CN102177236A

CN102177236A - 功能改善的rna聚合酶突变体

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Publication number: CN102177236A
Application number: CN2009801398070A
Authority: CN
Inventors: 大江正刚; 佐藤宽; 井出辉彦
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2008-08-08
Filing date: 2009-08-07
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2029-08-07
Also published as: EP2316934A4; JP5625908B2; EP2316934A1; JPWO2010016621A1; WO2010016621A1; EP2316934B1; KR20110044753A; CN102177236B; US8551752B2; US20110136181A1

Abstract

一种T7RNA聚合酶突变体，其中，与选自SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的至少786位的谷氨酰胺、179位的赖氨酸以及685位的缬氨酸中的至少1个相当的氨基酸残基被其它氨基酸取代，且与野生型T7样噬菌体的RNA聚合酶相比，该T7RNA聚合酶突变体的热稳定性和/或比活性提高。

Description

功能改善的RNA聚合酶突变体

技术领域

本发明涉及：通过在野生型RNA聚合酶的氨基酸序列的一部分中导入突变而具有改善的功能的RNA聚合酶、特别是热稳定性和/或比活性提高的RNA聚合酶、编码该RNA聚合酶的基因、该RNA聚合酶的生产方法、以及利用该RNA聚合酶制造RNA的方法。

背景技术

本发明涉及与野生型相比，在高温条件下稳定性和/或比活性有所提高的、由噬菌体得到的突变型RNA聚合酶，特别是T7RNA聚合酶。作为能够感染大肠杆菌的噬菌体，有T3、T7、

W31、H、Y、A1、croC21、C22以及C23，这其中，T7噬菌体编码的RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。

作为T7RNA聚合酶的特征，首先是对启动子序列具有高选择性。T7RNA聚合酶与其自身的特异性启动子序列相结合，对于除此以外的启动子序列，即使是其它噬菌体的启动子序列，也不会结合。由于这种高选择性，RNA聚合酶的转录反应并非针对宿主基因组，而是切实地针对其自身的基因组。

而且，T7RNA聚合酶与其它聚合酶不同，其具有识别启动子、引发转录、延伸RNA转录物、终止转录的一系列性能，而无需辅因子；而且，能够以5倍于大肠杆菌的RNA聚合酶的高转录速度延伸RNA。

而且，其是分子量98.6kDa、883氨基酸的单链蛋白质，因而可以容易地大量制造该酶。

具有上述优点的T7RNA聚合酶在各领域中有着积极的应用，其应用包括例如：体外转录或大肠杆菌中的高表达系统(美国专利第4952496号公报：专利文献1)、无细胞蛋白质合成系统、碱基序列测定法(特开平11-18799号公报：专利文献2)、等温核酸扩增法。针对等温核酸扩增法中的一种，即TRC法(特开2000-14400号公报：专利文献3以及Ishiguro T.et al.，Analytical Biochemistry，314，77-86(2003)：非专利文献1)进行具体说明。

TRC法是通过DNA依赖性RNA聚合酶与逆转录酶的协同作用来扩增包含特定RNA序列的靶标RNA的方法。即，针对作为靶标的RNA，利用含T7启动子序列的引物、逆转录酶以及核糖核酸酶H来合成含启动子序列的双链DNA，而利用T7RNA聚合酶合成由特定RNA序列组成的RNA。将此后生成的RNA作为含所述启动子序列的双链DNA合成的模板，以连锁的形式进行上述反应。与利用PCR法进行扩增的情况不同，基于TRC法的核酸扩增方法能够在一定的温度下进行反应，因而其优势是无需复杂的温度控制。然而，如果使用野生型T7RNA聚合酶来进行采用TRC法的核酸扩增，则观察到在46℃以上的条件下核酸扩增效率因T7RNA聚合酶的活性降低而降低。因此，现状是，采用TRC法的核酸扩增通常在40℃～45℃的较低温度条件下进行。低温条件下RNA容易形成复杂的高级结构，这导致能够在TRC法中以高灵敏度进行检测的引物的设计变得困难。因此，需要即使在46℃以上的条件下也具有高热稳定性和/或比活性的T7RNA聚合酶。

由于建立测定T7RNA聚合酶的活性的系统(Ikeda R.A.et al.，Biochemistry，31，9073-9080(1992)：非专利文献2以及Ikeda R.A.et al.，Nucl.Acid.Res.，20，2517-2524(1992)：非专利文献3)，目前为止已经通过突变制作了各种具有改善的功能的RNA聚合酶。例如，通过氨基酸取代而对识别的启动子序列进行了修饰的酶(美国专利第5385834号公报：专利文献4)、提高了高温下的比活性和热稳定性的酶(日本特表2003-525627号公报：专利文献5)、通过氨基酸的缺失和取代而增强了3’-脱氧核糖核苷酸摄取能力的酶等(日本特开2003-61683号公报：专利文献6)。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供与野生型相比，热稳定性和/或比活性提高的T7RNA聚合酶突变体及其制造方法。

为解决上述问题而进行了研究，结果发现了通过采用基因工程方法对野生型T7RNA聚合酶的氨基酸进行取代，从而发现热稳定性或比活性提高的氨基酸位点，并成功制作了与野生株比热稳定性或比活性提高的突变体。而且，通过将热稳定性提高的氨基酸位点的突变与比活性提高的氨基酸位点的突变组合，成功制作了热稳定性和比活性提高的突变体。

具体地，发现：与野生型T7RNA聚合酶相比，通过将与至少SEQ IDNO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的786位的谷氨酰胺和/或179位的赖氨酸相当的氨基酸残基取代成其它氨基酸而得到的T7RNA聚合酶突变体的热稳定性和/或热稳定性提高。

而且发现：与野生型T7RNA聚合酶相比，通过将不同于上述位点的位点的氨基酸残基、即与685位的缬氨酸相当的氨基酸残基取代成其它氨基酸，其热稳定性和/或热稳定性提高。

此外，通过将上述各氨基酸残基分别组合，进一步能够得到热稳定性和/或热稳定性提高的T7RNA聚合酶突变体。

即，本发明包括以下发明：

1.一种T7RNA聚合酶突变体，其中，与选自至少SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的786位的谷氨酰胺、179位的赖氨酸以及685位的缬氨酸中的至少1个相当的氨基酸残基被其它氨基酸取代，且与野生型T7样噬菌体的RNA聚合酶相比，该T7RNA聚合酶突变体的热稳定性和/或比活性提高。

2.一种T7RNA聚合酶突变体，其中，与至少SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的786位的谷氨酰胺相当的氨基酸残基被疏水性氨基酸取代，且与野生型T7样噬菌体的RNA聚合酶相比，该T7RNA聚合酶突变体的热稳定性和/或比活性提高。

3.一种T7RNA聚合酶突变体，其中，与至少SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的786位的谷氨酰胺相当的氨基酸残基被亮氨酸或甲硫氨酸取代，且与野生型T7样噬菌体的RNA聚合酶相比，该T7RNA聚合酶突变体的热稳定性和/或比活性提高。

4.根据项2或3所述的T7RNA聚合酶突变体，其中，进一步地，与至少SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的179位的赖氨酸相当的氨基酸残基被谷氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸中的任一个取代，且与野生型T7样噬菌体的RNA聚合酶相比，该T7RNA聚合酶突变体热稳定性和比活性提高。

5.一种T7RNA聚合酶突变体，其中，与至少SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的179位的赖氨酸相当的氨基酸残基被谷氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸中的任一种取代，且与野生型T7样噬菌体的RNA聚合酶相比，该T7RNA聚合酶突变体的热稳定性和/或比活性提高。

6.根据项2～5中任一项所述的T7RNA聚合酶突变体，其中，进一步地，与至少SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的685位的缬氨酸相当的氨基酸残基被中性或弱疏水性氨基酸取代，且与野生型T7样噬菌体的RNA聚合酶相比，该T7RNA聚合酶突变体的热稳定性和比活性提高。

7.根据项6所述的T7RNA聚合酶突变体，其中，进一步地，与至少SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的685位的缬氨酸相当的氨基酸残基被丙氨酸取代，且与野生型T7样噬菌体的RNA聚合酶相比，该T7RNA聚合酶突变体的热稳定性和比活性提高。

8.一种T7RNA聚合酶突变体，其中，与至少SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的685位的缬氨酸相当的氨基酸残基被中性或弱疏水性氨基酸取代，且与野生型T7RNA聚合酶相比，该T7RNA聚合酶突变体的热稳定性和/或比活性提高。

9.一种T7RNA聚合酶突变体，其中，与至少SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的685位的缬氨酸相当的氨基酸残基被丙氨酸取代，且与野生型T7RNA聚合酶相比，该T7RNA聚合酶突变体的热稳定性和/或比活性提高。

10.一种T7RNA聚合酶突变体，其中，与SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的685位的缬氨酸相当的氨基酸残基被其它氨基酸取代，且与179位的赖氨酸和/或786位的谷氨酰胺相当的氨基酸残基被其它氨基酸残基取代。

11.一种T7RNA聚合酶突变体，其中，与SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的685位的缬氨酸相当的氨基酸残基被丙氨酸取代，而且，与179位的赖氨酸相当的氨基酸残基被谷氨酸取代和/或与786位的谷氨酰胺相当的氨基酸残基被亮氨酸或甲硫氨酸取代。

12.一种基因，该基因编码项1～11中任一项所述的T7RNA聚合酶突变体。

13.一种细胞，该细胞能够表达编码项1～11中任一项所述的T7RNA聚合酶突变体的基因从而生产T7RNA聚合酶。

14.一种生产T7RNA聚合酶的方法，该方法通过表达编码项1～11中任一项所述的T7RNA聚合酶突变体的基因生产T7RNA聚合酶。

15.一种制造RNA的方法，该方法使用项1～11中任一项所述的T7RNA聚合酶突变体来制造RNA。

16.一种扩增RNA的方法，该方法使用项1～11中任一项所述的T7RNA聚合酶突变体来扩增RNA。

与野生型T7RNA聚合酶相比，本发明的突变型T7RNA聚合酶的热稳定性和/或比活性提高，因此，与野生株相比，能够期待其在更宽的温度范围进行转录反应和/或缩短转录反应时间。

附图说明

图1显示了克隆了T7RNA聚合酶的质粒pTrc99A-T7RNApol的限制酶图谱。

图2显示了pCDF2质粒的限制酶图谱。

图3显示了生产T7RNA聚合酶的质粒pCDF2-T7RNAP的限制酶图谱。

图4显示了生产N末端融合有组氨酸六聚体(hexamer)的T7RNA聚合酶的质粒pCDF2-T7RNAPHis的限制酶图谱。

图5显示了具有由T7启动子诱导表达的GFP基因的pSTVGFP的限制酶图谱。

图6显示了对制作的野生型T7RNA聚合酶、其突变体K179E、Q786L以及双重突变体(K179E+Q786L)分别针对于47℃加热时的热稳定性进行比较的结果(电泳照片)。而且，图中的泳道1、泳道2、泳道3和泳道4分别表示使用野生型T7RNA聚合酶、K179E突变体T7RNA聚合酶、Q786L突变体T7RNA聚合酶和(K179E+Q786L)突变体T7RNA聚合酶时的结果。

图7显示了对制作的野生型T7RNA聚合酶、其突变体K179E、Q786L以及双重突变体(K179E+Q786L)分别在43～50℃的RNA生产量进行比较的结果。

图8显示了对制作的野生型T7RNA聚合酶、其突变体K179E、K179C以及K179N分别在43～50℃的RNA生产量进行比较的结果。

图9显示了对制作的野生型T7RNA聚合酶、其突变体Q786L、Q786M、Q786F以及Q786Y分别在43～50℃的RNA生产量进行比较的结果。

图10显示了对野生型T7RNA聚合酶、突变体T7RNA聚合酶Q786L、Q786M、Q786F、Q786Y、K179E、K179C以及K179N分别针对于47℃加热时的热稳定性进行比较的结果。

图11显示了对野生型T7RNA聚合酶、(K179E+Q786L)双重突变体、以及(K179E+Q786L+V685A)三重突变体分别在43～50℃的RNA生产量进行比较的结果。

图12显示了对野生型T7RNA聚合酶、(K179E+Q786L)双重突变体、以及(K179E+Q786L+V685A)三重突变体分别针对于48℃加热时的热稳定性进行比较的结果。

图13显示了以沙门氏菌stn RNA作为靶标、使用野生型T7RNA聚合酶和(Q786L+V685A)双重突变体进行基于TRC法的等温核酸扩增反应的结果。

图14显示了对野生型T7RNA聚合酶和V685A突变体分别在43～49℃的RNA生产量进行比较的结果。

图15显示了对野生型T7RNA聚合酶和V685A突变体分别针对于46℃加热时的热稳定性进行比较的结果。

图16显示了对野生型T7RNA聚合酶、V685A突变体和(V685A+Q786M)双重突变体分别在43℃～50℃的RNA生产量进行比较的结果。

发明的具体实施方式

以下，对本发明进行具体说明。

在第一方面中，本发明公开的热稳定性和/或比活性提高的T7RNA聚合酶是将与SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的至少786位的谷氨酰胺相当的氨基酸残基取代成其它氨基酸而得到的，优选取代后的氨基酸是任一种疏水性氨基酸(亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)，更优选取代后的氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。而且，在本说明书中，“与786位的谷氨酰胺相当的氨基酸残基”是指：以SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列为基准时，处于786位的谷氨酰胺残基；而当在由SEQ ID NO：6所示的序列组成的T7RNA聚合酶的5’末端侧添加或删除多肽时，位置仅偏移所述添加或删除的多肽的长度(例如，对于在由SEQ ID NO：6所示的序列组成的T7RNA聚合酶的5’末端侧添加由10个氨基酸残基组成的多肽而得到的T7RNA聚合酶而言，“与786位的谷氨酰胺相当的氨基酸残基”是处于796位的谷氨酰胺)。

在第二方面中，本发明公开的热稳定性和/或比活性提高的T7RNA聚合酶是将与SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的至少179位的赖氨酸相当的氨基酸残基取代成其它氨基酸而得到的，优选取代后的氨基酸是谷氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸中的任一种，更优选取代后的氨基酸是谷氨酸。而且，在本说明书中，“与179位的赖氨酸相当的氨基酸残基”是指：以SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列作为基准时，处于179位的赖氨酸残基；而当在由SEQ ID NO：6所示的序列组成的T7RNA聚合酶的5’末端侧添加或删除多肽时，位置仅偏移所述添加或删除的多肽的长度。

在第三方面中，本发明公开的热稳定性以及比活性提高的T7RNA聚合酶是将与SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的至少786位的谷氨酰胺以及179位的赖氨酸相当的氨基酸残基分别取代成其它氨基酸而得到的，优选分别地将786位的氨基酸残基取代成任一种疏水性氨基酸(亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)，而将179位的氨基酸残基取代成谷氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸中的任一种，更优选分别地将786位的氨基酸残基取代成亮氨酸或甲硫氨酸，而将179位的氨基酸残基取代成谷氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸中的任一种。

在第四方面中，本发明公开的热稳定性和/或比活性提高的T7RNA聚合酶是将与SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的至少685位的缬氨酸相当的氨基酸残基取代成其它氨基酸而得到的，优选将该氨基酸取代成任一种中性或弱疏水性氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)，更优选取代后的氨基酸是丙氨酸。而且，在本说明书中，“与685位的缬氨酸相当的氨基酸残基”是指：以SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列作为基准时，处于685位的缬氨酸残基，而当在由SEQ ID NO：6所示的序列组成的T7RNA聚合酶的5’末端侧添加或删除多肽时，位置仅偏移所述添加或删除的多肽的长度(例如，对于在由SEQ IDNO：6所示的序列组成的T7RNA聚合酶的5’末端侧添加由10个氨基酸残基组成的多肽而得到的T7RNA聚合酶而言，“与685位的缬氨酸相当的氨基酸残基”是处于695位的赖氨酸)。

在第五方面中，本发明公开的热稳定性和/或比活性提高的T7RNA聚合酶是将与SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的前述685位的缬氨酸相当的氨基酸残基取代、且将与179位的赖氨酸和/或786位的谷氨酰胺相当的氨基酸残基取代成其它氨基酸残基而得到的，优选分别地将与179位的赖氨酸相当的氨基酸残基取代成谷氨酸和/或将与786位的谷氨酰胺相当的氨基酸残基取代成亮氨酸或甲硫氨酸。而且，在本说明书中，“与179位的赖氨酸和/或786位的谷氨酰胺相当的氨基酸残基”是指，以SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列作为基准时，处于179位的赖氨酸和/或处于786位的谷氨酰胺残基，而当在由SEQ ID NO：6所示的序列组成的T7RNA聚合酶的5’末端侧添加或删除多肽时，位置仅偏移所述添加或删除的多肽的长度。

本发明的突变型T7RNA聚合酶可以通过在野生型T7RNA聚合酶基因中导入突变来制作。在指定的核酸序列中导入希望的突变的方法是本领域技术人员公知的。通过适宜使用例如定点突变法、使用简并寡核苷酸的PCR、含核酸的细胞的诱变剂或暴露于放射线中等公知技术，可以构建具有突变的DNA。

野生型T7RNA聚合酶基因的获得可以采用本领域技术人员掌握的任何方法，例如，可以从T7噬菌体(DSMNo.4623，ATCC 11303-B7，NCIMB10380等)中，使用基于其基因组信息制作的适当引物通过PCR来获得。

对于本发明的酶的获得方法没有特殊限制，可以是利用化学合成而合成的蛋白质，也可以是利用基因重组技术制作的重组蛋白质。在利用基因重组技术来获得时，通过采用适当方法将T7RNA聚合酶基因导入宿主中，可以获得目的酶。

所使用的宿主可以是酵母、动物细胞株、植物细胞、昆虫细胞等各种培养细胞，但对于T7RNA聚合酶基因而言，优选使用最初的噬菌体的感染对象、且操作简便的大肠杆菌作为宿主。用于转化的大肠杆菌可以示例出JM109株、HB101株，但不限于此。

本发明的基因可以插入适当的载体中来使用。对于本发明中使用的载体的种类没有特殊限定，例如可以是自主复制型载体，或者也可以在导入宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中。优选地，本发明中使用的载体是表达载体。在表达载体中，本发明的基因与转录所必要的元件(例如启动子等)可发挥功能地连接。启动子是在宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，可以根据宿主的种类适宜选择。可在大肠杆菌中使用的启动子包括lac、trp或tac启动子等，在利用大肠杆菌作为宿主的情况下，将目的基因导入到适当的质粒中并转化的方法是简便的。使用的质粒可以示例出表达用质粒pTrc99A(GE Healthcare Biosciences制)、pCDF-1b(TAKARA Bio制)，但不限于此，只要是常规的大肠杆菌用载体、且本领域技术人员能够获得，则均可使用。此外，制作的T7RNA聚合酶基因中可以添加对酶的纯化有用的序列。例如可以制作基因，使得利用信号肽形成细胞外分泌型酶，在末端添加含组氨酸六聚体的标签序列作为信号肽。而且，信号肽的种类、信号肽与本酶的结合方法并不限于上述方法，本领域技术人员可以利用任何可利用的信号肽。

通过在导入的DNA构建体可表达的条件下、在合适的营养培养基中对制作的转化体进行培养，可以获得本发明的酶。从培养物分离纯化转化体，可以采用常规的用于蛋白质的分离、纯化方法。例如，当本发明的酶在细胞内表达时，在培养结束后，离心分离并回收细胞，将其悬浮于适当的水系缓冲液中，然后通过溶菌酶处理或超声波破碎机等破碎细胞，得到无细胞提取液。进一步，对无细胞提取液进行离心分离而得到上清，对于该上清，采用常规蛋白质的分离纯化方法进行纯化。即，通过单独或组合使用溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙基氨基乙基(DEAE)-Toyopearl(diethylaminoethyl(DEAE)Toyopearl)(商品名)(东曹制)这种树脂的阴离子交换色谱法、使用丁基-Toyopearl(Butyl-Toyopearl)以及苯基-Toyopearl(Phenyl-Toyopearl)(商品名)(东曹制)这些树脂的疏水性色谱法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和色谱法、色谱聚焦法、等电点电泳这种电泳方法等方法，可以得到纯化标准品。此外，利用信号肽，采用相应的方法进行纯化的方法是简便的，例如，通过使用组氨酸六聚体序列和镍柱，能够容易地进行纯化。

除上述方法外，本发明的T7RNA聚合酶突变体还可以通过例如化学合成来得到。

上述说明的本发明的酶可以作为传统已知的T7RNA聚合酶应用于各种用途。即，本发明的酶可以作为RNA聚合酶应用于RNA的合成。具体地，使用核糖核苷酸(ATP、CTP、GTP、UTP)作为底物，以具有特定序列的双链DNA为模板，可以进行单链RNA合成。

而且，本发明的RNA聚合酶还可以应用于通过与逆转录酶的协同作用扩增含特定RNA序列的靶标RNA的等温核酸扩增反应。作为等温核酸扩增反应，可以列举出TRC法(专利文献3以及非专利文献1)、NASBA法、TMA法等。

与野生型T7RNA聚合酶相比，本发明的T7RNA聚合酶突变体的热稳定性和/或比活性提高。因此，与野生型相比，其保存容易，此外还可以长时间保存。因此，能够提供使用便利性好、可长期使用的试剂。

此外，本发明的T7RNA聚合酶突变体可以在高于野生型的高温条件下使用，因此能够改善转录反应、等温核酸扩增反应中的实验条件，且无论体外、体内，可以在比野生型更宽的温度范围使用。

特别是，在采用TRC法的等温核酸扩增反应中，当使用野生型T7RNA聚合酶时，所述酶在46℃以上出现活性降低，因此必须在40℃～45℃的较低温度条件下进行核酸扩增反应。此外，在所述温度条件下，RNA容易形成复杂的高级结构，这导致高灵敏度进行检测的引物的设计变得困难。另一方面，与野生型相比，本发明的T7RNA聚合酶突变体在46℃以上的温度条件下的稳定性和/或比活性提高。因此，可以在46℃以上的温度条件下实施基于TRC法的核酸扩增反应，能够提供与传统相比检测时间缩短的核酸扩增试剂。此外，在高温条件下RNA不易形成复杂的高级结构，以更高灵敏度进行检测的引物的设计也变得容易。因此，通过使用本发明的T7RNA聚合酶突变体，在46℃以上的温度条件下进行基于TRC法的核酸扩增反应，还能够提供与传统相比，以更高灵敏度进行检测的核酸扩增试剂。

实施例

以下通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不受这些实施例的限制。

实施例1T7RNA聚合酶基因的克隆

T7RNA聚合酶基因的克隆按照以下方法实施。

(1)以T7噬菌体基因组DNA基因组文库(SIGMA制)作为模板质粒，采用以下的试剂组成和反应条件，分前半部分和后半部分，采用PCR法扩增了T7RNA聚合酶基因。而且，试剂组成中的合成DNA引物分别使用了下述引物：前半部分的扩增使用了引物FF(SEQ ID NO：1)以及引物FR(SEQ IDNO：2)，后半部分的扩增使用了引物RF(SEQ ID NO：3)以及引物RR(SEQ IDNO：4)。

(试剂组成)(总反应液量：100μL)

各200pM合成DNA引物

100ng模板质粒

0.2mM dNTPs

0.025单位/μL TaqDNA聚合酶

(TaKaRa Ex Taq(商品名)、TAKARA Bio制)

酶的附带缓冲液

(反应条件)

使用热循环仪(thermal cycler)(Perkin-Elmer制)，94℃加热2分钟后，反复进行25次94℃、1分钟；58℃、30秒；72℃、1分钟的温度循环。

(2)利用1％琼脂糖对PCR反应后的液体进行电泳后，进行溴化乙锭染色，通过从染色后的凝胶上切出目的产物的条带，纯化了PCR产物。

(3)在纯化后的PCR产物中，将前半部分的PCR产物用限制酶BspHI以及HindIII(TAKARA Bio制)消化，并通过T4连接酶将其与用限制酶NcoI(TAKARA Bio制)以及HindIII消化后的pTrc99A载体(GE Healthcare Biosciences制)于4℃反应30分钟。

(4)用(3)的反应液转化大肠杆菌JM109株，并在LBG/Crb琼脂培养基(1％多蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、0.5％葡萄糖、1％琼脂、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))上进行选择，将37℃培养过夜后生长出的菌落所保持的质粒作为pTrc99A-T7F。

(5)按照常规方法，在制备pTrc99A-T7F后，将后半部分的PCR产物用限制酶HindIII消化，通过T4连接酶将其与限制酶HindIII消化后的pTrc99A-T7F于4℃反应30分钟。

(6)用(5)的反应液转化大肠杆菌JM109株，并在LBG/Crb琼脂培养基(1％多蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、0.5％葡萄糖、1％琼脂、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))上进行选择，将在37℃培养过夜后生长出的菌落所保持的质粒作为pTrc99A-T7RNApol。图1显示了pTrc99A-T7RNApol的限制酶图谱。而且，对于T7RNA聚合酶基因，通过采用实施例6所示的方法测定碱基序列，确认了未导入不希望的突变。所得T7RNA聚合酶的基因序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

实施例2表达载体的制作

以实施例1中制作的pTrc99A-T7RNApol(图1)为模板，采用PCR法扩增了含T7RNA聚合酶基因的DNA片段，并将其与pCDF2质粒(图2)连接。

(1)以pTrc99A-T7RNApol(图1)作为模板质粒，采用以下的试剂组成和反应条件，进行了PCR反应。

(试剂组成)(总反应液量：100μL)

200pM引物pTrcF(SEQ ID NO：7)

200pM引物pTrcR(SEQ ID NO：8)

100ng模板质粒

0.2mM dNTPs

0.025单位/μL TaqDNA聚合酶

(TaKaRa Ex Taq(商品名)、TAKARA Bio制)

酶的附带缓冲液

(反应条件)

使用热循环仪(Perkin-Elmer制)，94℃加热2分钟后，反复进行25次94℃、1分钟；58℃、30秒；72℃、2分钟40秒的温度循环。

(2)用1％琼脂糖进行电泳后，进行溴化乙锭染色，通过从染色后的凝胶上切出目的产物的条带，纯化了PCR产物。

(3)将纯化后的PCR产物用限制酶EcoT22I(TAKARA Bio制)以及BlnI(TAKARA Bio制)消化，通过T4连接酶将其与限制酶PstI(TAKARA Bio制)以及BlnI消化后的pCDF2质粒(图2)于4℃进行30分钟反应。

(4)用(3)的反应液转化大肠杆菌JM109株，在LBG/Crb琼脂培养基(1％多蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、0.5％葡萄糖、1％琼脂、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))上进行选择，将37℃培养过夜后生长出的菌落所保持的质粒作为pCDF2-T7RNAP。图3示出了pCDF2-T7RNAP的限制酶图谱。而且，对于T7RNA聚合酶基因，通过采用实施例6所示的方法测定碱基序列，确认了未导入不希望的突变。

(5)以pCDF2-T7RNAP(图3)为基础，采用以下所示的方法进行了组氨酸六聚体的导入。

(5-1)以pCDF2-T7RNAP(图3)作为模板质粒，采用以下的试剂组成和反应条件，进行了第1次PCR反应。而且，合成引物使用了引物HisF(SEQ IDNO：9)与引物pCDFR(SEQ ID NO：10)的组合、或引物HisR(SEQ ID NO：11)与引物pCDFF(SEQ ID NO：12)的组合。

(试剂组成)(总反应液量：100μL)

各200pM合成DNA引物

100ng模板质粒

0.2mM dNTPs

0.025单位/μL DNA聚合酶(PrimeSTAR HS DNA polymerase(商品名)、TAKARA Bio制)

酶的附带缓冲液

(反应条件)

使用热循环仪(Perkin-Elmer制)，98℃加热30秒后，反复进行30次98℃、30秒；55℃、30秒；72℃、3分钟的温度循环，然后72℃反应7分钟。

(5-2)用1％琼脂糖对反应液进行电泳后，进行溴化乙锭染色，通过从染色后的凝胶上切出目的产物的条带，纯化了PCR产物。

(5-3)以所得的2种PCR产物为模板，使用引物pCDFR(SEQ ID NO：10)和引物pCDFF(SEQ ID NO：12)的组合作为合成DNA引物，进行了第2次PCR反应。PCR反应中的试剂组成和反应条件除合成DNA引物和模板以外，与(5-1)条件相同，将扩增的产物像(5-2)那样用琼脂糖凝胶进行电泳后，进行了提取、纯化。

(5-4)向pCDF2-T7RNAP质粒(图3)和(5-3)中纯化的第2次PCR产物中加入0.2mM dNTPs、0.025单位/μL DNA聚合酶以及酶的附带缓冲液，使总反应液量为100μL。对于该反应液，使用热循环仪，95℃加热30秒后，反复进行18次95℃、30秒；55℃、1分钟；68℃、8分钟的温度循环，然后于68℃反应7分钟，从而进行了PCR反应。

(5-5)PCR反应结束后，加入10个单位的限制酶DpnI，37℃消化1小时，按照常规方法转化到大肠杆菌JM109中。

(5-6)将转化后得到的溶液涂布于LBG/Crb琼脂培养基(1％多蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、0.5％葡萄糖、1％琼脂、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))，37℃保温过夜。从生成的菌落采用常规方法提取质粒，作为pCDF2-T7RNAPHis质粒。图4显示了pCDF2-T7RNAPHis的限制酶图谱。而且，通过采用实施例6所示的方法测定碱基序列，确认了未导入不希望的突变以及导入了组氨酸六聚体。此外，从培养的菌体提取酶，确认了可以利用镍螯合树脂进行亲和纯化。所得的融合了组氨酸六聚体的T7RNA聚合酶的基因序列如SEQ ID NO：13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。

实施例3突变文库的制作(之1)

按以下流程，向实施例2中制作的pCDF2-T7RNAPHis质粒(图4)的T7RNA聚合酶基因导入了突变。

(1)以pCDF2-T7RNAPHis(图4)作为模板质粒，采用以下的试剂组成和反应条件，进行了易错PCR反应。

(试剂组成)(总反应液量：100μL)

0.1～0.3mM(视需要)MnCl₂

200pM引物pTrcFs(SEQ ID NO：15)

200pM引物pTrcRs(SEQ ID NO：16)

100ng模板质粒

0.2mM dATP

0.2mM dGTP

lmM dCTP

lmM dTTP

2mM MgCl₂

0.01单位/μL TaqDNA聚合酶(GoTaq(商品名)、Promega制)

酶的附带不含Mg的缓冲液

(反应条件)

使用热循环仪(Perkin-Elmer制)，94℃加热2分钟后，反复进行25次94℃、30秒；55℃、1分钟；72℃、8分钟的温度循环。

(2)用1％琼脂糖对PCR产物进行电泳后，进行溴化乙锭染色，对从染色后的凝胶切出的目的产物的条带进行了纯化。

(3)将纯化的T7RNA聚合酶基因用限制酶NcoI和PstI消化后，通过T4连接酶将其与用相同酶消化的pCDF2质粒(图2)于4℃反应30分钟，将反应后的DNA溶液作为T7RNA聚合酶基因突变体文库。

(4)按常规方法用制作的文库的一部分转化大肠杆菌JM109株，并纯化质粒，通过采用实施例6所示的方法测定碱基序列，确认了易错PCR的效果。

实施例4筛选载体的制作

为了评价实施例3中制作的突变文库的活性，进行了使用GFP的活性确认用载体的制作。

(1)对于GFP基因，基于碱基序列信息(GenBank Accession NumberAF183395)，合成了dsDNA。合成的GFP基因被设计成该GFP基因上具有T7启动子与克隆用的限制酶SphI(TAKARA Bio制)的碱基序列。

(2)将合成的GFP基因用限制酶SphI于37℃消化3小时，用1.0％琼脂糖进行电泳后，进行溴化乙锭染色，对从染色后的凝胶切出的目的产物的条带进行了纯化。使用T4连接酶将其与同样消化、纯化的pSTV28载体(TAKARA Bio制)于4℃反应30分钟。

(3)用(2)的反应液转化大肠杆菌JM109株，并在LBG/Cm琼脂培养基(1％多蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、0.5％葡萄糖、1％琼脂、30μg/mL氯霉素)上进行选择，获得了37℃培养过夜后生长出的菌落。

(4)将获得的菌落使用LBG/Cm液体培养基(1％多蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、0.5％葡萄糖、30μg/mL氯霉素)于37℃培养过夜后，回收质粒，将该质粒作为携带由T7启动子诱导表达的GFP基因的pSTVGFP。图5显示了pSTVGFP的限制酶图谱。

(5)将获得的pSTVGFP(图5)与实施例3中制作的T7RNA聚合酶基因突变体文库一起转化大肠杆菌JM109株。将该菌液用37℃的SOC培养基培养1.5小时后，1个克隆1个克隆地采集在FACAria细胞分选仪(日本BD制)上能够观察到荧光的菌株，并将用37℃的2×YTG/Crb培养基(1.6％细菌用胰蛋白胨、1％细菌用酵母提取物、0.5％NaCl、0.5％葡萄糖、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))繁殖出的菌株分别作为突变体候选株。

实施例5高温型T7RNA聚合酶的筛选

突变株的筛选使用96孔滴定板进行，以使得能够有效率地对突变体进行评价。

(1)在1mL容量的96孔深孔平板中加入200μL的LBG/Crb培养基(1％多蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、0.5％葡萄糖、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))，接菌实施例4中得到的GFP阳性菌落，以37℃、600转/分钟培养过夜。

(2)在2mL容量的96深孔平板中加入1.0mL的2×YTG/Crb培养基(1.6％细菌用胰蛋白胨、1％细菌用酵母提取物、0.5％NaCl、0.5％葡萄糖、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))，接菌10μL(1)中的过夜培养液，以37℃、750转/分钟开始培养。

(3)(2)中的培养进行约4小时后，添加50mM的IPTG(异丙基-β-硫代半乳糖苷)溶液10μL，将温度降至30℃，再进行3小时振荡培养。培养结束后，于4℃以3000转/分钟进行15分钟的离心分离来回收菌体，将所得的菌体于-30℃冷冻保存过夜。

(4)在冷冻的菌体中加入溶菌液100μL(组成：20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、0.2％Triton X-100、0.02％脱氧胆酸钠、0.03％溶菌酶(太阳化学制)、0.25单位的Benzonase(Novagen制))，30℃、500转/分钟振荡1小时，4℃、3000转/分钟进行30分钟离心分离，回收上清。

(5)将(4)中所得的上清的全部量加载于充填了镍螯合树脂(His-Bind(商品名)、Novagen制)的96孔过滤平板，用缓冲液A(含20mM咪唑以及500mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0))200μL洗涤4次后，用50μL的缓冲液B(含150mM咪唑以及500mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0))进行了洗脱。

(6)对于洗脱级分，像实施例7的流程那样测定蛋白质浓度和转录活性，求出了比活性，即相对于每单位蛋白质量的转录产物量。转录活性的测定条件设定为反应温度46℃、反应时间60分钟、T7RNA聚合酶量0.5μL，RNA的定量使用了Quant-IT RNA Assay Kit(商品名)(Invitrogen制)。从约4000个突变株中筛选出比活性高至野生型的约2倍的60个菌株。

实施例6测序方法

将实施例5中选择出的突变体候选株用37℃的LBG/Crb液体培养基(1％多蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、0.5％葡萄糖、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))培养过夜后，采用常规方法提取了质粒。提取的质粒中所含的T7RNA聚合酶基因的碱基序列测定采用以下方法进行。

(1)使用Big Dye Terminator v3.1cycle Sequencing Kit(商品名)(Applied Biosystems制)，用灭菌水配制附带的缓冲液2.0μL、预混物4.0μL、合成DNA引物3.2pmol、模板质粒500ng至20μL，使用热循环仪(Perkin-Elmer制)，96℃加热1分钟后，反复进行25次96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分钟的温度循环。

(2)对于(1)中制备的碱基序列测定用样品，使用Centri-Sep Spin Column(商品名)(ABI制)按以下所示的方法进行了纯化。

(2-1)向Centri-Sep Spin Column加入灭菌水800μL，使因涡旋而干燥的凝胶充分水合。

(2-2)在确认柱中无气泡后，室温放置2小时以上。

(2-3)依次拆下上面的帽儿(cap)和下面的塞子(stopper)，使柱内的灭菌水自然地落到凝胶表面上，然后730×g离心分离2分钟。

(2-4)在通过(2-1)～(2-3)制作的Spin Column的中央上样碱基序列测定用样品，通过730×g离心分离2分钟，并将样品回收到管中。

(2-5)对回收的样品进行减压干燥后，将其溶解在甲酰胺中。

(3)将(2)中制备的碱基序列测定用样品于95℃处理2分钟，在冰上骤冷后，通过ABI PRISM310-DNA Analyzer(商品名)(Applied Biosystems制)进行解析，测定了碱基序列。在碱基序列测定中使用的合成DNA引物方面，视需要选择使用了引物pTrcFs(SEQ ID NO：15)、引物pTrcRs(SEQ ID NO：16)、引物T7F0(SEQ ID NO：17)、引物T7F1(SEQ ID NO：18)、引物T7F2(SEQ IDNO：19)、引物T7F3(SEQ ID NO：20)、引物T7F4(SEQ ID NO：21)、引物T7F5(SEQ ID NO：22)、引物T7F6(SEQ ID NO：23)、引物T7R0(SEQ ID NO：24)、引物T7R1(SEQ ID NO：25)、引物T7R2(SEQ ID NO：26)、引物T7R3(SEQ IDNO：27)、引物T7R4(SEQ ID NO：28)、引物T7R5(SEQ ID NO：29)、引物T7R6(SEQ ID NO：30)。

(4)对于测定的碱基序列，使用GENETYX ver.8.0(商品名)(GENETYX制)进行了解析。

解析的结果，在19个菌株中发现了碱基序列的取代。其中，10个菌株中包含带来氨基酸的改变的突变。可知：其中的1个菌株中，在野生型T7RNA聚合酶碱基序列(SEQ ID NO：5)中，535位的腺嘌呤被鸟嘌呤取代，从而AAG密码子被GAG密码子取代，该聚合酶氨基酸序列(SEQ ID NO：6)的179位的赖氨酸突变成谷氨酸。将具有该突变的T7RNA聚合酶作为K179E突变体，其基因序列如SEQ ID NO：31所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示。而且可知：在其余9个菌株中，在野生型T7RNA聚合酶碱基序列(SEQID NO：5)中，2357位的腺嘌呤被胸腺嘧啶取代，从而CAA密码子被CTA密码子取代，该聚合酶氨基酸序列(SEQ ID NO：6)的786位的谷氨酰胺突变成亮氨酸。将具有该突变的T7RNA聚合酶作为Q786L突变体，其基因序列如SEQ ID NO：33所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示。

实施例7T7RNA聚合酶的制备与活性测定

T7RNA聚合酶的制备按以下所示的流程进行。

(1)在LBG/Crb液体培养基(1％多蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、0.5％葡萄糖、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))3mL中接菌实施例5中得到的转化体的甘油保存液，在18mL试管中37℃振荡培养过夜。

(2)在2×YTG/Crb培养基(1.6％细菌用胰蛋白胨、1％细菌用酵母提取物、0.5％NaCl、0.5％葡萄糖、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))100mL中接菌(1)的前培养液1.0mL，在500mL容量的带挡板的(ひだ付き)三角烧瓶中，37℃、150转/分钟(Tietech制、旋转式)进行培养。

(3)在(2)的培养进行约3～4小时后(O.D._600nm值约1.0左右)，添加500mM的IPTG(异丙基-β-硫代半乳糖苷)100μL，并将温度降至30℃，再振荡培养3小时。

(4)培养结束后，4℃、4000转/分钟离心分离15分钟，并回收菌体。在不立即进行菌体破碎的情况下，于-30℃保存。

(5)将回收的菌体用20mL的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗涤1次，然后重悬于相同组成的缓冲液20mL中，进行菌体破碎。菌体破碎是使用超声波发生装置(Insonator 201M(商品名)、久保田商事制)，于5℃以约150W的输出功率处理约5分钟。

(6)将所得的菌体破碎液于4℃、12000转/分钟离心分离10分钟，将回收的上清作为酶提取液，分别添加最终为500mM、20mM的氯化钠和咪唑，用于利用镍螯合树脂的亲和纯化。

(7)通过利用添加在T7RNA聚合酶上的组氨酸六聚体标签的亲和纯化，采用以下方法进行了酶的纯化。

(7-1)将2mL的镍螯合树脂(His-Bind(商品名)、Novagen制)的浆料充填在附带的空柱中，用3mL的灭菌水进行洗涤。

(7-2)对于洗涤后的镍螯合树脂，用5mL的50mM硫酸镍水溶液使螯合树脂上结合镍，再用3mL的缓冲液A(20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、500mM氯化钠、20mM咪唑)进行洗涤。向其中加入上述的酶提取液，用6mL的缓冲液A进行洗涤后，用1mL的缓冲液B(20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、500mM氯化钠、150mM咪唑)进行洗脱，回收了活性级分。

(7-3)利用脱盐柱(PD-10(商品名)、GE Healthcare Biosciences制)，将回收的级分替换成含5mM二硫苏糖醇以及0.1mM EDTA的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，并加入等量的甘油。对于纯化的T7RNA聚合酶，以牛血清白蛋白为对照蛋白质，使用Protein Assay Kit(BIO RAD制)求出了浓度。此外，通过7.5％浓度的SDS-PAGE分析了酶的纯度，确认其基本上单一。

(8)活性测定采用测定体外转录反应中生成的RNA量的方法来进行。而且，模板DNA可以使用具有特异性识别T7RNA聚合酶的T7启动子序列的DNA，而此处使用的是以含T7启动子序列的质粒为模板通过PCR扩增得到的约1.5kbp的DNA片段。此外，T7启动子序列的下游的DNA长度为1.0kbp，转录的RNA为约1.0kb。

(8-1)将除去了T7RNA聚合酶的反应液(40mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、20mM MgCl₂、5mM二硫苏糖醇、20ng模板DNA、0.4U RNase抑制剂、各0.4mM NTPs(ATP，CTP，GTP，UTP)装入0.2mL的PCR管，以冷却至0℃的状态加入纯化的T7RNA聚合酶，总计10μL。

(8-2)将刚才制备的PCR管设置在预先保温在反应温度的加热块(Mastercycler ep Gradient(商品名)、Eppendorf制)上，进行了转录反应。通过80℃加热2分钟使反应停止。

(8-3)采用下述方法分析了生成的RNA量：用1％琼脂糖凝胶进行电泳后，用溴化乙锭进行染色的方法，以及使用市售的RNA定量试剂盒Quant-ITRNA Assay Kit(商品名)(Invitrogen制)进行荧光染色，并通过用附带的标准RNA制作的标准曲线进行浓度换算的方法。

实施例8(K179E+Q786L)双重突变体的制作

以K179E突变体和Q786L突变体为基础，制作了具有K179E和Q786L这两个突变的双重突变体。

(1)分别从K179E突变体和Q786L突变体采用小量制备(miniprep)法制备了质粒。

(2)以从K179E突变体制备的质粒作为模板，采用以下的试剂组成和反应条件，进行了PCR反应。

(试剂组成)(总反应液量：100μL)

200pM引物T7R2(SEQ ID NO：26)

200pM引物pTrcFs(SEQ ID NO：15)

100ng模板质粒

0.2mM dNTPs

0.025单位/μL TaqDNA聚合酶

(TaKaRa Ex Taq(商品名)、TAKARA Bio制)

酶的附带缓冲液

(反应条件)

使用热循环仪(Perkin-Elmer制)，94℃加热2分钟后，反复进行25次的94℃、1分钟；58℃、30秒；72℃、2分钟40秒的温度循环。

(3)将反应液用1％琼脂糖进行电泳后，进行溴化乙锭染色，对从染色后的凝胶切出的目的产物的条带进行了纯化。

(4)除了以从Q786L突变体制备的质粒为模板、使用引物T7F2(SEQ IDNO：19)和引物pTrcRs(SEQ ID NO：16)的组合作为合成引物以外，采用与(1)～(2)相同的条件进行了PCR反应和纯化。

(5)以(3)和(4)所得的2种纯化PCR产物作为模板，进一步进行PCR反应，制作了双重突变体基因。而且，PCR反应中的试剂组成、反应条件以及纯化操作，除了使用引物pTrcFs(SEQ ID NO：15)和引物pTrcRs(SEQ IDNO：16)的组合作为合成DNA引物之外，采用与(1)～(2)相同的条件。

(6)将(5)中所得的纯化双重突变体基因用限制酶NcoI以及PstI(TAKARA Bio制)消化后，通过T4连接酶将其与用同样的酶消化的pCDF2载体于4℃、反应30分钟。

(7)用(6)的反应液转化大肠杆菌JM109株，在LBG/Crb琼脂培养基(1％多蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、0.5％葡萄糖、1％琼脂、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))上进行选择，将37℃培养过夜后生长出的菌落作为双重突变体。进一步，对于双重突变体，通过实施例6所示的碱基序列测定方法确认了突变的导入，其为(K179E+Q786L)突变体。其基因序列如SEQ IDNO：35所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示。

实施例9突变型T7RNA聚合酶的热稳定性评价(之1)

如下地测定突变型T7RNA聚合酶的热稳定性。

(1)从实施例5筛选出的突变体的碱基序列解析结果(实施例6)中，对于在高温区活性高于野生型的、179位的氨基酸由赖氨酸被取代成谷氨酸的突变体(K179E)、786位的氨基酸由谷氨酰胺被取代成亮氨酸的突变体(Q786L)以及兼具2个突变的双重突变体(K179E+Q786L)，按照实施例7记载的方法制备了纯化酶。而且，按照实施例7所示的方法测定了纯化的酶的蛋白质浓度以及转录活性。

(2)将实施例7中制备的各种T7RNA聚合酶用稀释液(40mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、20mM氯化镁、5mM二硫苏糖醇、70mM KCl、0.1mg/mL牛血清白蛋白)制备成50μg/mL。

(3)以25μL的量分装至0.2mL的PCR管中，于47℃分别加热5分钟、10分钟、20分钟。

(4)加热处理后，进行离心分离回收上清，然后于43℃进行30分钟的转录反应，求出残留活性。

(5)对于生成的RNA量，通过使用1％琼脂糖的电泳进行了分析。

结果如图6所示。根据图6，即使是在野生型基本上没有活性的47℃，突变体Q786L以及(K179E+Q786L)也可以确认到明显的RNA的条带。由此可知：导入了至少Q786L的突变的T7RNA聚合酶在热稳定性方面优于野生型。

实施例10突变型T7RNA聚合酶的活性评价(之1)

如下测定了突变型T7RNA聚合酶在各反应温度的活性。

(2)T7RNA聚合酶的活性是使T7RNA聚合酶的酶量为10μg/mL、反应温度在43～50℃的范围、反应10分钟来测定的。

(3)使用Quant-IT RNA Assay Kit(商品名)(Invitrogen制)求出了生成的RNA的量。

测定的RNA浓度如图7所示。可知突变体K179E在42.9℃～46.8℃的范围的比活性高于野生型，由此可知：导入了至少K179E的突变的T7RNA聚合酶的比活性与野生型相比有所提高。然后，突变体Q786L在44.7℃～47.9℃的范围的比活性高于野生型，可以认为这源于根据实施例9的结果热稳定性提高。此外，双重突变体(K179E+Q786L)在42.9℃～47.9℃的温度区的比活性高于野生型。由此可知：导入了至少K179E和Q786L的突变的T7RNA聚合酶的热稳定性和比活性与野生型相比有所提高。

实施例11突变型T7RNA聚合酶基因的制备(之1)

野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)中179位的赖氨酸被其它氨基酸取代后的T7RNA聚合酶的编码基因的制备，按以下所示的流程进行。

(1)以pCDF2-T7RNAPHis(图4)为模板质粒，采用以下的试剂组成和反应条件，进行了第1次PCR反应。而且，作为扩增T7聚合酶基因的5’末端侧的合成DNA引物，使用了引物pCDFF(SEQ ID NO：12)与引物179MIXR(SEQ ID NO：39)的组合，而作为扩增3’末端侧的合成引物，使用了引物179MIXF(SEQ ID NO：37)与引物pCDFR2(SEQ ID NO：38)的组合。

(试剂组成)(总反应液量：100μL)

各200pM合成DNA引物

100ng模板质粒

0.2mM dNTPs

酶的附带缓冲液

(反应条件)

使用热循环仪(Perkin-Elmer制)，98℃加热30秒后，反复进行30次98℃、30秒；55℃、30秒；72℃、1分钟30秒的温度循环，然后72℃反应7分钟。

(2)将(1)中制备的PCR产物用1％琼脂糖进行电泳后，进行溴化乙锭染色，通过从染色后的凝胶上切出目的产物的条带，纯化了PCR产物。

(3)以所得的2种(5’末端侧以及3’末端侧)PCR产物为模板，使用引物pCDFF(SEQ ID NO：12)与引物pCDFR2(SEQ ID NO：38)作为合成DNA引物，进行了第2次PCR反应。PCR反应中的试剂组成以及反应条件，除了合成DNA引物和模板以外采用与(1)相同的条件，对于扩增的产物像(2)那样用琼脂糖凝胶进行电泳后，进行了提取、纯化。

(4)将(3)中纯化的第2次PCR产物用限制酶NruI以及SacI消化后，通过T4连接酶将其与用相同酶消化的pCDF2-T7RNAPHis质粒(图4)于4℃反应30分钟，将反应后的DNA溶液作为T7RNA聚合酶基因突变体文库。

(5)用(4)中制作的文库转化大肠杆菌JM109株，从各文库中选择出在37℃的LBG/Crb培养基(1.0％细菌用胰蛋白胨、0.5％细菌用酵母提取物、0.5％NaCl、0.5％葡萄糖、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))上增殖出的菌落90个。

(6)对于选择出的菌株，按常规方法提取质粒后，除了使用pCDFF(SEQID NO：12)作为碱基序列测定用合成DNA引物外，像实施例6的流程那样进行了碱基序列测定，从而确认了碱基序列的突变。

实施例12突变型T7RNA聚合酶基因的制备(之2)

野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)中786位的谷氨酰胺被其它氨基酸取代后的T7RNA聚合酶的编码基因的制备按以下所示的流程进行。

(1)以pCDF2-T7RNAPHis(图4)作为模板质粒，采用以下的试剂组成和反应条件，进行了第1次PCR反应。而且，作为用于扩增T7聚合酶基因的5’末端侧的合成DNA引物，使用了引物pCDFF4(SEQ ID NO：42)与引物786MIXR(SEQ ID NO：41)的组合，作为用于扩增3’末端侧的合成引物，使用了引物786MIXF(SEQ ID NO：40)与引物pTrcRS(SEQ ID NO：16)的组合。

(试剂组成)(总反应液量：100μL)

各200pM合成DNA引物

100ng模板质粒

0.2mM dNTPs

酶的附带缓冲液

(反应条件)

使用热循环仪(Perkin-Elmer制)，98℃加热30秒后，反复进行30次的98℃、30秒；55℃、30秒；72℃、1分钟30秒的温度循环，然后72℃反应7分钟。

(3)以所得的2种(5’末端侧以及3’末端侧)PCR产物为模板，使用引物pCDFF4(SEQ ID NO：42)与引物pTrcRS(SEQ ID NO：16)作为合成DNA引物，进行了第2次PCR反应。PCR反应中的试剂组成以及反应条件，除了合成DNA引物与模板以外，采用与(1)相同的条件进行，对于扩增的产物，像(2)那样使用琼脂糖凝胶进行电泳后，进行了提取、纯化。

(4)将(3)中纯化的第2次PCR产物用限制酶HindIII和KpnI消化后，通过T4连接酶将其与用相同酶消化的pCDF2-T7RNAPHis质粒(图4)于4℃反应30分钟，将反应后的DNA溶液作为T7RNA聚合酶基因突变体(179位)文库。

(5)用(4)中制作的文库转化大肠杆菌JM109株，从各文库选择出在37℃的LBG/Crb培养基(1.0％细菌用胰蛋白胨、0.5％细菌用酵母提取物、0.5％NaCl、0.5％葡萄糖、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))上增殖的菌落90个。

(6)对于选择出的菌株，采用常规方法提取质粒，除了使用pCDFF4(SEQID NO：42)作为碱基序列测定用合成DNA引物以外，像实施例6的流程那样进行了碱基序列测定，从而确认了碱基序列的突变。

实施例13突变型T7RNA聚合酶突变体的活性评价(之2)

从实施例11以及12中制作的突变型T7RNA聚合酶基因出发，按实施例7的方法实施T7RNA聚合酶的制备以及转录活性的测定。结果如图8(179位的赖氨酸被取代成其它氨基酸而得的T7RNA聚合酶)以及9(786位的谷氨酰胺被取代成其它氨基酸而得的T7RNA聚合酶)所示。

在179位的赖氨酸被取代成其它氨基酸的情况下，除了筛选所得的谷氨酸取代(K179E)之外，半胱氨酸取代(K179C)、天冬酰胺取代(K179N)的突变体的耐热性和/或比活性也比野生型高，特别是取代成谷氨酸(K179E)的突变体的耐热性和比活性相对于野生型大幅提高(图8)。

另一方面，在786位的谷氨酰胺被取代成其它氨基酸的情况下，除了筛选所得的亮氨酸取代(Q786L)之外，甲硫氨酸取代(Q786M)、苯丙氨酸取代(Q786F)、酪氨酸取代(Q786Y)的突变体的耐热性和/或比活性也比野生型高，特别是取代成甲硫氨酸(Q786M)的突变体的耐热性和比活性相对于野生型大幅提高(图9)。

实施例14突变型T7RNA聚合酶的热稳定性评价(之2)

采用以下所示的方法测定了实施例13中制备的突变型T7RNA聚合酶的热稳定性。

(1)对于实施例13中制备的突变型T7RNA聚合酶(Q786M、Q786L、Q786F、Q786Y、K179E、K179C、以及K179N)以及野生型T7RNA聚合酶，使用以下所示组成的缓冲液将其制备成100μg/mL，在分成25μL注入0.2mL的PCR管中后，于47℃加热处理1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟。

(缓冲液组成)

40mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)

20mM MgCl₂

5mM二硫苏糖醇

70mM KCl

0.01mg/mL牛血清白蛋白

(2)使用加热处理后的液体，通过43℃、30分钟的转录反应测定活性，用各处理时间的活性除以加热前的活性，将所得的值作为残留活性。

残留活性的曲线如图10所示。此外，由图10的曲线的斜率求出各种突变型T7RNA聚合酶以及野生型的半衰期，其结果如表1所示。由表1可知，各种突变型T7RNA聚合酶的半衰期长于野生株，其在48℃的热稳定性良好。此外可知，特别是Q786L以及Q786M突变型T7RNA聚合酶的热稳定性高。

表1

T7RNA聚合酶	半衰期(分钟)
		Q786M突变型	12.9
Q786L突变型	19.9
		Q786F突变型	4.0
Q786Y突变型	4.7
		K179E突变型	4.0
K179C突变型	2.1
		K179N突变型	1.9
野生型	1.6

实施例15突变文库的制作(之2)

使用实施例8中制作的(K179E+Q786L)突变体基因序列(SEQ ID NO：35)、以及在所述序列的5’末端侧包含组氨酸六聚体序列的质粒载体pCDF2-T7RNAPHis(K179E+Q786L)，按以下流程导入突变。

(1)以pCDF2-T7RNAPHis(K179E+Q786L)作为模板质粒，采用以下的试剂组成和反应条件，进行了易错PCR反应。

(试剂组成)(总反应液量：100μL)

0.1～0.3mM(视需要)MnCl₂

200pM引物pTrcFs(SEQ ID NO：15)

200pM引物pTrcRs(SEQ ID NO：16)

100ng模板质粒

0.2mM dATP

0.2mM dGTP

1mM dCTP

1mM dTTP

2mM MgCl₂

0.01单位/μL TaqDNA聚合酶(GoTaq(商品名)、Promega制)

酶的附带的不含Mg的缓冲液

(反应条件)

(2)将PCR产物用1％琼脂糖进行电泳后，进行溴化乙锭染色，将其从凝胶上切出，并进行了纯化。

(3)将纯化后的T7RNA聚合酶基因用限制酶NcoI以及PstI消化后，通过T4连接酶将其与用相同酶消化的pCDF2-T7RNAPHis质粒(图4)于4℃反应30分钟，将反应后的DNA溶液作为T7RNA聚合酶基因突变体文库。

(4)用制作的T7RNA聚合酶基因突变体文库转化包含实施例4中制作的质粒pSTVGFP(图5)的大肠杆菌JM109株，将所述转化液用37℃的SOC培养基培养1小时后，将在LBG/Crb/Cm琼脂体培养基(1％多蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、0.5％葡萄糖、50μg/mL羧卡青霉素、30μg/mL氯霉素、1.5％琼脂)上增殖、且发GFP荧光的菌株作为突变体候选株。而且，对于制作的文库，使用其的一部分、采用常规方法转化大肠杆菌JM109株，并纯化质粒，通过采用实施例6所示的方法测定碱基序列，确认了易错PCR的效果。

实施例16高温型T7RNA聚合酶的筛选(之2)

实施例15所得的突变株的筛选采用与实施例5中相同的方法进行筛选。筛选的结果是，从约4000个突变株中，得到了比活性高至实施例8中制作的(K179E+Q786L)突变型T7RNA聚合酶的约2倍的34个菌株，将其作为一次候选株。进一步，对于所述一次候选株，采用与实施例5相同的方法进行再筛选，最终选定了1个菌株，其比活性高至(K179E+Q786L)突变型T7RNA聚合酶的2倍以上。

实施例17选定株的碱基序列解析

对于实施例16中选定的菌株，采用实施例6所述的方法进行了碱基序列的确认，确认了突变位点。结果可知，通过碱基序列2054位的胸腺嘧啶被取代成胞嘧啶，GTG密码子被取代成GCG密码子，从而氨基酸序列685位的缬氨酸突变成丙氨酸。将具有该突变的T7RNA聚合酶作为(K179E+Q786L+V685A)突变体，其基因序列如SEQ ID NO：43所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：44所示。

实施例18(K179E+Q786L+V685A)突变型T7RNA聚合酶的制作

使用实施例16中所得的表达具有组氨酸六聚体序列的(K179E+Q786L+V685A)三重突变型T7RNA聚合酶的大肠杆菌JM109株，按以下的流程制备了酶。

(1)在LBG/Crb液体培养基(1％多蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、0.5％葡萄糖、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))40mL中接菌实施例16所得的菌株的甘油保存液，在100mL容量的带挡板的三角烧瓶中37℃振荡培养过夜。

(2)在1.5L的2×YTG/Crb培养基(1.6％细菌用胰蛋白胨、1％细菌用酵母提取物、0.5％NaCl、0.5％葡萄糖、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))中接菌前培养液30mL，用3L容量的发酵槽于37℃进行培养。

(3)在(2)的培养进行约3小时后(O.D._600nm值为约2.0)，添加500mM的IPTG(异丙基-β-硫代半乳糖苷)1.5mL，将温度降至30℃，再培养3小时。将培养中的氧浓度调整在1.6ppm以上，pH调整在6.8～7.2的范围。

(4)培养结束后，进行4℃、15分钟、7000转/分钟的离心分离，得到了湿菌体21g。将菌体用100mL的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)进行洗涤，在不立即进行后续处理的情况下，于-30℃保存。

(5)将回收的菌体的一半量悬浮于含0.1mM PMSF和1mM EDTA的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)42mL中，破碎菌体。菌体破碎是使用超声波发生装置(Insonator 201M(商品名)、久保田商事制)，于5℃以约150W的输出功率处理约5分钟，通过进行4℃、10分钟、12000转/分钟的离心分离，回收了可溶性级分。

(6)在回收的级分45mL中分别添加5.1mL的2M硫酸铵、以及0.95mL的10％聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)，0℃保温约1小时后，进行4℃、10分钟、12000转/分钟的离心分离，回收了上清。

(7)使用回收的上清的一部分，按照实施例7所示的方法，通过利用组氨酸六聚体标签的亲和色谱进行了纯化。

通过280nm的吸光度求出纯化后的T7RNA聚合酶的蛋白质浓度。此外，通过5～20％浓度的SDS-PAGE分析了酶蛋白纯度，确认了为基本上单一的蛋白质。

实施例19突变型T7RNA聚合酶的活性评价(之3)

实施例18中制作的(K179E+Q786L+V685A)三重突变型T7RNA聚合酶的活性评价，采用实施例7所示的测定通过体外转录反应生成的RNA量的方法来进行。而且，转录反应温度设定为43～50℃的范围，T7RNA聚合酶的酶量为10ng/μL，反应时间为30分钟。此外，作为对照，使用了实施例8中制作的(K179E+Q786L)双重突变型T7RNA聚合酶、以及野生型T7RNA聚合酶。

各温度下生成的RNA量如图11所示。由图11可知，与原突变体即(K179E+Q786L)双重突变体相比，(K179E+Q786L+V685A)三重突变体在反应温度46℃以上的比活性高。

实施例20突变型T7RNA聚合酶的热稳定性评价(之3)

T7RNA聚合酶各种突变体以及野生型的热稳定性采用以下方法测定。

(1)将实施例18中制作的(K179E+Q786L+V685A)三重突变型T7RNA聚合酶、实施例8中制作的(K179E+Q786L)双重突变体型T7RNA聚合酶、以及野生型T7RNA聚合酶使用以下所示组成的缓冲液制备成100μg/mL，分成25μL注入0.2mL的PCR管后，于48℃加热处理1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟。

(缓冲液组成)

40mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)

20mM MgCl₂

5mM二硫苏糖醇

70mM KCl

0.01mg/mL牛血清白蛋白

(2)使用加热处理后的液体，于43℃通过30分钟的转录反应测定活性，用各处理时间的活性除以加热前的活性，将所得的值作为残留活性。

残留活性的曲线如图12所示。此外，由图12的曲线的斜率求出各种突变型T7RNA聚合酶以及野生型的半衰期，结果如表2所示。由表2可知，与(K179E+Q786L)双重突变体、野生株相比，(K179E+Q786L+V685A)三重突变体的半衰期长，其在48℃的热稳定性好。

表2

T7RNA聚合酶	半衰期(分钟)
		(K179E+Q786L+V685A)突变型	5.3
(K179E+Q786L)突变型	1.7
		野生型	＜1

实施例21(Q786L+M685A)突变型T7RNA聚合酶的制作

从实施例18中制作的(K179E+Q786L+V685A)三重突变型T7聚合酶出发，采用以下的方法制作了(Q786L+V685A)双重突变型T7聚合酶。

(1)采用小量制备法制备了插入有编码(K179E+Q786L+V685A)三重突变型T7RNA聚合酶的基因的pCDF2-T7RNAPHis(K179E+Q786L+V685A)质粒、以及插入有编码野生型T7RNA聚合酶的基因的质粒pCDF2-T7RNAP(图3)。

(2)采用常规方法将两种质粒200ng用限制酶KpnI和SacI消化，琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶提取法纯化了野生型的4.5kbp片段以及(K179E+Q786L+V685A)突变体的1.4kbp片段。

(3)使用T4连接酶将纯化后的野生型片段40ng和(K179E+Q786L+V685A)突变体片段80ng于16℃反应30分钟，采用常规方法转化大肠杆菌JM109株。

(4)对于所述转化体，在LBG/Crb琼脂培养基(1％多蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、0.5％葡萄糖、1.5％琼脂、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))上进行选择，制备了37℃培养过夜后生长出的菌落的质粒。

对于(4)中制备的质粒，采用实施例6所示的碱基序列测定方法，确认了目的突变的导入。该质粒基因序列如SEQ ID NO：45、氨基酸序列如SEQ IDNO：46所示。

实施例22(Q786L+V685A)突变型T7RNA聚合酶的纯化

使用实施例21中制作的表达(Q786L+V685A)双重突变型T7RNA聚合酶的大肠杆菌JM109株，采用以下方法制备了(Q786L+V685A)突变型T7RNA聚合酶。

(1)按实施例18所示的流程进行培养，得到了湿菌体28g。

(2)将所得的菌体悬浮于含0.1mM PMSF和1mM EDTA的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)112mL后，利用超声波破碎菌体，通过离心分离回收了上清。

(3)相对于所得的酶提取液135mL，添加17.5mL的2M硫酸铵以及3.5mL的10％聚乙烯亚胺，0℃保温约1小时后，通过离心分离回收了上清。

(4)在回收的上清130mL中加入51g的硫酸铵，0℃保温1小时后，通过离心分离回收沉淀，将该沉淀溶解于以下组成的缓冲液30mL中。

(缓冲液组成)

20mM磷酸钾缓冲液(pH7.6)

1mM二硫苏糖醇

0.1mM PMSF

1mM EDTA

(5)对于(4)中制备的沉淀溶解液，按照以下的方法利用高速液体色谱进行了纯化。

(5-1)使用疏水柱(TSKgel Phenyl-5PW(商品名)、东曹制)，按以下的条件进行了纯化。

(纯化条件)

洗脱液A：

20mM磷酸钾缓冲液(pH7.2)

50mM NaCl

0.6M硫酸铵

1mM DTT

1mM EDTA

洗脱液B：

组成中不含硫酸铵，其它同洗脱液A

梯度：

0分钟～60分钟：洗脱液A100％

60分钟～120分钟：洗脱液A100％至0％的线性梯度

120分钟～130分钟：洗脱液A0％

130分钟：洗脱液A0％至100％的不连续梯度

检测：280nm

流速：4mL/分钟

(5-2)通过SDS-PAGE回收了T7RNA聚合酶含量多的级分100mL，用39g的硫酸铵进行了盐析。

(5-3)将利用离心分离回收的盐析物溶解于以下所示组成的缓冲液5mL中。

(缓冲液组成)

20mM磷酸钾缓冲液(pH7.6)

1mM二硫苏糖醇

0.1mM PMSF

1mM EDTA

(5-4)使用分级分子量12000的透析膜，用相同组成的缓冲液于4℃透析过夜，利用离子交换柱(TSKgel DEAE-5PW(商品名)、东曹制)按以下的条件进行了纯化。

(纯化条件)

洗脱液A：

20mM磷酸钾缓冲液(pH7.6)

50mM NaCl

1mM二硫苏糖醇

1mM EDTA

洗脱液B：

将洗脱液A中的NaCl浓度变更为0.8M

梯度：

0分钟～20分钟：洗脱液A100％

20分钟～80分钟：洗脱液A100％至0％的线性梯度

80分钟～90分钟：洗脱液A0％

90分钟：洗脱液A0％至100％的不连续梯度

检测：280nm

流速：4mL/分钟

(5-5)通过SDS-PAGE分析回收了T7RNA聚合酶含量多的级分5mL，用1.95g的硫酸铵进行了盐析。

(5-6)将其溶解于用于凝胶过滤纯化的缓冲液1mL中，利用凝胶过滤柱(TSKgel G3000SW(商品名)、东曹制)按以下条件进行了纯化。

(纯化条件)

洗脱液：

40mM磷酸钾缓冲液(pH7.6)

200mM NaCl

2mM二硫苏糖醇

0.2mM EDTA

检测：280nm

流速：5mL/分钟

(5-7)通过SDS-PAGE分析，回收了T7RNA聚合酶含量多的级分4mL。

(5-8)将回收级分用1.56g的硫酸铵进行盐析，然后使用脱盐柱(PD-10(商品名)、GE Healthcare Biosciences制)，并与凝胶过滤柱纯化相同组成的缓冲液进行替换，加入等量的甘油，最终为2.5mL。

通过280nm的吸光度求出纯化的T7RNA聚合酶双重突变体的蛋白质浓度为1.9mg/mL。此外，用5～20％浓度的SDS-PAGE对酶蛋白进行分析，确认为基本上单一的条带。

实施例23利用突变型T7RNA聚合酶进行核酸扩增反应

使用实施例22中制备的(Q786L+M685A)双重突变型T7RNA聚合酶基于TRC法进行核酸扩增，按以下的方法以沙门氏菌毒素基因(stn RNA)作为靶标RNA，并进行了测定。而且，作为对照，使用了野生型T7RNA聚合酶。

(1)将沙门氏菌stn mRNA检测试剂(TRCRtest stn-m(商品名)、东曹制)附带的stn RNA阳性标准(浓度：10⁶拷贝/5μL)用RNA稀释液(10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mM EDTA、0.5U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、5mM二硫苏糖醇)稀释成10⁴拷贝/5μL。对照试验区(阴性)仅使用RNA稀释液。

(2)将以下组成的反应液分成20μL注入0.5mL容量的PCR用管，向其中添加上述RNA试样5μL。

(反应液的组成)(最终反应液量30μL中的浓度或量)

60mM Tris-HCl缓冲液(pH8.6)

17mM MgCl₂

100mM KCl

6U RNase Inhibitor

1mM二硫苏糖醇

各0.25mM dATP、dCTP、dGTP、

dTTP

3.6mM ITP

各3.0mM ATP、CTP、GTP、UTP

0.12μM切割用寡核苷酸(SEQ ID NO：47、3’末端的羟基氨基化)

1.0μM第一引物(SEQ ID NO：48)

1.0μM第二引物(SEQ ID NO：49)

7.5nM嵌入性荧光染料标记的核酸探针(SEQ ID NO：50、5’末端侧12位的“A”与13位的“A”之间用嵌入性荧光染料标记、且3’末端侧的羟基用二醇基(glycol group)修饰)

1％DMSO

容量调整用蒸馏水

(3)将(2)的反应液保温(其中，对于突变体是在49℃、50℃、51℃各温度，对于野生型是在43℃、49℃各温度)5分钟后，添加预先在各温度保温2分钟的以下所示组成的酶液5μL。

(酶液的组成)(最终反应液量30μL中的浓度或量)

2％山梨醇

3.6μg牛血清白蛋白

4U AMV逆转录酶(Life Science制)

46U T7RNA聚合酶

容量调整用蒸馏水

(4)使用可直接测定的具有温度调节功能的荧光光度计，在各温度下保温PCR管，以激发波长470nm、荧光波长510nm随时间对反应溶液进行了测定。

以添加酶时的时间为0分钟，反应液的荧光强度比(指定时间的荧光强度值除以背景的荧光强度值所得的值)的时间变化如图13所示。使用野生型T7RNA聚合酶的情况下，反应温度49℃时未见stn RNA的扩增；与此相对，使用(Q786L+V685A)双重突变体的情况下，在反应温度51℃仍可见stn RNA的扩增。由此可知：与野生型T7RNA聚合酶相比，(Q786L+V685A)双重突变体在49℃～51℃的高温区域的热稳定性和/或比活性好。

实施例24基于T7RNA聚合酶突变体的核酸扩增反应的最低检测浓度测定

确认了实施例22中制备的(Q786L+V685A)双重突变型T7RNA聚合酶针对stn mRNA标准RNA的最低检测浓度。

测定方法如下，除了将反应温度变更为50℃(双重突变体)或43℃(野生型)、将靶标RNA的浓度变更为10、50、100、300、500、1000拷贝/5μL之外，按与实施例23相同的方法进行。

各初期RNA拷贝数下的(Q786L+V685A)双重突变型T7RNA聚合酶以及野生型T7RNA聚合酶的检出率如表3所示。表3显示：使用(Q786L+V685A)双重突变体时的stn RNA检出率高于野生型43℃的检出率；对显示检出率80％以上的最小RNA浓度进行比较，则野生型为1000拷贝/5μL，而(Q786L+V685A)双重突变体为200拷贝/5μL。可知，当在两酶的最适温度条件下进行比较时，与野生型相比，(Q786L+V685A)突变体的灵敏度提高至约5倍。

表3

实施例25V685A突变型T7RNA聚合酶的制作

从实施例2中制作的pCDF-T7RNAPHis质粒(图4)的T7RNA聚合酶基因出发，按以下的流程制作了氨基酸序列685位的缬氨酸突变成丙氨酸的T7RNA聚合酶突变体(V685A突变体)。

(1)以pCDF2-T7RNAPHis(图4)作为模板质粒，采用以下的试剂组成和反应条件，进行了PCR反应。而且，合成引物使用了引物V685AF(SEQ IDNO：51)与引物pTrcRs(SEQ ID NO：16)的组合、或pCDFF4(SEQ ID NO：42)与引物V685AR(SEQ ID NO：53)的组合。

(试剂组成)(总反应液量：50μL)

各100pM合成DNA引物

50ng模板质粒

0.1mM dNTPs

酶的附带缓冲液

(反应条件)

使用热循环仪(Perkin-Elmer制)，96℃加热30秒后，反复进行30次的96℃、30秒；50℃、30秒；72℃、1分钟的温度循环。

(2)将反应液用1％琼脂糖电泳进行分离后，进行溴化乙锭染色，对从染色后的凝胶切出的目的产物的条带进行了纯化。

(3)以(2)中所得的、2种纯化PCR产物作为模板，再进行PCR反应，制作了V685A突变体基因。而且，PCR反应中的试剂组成、反应条件以及纯化操作，除了作为合成DNA引物使用引物pCDFF4(SEQ ID NO：42)与引物pTrcRs(SEQ ID NO：16)的组合之外，采用与(1)～(2)相同的条件。

(4)将(3)中所得的DNA片段用限制酶HindIII以及KpnI(TAKARA Bio制)消化后，通过T4连接酶将其与用相同酶消化的pCDF2-T7RNAPHis载体于4℃反应30分钟。

(5)用(4)的反应液转化大肠杆菌JM109株，在LBG/Crb琼脂培养基(1％多蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、0.5％葡萄糖、1.5％琼脂、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))上进行选择，将37℃培养过夜后生长出的菌落作为V685A突变体。而且，对于V685A突变体通过实施例6所示的碱基序列测定方法确认了突变的导入。其基因序列如SEQ ID NO：54、氨基酸序列如SEQID NO：55所示。

实施例26V685A突变型T7RNA聚合酶的纯化与活性评价

使用表达实施例25中制作的V685A突变型T7RNA聚合酶的大肠杆菌JM109株，采用实施例7所示的方法进行了V685A突变型T7RNA聚合酶的制备以及活性评价。而且，转录反应温度设定为43～49℃的范围，T7RNA聚合酶的酶量为20ng/μL，反应时间为30分钟。此外，作为对照，使用了野生型T7RNA聚合酶。

各温度下生成的RNA量如图14所示。由图14可知：与野生型相比，V685A突变型T7RNA聚合酶在反应温度45℃以上的RNA生产量多，高温下的比活性提高。

实施例27V685A突变型T7RNA聚合酶的热稳定性评价

使用实施例26中制备的V685A突变型T7RNA聚合酶，按照实施例20所示的方法对V685A突变型T7RNA聚合酶的热稳定性进行了评价。而且，加热处理温度设定为46℃，处理时间为1分钟、2分钟、5分钟。此外，作为对照，使用了野生型T7RNA聚合酶。

残留活性的曲线如图15所示。此外，由图15的曲线的斜率求出V685A突变型T7RNA聚合酶以及野生型的半衰期，结果如表4所示。由表4可知：与野生型相比，V685A突变体的半衰期长，46℃的热稳定性好。

表4

T7RNA聚合酶	半衰期(分钟)
		V685A突变型	1.4
野生型	0.9

实施例28(V685A+Q786M)突变型T7RNA聚合酶的制作

使用实施例25中制作的、插入有V685A突变体T7RNA聚合酶基因的pCDF-T7RNAPHis质粒(图4)，采用以下方法，制作了进一步氨基酸序列786位的谷氨酰胺突变成甲硫氨酸的(V685A+Q786M)双重突变型T7RNA聚合酶。

(1)以V685A突变体的pCDF2-T7RNAPHis作为模板质粒，采用以下的试剂组成和反应条件，进行了PCR反应。而且，合成引物使用了引物Q786MF(SEQ ID NO：56)与引物pTrcRs(SEQ ID NO：16)的组合、或pCDFF4(SEQ ID NO：42)与引物Q786MR(SEQ ID NO：57)的组合。

(试剂组成)(总反应液量：50μL)

各100pM合成DNA引物

50ng模板质粒

0.1mM dNTPs

酶的附带缓冲液

(反应条件)

(2)将反应液用1％琼脂糖电泳分离后，进行溴化乙锭染色，对从染色后的凝胶切出的目的产物的条带进行了纯化。

(3)以(2)中所得的、2种纯化PCR产物作为模板，再进行PCR反应，制作了(V685A+Q786M)突变体基因。而且，PCR反应中的试剂组成、反应条件以及纯化操作，除了作为合成DNA引物使用引物pCDFF4(SEQ ID NO：42)与引物pTrcRs(SEQ ID NO：16)的组合之外，采用与(1)～(2)相同的条件。

(5)用(4)的反应液转化大肠杆菌JM109株，在LBG/Crb琼脂培养基(1％多蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、0.5％葡萄糖、1.5％琼脂、50μg/mL羧卡青霉素(pH7.4))上进行选择，将37℃培养过夜后生长出的菌落作为(V685A+Q786M)突变体。而且，对于(V685A+Q786M)突变体，采用实施例6所示的碱基序列测定方法确认了突变的导入。其基因序列如SEQ ID NO：58、氨基酸序列如SEQ ID NO：59所示。

实施例29(V685A+Q786M)突变型T7RNA聚合酶的纯化与活性评价

使用表达实施例28中制作的(V685A+Q786M)突变型T7RNA聚合酶的大肠杆菌JM109株，采用实施例7所示的方法，进行了(V685A+Q786M)突变型T7RNA聚合酶的制备以及活性评价。而且，转录反应温度设定为43～50℃的范围，T7RNA聚合酶的酶量为20ng/μL，反应时间为30分钟。此外，作为对照，使用了野生型T7RNA聚合酶。

各温度下生成的RNA量如图16所示。由图16可知：与野生型相比，(V685A+Q786M)突变型T7RNA聚合酶在反应温度45℃以上的RNA生产量多，高温下的比活性提高。

Claims

4.根据权利要求2或3所述的T7RNA聚合酶突变体，其中，进一步地，与至少SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的179位的赖氨酸相当的氨基酸残基被谷氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸中的任一个取代，且与野生型T7样噬菌体的RNA聚合酶相比，该T7RNA聚合酶突变体热稳定性和比活性提高。

5.一种T7RNA聚合酶突变体，其中，与至少SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的179位的赖氨酸相当的氨基酸残基被谷氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸中的任一个取代，且与野生型T7样噬菌体的RNA聚合酶相比，该T7RNA聚合酶突变体的热稳定性和/或比活性提高。

6.根据权利要求2～5中任一项所述的T7RNA聚合酶突变体，其中，进一步地，与至少SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的685位的缬氨酸相当的氨基酸残基被中性或弱疏水性氨基酸取代，且与野生型T7样噬菌体的RNA聚合酶相比，该T7RNA聚合酶突变体的热稳定性和比活性提高。

7.根据权利要求6所述的T7RNA聚合酶突变体，其中，进一步地，与至少SEQ ID NO：6所示的构成野生型T7RNA聚合酶的氨基酸序列中的685位的缬氨酸相当的氨基酸残基被丙氨酸取代，且与野生型T7样噬菌体的RNA聚合酶相比，该T7RNA聚合酶突变体的热稳定性和比活性提高。

12.一种基因，所述基因编码权利要求1～11中任一项所述的T7RNA聚合酶突变体。

13.一种细胞，所述细胞能够表达编码权利要求1～11中任一项所述的T7RNA聚合酶突变体的基因从而生产T7RNA聚合酶。

14.一种生产T7RNA聚合酶的方法，所述方法通过表达编码权利要求1～11中任一项所述的T7RNA聚合酶突变体的基因来生产T7RNA聚合酶。

15.一种制造RNA的方法，所述方法使用权利要求1～11中任一项所述的T7RNA聚合酶突变体来制造RNA。

16.一种扩增RNA的方法，所述方法使用权利要求1～11中任一项所述的T7RNA聚合酶突变体来扩增RNA。