 LB 배지 3㎖에 접종하여 하룻밤 배양하고 원심분리하여 균체를 회수한 후, 50mM Tris-HCl (pH8.0), 10mM EDTA, 4㎎/㎖ 라이조자임(lysozyme) 용액 100㎕에 현탁시켜 상온에서 5분간 방치하였다. 0.2N NaOH/1% SDS 용액 200㎕을 가하여 얼음에서 5분간 방치한 후 5M 포테슘 아세테이트(potassium acetate) 용액 150㎕을 가하고 얼음에서 5분간 처리하였다. 이를 원심분리(4℃, 12000rpm, 5분)하여 상층액 만을 모으고, 동량의 페놀(phenol)을 1-2회, 클로로포름/이소아밀알콜(chloroform/isoamylalchol)(24:1) 혼합용액으로 1회 처리하고, 2배의 에탄올(ethanol)을 가하여 잘 섞어준 후 상온에서 5분간 방치하였다. 이를 원심분리하여 침전물을 얻고 70% 에탄올로 씻어준 다음 완전히 건조하여 0.5㎍/㎖의 DNase 없는 RNase(DNase free RNase)를 포함한 TE 완충용액(buffer)에 DNA 침전물을 녹이고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이렇게 하여 얻어진 DNA를 전기영동하여 양을 확인한 후 실험에 들어갔다. 먼저 1.5 kbBamHI 단편이 삽입되었다고 예상한 플스미드들를 제한효소 BamHI로 절단한 후, 아가로스 젤에 전기영동하여 확인한 결과 예상한 약 1.5 kb BamHI 절편이 나타났으며, 또 상기 실시예 1의 서던블롯에 사용한 것과 동일한 프로브를 사용하여 아가로스 젤 하이브리다이제이션을 실시한 결과, 1.5 kb BamHI 절편에 하이브리다이즈한다는 것을 확인하였다. 따라서 1.5 kb HindIII 절편이 삽입된 플라스미드를 pTBIP라고 명명하였다. 그리고 0.8 kb SacI 단편이 삽입되었다고 예상한 플스미드들를 제한효소 SacI 으로 절단한 후, 아가로스 젤에 전기영동하여 확인한 결과 예상한 약 0.8 kb SacI 절편이 나타났으며, 또 상기 실시예 1의 서던블롯에 사용한 것과 동일한 프로브를 사용하여 아가로스 젤 하이브리다이제이션을 실시한 결과, 0.8 kb SacI 절편에 하이브리다이즈한다는 것을 확인하였다. 따라서 0.8 kb SacI 절편이 삽입된 플라스미드를 pTSIP라고 명명하였다. 전기의 pTBIP와 pTSIP 플라스미드를 제조한 다음, ApaI, BamHI, HindIII, SacI, PstI등의 제한효소를 이용하여 절단하고 유전자 사이즈 마커와 함께 전기영동하여 각 크기를 비교함으로써 제한효소지도를 작성하였다. 그 결과, 도 2와 같은 제한효소 지도를 얻었다.

실시예4: Tca Ppase 유전자 염기서열의 결정 및 아미노산 서열 비교

서던블롯(Sothern Blot)을 하여 양성신호가 나타난 플라스미드 pTBIP (1.5 kb BamHI 절편)와 pTSIP (0.8 kb SacI 절편)를 T3 프라이머와 T7 프라이머를 사용하여 생거의 디데옥시 사슬 종결법(Sanger's dideoxy chain termination method)으로각 클론의 염기서열을 결정하고, 이를 컴퓨터 프로그램인 피씨진(PCGENE)으로 분석한 다음, 인터넷프로그램인 NCBI 블라스트 검색프로그램NCBI-blast search)의 서열 분석결과 HindIII 절편과 SacI 절편사이에 Tca Ppase 유전자가 코딩되어 있음을 알 수 있었다. Tca Ppase 유전자는 총 531bp(종지코돈포함)의 염기서열을 포함하였고(참조: 서열번호 1) 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정하였다 (참조: 서열번호 2).

전기의 Tca Ppase 유전자는 일반적인 써머스속 DNA와 유사한 66.5%의 G+C 함량을 보였다. Tca Ppase 유전자는 총 175개의 아미노산으로 구성된 단백질로 보이며, 다른 종의 Ppase의 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, Tca Ppase가 다른 종들로부터 유래한 Ppase들과는 상이한 아미노산 서열을 지니고 있는 새로운 Ppase임이 확인되었다. 아미노산 서열 비교 결과 Tca Ppase는 Aae Ppase와는 약 45%, 대장균의 Ppase와는 45%의 상동성을 각각 나타내었다 (참조: 도 3). 도 3에서 Tca Ppase는 Tca, Aae Ppase는 Aae, 대장균의 Ppase는 Eco로 각각 나타내었으며, 박스부분은 아미노산 서열보존부위이다.

실시예5: Tca Ppase 유전자의 발현벡터의 구축

결정된 Tca Ppase 유전자의 염기서열로부터 5‘-말단 및 3’-말단 염기서열에 각각 상보적인 프라이머 P1과 P2를 각각 합성하여, 써머스 써머필러스 GK24의 제노믹 DNA로부터 PCR(중합효소연쇄반응)방법으로 Tca Ppase 유전자를 증폭시켰다. 프라이머 P1은 Tca Ppase유전자의 개시코돈(ATG)을 포함한 31개 염기로 구성되어 있으며, PCR에 의해 증폭된 DNA가 5‘-말단에 EcoRI site를 갖도록 설계하였다 (5'-NNNNGAATTCATGGCGAACCTGAAGAGCCTT-3'). 프라이머 P2는 Tca Ppase 유전자의 3’-말단의 종지코돈(TAG)과 상보적인 CTA를 포함하는 28개 염기서열로 구성되어 있으며, PCR에 의해 증폭된 DNA가 3‘말단에 SalI 사이트(site)를 갖도록 설계하였다 (5'-NNNNGTCGACTAGCCCTTGTAGCGGGCG-3').

써머스 써머필러스 GK24 제노믹 DNA를 주형 DNA로 하고 프라이머 P1과 P2 를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR의 반응화합물(50㎕)은 1㎍의 써머스써머필러스 GK24의 제노믹 DNA, 1μM의 각각의 프라이머 P1과 P2, 200μM dNTPs, 50mM KCl, 20mM Tris-HCl (pH8.3), 1mM MgCl2이다. 이 반응 화합물 위에 메네랄 오일(mineral oil)을 한 방울 적하시킨 후, 100℃에서 5분간 주형 DNA를 변성시켰다. 여기에 Taq DNA polymerase(폴리머라제) 2.5 units을 첨가한 후에 94℃에서 5분, 45℃에서 1분, 72℃에서 1분, 이 순서를 반복하여 30회 PCR robot을 이용하여 수행한 후, 마지막회(31회)에는 72℃로 5분 동안 폴리머라이제이션 반응을 길게 하였다. 반응이 끝난 후, 상층부의 오일을 제거하고, 동량의 페놀(phenol) 및 클로로포름(chloroform)으로 처리한 후 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상층액의 2배의 에탄올(ethanol)을 가하여 잘 섞어준 후 -70 ℃에 30분간 반응 후 이를 원심분리하여 침전물을 얻고 70% 에탄올로 씻어준 다음 완전히 건조하여 TE buffer(완충용액)에 DNA 침전물을 녹이고, 위의 PCR 생성물(product)를 EcoRI과 SalI 제한효소로 절단 한후 발현벡터 pJR (참조: Kwon, S.-T., et al., Mol. cells7: 264-271 (1997))의 동일한 사이트(site)에 삽입하여 Tca Ppase 생산을 위한 재조합 플라스미드 pTCPP를 구축하였다 (참조: 도 4). 이를 E. coli MV1184에 트랜스포메이션하였다. 형질전환체들로부터 플라스미드를 분리하여 EcoRI과 SalI 효소처리를 하여 Tca Ppase유전자가 정확히 삽입되어 정확하게 구축된 플라스미드 pTCPP를 함유하고 있는 재조합된 균주를 선별하였다.

실시예6: Tca Ppase의 활성 측정

전기 실시예 4에서 선별된 Tca Ppase유전자가 재조합된 균주들의 Tca Ppase 활성 측정은 하이노넨과(Heinonen)과 라티(Lahti)의 방법 (참조: Heinonen, J. K. and Lahti, R. J., Anal. Biochem. 113: 313-317))을 약간 변형하여 다음과 같이 실시하였다. Tca Ppase유전자가 재조합된 균주를 앰피실린(ampicillin)(100 ug/ml)이 첨가된 LB 배지 3ml에 접종하여 A600에서 0.6-0.8까지 키운후 아이소프로필갈락토사이드(IPTG)유도에 의해 발현시키고 6시간 동안 배양하였다. 그리고 모든 균주의 세포의 양을 일정하게하기 위해 A600에서 1로 맞춰준 후, 그에 해당하는 볼륨의 세포를 회수하여 활성측정을 하였다.

회수된 세포를 sonication buffer(초음파 파쇄용액)(10mM Tris-HCl pH8.0/ 1mM MgCl2) 1㎖에 세포를 현탁한 후 초음파 파쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포를 원심분리(15,000rpm, 15분) 하여 상층을 회수하고 대장균유래의 Ppase를 포함한 단백질을 제거하기위해 85℃에서 20분간 열처리를 하였다. 열처리한 샘플을 원심분리(15,000rpm, 15분)하여 회수된 상층을 조효소액으로 이용하였다. 전기의 조효소액을 100㎕를 취하고 20㎕의 50mM 소디움 파이로포스페이트(sodium pyrophosphate)를 첨가하여 80℃에서 10분간 반응시킨 후, 효소반응을 멈추기 위하여 0.1M 시트루산(citric acid)를 100 ㎕를 첨가하였다. 여기에 발색반응에 의한 포스페이트 함량을 측정하기위해 AAM solution(용액){1 볼륨의 ammonium molybdate(몰리브덴산 암모늄) 용액, 1 볼륨의 5N 황산용액, 2 볼륨의 아세톤}을 1ml 첨가하여 충분히 혼합한 후, 1M 시트루산(citric acid) 100㎕ 를 첨가하고 420nm에서 흡광도를 측정하여 그 중 활성이 높은 균주를 선별하여 본 실험에 들어갔다.

실시예7: Tca Ppase유전자의 발현 및 간단한 효소정제 방법

상기예 5에서 선별된 재조합균주 (E. coli mv1184/pTCPP)를 항생제 앰피실린(ampicillin)(100 ug/ml)이 첨가된 LB 배지 3ml에 접종하여 37℃로 12시간정도 배양한 후, 다시 ampicillin (100 ug/ml)이 첨가된 LB 배지의 10ml에 1%되게 접종을 하여 5시간정도 전배양한 후, 1ℓ의 앰피실린(ampicillin)(100 ug/ml)이 첨가된 LB 배지에 1% 접종하여 본배양에 들어갔다. 본배양중 세포농도가 A600에서 0.8까지 배양한 후 최종 농도 0.5mM의 IPTG를 첨가하여 7시간 배양하여 Tca Ppase 유전자의 발현을 유도하였다. 1ℓ를 키운 균체를 원심분리 (6000rpm, 10분, 4℃)하여 세포를 회수한 후, 1mM PMSF를 포함한 용액 A (10mM Tris-HCl, pH7.4/ 1mMMgCl2)로 세포를 현탁시켜 초음파파쇄(sonication)으로 세포를 파쇄하고 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 이 파쇄과정을 3회정도 반복하여 상층액을 회수하였다. 이 상층액의 핵산을 제거하기위해 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate)를 상층액 볼륨의 1% 정도 농도로 처리하여 실온에서 1시간 동안 방치한 후, 15,000rpm에서 약 30분간 원심분리하였다. 그 상층액을 회수하여 85℃에서 30분간 열처리한 후, 또 다시 원심분리하여 E. coli 유래의 단백질을 제거하였다.

상층액을 용액 A로 완전히 투석한 후, 용액 A로 평형화시킨 DEAE-sephacel column(세파셀 칼럼)에 로딩(loading)한 후. 충분히 용액 A로 결합하지 않은 단백질들을 씻어주었다. 그 다음 NaCl 용액을 이용하여 0-1M 농도까지 구배(gradient)로 결합된 Tca Ppase을 분리, 정제하였다. 전기 실시예5의 Tca Ppase 활성측정 방법으로 용출된 분획(fraction)들을 확인하여 24시간정도 투석 시킨 후, SDS-PAGE 전기영동(참조: Laemmli, U. K., Nature 227: 680-685 (1970))하였으며 그 결과를 도 5에 나타냈다. 도 5에서 lane 4는 단백질 분자량 마커들이고, lane 1은 대장균에서 Tca Ppase 유전자를 발현시킨 샘플을 sonication으로 파쇄시킨 시료, lane 2는 lane 1의 시료를 80℃에서 30분간 열처리하여 대장균 유래의 단백질을 원심분리에 의해 제거한 시료, lane 3은 lane 2의 샘플을 DEAE-sephacel column chromatography(세파셀 칼럼 크로마토그라피)로 정제한 시료들을 각각 나타낸다. 도 5의 SDS-PAGE 전기영동에서 분자량은 약 22,500 달톤(Da)의 써브유니트(Sub-unit)를 갖는 것으로 나타났다.

실시예8 : Tca Ppase의 특성조사

전기 실시예 8의 방법으로 정제된 Tca Ppase를 이용하여 효소특성조사를 수행하였으며, Tca Ppase 활성은 전기의 실시예 5의 방법을 토대로 측정하였다. 정제된 Tca Ppase의 최적 온도를 측정하는데 있어 온도범위는 40℃에서 90℃에 이르기까지 10℃ 간격으로 조사를 하였다. 그 결과 70℃부터 90℃에 이르기까지는 다양하게 활성을 나타내었으나 그 중 80℃가 가장 최적의 활성을 보였다 (참조: 도6).

Tca Ppase의 최적 pH를 측정하기 위하여 pH 3.0-11.0범위에서 0.4간격으로, 조효소액 100㎕에 각각의 pH별 완충용액(buffer)를 10mM 농도로 하여 섞은 후 50mM 소디움 파이로포스페이트(sodium pyrophosphate) 20㎕를 넣고 70℃에서 10분간 반응시켜 전기 실시예 5의 Tca Ppase의 활성측정 방법으로 효소활성을 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 그 결과 트리스 완충용액(Tris-HCl buffer)에서 높은 활성을 보였으며, pH 6.8에서 9.0에 이르는 넓은 범위에서 활성을 지녔으며 그 중 pH 8.4에서 최적 활성을 나타내었다.

Tca Ppase의 활성에 2가 양이온 (MgCl2, CaCl2, ZnCl2, MnCl2, CuCl2)이 미치는 영향을 조사하기 위하여 다음과 같이 반응을 하였다. 정제된 Tca Ppase의 효소액 일정량과 10mM 트리스 완충용액(Tris-HCl buffer)(pH8.4) 혼합액에 최종농도가 1mM이 되도록 2가 양이온을 첨가하여 실온에서 1시간 방치한 후, 각각의 시료에 50mM의 기질 20㎕을 첨가하여 70℃에서 10분간 반응 시킨 후, 전기 실시예 5의 Tca Ppase의 활성측정 방법으로 측정하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 그 결과 CaCl2은 활성에 영향을 끼치지 못했으나 MgCl2, ZnCl2, CuCl2은 2가 양이온을 넣지 않고 효소반응을 진행한 조정(control)보다 약 2배의 활성을 나타내었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 써머스 칼도필러스 GK24(Thermus caldophilus GK24)로부터 유래하는 내열성 파이로포스파타제 (Tca Ppase) 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 제공한다. 또 본 발명은 대장균에서 Tca Ppase 유전자의 발현 및 내열성 Tca Ppase의 간단한 정제 방법을 제공하며, 또 내열성 Tca Ppase의 대량생산을 실현시킬 수 있을 것이다. 본 발명의 내열성 파이로포스파타아제(Tca Ppase)는 DNA 염기서열 결정(씨퀀싱, sequencing)의 효율 증진과 PCR(polymerase chain reaction)에 의한 DNA 증폭 효율을 높이기 위해 내열성 DNA 중합효소와 함께 각종 유전공학연구 및 유전병 진단 등에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Claims (4)

1. 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 써머스 칼도필러스 GK24 (Thermus caldophilus GK24)로부터 유래하는 파이로포스파타제 (Tca Ppase)를 코딩하는 유전자
2. 제 1항의 서열번호 1로 기재된 염기서열로부터 유추된 서열번호 2로 기재되는 써머스 칼도필러스 GK24 (Thermus caldophilus GK24)로부터 유래하는 파이로포스파타제 (Tca Ppase)의 아미노산 서열
3. 서열번호 1로 기재되는 염기서열로부터 유추되는 써머스 칼도필러스 GK24 (Thermus caldophilus GK24)로부터 유래하는 파이로포스파타제 (Tca Ppase)의 유전자가 구축된 발현벡터 pTCPP
4. 제 1항의 파이로포스파타제 (Tca Ppase)의 유전자를 대장균에서 발현시켜 열처리 방법으로 원심분리하고 DEAE-sephacel column chromatography(세파셀 칼럼 크로마토그라피)로 NaCl 용액의 농도구배를 이용하여 내열성 Tca Ppase를 분리 정제하는 방법.