JP2000506734A - 緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のシトクロムＣ▲下５５１▼をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａで製造するための組換え法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、電子伝達能を有し、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)のシトクロムＣ₅₅₁の配列を含むヘムタンパク質を製造するための組換え法において、このヘムタンパク質がPseudomonas putidaで産生されることを特徴とする方法に関する。本発明方法によって得られるヘムタンパク質は、天然型のシトクロムＣ₅₅₁ならびにシグナル配列の全部または一部、典型的にはＮ−末端部分の存在を特徴とするその前駆体を含む。本発明のヘムタンパク質は、次の方法で製造できる。すなわち、（ａ）ヘムタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主を該ヘムタンパタ質が発現されるような条件で提供し、（ｂ）該ヘムタンパク質を単離または精製する。従って、本発明のさらに別の目的は、本発明のヘムタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクター；本発明に係る適切な発現ベクターで形質転換した宿主；および本発明に係るヘムタンパク質をコードする配列を含む、天然または合成起源のＤＮＡ分子を含む。本発明に係るヘムタンパク質は、診断分野、例えばペルオキシダーゼの色素産生基質として、または電気化学研究において有用な用途が見いだされ、酸化還元タンパク質と電極との間の電子移動反応の検出、測定および調節に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)のシトクロムＣ₅₅₁をPseudomonas putidaで製 造するための組換え法 本発明は、Pseudomonas putidaの細菌系において緑膿菌(Pseudomonas aerugin osa)のシトクロムＣ₅₅₁を製造するための組換え法に関する。 シトクロムＣ₅₅₁は、緑膿菌(Pseudomonas(Ps)aeruginosa)という細菌から抽出 された電子伝達ヘムタンパク質である（Horioら、1960）。その生理学的役割は 、恐らく、亜硝酸をＮＯに還元する異化型脱窒素の重要な酵素である亜硝酸リダ クターゼに電子を供与することから成るが、Ps．aeruginosaでの同一および恐ら く他の代謝経路にも関与する、銅を含む電子伝達タンパク質であるアズリンと電 子を非常に迅速に交換することもできる。 シトクロムＣ₅₅₁は、構造（三次元構造）および機能（小さいレドックス分子 と生理学的巨大分子の相手との電子の伝達）の点から十分解析されており、この ことが、巨大分子を、タンパク質マトリックスが補欠分子ヘム族の反応性ならび に電子伝 達プロセスの速度および方向の制御において果たす役割に関する詳細な研究に最 も適し、また恐らく部位特異的突然変異研究にも適するものにしている。 この目的のためには、天然のシトクロムＣ₅₅₁の関係する量を容易に得ること ができ、次いで、部位特異的突然変異体の発現にも使用できる効率的なタンパク 質の発現系が利用できるのが最も有用である。 ｃ型シトクロムの発現には、いくつかの問題がある。すなわち、ｉ）ヘム族は ２個の共有結合によってタンパク質に結合するが、その形成は特定の酵素によっ て触媒される。ii）シトクロムｃは特定の細胞室（真核細胞シトクロムの場合は ミトコンドリアの膜間腔、原核細胞の場合は細胞周辺腔）に達した後、ヘムを取 込むが、シトクロムｃはそのタンパク質に存在する特徴的なシグナル配列によっ てその方向に転置され、その後、特定のプロテアーゼによって除去される。 今日まで、この種のタンパク質の発現は、次の場合に試みられている。 ａ）染色体でのコード遺伝子の置換により酵母自体で発現される突然変異体酵母 （Margoliashら、1990）。この方法は、タン パク質自体の機能を許容可能なレベルで維持する酵母シトクロムの突然変異体の みの発現を可能にする。なぜならば、細胞の増殖は、このシトクロムの存在およ び活性に関係するからである。 ｂ）大腸菌(E．coli)でのTh．versutusのシトクロムＣ₅₅₀の発現（Ubbinkら、19 92）。この方法は、細菌のシトクロムの妥当な収量での発現を異種系で可能にし たが、大腸菌が十分な量のヘムを産生するためにはほとんど嫌気性の環境を必要 とする。この条件は、実験上、定量的に定義されるものではなく、特に大規模な 培地では、好気性培養条件と比較して、得るのは容易でない。 これらの問題は、Ps．putidaで産生されるPs．aeruginosaのシトクロムＣ₅₅₁ の発現に関する本発明によって解決される。この細菌を選択したのは、それが天 然には好気性条件で増殖し、栄養要求が限られており、従って、醗酵槽において 限られたコストでの増殖が可能であるためであり、さらに、それは、通常ｃ型シ トクロムを発現していて、これにより、ヘム取込みの系の存在および効率が確実 であるからである。選択した方法は、天然のものと見分けがつかない特性を有す るシトクロム Ｃ₅₅₁の高められた発現レベルおよび細胞毒性がないことによって、有効である ことが証明され、他の細菌のシトクロムｃおよび恐らく真核細胞にも適用できる と考えられる。さらに、シトクロムＣ₅₅₁の物理−化学特性により、組換えタン パク質の精製法、特に容易で迅速かつ経済的な精製法の開発が可能になった。 すなわち、本発明の第一の目的は、電子伝達能を有し、緑膿菌(Pseudomonas a eruginosa)のシトクロムＣ₅₅₁の配列を含むヘムタンパク質を製造するための組 換え法において、このヘムタンパク質がPseudomonas putidaで産生されることを 特徴とする方法を構成する。述べたように、シトクロムＣ₅₅₁は、電子伝達系と して作用するヘモタンパク質であり、従って、診断分野、例えばペルオキシダー ゼ用の色素産生基質として、または電気化学的研究における用途において有用で あり、酸化還元タンパク質と電極との間の電子伝達反応の検出、測定および調節 に使用される。 本発明方法によって得られるヘモタンパク質としては、シトクロムＣ₅₅₁の天 然型およびその前駆体が挙げられ、前駆体は、ヘムが取込まれ、タンパク質がそ の機能活性を及ぼす場所であ る細胞室の方にシトクロムを向かわせる機能を有するシグナル配列の全部または 一部（典型的にはＮ−末端部分）により特徴付けられている。このシグナル配列 は、天然のタンパク質のものであっても、また、外因性のシグナル配列であって もよい。本発明のヘムタンパク質は、次の方法で製造できる。 ａ）このヘムタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換 した宿主を、該ヘムタンパク質が発現するような条件で提供し、 ｂ）該ヘムタンパク質を単離または精製する。 これは、本発明の第二の側面を表す。この方法は、典型的には、発現させたい ヘムタンパク質をコードするヌクレオチド配列の構築および組換え宿主生物での ヘムタンパク質の発現に基づく。遺伝的に改変した生物の培養により、生物活性 を付与した所望のタンパク質が産生される。すなわち、本発明のさらに別の目的 はまた、 −本発明に係る適切な発現ベクターで形質転換した宿主、および −本発明に係るヘムタンパク質をコードする配列を含む、天然または合成起源の ＤＮＡ分子 から構成される。 本発明に従ってヘムタンパク質を発現することができる宿主は、本発明に係る 適合性発現ベクターで宿主を形質転換することにより作製できる。発現ベクター は、 ａ）本発明のヘムタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、Ps.aeruginosaのゲノ ムの一部から酵素的に合成し（Silvestriniら、1989)、 ｂ）該ＤＮＡを発現ベクター内に挿入する ことにより作製できる。 あるいは、発現ベクターは、 ａ）Ps．aeruginosaゲノムから、シトクロムＣ５５１をコードする遺伝子を単離 し、 ｂ）該遺伝子を発現ベクターに挿入する ことにより作製できる。 従って、本発明に係るヘムタンパク質は、形質転換宿主を提供し、この宿主を 、そのヘムタンパク質が発現できるような条件で培養することにより製造される 。 本発明のヘムタンパク質を組換えＤＮＡ技術によって製造するために、該ヘム タンパク質をコードする遺伝子を作製する。 本発明は、本質的に下記配列（配列番号１）から成るＤＮＡ分子を含む。 GAA GAC CCC GAA GTG CTG TTC AAG AAC AAG GGC TGC GTG GCC TGC CAT GCC ATC GAC ACC AAG ATG GTC GGC CCG GCC TAC AAG GAC GTC GCC GCC AAG TTC GCC GGC CAG GCC GGC GCG GAA GCG GAA CTC GCG CAG CGG ATC AAG AAC GGC AGC CAG GGC GTC TGG GGC CCG ATC CCG ATG CCG CCG AAC GCG GTC AGC GAC GAC GAG GCG CAG ACC CTG GCG AAG TGG GTC CTG TCG CAG AAA TGA このＤＮＡ分子は、その直前に下記： ATG AAA CCG TAC GCA CTG CTT TCG CTG CTC GCC ACC GGC ACC CTG CTC GCC CAG GGC GCC TGG GCC（配列番号２） から成るシグナル配列を置くことができる そのコードするＤＮＡ配列は、典型的にはイントロンを含まない。シトクロム Ｃ₅₅₁をコードする遺伝子は、それが天然に存在するオペロンからＰＣＲ法（ポ リメラーゼ連鎖反応、MullisおよびFaloona，1987）によって単離できる。 この目的のために、シトクロムＣ₅₅₁をコードする遺伝子の５’末端および３ ’末端に相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、そこに存在する制限部 位を利用する発現ベクター中でのクローニングに使用する。典型的には、発現ベ クターとしては、発現したい遺伝子に対するプロモーター、転写終結部 位ならびに翻訳開始および終結コドンなどの適切な転写および翻訳調節因子を含 む。遺伝子は、ベクターに適合する宿主でヘムタンパク質を発現させることがで きるように、正確な構造で提供する。発現ベクターは、典型的には、複製起点お よび恐らく抗生物質耐性を付与する遺伝子などのマーカー遺伝子も含む。 上述したように、発現ベクターを使用して適切な宿主を形質転換し、発現が確 実に生じるような方法で培養する。形質転換宿主は、原核細胞でも真核細胞でも よい。特に、細菌宿主を使用することができる。好ましい細菌宿主はPs．putida である。 発現させたヘムタンパク質は、単離し、精製することができる。上述したよう に、ヘムタンパク質は、輸送シグナル配列を含み得る。輸送配列は、典型的には 、本発明のヘムタンパク質のＮ−末端に存在する。 本発明に係るヘムタンパク質は、典型的には、診断用に使用できる。特に、研 究活動の熱心な領域の代表は、金属タンパク質電子伝達反応に関する研究である 。これらの研究に対する特定の方法は、電気化学法を使用して、電極と溶液との 間の界面で生じる電子伝達反応を調べることであった。すなわち、各種シトクロ ムと反応可能な電極が発明されており、特に、Ps. aeruginosaのシトクロムＣ５５１の電気化学は、多機能性有機分子で改変された 金電極の使用によって研究され、シトクロムＣ₅₅₁はこの電極と電子を交換する ことができることが立証されている(H．Allen O．Hillら、J.Elletroanal．Chem .,217(1987):129-140)。 この情報は、シトクロムＣ₅₅₁の、この分子に直接関与する酵素反応を検出す ることができるバイオセンサーの構築における使用を示唆している。これらのバ イオセンサーは、酵素および基質の測定のためのアッセイ法または臨床手順にお いて有用であることが分かる。例えば、それらのバイオセンサーは、生物学的流 体、特に糖尿病患者において存在するグルコースの測定（欧州特許出願No．EP12 5137）または能動もしくは受動系での、特にグルコース−オキシダーゼ、オキサ レート−オキシダーゼおよびコレステロール−オキシダーゼなどのレドックス酵 素の活性を調節するための、Ｈ₂Ｏ₂の検出に使用されている（英国特許No．GB22 06414）。 下記実施例で本発明を説明する。添付の図面において、図１（Ａ）は、以前に 解析された（Silvestriniら、1989）Ps.aeruginosaの3.5kbゲノムＤＮＡ断片に おけるcit遺伝子 の存在を確認するために使用した２つのオリゴヌクレオチド〔配列番号３および ４〕の配列である。（Ｂ）は、オリゴヌクレオチド２８〔配列番号３〕および２ ９〔配列番号４〕をプライマーとして使用したサンガー法によって得られたＤＮ Ａ配列である。nir遺伝子の末端およびcit遺伝子の始めをコードするゾーンはア ミノ酸に翻訳されている。 図２は、図ＩＡに記載の3.5kbの断片からのcit遺伝子のＰＣＲによる選択的増 幅および続くベクターpNM185(オリゴＮＭ−１〔配列番号５〕およびＮＭ−２〔 配列番号〕）でのクローニングのために使用されるオリゴヌクレオチドである。 図３は、cit遺伝子のＰＣＲによる増幅を確認するためのアガロースゲル（１. 2%）分析を示す。ＡおよびＢはプライマーＮＭ−１およびＮＭ−２で増幅した１ および10ngのpEMBL18NRであり、ｍは分子量マーカーとしてのHindIIIで消化した λファージであり、矢印は増幅した断片およびそれらのサイズを示す。 図４は、ＰＣＲによって増幅した配列を決定するために使用したクローンのマ ップである。インサートcitEの配列は図６に示す。 図５は、ＰＣＲによって増幅したPs．putidaでの発現に使用したベクターpNM1 85およびそれから誘導したクローンのマップである。 図６は、Cit Ｃ５５１の遺伝子を含むインサートcitEの配列〔配列番号７〕で ある。リボソーム結合部位ＲＢＳ(...)、開始コドン（ＡＴＧ）およびコード配 列の１０２の位置で検出される唯一のサイレント置換を示す。 図７は、組換えプラスミドPNM-citの単離のためのコロニーハイブリダイゼー ションのオートラジオグラフィーである。 図８は、組換えプラスミドPTZ18-CitE(1)の単離を確認するためのアガロース ゲル（１.2%）分析を示す。 図９は、組換えＣ₅₅₁シトクロムの精製した製剤の逆相高圧液体クロマトグラ フィー分析を示す。分離は、水−トリフルオロ酢酸における直線勾配のアセトニ トリルを使用してＣ１８カラム上で行い、２２０ｎｍの波長で検出した。 図１０は、シトクロムＣ₅₅₁の精製した調製物の等電点電気泳動分析を示す。 分離はポリアクリルアミドゲル（Immobiline dry Plate）上で行い、pH勾配は４ →７とした。組換えシトクロムＣ₅₅₁は、ｐＩ＝4.9の均一なタンパク質バンドに 収束 した（サンプル１）。等電点は、基準のBioradタンパク質の混合物（サンプル２ ）と比較することによって推定した。 図１１は、ＳＤＳ−トリシンでのポリアクリルアミドゲルである。ＡおよびＢ は、Ps．aeruginosaからの精製したシトクロムＣ₅₅₁の増加量を示し、Ｃおよび Ｄは、Ps．putidaからの精製したシトクロムＣ₅₅₁の増加量を示し、Ｍは分子量 マーカー（10〜100kDaの範囲）を示す。 図１２は、Ps．putidaからの精製したシトクロムＣ₅₅₁の酸化型（破線）およ び還元型（実線）のスペクトルである。 図１３は、Ps．putidaからの精製したシトクロムＣ₅₅₁の可視スペクトルであ り、還元型のタンパク質を、報告されている３つのｐＨ値で分析した。 図１４は、Ps．putidaからの精製したシトクロムＣ₅₅₁の円二色性スペクトル であり、酸化されたシトクロムの溶液のスペクトルを示す。 図１５は、Ps．putidaからの精製したシトクロムＣ₅₅₁の円二色性スペクトル であり、還元されたシトクロムの溶液のスペクトルを示す。 図１６は、遠ＵＶ領域での円二色性スペクトルであり、酸化 されたシトクロムの溶液のスペクトルを示す。 図１７は、組換えシトクロムＣ₅₅₁の精製した調製物のマススペクトル分析を 示す。9309.97 Daの質量を有するピークＡは、シトクロムＣ₅₅₁の計算した質量 に相当する。ピークＢは、イオン化条件で生成した付加物シトクロムＣ₅₅₁−ナ トリウムイオンに対応する。 実施例１：オペロンにおけるcit遺伝子の同定 最近の文献データ(Nordlingら、1990;Araiら、1990)は、緑膿菌(Ps．aerugino sa)の細菌ゲノムのオペロンにおけるシトクロムＣ₅₅₁(cit)をコードする遺伝子 の単離を報告している。この情報から、この遺伝子の存在を、以前に単離され(S ilvestriniら、18989)、亜硝酸リダクターゼ酵素(nir)をコードする遺伝子を含 む、長さ3.5kbのゲノムＤＮＡにおいて調べた。この目的のために、各々、nir遺 伝子の３’端およびcit遺伝子の５’端に相補的である特定のオリゴヌクレオチ ドを合成し（プラスミド２８〔配列番号３〕および２９〔配列番号４〕と命名し た）、200塩基のセグメントのヌクレオチド配列を決定した。この配列は、文献 で報告されたものと比較して、研究中のゲノムＤＮＡ断片にcit遺伝子が存在す ることを示し た。使用したプライマーの配列、以前に解析された断片内でのそれらの位置およ びゲノムＤＮＡのセグメントの配列を図１に示す。使用した方法 特定の文献で明確に示された場合を除いて、本明細書で使用する分子遺伝学の 方法は全て、Sambrookら(1989)に記載されている。 １）配列決定のためのＤＮＡの調製 一本鎖ＤＮＡ（ssＤＮＡ）を、バクテリオファージＦ１の存在下、プラスミド pEMBL18-NR（Silvestriniら、1989）のＤＮＡをＤＨ５細菌細胞の培養物に感染 させることにより調製する。感染した培養物は、培地中にssＤＮＡを産生する。 これを、ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させることにより回収し、ＴＢＥ媒体中、１％ アガロースゲルでの電気泳動により調べる。 ２）プライマー28および２９の構築 プライマー２８〔配列番号３〕のヌクレオチド配列は、以前の情報（Silvestr iniら、1989）に基づいて決定したが、プライマー２９〔配列番号４〕は、新規 配列の第一セグメントの決定後に設計した。それらの配列を図１に詳細に報告す る。 ３）ヌクレオチド配列の決定 配列の決定は、Ps．aeruginosaのＤＮＡのＧＣ含量が高いことから誘導される 圧縮の問題を取り除くために、ｄＧＴＰおよびｄＩＴＰの両方を有するSequenas e version2.0試薬（USB）を使用してSangerら(1977)の方法により決定した。配 列決定反応は、６％尿素／ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により解像した 。 実施例２：cit遺伝子の単離およびクローニング cit遺伝子の存在がオペロンにおいていったん同定されると、オペロンの残り の部分からの遺伝子の同定を行った。この操作は、次の理由により必要であると 思われた。すなわち、培地はＫＮＯ₃などの化合物を豊富にしなければならない が、亜硝酸リダクターゼの過発現の毒性効果の結果としてのバイオマスの収率を 低下させるので、フランキング配列（亜硝酸リダクターゼをコードする配列を含 む）の存在は、形質転換したPs.putida菌株の栄養要求を複雑にし；発現ベクタ ーpNM185のプロモーターPmからの転写効率は、むしろそのプロモーターのすぐ下 流に存在する、nir遺伝子の３’端にあるcit遺伝子の位置により減少し；精製の プロトコールも、亜硝酸リダクター ゼの共発現の結果、複雑になる。 発現を収率良く得るために、また組換えタンパク質の細菌による増殖および精 製のプロトコールを簡単にするために、cit遺伝子を、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連 鎖反応、MullisおよびFaloona，1987）を使用してオペロンの前後関係から単離 した。引き続くベクターpTZ18(ヌクレオチド配列決定用)(Meadら、1986)およびp NM185（Ps．putidaでの発現用）（Mermodら、1986）でのcit遺伝子のクローニン グに適切な合成オリゴヌクレオチド（図２）を設計して合成した。転写開始シグ ナルのみを有するベクターpNM185では、EcoRIによって認識される配列の他に、 翻訳開始に必要なＲＢＳ（リポソーム結合部位）もcit遺伝子の合成オリゴヌク レオチドに挿入した。 配列決定ベクターでのクローニングのために、pNM185でのクローニングについ て記載したものと同じオリゴヌクレオチドを使用した。ＰＣＲ反応の結果、約35 0ヌクレオチドの断片が得られ、次いで精製して、上記したベクターに挿入した 。 組換えプラスミドは、E．coli JM109での形質転換によって挿入し、cit遺伝子 に対応する放射性プローブとのハイブリダイゼーションによって単一コロニーと して単離した。 異なる構築体の制限マップを図４および５に示す。組換えプラスミドは、pTZ1 8-citEおよびPNM-citと命名した。350ヌクレオチドの断片の配列が実際にcit遺 伝子に対応することを確認するために、この断片のヌクレオチド配列を、組換え プラスミド PTZ18-citEから決定した。図６に示す配列〔配列番号７〕は、すで に発表されたもの(Nordlingら、1990;Araiら、1990)と、そのコード配列の102の 位置がＴからＣに置き換わっていることを除いて、同一である。 次いで、緑膿菌(Ps．aeruginosa)の遺伝子のこのゾーンの配列を、増幅する前 に確認して、増幅中のポリメラーゼのエラーを除いて、その置換が存在していた 。この突然変異は、正しい翻訳に何ら悪影響を及ぼすものではなく、我々がnir およびcit遺伝子の単離のために使用したPs．aeruginosa菌株が、Nordlingら(19 90)およびAraiら(1990)が使用した菌株と異なることを考慮すれば、自然にしば しば現れるサイレント突然変異に基づいて説明することができる。使用した方法 特定の文献で明確に示された場合を除いて、本明細書で使用する分子遺伝学の 方法は全て、Sambrookら(1989)に記載されて いる。 １）ＰＣＲによるcit遺伝子の単離 citT遺伝子を単離するために、図２に示すオリゴヌクレオチドを設計した。そ れらのオリゴヌクレオチドの配列をこの図に示し〔配列番号５および６〕、各サ ブ配列の機能を特定する（すなわち、制限酵素、リンカー、リボソーム結合部位 またはＲＢＳの開列部位；シトクロムのコード配列）。 二つのオリゴヌクレオチドは、各々、cit遺伝子の５’−末端および３’−末 端に相補的であり、ベクターpNM185でのクローニングおよび配列決定ベクターpT Z18でのクローニングにも使用した。ＰＣＲ反応は、二つの特定のプライマーの 各々50pmoleの存在下、１および10ngの組換えプラスミドpEMBL18-NRを使用して 行った。使用したTaqポリメラーゼはAmplitaq(Perkin Elmer Cetus Corp.)であ る。反応条件は以下の通りであった。 ａ）９５℃で５分 ｂ）９４℃で１分 ｃ）５８℃で１分 ｄ）７２℃で２分 ｂ〜ｄ工程は、続けて３０サイクル繰り返し、その後、混合物を３５℃で１５ 分間平衡にした。次いで、反応物の１０分の１をＴＢＥにおいて１．２％アガロ ースゲルで分析した。図３に示す結果は、約350ヌクレオチドの増幅断片の存在 を示し、この断片をゲルから抽出し、低融点アガロース法を使用して精製した。 ２）発現および配列決定ベクターでのクローニング cit遺伝子を含む350ヌクレオチドの断片を、記載した制限部位を使用して、下 記ベクターでクローン化した。 pNM185のEcoRI部位 pTZ18のEcoRI部位 この目的のために、ベクターを、製造者によって提供される取扱説明書に従っ て上記酵素(Biolabs)で消化し、消化は、ＴＢＥにおける１％アガロースゲルで 調べた。平行して、EcoRIによる同様の消化を、ＰＣＲから得られる断片につい て行った。両方のＤＮＡ（ベクターおよびインサート）を低融点アガロース法に よって精製した。組換えプラスミドは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Biolabs)の存在下 、１６℃で１２時間連結反応を行うことにより得た。次いで、それらの構築体を 、ＣａＣｌ₂処理に よってコンピテントにしたE．coli JM109細胞の形質転換によって挿入した。 組換えプラスミドpNM-citの単離のために、形質転換から得られる約200コロニ ーを、カナマイシン(30g/ml)を含むLBプレートおよびナイロンフィルター(Hybon d N，Amersham)上でレプリカ平板法に付した。コロニーは、３７℃で１２時間増 殖させた。フィルターを変性溶液で処理してプラスミドＤＮＡを変性させ、単離 してＰ３２−ＡＴＰによるランダムプライム法により標識したcit遺伝子とハイ ブリダイズさせた。使用したハイブリダイゼーション条件は、Hybond Nフィルタ ーの製造者Amershamが勧めるものである。 陽性コロニー（図７参照）をレプリカ平板から単離し、これらのコロニーから プラスミドＤＮＡを調製した。350 bpの断片の存在は、EcoRI消化によってさら に確認した。 組換えプラスミド PTZ18-citEの単離のために、プラスミドＤＮＡを、形質転 換から得られるコロニーから直接調製し、インサートの存在を、EcoRI消化によ って確認した（図８参照）。 ３）完全遺伝子cit配列の決定 cit遺伝子のヌクレオチド配列は、緑膿菌(Ps．aeruginosa) のＤＮＡのＧＣが高含量であることから生じる圧縮の問題を取り除くために、Se quenase version2.0（USB）試薬を使用してサンガー法により決定し、配列決定 反応は、ｄＧＴＰおよび７ＡＺＡ−ｄＧＴＰの両方を用いて行った。配列は、６ ％尿素／ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって解像した。 実施例３：Ps．putidaでのcit遺伝子の発現 cit遺伝子は以前に単離されたオペロン（Silvestriniら、1989）に存在してい て、その起源(Ps．aeruginosa)と同様、同じオペロンに存在するnir遺伝子の発 現についてすでに使用された（Silvestriniら、1992）細菌種Ps．putidaが、シ トクロムの発現を行うための基礎となる。この細菌種を選択したのは、天然種と 相関性があるにもかかわらず、それが、好気性条件において増殖し、限られた栄 養要求を示し、限られたコストの醗酵槽での増殖を可能にするからである。さら に、大腸菌におけるｃ型シトクロムの高レベルの発現は、大規模の増殖への展開 の可能性を制限する、部分的嫌気的増殖条件を使用して、異なるシトクロムｃに ついてのみこれまで行われた(Ubbinkら、1992)。 cit遺伝子を含む発現ベクター(プラスミドpNMcit)を、Ps. putida PaW340の菌株への形質転換によって導入した。ｃ型シトクロムの増大は 、溶解した総細胞に対するヘムタンパク質に存在する鉄原子の酸化型と還元型と の間の差スペクトルによって調べた。産生したタンパク質が事実上シトクロムＣ₅₅₁ に対応するかどうかを調べるために、見かけ分子量が9-kDa（ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ）であり、Ps．aeruginosa由来の天然シトクロムのものと同一の変性条件での 電気泳動移動度を有するタンパク質を精製して均一にした(Parrら、1976)。この タンパク質はさらに、Ｎ−末端配列決定により検査した（最初の35残基）。この 配列は、以前に発表された(Ambler，1963)成熟シトクロムＣ₅₅₁の配列に完全に 対応した。また、細菌のペリプラズマでのトランスローケーションに必要な22個 のアミノ酸のシグナル配列を有するプレタンパク質として遺伝子レベルでコード されるタンパク質は、Ps．Putidaである異種系でも正しく処理されることが分か る。使用した方法 特定の文献で明確に示された場合を除いて、本明細書で使用する分子遺伝学の 方法は全て、Sambrookら(1989)に記載されている。 １）PaW340のベクターPNMcltによる形質転換 上記したプラスミドPNMcitを、以前に挿入を行ったE．coli JM109のクローン から、アルカリ溶菌法を使用して精製した。こうして得られたＤＮＡ（10〜100n g)を、ＣａＣｌ₂およびＭｇＣｌ₂法によってコンピテントにしたPaW340細胞への 形質転換によって導入した(LederbergおよびCohen，1974)。形質転換体は、30g/ mlのカナマイシンを含むＬＢ培地上、３０℃で選択した。プラスミドの存在は、 アルカリ溶菌法により、そのＤＮＡを抽出する形質転換体において調べた。組換 えプラスミドを含むクローンは、PaW340-pNMcitと命名した。 ２）シトクロム発現の誘導 プラスミド PNMcitは、プロモーターPmの制御下でクローン化したcit遺伝子 を含む。発現は、このプロモーターからの転写を誘導物質m-toluateで刺激する ことにより誘導できる（Mermodら、1986）。誘導は、以下に記載するように行っ た。 固体ＬＢ培地＋30g/mlのカナマイシン上でクローンPaW340-pNMcitから単離し たコロニーと共に、５mlのプレ培養物を同一の液体培地に接種し、３０℃で約６ 〜８時間、増殖させた。次いで、そのプレ培養物を100mlのＬＢ培地＋30g/mlの カナマイシンで希釈し(1:100)（非誘導の対照）、平行して、0.5nMのm-toluate を含む同一の培地上に置き（誘導サンプル）、培養物を３０℃で１６〜１８時間 増殖させた。同じ誘導アッセイを、プラスミドpNM185のみを含む菌株PaW340（ci t遺伝子は含まない）について行い、対照とした。 ３）差スペクトル 上記した誘導実験から誘導される細胞を0.1Mのリン酸緩衝液ｐＨ 7.0（4ml/g 細胞）に再懸濁し、氷中で5ｘ１分間音波処理を行った。遠心分離（12000rpmで2 0分間）によって回収した音波処理物の上清に、フェリシアン酸カリウムを添加 して、恐らく存在しているヘムタンパク質の鉄を酸化した。この酸化抽出物を等 量に分けて分光光度計セル（１cm光路）に入れ、400〜500nmでの基線を記録した 。サンプルの一つには、次いでジチオン酸ナトリウム（固体）を添加し、同じ波 長でのスペクトルを記録した。 ４）シトクロムの精製 PaW340-pNMcit菌株の細胞を、誘導サンプルに対して上記した方法に従って大 規模に増殖させる。典型的には、1.51の培養物(6×250ml/2l容ビーカー)から、 約10ｇの湿った細胞を 得る。 精製プロトコールは、セファデックスG-75カラムによるゲル濾過クロマトグラ フィーまではParrら(1976)のプロトコールと同じである。この時点で、遅いクロ マトグラフィー移動度を有する画分（ｃ型シトクロムの存在は、分光光度計によ り確認する）を集めてプールする。これらの画分を、酢酸を添加することにより ｐＨ3.9にし、12000rpmで２０分間遠心分離して沈殿物を除去する。上清を回収 し、50mMの酢酸アンモニウムｐＨ3.9で平衡にしたＣＭ５２イオン交換カラム（W hatman）に充填し、そのカラムを次いで同一の緩衝液で洗浄し、タンパク質を50 mMの酢酸アンモニウムｐＨ 4.45で溶離する。 溶離した画分を、250〜650nmで分光光度計により分析して、得られたサンプル の純度を測定する。一般に、天然のシトクロムの場合、この純度指数は還元型の 吸光度(550〜570nm)と酸化型の吸光度(280nm)との間の比から求める。この比は 、100%純粋なタンパク質の場合は1.14の値を有していなければならない(Parrら 、1976)。 ５）Ｎ−末端配列の決定 配列の分析を、アミノ酸のフェニルチオヒダントイン誘導体 を測定するためのApplied Biosystems 120A型PTH分析器によって供給される気相 でApplied Biosystems 470A型配列決定装置を使用して行った。サンプルを、製 造者によって提供される取扱説明書に従って、トリフルオロ酢酸で処理したガラ ス繊維フイルターにかけ、ポリプレンで被覆し、予備洗浄した。 実施例４：Ps．putidaPa W340からのシトクロムＣ₅₅₁の産生 この実施例は、最適化した醗酵プロトコールを使用して、PaW340において発現 系pNMcitからシトクロムＣ₅₅₁を産生するために設定した手順を記載する。続く 精製手順により、高純度のシトクロムＣ₅₅₁の調製物がたった２工程で得られる 。菌株PaW340-pNMcitの醗酵プロトコールおよび続く精製は、大規模で適用可能 であり、より高い収率が得られるように最適化した。かなりの量のバイオマスお よび高レベルの特異的発現を得るために、醗酵手順の最適化は、培地の組成物、 温度、グルコース濃度および酸素分圧のパラメータを考慮して、予備実験におい て行った。最適化条件は、後に101容の醗酵槽に適用し、得られた細胞バイオマ スをシトクロムＣ₅₅₁の抽出に使用した。精製のために、新規手順を開発した。 それは、工程数が限られ、総収量が高められ、工業的規模での適用が容易である こ とを特徴とする。新規精製手順に従って得られる組換えタンパク質は、物理化学 的観点および機能活性の点で純粋であるという結果が得られた。使用した方法 １）醗酵条件の最適化 菌株PaW340-pNMcitの増殖に対する最良の条件を、バイオマスのレベルおよび 組換えタンパク質の発現に対する増殖条件の効果を評価することにより研究し、 かなりのレベルの容量生産性および特異的発現（mgシトクロムＣ₅₅₁／ｇ細胞） の達成が確実になった。 表１に示すように、最良の結果は、試験６の条件で得られたものである。この 場合、約20ｇの湿ったバイオマス／ｌ醗酵物が、約1mgのシトクロムＣ₅₅₁／ｇ細 胞のレベルで回収された。 表１：組換え菌株PaW340-pNMcitの醗酵 産生のために選択した最適化条件は、主に下記パラメーターを特徴とする。 −F120、ｐＨ７の培地 −32℃の温度 −２％飽和度で維持されるＯ₂レベル 生産スケールでの適用に対して必須の条件である最適化した醗酵プロトコール の再現性は、10 1容醗酵器（表１の試験７および８）およびより大きい規模で行 った反復実験により確認した。 ２．醗酵 ａ）培地の組成物 ＬＫ培地（カナマイシンを含むLuria-Bertani）： Bactotryptone 20 g/l 酵母エキス 10 g/l ＮａＣｌ 10 g/l カナマイシン 50 mg/l 培地F120 ： カゼイン加水分解物 18 g/l 酵母エキス 36 g/l ＫＨ₂ＰＯ₄ 0.58 g/l Ｋ₂ＨＰＯ₄ 3.14 g/l グルコース 4 g/l トルイル酸 0.68 g/l カナマイシン 50 mg/l ｂ）増殖期 250mlのＬＫ培地を含む２つの１１容ビーカーに、組換え菌株PaW340-pNMcitの 懸濁物0.5mlを添加し、培養を、160rpmの振動攪拌器上、３０℃で１６時間行っ た。得られた細菌培養物を、産生期用接種物として使用した。 ｃ）産生期 増殖期の産物を接種した、５１のF120培地ｐＨ７を含む10 l 容醗酵槽を使用した。醗酵は、攪拌を300rpmに調整し、空気流を0.25l/l培地と して、32.1℃で行った。醗酵中、攪拌は、酸素レベルが２％飽和で維持されるよ うに自動的に調節した。醗酵の産生期は約９時間続け、600nmで測定した光学密 度が約20単位に相当する最終の細胞増殖を得た。醗酵の終わりに遠心分離によっ て集めた細胞は、典型的には、約100ｇの湿重量に相当する。 ３．精製 精製操作は、４℃で行った。 51の醗酵から得たバイオマス（約100gの湿重量）を、1200mlの0.1Mトリス−１ mMフッ化メチルスルホニルフェニル−1mMＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ７に再懸濁し、細 胞を約800バールの圧力で機械的ホモゲナイザー（APV-Rainin型）の２回通過に よって分解した。あるいは、細胞破壊は、音波処理によって得ることができる。 細胞ホモジネートは、7000ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収して、希酢酸の 添加によりpH4.0とし、再度遠心分離した。桃色の上清に2mlの5%Ｋ₂Ｆｅ（ＣＮ ）₆を添加してシトクロムＣ₅₅₁を酸化し、その溶液を20mMの酢酸緩衝液ｐＨ４（ 緩衝液Ａ）に対して約４時間透析した。透析 した溶液を200mlのＣＭ−セファロース Fast Flow樹脂床（Pharmacia Biotech 社）を含むクロマトグラフィーカラムに充填し、緩衝液Ａと予備平衡させた。カ ラムを１１の緩衝液Ａで洗浄した後、下記条件で溶離した。すなわち、100%の緩 衝液Ａ→35%の緩衝液Ｂ（20mMの酢酸ナトリウム−0.5MのＮａＣｌ、ｐＨ 4.0） の直線勾配で６０分間、次いで、65%の緩衝液Ａおよび35%の緩衝液Ｂから成る相 による３０分間のイソクラティック溶離、および40%→100％の直線勾配の緩衝液 Ｂで３０分間である。淡桃色を特徴とするシトクロムＣ₅₅₁を含む画分を、分光 光度計による分析および逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で 調べ、分析結果に基づいてプールした。シトクロムＣ₅₅₁の調製物を＋４℃で保 存し、あるいは、10mMの酢酸アンモニウム緩衝液に対する透析の後に凍結乾燥し て、組換えタンパク質の固体形状の調製物を得た。その精製手順で得られた結果 の典型的な例を下記に示す。 記載した精製プロトコールに従って得られたシトクロムＣ₅₅₁の調製物は、逆 相高圧液体クロマトグラフィー（図９）、等電点電気泳動（図１０）およびポリ アクリルアミドゲル電気泳動（図１１）によって調べると、90%より大きい純度 を示した。 実施例５：組換えシトクロムＣ₅₅₁の天然形における解析 実施例４に記載の精製によって得られた組換えシトクロムＣ₅₅₁を解析して、 得られたタンパク質が緑膿菌(Ps.aeruginosa)から精製した天然形と事実上同一 であるかどうかを調べた。 このヘムタンパク質の主な特徴のいくつかが、他のｃ型シトクロムと共通であ る。まず第一に、鉄の原子を含むポルフィリンである、２個のチオエーテルによ ってタンパク質成分に共有的に結合している補欠分子族が、タンパク質の２個の システイン残基（Ｃ１２およびＣ１５、Ambler，1963）と結合している。これら のヘムとタンパク質との間の特定の共有結合の存在は、他の型のシトクロム（ａ 、ｂ、ｄなど）にはなく、本質的に、そのタンパク質によって想定される正しい コンホメーションの特徴である。 さらに、マススペクトル法によって高精度で得られる質量の 実験的測定は、ポリペプチド鎖の完全性ならびにヘムとの共有結合の形成に関し て、組換えシトクロムＣ₅₅₁の分子構造を直接確認するものである。正確な三次 元構造は、発色団（ヘム）の分光学的特徴にも影響を及ぼす。それは、実際、ヘ ムのこの部分の光吸収の固有の特性だけでなく、この発色団の周囲の環境、すな わちタンパク質成分との相互作用にも依存する。 また、可視ゾーンでの円二色性実験で得られる情報も、発色団（この場合もヘ ムである）の周りの分子の完全性と相関性があると考えられる。 すなわち、組換えシトクロムの解析は、ゲルによる電気泳動ならびに広範囲に わたる分光学的解析（光学および円二色性）によって行った。下記に関して分析 した。 ・変性条件での電気泳動およびヘム−特異的染色によるタンパク質とヘムとの間 の共有結合の存在； ・酸化型および還元型の組換えシトクロムのスペクトル（図１２）； ・緑膿菌(Ps．aeruginosa)から精製した天然のシトクロムＣ₅₅₁ではすでにかな り解析されている（Silvestriniら、1981）、典型的なｐＨ−依存性分光学的変 動の存在（図１３）； ・酸化型の組換えシトクロムに対する近および遠ＵＶによる、可視ゾーンでの円 二色性スペクトル（図１４および１６）； ・還元型の組換えシトクロムに対する近ＵＶによる、可視ゾーンでの円二色性ス ペクトル（図１５） この解析により、組換えＤＮＡによりPs．putidaで産生されるシトクロムＣ_{55 1} が天然形であること、および、我々が分析した分子の特徴に関して、緑膿菌(Ps ．aeruginosa)から精製した天然のシトクロムＣ₅₅₁と見分けがつかないことが確 認できた。使用した方法 １）電気泳動 組換えシトクロムを、トリシン−ＳＤＳでの電気泳動法（SchaggerおよびVon Jagow，1987）に従って、変性条件での電気泳動により分析した。ゲルはクーマ シーブルーおよびベンジジン法によるヘム−特異的染料で染色した（Thomasら、 1976）。 この実験の結果は、組換えシトクロムが、変性条件においてタンパク質から分 離しないので、共有的に結合したヘム族を有することを示している。 ２）光学分光法 分光学的分析を、Cary 219二重ビーム分光光度計（Varian）を使用して行った 。組換えシトクロムの0.1M Ｎａ／リン酸緩衝液、ｐＨ 7.0におけるサンプル を、260〜600nm(酸化型)および380〜600nm（還元型）で分析した。精製により誘 導されるタンパク質は、酸化型で存在し、還元型は、固体のジチオン酸ナトリウ ムの添加により得られる。 図１０は、組換えヘムタンパク質の酸化型および還元型のスペクトルを示す。 スペクトルは共に、Ps．aeruginosaから精製した天然のＣ₅₅₁に対してすでに記 載されている（Horioら、1960）280、410および530nm（酸化型）ならびに417、5 20および551（還元型）での特徴的な吸収ピークを示す。 Ps．aeruginosaから精製した天然のＣ₅₅₁（Silvestiniら、1981）の特徴であ る、551nmでの吸収ピークのｐＨ−依存性分光学的変動の存在も確認された。こ の場合、組換えシトクロムのサンプルは、最初はｐＨ 5.5であったが、4MのＮ ａＯＨの添加により、ｐＨ7.2およびｐＨ 10.0にした。各ｐＨ値について、500 〜600ｎ・のスペクトルを記録した。図13は、アルカリ性ｐＨでは、551nmでの吸 収ピークはより長い波長にシ フトし、同時に吸収の最大値が減少することを示している。この特徴的な分光学 的変動（アルカリシフト）は、他のｃ型シトクロムにはなく、補欠分子族近縁物 における天然のシトクロムＣ₅₅₁の残基のイオン化状態の変動と恐らく相関性が あり、これはヘムだけでもみられる。 ３）円二色性の分光学 円二色性の実験を、データ分析器を完備したJasco J500分光偏光計(Jascoモデ ルDPS OO N)で行った。これらの実験では、0.1MのＮａ／リン酸緩衝液、ｐＨ 7 .0における組換えシトクロムの溶液を、200〜600nm（酸化型シトクロム）および 380〜600nm（還元型シトクロム）で分析した。この場合も、ヘム鉄の還元は、固 体のジチオン酸ナトリウムの添加によって得られた。シグナルの量を改善するた めに、200〜450nmゾーンのスペクトルは４倍し、450〜600nmゾーンは２倍した。 これらの実験の結果を図１４〜１６に示すが、それらは、組換えシトクロムが緑 膿菌(Ps．aeruginosa)から精製した天然のＣ₅₅₁と同一であることを示している 。この場合も、組換えタンパク質は、天然のＣ₅₅₁の特徴を有している。 ４）マススペクトルによる分子量の測定 メタノール−水−酢酸(50:50:0.1)に0.2mg/mlの濃度で溶解したシトクロムＣ_{5 51} の製剤を、２μｌ/分の流速で、Hewlett-Packardモデル59987Aエレクトロース プレー界面に接続した単一の四極子Hewlett-Packardモデル5989A マススペクト ロメーターに注入した。分子量の実験値（図１７）は9309.97 Daであり、これは 、１Daの変動間隔内で、２つのチオエーテル結合により共有結合したアポタンパ ク質とヘムの分子量を合計し、鉄原子を含んで計算した値に対応する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:385） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:40） (72)発明者 ゼンチエ，エリザベツタ イタリー国、イ―00100・ローマ、ビア・ インペリア、12 (72)発明者 ビスコ，カルロ イタリー国、イ―20156・ミラノ、ビア・ コンソーレ・マルセロ、１ (72)発明者 デイツシエポーロ，マツシモ イタリー国、イ―20100・ミラノ、ビア・ ジアンベリーノ、34 【要約の続き】 学研究において有用な用途が見いだされ、酸化還元タン パク質と電極との間の電子移動反応の検出、測定および 調節に使用される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)のシトクロムＣ₅₅₁の配列を含み、電子伝 達能を有するヘムタンパク質を製造するための組換え法において、このヘムタン パク質がPseudomonas putidaで産生される方法。 ２．ヘムタンパク質が、その機能活性を示す細胞室においてシトクロムＣ₅₅₁を 転置させる得るシグナル配列を有する、請求項１に記載の方法。 ３．下記配列〔配列番号１〕： GAA GAC CCC GAA GTG CTG TTC AAG AAC AAG GGC TGC GTG GCC TGC CAT GCC ATC GAC ACC AAG ATG GTC GGC CCG GCC TAC AAG GAC GTC GCC GCC AAG TTC GCC GGC CAG GCC GGC GCG GAA GCG GAA CTC GCG CAG CGG ATC AAG AAC GGC AGC CAG GGC GTC TGG GGC CCG ATC CCG ATG CCG CCG AAC GCG GTC AGC GAC GAC GAC GCG CAG ACC CTG GCG AAG TGG GTC CTG TCG CAG AAA TGA を含む、電子伝達能を有するヘムタンパク質をコードするＤＮＡ分子。 ４．下記シグナル配列〔配列番号２〕： ATG AAA CCG TAC GCA CTG CTT TCG CTG CTC GCC ACC GGC ACC CTG CTC GCC CAG GGC GCC TGG GCC が直前に置かれている、請求項３の配列を含むＤＮＡ分子。 ５．添付した図面の図６に示すＤＮＡ分子。 ６．請求項３ないし５のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を含むプラスミド発現 ベクター。 ７．請求項６に記載のプラスミド発現ベクターによって形質転換した細菌宿主。 ８．Pseudomonas putida菌株から成る、請求項７に記載の宿主。