KR20020026470A - 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 디히드로오로테이트데히드로게나제 서열, 및 미생물에 의한 피리미딘및(또는) 피리미딘 관련 화합물 생산에 있어서 그의 용도 - Google Patents

코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 디히드로오로테이트데히드로게나제 서열, 및 미생물에 의한 피리미딘및(또는) 피리미딘 관련 화합물 생산에 있어서 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피리미딘 생합성을 위한 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 유전자 (pyrD)의 뉴클레오티드 서열 및 미생물에 의한 피리미딘 생산에 있어서 그의 용도에 관한 것이다.

Description

코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 디히드로오로테이트 데히드로게나제 서열, 및 미생물에 의한 피리미딘 및(또는) 피리미딘 관련 화합물 생산에 있어서 그의 용도{Dihydroorotate Dehydrogenase Sequence of Corynebacterium Glutamicum and The Use Thereof in Microbial Production of Pyrimidine and/or Compounds Used With Pyrimidine}
본 발명은 유전자 조작 생물을 이용한 발효에 의해 피리미딘을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium Glutamicum)으로부터의 디히드로오로테이트 데히드로게나제 서열, 및 미생물에 의한 피리미딘 및(또는) 피리미딘 관련 화합물 생산에 있어서 그의 용도를 포함한다.
피리미딘의 생합성 경로는 살아있는 모든 생물에서 필수적이다 (참조: 문헌[Switzer, R.L. 및 Quinn, C.L.Bacillus subtilis(editors: Sonenshein, A.L., Hoch, J.A. and Losick, R., American Society for Microbiology, Washington, D.C.), 1993, pp. 343-358]). 피리미딘 뉴클레오티드는 피리미딘 유도체이며, 예컨대 여러 생합성 경로에 있어서 DNA 및 RNA의 활성화 전구체이다. 피리미딘 뉴클레오시드 시티딘, 우리딘, 데옥시시티딘 및 데옥시티미딘에서, 피리미딘 염기는 펜토즈에 결합되어 있고, 피리미딘 뉴클레오티드는 피리미딘 뉴클레오시드의 포스페이트 에스테르이다. 피리미딘 뉴클레오시드 및 피리미딘 뉴클레오티드 및 그들의 유도체 또한 유용한 약물, 예컨대 CDP-콜린, 오로트산 또는 UMP를 합성하는데 있어 중요한 출발 화합물이다 (참조: 문헌[Kuninaka, A. Biotechnology, vol. 6 (editors: Rehm, H.-J. and Reed, G.), VCH, Weinheim, Germany, 1996, pp. 561-612]).
모든 미생물은 아니지만 여러 미생물은 데 노보 (de novo) 합성 경로 및 외부로부터 공급된 피리미딘 염기 및 피리미딘 뉴클레오시드로부터의 합성 경로 둘다를 이용하여 그들의 피리미딘 뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 피리미딘 염기 및(또는) 피리미딘 뉴클레오시드는 일반적으로 세포내에 없다. 그러나, 일부 증식 조건하에서는 그들을 과량으로 형성시킨 다음, 배양 배지로 분비시킬 수 있다. 이러한 이유로, 미생물이 피리미딘 뉴클레오티드 및(또는) 관련 화합물의 발효적 생산 방법에 이용될 수 있다.
피리미딘 뉴클레오티드를 위한 미생물의 생합성 효율은 피리미딘 생합성 경로의 유전자 조작에 의해 최적화될 수 있다. 유전자 조작이란 피리미딘 합성 경로에 있는 유전자의 카피수 및(또는) 전사율을 증가시키는 것과 관련된 것을 의미한다. 그 결과, 유전자 생성물의 양 및 세포내 효소 활성이 증가된다. 증가된 효소 활성은 영양 배지에서 공급된 화합물의 피리미딘 뉴클레오티드 및(또는) 관련 화합물로의 전환을 증가시키고, 이로써 합성 효율 또한 증가된다. 따라서, 예를 들어 (S)-디히드로오로테이트의 오로테이트로의 산화 (이는 피리미딘 뉴클레오티드를 위한 데 노보 피리미딘 생합성의 제4 단계)를 촉매하는 디히드로오로테이트 데히드로게나제의 활성이 증가되면 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacteriumammoniagenes)에서 UMP 합성 효율이 증가된다는 것을 입증할 수 있다 (문헌[Nudler, A.A., Garibyan, A.G. and Bourd, G.I. (1991) FEMS Microbiol. Lett. 82:263-266]).
본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 피리미딘 생합성 경로의 디히드로오로테이트 데히드로게나제를 위한 신규한pyrD유전자 및 피리미딘 뉴클레오티드 및(또는) 피리미딘 관련 화합물 생산에 있어서 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일면은pyrD유전자 생성물을 포함한다. 서열 2는 폴리펩티드 서열을 기재한 것이다. pyrD 유전자는 분자량이 33953인 321 아미노산의 폴리펩티드를 코딩한다. 본 발명은 또한 서열 2에서 아미노산 1개 이상, 바람직하게는 아미노산의 25% 이하, 가장 적합하게는 아미노산의 15% 이하를 결실, 삽입 또는 치환에 의해, 또는 결실, 삽입 및 치환의 조합에 의해 교체함으로써 얻을 수 있는 상기 폴리펩티드의 기능적 유도체에 관한 것이다. 용어 기능적 유도체란 유도체의 효소 활성이 서열 2의 서열을 갖는 폴리펩티드의 효소 활성과 여전히 동일한 정도인 것을 의미한다.
본 발명의 또다른 면은 상기 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 서열은, 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 단리된 서열 (즉, 서열 1)로부터 출발하여, 위치 지정 돌연변이 유발법에 의해 변형시키거나 또는 유전 코드를 이용하여 상응하는 폴리펩티드를 역번역한 후 전체 화학 합성을 수행함으로써 생성될 수 있다.
가장 적합하게는, 이들 폴리뉴클레오티드 서열은 숙주 생물, 바람직하게는미생물의 형질변형을 위해 유전자 구조물 형태로 사용될 수 있다. 이들 유전자 구조물은 조절 서열 1개 이상과 함께 이들 폴리뉴클레오티드의 카피 1개 이상으로 구성된다. 조절 서열은 프로모터, 터미네이터, 인핸서 및 리보좀 결합 부위를 포함한다.
상기 유전자 구조물을 이용한 형질변형을 위한 바람직한 숙주 생물은 코리네박테리움 및 바실러스 종 (Bacillusspecies)이지만, 형질변형을 위해서 임의의 진핵 미생물, 바람직하게는 애쉬비아 (Ashbya), 칸디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 한센눌라 (Hansenula) 속의 효모 균주를 이용할 수 있다.
본 발명의 또다른 면은 상기 기재한 방식으로 형질변형된 숙주 생물을 배양한 후 피리미딘을 단리함으로써, 피리미딘 및 피리미딘 유도체를 생산하는 방법을 포함한다. 피리미딘 유도체는 본 발명에 상응하는 폴리뉴클레오티드 중 하나로 숙주 생물을 형질변형시킴으로써 제조될 수 있는 피리미딘 고리를 갖는 화합물을 의미한다.
미생물을 배양하는 방법 및 절차, 및 미생물에 의한 생산으로부터 피리미딘을 단리하는 방법 및 절차는 숙련자에게는 잘 알려져 있다.
본 발명에 따른 미생물의 유전자 조작에 의해 피리미딘 뉴클레오티드 및(또는) 관련 화합물 합성의 효율을 증가시키는 것에 대하여 하기 실시예에 보다 상세하게 기재된다.
<실시예 1: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 게놈 라이브러리의 제작>
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈으로부터의 DNA는 예를 들어 문헌[J. Altenbuchner 및 J. Cullum (1984), Mol. Gen. Genet. 195: 134-138]에 이미 기재된 표준 방법을 이용하여 얻을 수 있다. 게놈 라이브러리는 표준 프로토콜 (예, 문헌[Sambrook, J. 등 (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press])에 따라 임의의 클로닝 벡터, 예를 들어 pBluescript II KS- (스트라타젠 (Stratagene)) 또는 ZAP ExpressTM(스트라타젠)을 이용하여 제작할 수 있다. 또한, 임의의 단편 크기, 바람직하게는 길이가 2-9 kb인Sau3AI단편을 이용할 수 있으며, 이 단편을BamHI로 절단하여 클로닝 벡터에 삽입시킬 수 있다.
<실시예 2: 게놈 라이브러리의 핵산 서열의 분석>
개별 이. 콜라이 (E. coli) 클론은 실시예 1에서 제작된 게놈 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 이. 콜라이 세포를 적합한 배지 (예, 암피실린 100 ml/l가 보충된 LB)에서 표준 방법에 의해 배양시킨 다음, 플라스미드 DNA를 단리할 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 DNA로부터의 게놈 단편을 pBluescript II KS- (실시예 1 참조)에 클로닝시켜, 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3' 및 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' 올리고뉴클레오티드를 이용하여 상기 DNA를 서열분석할 수 있다.
<실시예 3: 단리된 핵산 서열의 컴퓨터 분석>
뉴클레오티드 서열은 예를 들어 BLASTX 알고리즘 (문헌[Altschul 등. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410])를 이용하여 서로 연계될 수 있다. 이러한 방법으로 신규 서열을 찾아내고 이들 신규 서열의 기능을 설명할 수 있다.
<실시예 4: 디히드로오로테이트 데히드로게나제 (EC 1.3.3.1)에 대한 유전자를 포함하는 이. 콜라이 클론의 확인>
실시예 2에 기재된 바와 같이 이. 콜라이 클론을 분석한 다음, 실시예 3에 기재된 바와 같이 수득한 서열을 분석함으로써, 서열 1로 기재된 서열을 밝혀냈다. BLASTX 알고리즘 (실시예 3 참조)을 이용하였을 때, 이 서열이 다양한 생물로부터의 디히드로오로테이트 데히드로게나제 (PyrD; EC 1.3.3.1)와 유사함이 밝혀졌다. 미코박테리움 레프라에 (Mycobacterium leprae) (SWISSPROT p46727; 아미노산 수준에서 67% 일치)로부터의 디히드로오로테이트 데히드로게나제 (PyrD)와 가장 유사하였다.
<실시예 5: 피리미딘 및(또는) 피리미딘 관련 화합물 생성을 위한 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 디히드로오로테이트 데히드로게나제 (PyrD)에 대한 유전자의 용도>
코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 디히드로오로테이트 데히드로게나제에 대한 유전자는 적합한 클로닝 및(또는) 발현계를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰으로 또는 임의의 다른 미생물로 도입될 수 있다. 유전자의 활성 또는 카피수의 면에서 야생형 생물과는 다른 유전자 조작 미생물이 생성될 수 있다. 이들 신규한 유전자 조작 균주는 피리미딘 및(또는) 피리미딘 관련 화합물 생성에 이용될수 있다.
서열 목록
(I) 일반 정보
(1) 출원인:
(A) 명칭:바스프-린크스 바이오사이언스 아게
(B) 거리:임 뉴엔하이머 펠트 515
(C) 도시:하이델베르그
(D) 국가:독일
(E) 우편 번호:69120
(F) 전화 번호:06221/4546
(G) 팩스:06221/454770
(2) 표제:코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 디히드로오로테이트 데히드로게나제 서열, 및 미생물에 의한 피리미딘 및(또는) 피리미딘 관련 화합물 생산에 있어서 그의 용도
(3) 서열 수: 2
(4) 컴퓨터로 판독가능한 형태의 유형
(A) 매체 유형:디스켓
(B) 컴퓨터:IBM PC 컴퓨터
(C) 구동 시스템:윈도우 NT
(D) 소프트웨어:마이크로(등록상표) 워드 97 SR-1
(I) 서열 1에 대한 정보
(1) 서열 특성
(A) 길이:966
(B) 유형:핵산
(C) 가닥 유형:이중 가닥
(D) 토폴로지:선형
(2) 분자 유형:DNA
(3) 가설:없음
(4) 안티센스:없음
(5) 공급원
(A) 생물:코리네박테리움 글루타미쿰
(6) 서열의 기재:서열 1
(I) 서열 2에 대한 정보
(1) 서열 특성
(A) 길이:321
(B) 유형:아미노산
(C) 가닥 유형:1 쇄
(D) 토폴로지:선형
(2) 분자 유형:아미노산
(3) 가설:없음
(4) 안티센스:없음
(5) 공급원
(B) 생물:코리네박테리움 글루타미쿰
(6) 서열의 기재:서열 2

Claims (5)

  1. (a) 서열 2로 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 (b) 1개 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환에 의해 (a)와 비교할 때 변경된 폴리펩티드로부터 선택되고 디히드로오로테이트 데히드로게나제 활성을 갖는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 상응하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 조절 서열 1개 이상과 함께 제2항에 상응하는 폴리뉴클레오티드의 카피 1개 이상을 포함하는 유전자 구조물.
  4. 제3항에 상응하는 유전자 구조물로 형질변형된 숙주 생물.
  5. 제4항에 상응하는 숙주 생물을 배양한 후 피리미딘 또는 피리미딘 유도체를 단리함으로써 피리미딘 또는 피리미딘 유도체를 생산하는 방법.
KR1020017016566A 1999-06-25 2000-06-23 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 디히드로오로테이트데히드로게나제 서열, 및 미생물에 의한 피리미딘및(또는) 피리미딘 관련 화합물 생산에 있어서 그의 용도 KR20020026470A (ko)

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