KR940005592B1

KR940005592B1 - 이. 콜라이에서 써머스 아쿠아티커스 dna 폴리머라제의 생산을 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR940005592B1
Application number: KR1019910018801A
Authority: KR
Inventors: 알란 설리반 마크
Original assignee: 이스트만 코닥 캄파니; 제이. 제프리 홀리
Priority date: 1990-10-26
Filing date: 1991-10-25
Publication date: 1994-06-21
Also published as: EP0482714A1; JPH0759195B2; US6083686A; KR920008186A; IL99852A0; ATE136932T1; DE69118809D1; NO914191D0; CS324291A3; DE69118809T2; ES2086479T3; NO914191L; DK0482714T3; CA2052827A1; HU913365D0; SG52453A1; JPH05130871A; AU8469091A; HUT62334A; EP0482714B1

Abstract

내용 없음.

Description

이. 콜라이에서 써머스 아쿠아티커스 DNA 폴리머라제의 생산을 증가시키는 방법

제1도는 이.콜라이 숙주를 형질전한시키는데 사용되는 백터 pSCW 562의 관련된 유전자 성분들을 나타낸다.

본 발명은 유전공학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은, 이.콜라이에서 고유의 유전자를 변경시켜 개선된 발현을 갖는 돌연번이체 형태를 제공하는 것에 관한 것이다.

재조합 기법에서 성취한 주요 업적중의 하나는 에스케리키아 콜라이(E. coli)와 같은 원핵세포에서 외래 단백질을 고농도로 발현(과생산) 시킨 것이다. 이러한 기법은 최근에 의학적 및 과학적으로 중요한 단백질들(이들중 다수는 이미 임상적 치료 및 과학적 연구에 이용하고 있다)의 유용성을 개선시켰다. 원핵 세포에서 단백질의 과생산은 효소와 적합한 기질과의 활성을 직접 측정하거나 또는 생산된 특정 단백질의 물리적 양을 측정함으로써 입증된다. 고농도의 단백질 생산은 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 개선시킴으로써 성취할 수 있다. 유전자 발현의 중요한 태양은 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 번역하는 능력에 있다. 본 분야에서는 핵산 생화학 자체에 유용한 시약인 세균성 효소, 예를 들면 DNA 리가제, DNA 폴리머라제 등의 생산을 개선시키는데 많은 관심이 있다.

불행하게도, 상기 기법이 반드시 높은 수율의 단백질을 제공하는 것은 아니다. 단백질의 수율이 낮은 원인중의 하나는 외래 단백질을 암호하하는 뉴클레오티드 서열의 번역능력이 비효율적인데 있다. 단백질 수율의 증대는 특히 효율적인 번역을 보장하는데 따라 변한다.

여러실험실에서의 광범위한 연구를 통해, 유전자의 N-말단-암호화 영역의 뉴클레오티드 서열이 번역 능력에 강하게 영향을 미치는 인자들중의 하나임을 이제 밝혀냈다. 또한 유전자의 개시코돈을 변경시켜 불충분한 변역을 극복할 수 있음도 인지되었다. 하나의 방법은 코돈 선택을 변경시키는 공지된 유전자 암호의 변성을 사용함으로써, 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 변경시킴 없이 암호화 서열의 첫번째 부분을 재구성하는 것이다.

그러나, 상기 연구들은 어느 염기가 중요한지 또는 특정 단백질을 위해 어느 서열을 변경시켜야 하는지에 관해서 예견, 교지하거나 또는 지점을 제공하지 않는다. 따라서, 연구가들은 상기 재조합 기법을 사용함으로써 단백질 생산을 최적화하고자 할 때 반드시 실험적 접근방법을 채택해야 한다.

실험적 접근 방법은 힘이 드는 방법이다. 일반적으로, 정확한 아미노산 서열에 대한 모든 잠재적 코돈을 포함하는 다양한 합성 올리고뉴클레오티드를 N-말단 암호화 영역에서 치환시킨다. 이어서 다양한 방법을 사용하여 높은 발현 수준을 제공하는 한 올리고뉴클레어티드를 선별하거나 또는 스크리닝 한다. 또다른 접근 방법은 고유 서열을 임의로 돌연변이 유발시킴으로써 일련의 유도체를 수득하는 것이다. 광범위한 스크리닝 방법을 사용하여 높은 발현수준을 갖는 클론을 수득하게 될 것이다. 이어서 상기 후보물질들은 분석하여 "최적"서열을 결정하고 상기 서열을 사용하여 고유 유전자에서 상응하는 단편들을 치환시킨다. 이러한 무차별 접근 방법은 힘이 든다.

상기 장황한 방법을 사용하여 변경되지 않은 (고유의) 유전자에 의해 생산된 원하는 단백질의 합성을 단지 소량으로 증대시킨다. 써머스 아쿠아티커스(Thermus aquaticus)의 내열성 DNA 폴리머라제(Taq Pol)가 이러한 생성물이다.

Taq Pol은 핵산 스트랜드에 상보적인 핵산 스트랜드를 형성하는 뉴클레오티드 트리포스페이트의 결합을 촉진한다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 핵산의 증폭에 내열성 Taq Pol을 적용하는 것이 분자 생물학에 있어서 PCR을 그의 현재의 우세한 위치로 발전시키는데 중요한 단계였다. Taq Pol을 암호화하는 유전자를 클로닝시키고, 서열화하고, 이. 콜라이에 발현시켜 단지 적당한 양의 Taq Pol을 수득하였다.

이 문제는 비록 Tqp Pol을 다수의 공급원으로부터 상업적으로 입수할 수 있더라도, 부분적으로 통상 이용할 수 있는 방법을 사용함으로써 회수된 양이 많지 않기 때문에 비싸다는 것이다. Taq Pol의 증가된 수요를 만족시키고 보다 경제적으로 생산하기 위해 Taq Pol의 생산을 증가시키는 것이 분명히 바람직하다.

본 발명은 성숙한 고유 단백질의 첫번째 10개 아미노산을 암호화하는 고유 유전자의 첫번째 30개 뉴클레오티드의 서열이 하기 A) 또는 B)에 의해 변화된 Taq 폴리머라제의 유전자를 제공한다 :

로 이루어진 그룹으로부터 선택된 변경된 뉴클레오티드 서열을 성숙한 고유 단백질의 첫번째 10개 아미노산을 암호화하는 고유 유전자의 첫번째 30개 뉴클레오티드의 서열 대신에 치환시키거나, 또는

B) 성숙한 고유 단백질의 첫번째 아미노산에 대한 코돈(ATG)과 성숙한 고유 단백질의 두번째 아미노산에 대한 코돈(AGG) 사이에 GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG 24의 서열(서열 식별 번호 : 5)을 삽입한다.

본 발명은 또한 상기 변경된 유전자를 사용함으로써 Taq Pol의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 200배 정도로 증가된 폴리머라제 활성 수준을 제공한다. 본 발명의 재조합 폴리머라제는 고유 Taq Pol과 기능적으로 구별할 수 있다.

[개요]

본 발명의 목적은 폴리머라제의 N-말단을 암호화하는 유전자의 5' 영역에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 변화시킴으로써 이. 콜라이에서 Taq 폴리머라제의 생산을 증가시키는 것이다.

본 발명은 고유의 써머스 아쿠아티커스 폴리머라제(Taq Pol) 유전자와 하나 내지 다수의 뉴클레오티드가 상이한 4개의 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 이러한 DNA 서열을 고유 유전자에 도입하고, 이. 콜라이에 형질감염시키면, 효소의 증가된 활성에 의해 입증된 바와 같이 유전자의 개선된 발현이 제공된다. 증가량은 수행된 뉴클레오티드 변화 및 또한 IPTG를 사용한 유도, 이. 콜라이의 배양시간 등과 같은 기타의 인자에 따라 매우 다양하다.

본 발명에 의해 제공된 유전자는 본 발명에 따라 수행된 고유 서열의 변화를 제외하고 고유 Taq Pol 유전자와 동일하다. 이러한 변화는 수행되는 경우, 이들을 구체적으로 개시하며 실시예 및 서열목록에 나타낸다. 단백질의 N말단을 암호화하는 영역에서만 변화를 일으킨다. 보다 구체적으로, 변화는 단지 성숙한 고유 단백질의 11번째 아미노산(라이신)을 암호화하는 11번째 코돈(AAG)의 상향 영역에서만 일어난다. 11번째 코돈은 바뀌지 않았으나, 본 발명을 실행할 때 그보다 위쪽에서 변화가 수행됨을 표시하기 위해 이를 괄호 또는 점으로 서열목록에 나타낸다. 이러한 확인된 변화를 제외하고, Taq Pol 유전자의 남은 서열을 바뀌지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "Taq Pol 유전자"라는 용어는 써머스 아쿠아티커스의 내열성 DNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 지칭하며, 돌연변이가 고유 폴리머라제의 본질적인 활성에 실질적인 변화를 부여하지 않는 한, 고유 유전자의 자발적이거나 또는 유도된 돌연변이 형태를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "Taq Pol"이라는 용어는 Taq Pol 유전자에 의해 암호화된 폴리머라제를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "고유의"라는 용어는 티. 아쿠아티커스에서 자연적으로 발생하는 유전자 또는 효소와 같은 Taq Pol 유전자의 변경되지 않은 뉴클레오티드 서열 또는 Taq 폴리머라제의 변경되지 않는 아미노산 서열을 지칭한다. 서열식별번호 1을 참조하시오.

일반적으로, 본 발명은 하기 A) 내지 C)의 단계들을 포함한다 :

A) 본 발명의 Taq Pol 유전자를 벡터에 제공하고,

B) A)의 백터로 양립성 이. 콜라이 숙주 세포를 형질감염함으로써 형질전환된 이. 콜라이 숙주 세포를 수득하고,

C) 증식 조건하에서 B)의 형질전환된 세포를 배양함으로써 형질 전환된 숙주세포에 의해 합성되는 Taq 폴리머라제를 생산한다.

하기의 세균 균주, 플라스미드, 파지 및 시약을 본 발명에 사용한다.

[세균 균주]

서머스 아쿠아티커스 YT-I, ATCC 25104번을 고유 DNA 단리에 사용한다. 모든 클로닝 및 플라스미드 조작을 위한 숙주인 이. 콜라이 균주 DH5α[F-θ 80dlacZ△M15 △(lacZYA-argF) U169 recAl endAl hsdR17(rk^-, mk⁺) supE44 thil gyrA relAl]를 BRL로부터 수득한다.

균주 JM1031[thi^-, strA, supE, endA, sbcB, hsdR^-, D(lac-pro), F' traD36, proAB, lac^q, lacZDM15] (Yanisch-Perron and others, Improved M13 Phage Cloning Vectors and Host Strains ; Nucleotide Sequence of M13mp18 and pUC19 Vectors, Gene 33 ; 103-119(1985)를 또한 단백질 발현 실험에 이용한다.

돌연변이유발에 사용하기 위한 단일-가닥 DNA 제조용 숙주 균주는 CJ236이다(pCJ1405, dut ung thirelA)(Kunkel and others, Rapid and Efficient Sits-Specific Mutagenesis without Phenotypic Selection, Methods Enzymol 154 ; 367-382, (1987)).

F1 파지 R408(Russel and others, An Improved Filamentous Helper Phage for Generating Single-Stranded DNA, Gene 45 ; 333-338(1986)을 돌연변이유발에 사용하기 위한 단일-가닥 플라스미드 DNA를 발생시키는 헬퍼(helper)로서 사용한다. 모든 클로닝 및 발현 작업에 사용되는 플라스미드는 pSCW562 또는 그의 유도체인 pTaq 1이다. pSCW562의 그림을 제1도에 나타낸다. 고유 Taq Pol 유전자를 pSCW562에 삽입할 때, 생성된 플라스미드를 pTaq 1으로 표시한다. 고유 Taq Pol 유전자를 돌연변이 유발에 의해 변경시킬 때, 돌연변이를 일으킨 뉴클레오티드 서열에 따라 돌연변이 플라스미드를 pTaq 3, pTaq 4, pTaq 5 또는 pTaq 6으로 표시한다.

[시약]

화학약품들은 시그마, 인터내쇼날 바이오테크놀로지사(Sigma, International Biotechnologies, Inc.) 또는 이스트만 코닥사로부터 구입한다. LB 배지는 깁코(Gibco)로부터 구입한다. 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolads), IBI, BRL. 베링거-만하임(Boehringer-Mannheim), 또는 유.에스.바이오 케미칼스(U.S.Biochemicals)로부터 구입하고 공급자가 추천는 바와 같이 사용된다. DNA 서열 결정에서 시쿼나제^TM(Sequenase^TM)키트를 유.에스 바이오케미칼스로부터 구입한다. 방사성 동위원소를 에머샴(Amersham)로부터 구입한다. Taq 폴리머라제를 세투스(Cetus)로부터 구입한다.

[Taq Pol의 생산을 증가시키는 방법]

단계 A-본 발명의 Taq Pol 유전자를 벡터에 제공

본 발명의 Taq Pol 유전자를 벡터에 제공하는 하나의 방법은 하기와 같다 :

- i) 써머스 아쿠아티커스로부터 고유 DNA를 제공하고,

- ii) 고유 Taq Pol DNA를 증폭시키고 DNA 단편의 양 끝에 제한 부위를 결합시키고,

- iii) ii)의 DNA 단편을 적합한 벡터내로 연결시키고,

- iv) 부위가 정해진(site-directed) 돌연변이유발을 사용하여 고유 DNA의 뉴클레오티드 서열을 변화 시키고,

- v) 본 발명의 변화된 뉴클레오티드 서열을 갖는 벡터를 스크리닝한다.

i. 티. 아쿠아티커스로부터의 고유 유전자의 제공

모든 DNA 조작은 표준 프로토콜(Maniatis and others, Molecular Cloning ; ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Yorkm 1982 and Ausebel and others, Current Protocols in Mlnecular Biology, John Wilet and Sons, New York, New York, 1987)을 사용하여 수행한다.

ATCC 배지 #462중에서 70℃에서 밤새 증식한 미생물 배양액 40ml로부터 티.아쿠아티커스(균주 YT-1, [ATCC No.25104]로부터의 전체 DNA를 단리시킨다. 세포를 원심분리에 의해 펠릿화시키고, 10mM 트리스 HCL(pH 8.0), 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 10mM 트리스 HCL(pH 8.0) (TE)로 1회 세척하고, TE 5ml에 재현탁시킨다. 리소자임을 1mg/ml의 농도로 가하고 용액을 30분간 37℃에서 배양한다. EDTA, 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 및 단백질 분해효소 K를 각각 50mM, 0.5% 및 100㎍/m의 농도로 가하고, 용액을 50℃에서 4시간동안 배양한다. 샘플을 페놀-클로로포름으로 3회 및 클로로포름으로 1회 추출하고, 아세트산 나트륨을 0.3M로 가하고 에탄올 2부피를 가함으로써 DNA를 침전시킨다. DNA를 유리 막대로 감아 모으고, 70% 에탄올로 세척하고, TE에 용해시킨다.

ii. 고유 Taq Pol 유전자의 증폭 및 제한 부위 결합

Taq Pol 유전자를 다량 생산하는 가장 빠른 방법은 유전의 발표된 핵산 서열(Lawyer and others, Isolation, Charaterization and Expression inEscherichia coilof the DNA Polymerase formThermus aquaticus, Jouran of Biological Chemisity, 264 : 6427-6437, 1989)을 이용하여 게놈 DNA를 증폭시키기 위한 PCR에서 사용할 수 있는 올리고뉴클레디오티드 플라이머를 구상하는 것이다. 전체 유전자 서열에 대해서는 서열식별번호 ; 1을 참조하시오.

PCR은 본 분야에 잘 공지된 증폭기법(Saiki and others, Primer-directed Enzymaic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymeraze, Science 239 : 487-491(1988)이며, 공지된 특정 핵산 서열을 다량 생산하는 연쇄 반응을 포함한다. PCR은 증폭되는 핵산 서열이 원하는 핵산 서열과 하이브리드를 형성하고 연장 생성물을 합성할 만큼 상기 원하는 핵산 서열에 충분히 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조할 수 있도록 충분하게 상세히 공지되어 있어야 할 필요가 있다.

프라이머는 천연 또는 합성 올리고뉴클레오티드이며, 핵산 스트랜드에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성이 유도되는 조건하에서, 즉, 적합한 완충제 및 적합한 온도에서 4개의 상이한 뉴클레오티드 트리포스 페이트와 내열성 효소의 존재하에 놓일 때, DNA 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다.

PCR 증폭을 문헌[Saiki and others, in an Ericomp thermocycler]에 개시된 바와 같이 필수적으로 i]의 Tap Pol DNA상에서 수행한다. 프라이머를 발표한 Taq Pol 유전자 서열(Lawyer and others)을 기본으로 구상한다. 증폭 혼합물은 약100ng의 티. 아쿠아티커스 DNA 각각 1μM의 2개의 프라이머, 각각 200μM의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP및 0.05ml 부피의 Taq Pol 2 유니트를 함우한다. 혼합물을 10초간 97℃로 가열하고, 30초간 40℃에서 어닐링(annealing)하고, 5분간 72℃에서 5 사이클동안 연장시킨다. 연속적적으로 20 사이클동안, 어닐링 온도를 55℃로 올리고 연장시간을 3분으로 감소시킨다. 최종적으로, 혼합물을 15분간 72℃에서 배양하여 완전하게 이중가닥인 생성물의 양을 최대화시킨다. 전체 PCR 반응 혼합물을 1.0% 한천 겔상에서 단편화시키고 2.5Kb의 Taq 폴리머라제 유전자를 절단하고 추출한다. DNA 단편을 "동결-압착 기법'을 사용하여 한천 겔으로부터 단리시킨다. 한전 조작을 잘게 썰고, 드라이 아이스상에서 냉동시키고 5분간 37℃에서 고속 해동시킨다. 슬러리를 밀리포어(Millipore) 0.45mm 듀라포어(Durapore)막을 통해 원심분리에 의해 여과한다. 여과물을 수 포화된 페놀로 1회, 페놀-클로로포름(1 : 1)으로 1회, 및 클로로포름으로 1회 추출한다. DNA를 에탄올 침전에 의해 회수한다.

제한 부위의 결합 : PCR 과정동안 Taq Pol 유전자의 절제 및 회수를 허용하고 또한 발현 벡터내로 Taq Pol 유전자를 편리하게 클로링시키기 위해서, 2개의 제한 부위를 유전자의 양 스트랜드의 5' 말단에 도입시킨다. 보다 구체적으로, 하나의 제한 부위를 개시 코돈(ATG)에 연결하여 하향으로 도입시키고, 다른제한 부위는 정지 코돈(TGA)에 인접하여 하향으로 도입시킨다. (서열식별번호 : 6과 7). 제한 부위를 형성하는 뉴클레오티드는 PCR에 사용되는 합성 프라이머에 포함된다. 하기 개시한 예에서, 뉴클레오티드 서열 GAATTC(상기는 EcoI1 제한 부위를 형성한다)는 상기 프라이머에 포함된다.

다른 제한 부위들을 본 발명의 실시에서 사용할 수도 있으나, 단1) 발현벡터는 Taq DNA를 연결할 상응 부위를 갖고 2) 제한부위는 Taq Pol 유전자내에서는 나타나지 않아야 한다.

제1도에 나타낸 바와 같이, EcoR1은 pSCW562에 있는 다수 제한 부위들중의 하나이다. 기타 전형적인 제한 부위는 Xball 및 SphI이다. 물론, 다른 제한 부위를 갖는 발현 벡터가 본 발명의 실시예 유용한 훨씬 더 잠재적인 제한 부위를 제공할 수도 있다.

적합한 효소로 절단될 때, 상기 제한 부위들은 발현 백터상에서 상응하게 절단된 제한 부위에 편리하게 연결될 수 있는 접착 말단을 형성한다. 제한 부위들은 Taq Pol 의 아미노산 서열에는영향을 미치지 않는다.

또다른 방법 ; 상기 개시한 PCR 기법 대신에, 다른 방법으로 고유 Taq Pol 유전자를 통상적으로 클로닝시킴으로써 제공할 수 있다. 상기 경우에, 제한 부위를 부위가 정해진 돌연변이 유발에 의해 도입시킬 수도 있다. 상기 양 방법들의 최종 결과를 구별할 수 없을 정도이다.

iii. 벡터내로 DNA 단편들의 연결

단계 ii)로부터의 DNA를 이어서 적합한 발현 벡터에 연결시킨다. 콜로닝을 위해 선택한 벡터는 pSCW562이며, 이는 리보소음 결합 부위와 강한 tac(trp-lac 하이브리드)프로모터의 하향으로 11개의 염기쌍을 갖는 EcoR1 부위를 함유한다(제1도). Taq Pol 유전자는 어떤 EcoR1 부위도 함유하지 않으며, 따라서 PCR 프라이머를 상기 프라이머의 5' 말단(단계 ii)) 부근에서 EcoR1 부위를 갖도록 구상하여 pSCW562의 EcoR1 부위로 직접 클로닝 시킨다.

EcoR1 부위 이외에, 벡터 pSCW562는 1) 파지 복제 개시점(F1), 2) 플라스미드 복제 개시점(ORI), 3) 항생물질 내성마커(AMP), 및 4) 제한 부위의 하향의 전사 종결 서열을 함유한다. 상기 플라스미드를 문헌 [Maniatis and others, Molecular Cloning ; A Laboratory Manual, Cold Spring Haebor, New York (1982)]에 교지된 바와 같이 재조합 DNA 분야에 잘 공지된 기법을 사용하여 제작한다. 그러나, 이러한 특정 플라스미드가 본 발명에 중요한 것은 아니다. 적합한 프로모터와 제한 부위를 함유하는 임의의 벡터가 본 발명에 유용한다.

단계 ii)로부터 얻은 EcoR1 절단된 PCR 생성물을 1% 한천겔에서 단편화시키고 용출시킨다. pSCW562 벡터를 밤새 EcoR1(10 단위/㎍)으로 절단시키고, 송아지 장의 알칼리 포스파타제(1 단위/㎍)로 처리하고, 페놀/클로로포름으로 추출하고, 에탄올 침전시키고 TE에 재현탁시킨다. 준비된 벡터 약200ng을 정제된 PCR 생성물 500ng과 혼합하고 18시간동안 50mM 트리스 HCl(pH7.8), 10mM MgCl₂, 20mM 디티오트레이톨, 1mM ATP중에서 20μ1 부피의 T4 DNA리가제 0.5바이스 유니트를 사용하여 연결시킨다.

iv. 부위가 정해진 돌연변이유발을 이용하여 고유 Taq Pol 유전자의 뉴클오티드 서열 변화.

부위가 정해진 동연변이유발은 변경하려는, 서열내로 선택된 뉴클레오티드를 특이적으로 치환, 삽입 또는 결실시킴으로써 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 변경시키는 방법이다. 이 방법은 주형 서열과 잘못 짝을 지은 뉴클레오티드를 가지며 화학적으로 합성된 뉴클레오티드를 사용하여 생체외에서 DNA 합성을 자극함을 포함한다. 합성 올리고뉴클레오티드는 DNA 합성을 자극하며 그 자체가 생성된 이종 2 사슬(heteroduplex) 분자내로 결합된다. 숙주세포의 형질전환 후에 상기 이종2사슬은 돌연변이유발성 뉴클레오티드를 수반하는 서열을 갖는 동종 2사슬(homoduples)을 생성시킨다. 돌연변이체 클론을 표지된 탐침과 핵산의 하이브리드형성 및 DNA 서열화와 같은 본 분야에 잘 공지된 스크리닝 기법에 의해 선별한다.

부위가 지정된 돌연변이유발을 사용하여, 성숙한 고유 단백질의 첫번째 10개 아미노산을 암호화하는 고유 유전자의 첫번째 30개 뉴클레오티드 염기의 서열이 하기 A) 또는 B)에 의해 변화된, Taq 폴리머라제에 대한 돌연변이 유전자를 제작한다 :

로 이뤄진 그룹으로부터 선택된 변경된 뉴클레오티드 서열을, 성숙한 고유 단백질의 첫번째 10개 아미노산을 암호화하는 고유 유전자의 첫번째 30개 뉴클레오티드의 서열 대신에 치환시키거나, 또는 B) 성숙한 고유 단백질의 첫번째 아미노산에 대한 개시코돈(ATG)과 성숙한 고유 단백질 두번째 아미노산에 대한 코돈(AGG) 사이에 GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG 24의 서열(실시예 4-서열식별번호 : 13)을 삽입한다.

상기의 예들에서, 변환된 염기는 굵은 필체로 강조했다. 상기 변화가 폴리머라제 활성에 미치는 효과를 표1에 나타낸다. 상기 예들은 단지 예시를 위해서 제공하는 것이며, 결코 특허청구된 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

상기 실시예에서, 모든 유전자 변경은 부위가 지정된 돌연변이유발에 의해서 수행한다. 그러나, 동일한 결과를 제공하는 또 다른 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 상기 개시한 변화된 Taq Pol 유전자를 증폭(PCR) 시키는 동안 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 상향의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 적합하게 구상함으로써 유전자에 직접 결합시킬 수도 있다.

또 다른 방법은 유전자의 첫번째 10개 코돈을 일괄하는 특이한 제한 부위를 결합시키는 것이다. 이는 제한 엔도뉴클레아제 절단 및 이중가닥의 합성 단편을 사용한 치환에 의해서 아미노 말단을 암호화하는 서열의 제거를 허용한다. 상기 방법들중의 어느 하나를 사용하여 상기 개시한 뉴클레오티드 변화를 수행할 수 있다.

부위가 지정된 돌연변이 유발을 필수적으로 바이오래드로부터 수득한 키트를 사용하여 문헌[Kunkel and others, Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis without Phenotypic Selection, Methods Enzymol, 154 : 367-382(1987)]에 개시된 바와 같이 수행한다. 단일-가닥 플라스미드 DNA를 R408을 사용하여 CJ236(pTaq을 가짐)의 초기 대수기 배양물을 약 10 내지 20의 감염다증성에서 감염시킴으로써 제조한다. 37℃에서 밤새 증식시킨 후에,원심분리에 의해서 세포를 제거하고 폴리에틸렌글리콜을 5%로 가하고 NaCl을 0.5M로 가함으로써 파지를 침전시킨다. 파지를 원심분리에 의해 펠릿화시키고 DNA를 페놀-클로로포름 추출 및 에탈올 침전에 의해 단리시킨다. 변이유발성 올리고뉴클레오티드를 T4 폴리튜클레오티드 키나제로 부인산화반응시키고 각각의 9 피코몰을 약 3 피코몰의 단일-가닥 폴리스미드 DNA에 어닐링시킨다. 어닐링된 혼합물을 T4 DNA폴리머라제로 연장시키고, 결합시키고, DH5α 또는 JM103내로 형질전환 시킨다. 플라스미드 DNA를 고속 비등(Holmes and Quigley, A Rapid Boiling Method for the Preparation of Bactrial Plasmids, Anal. Biochen. 114 : 193-199, 1981) 시킴으로써 형질전환체로부터 단리시키고 EcoR1으로 절단시켜 돌연변이 유발된 클론을 동정한다.

v Taq Pol 유전자를 갖는 벡터의 스크리닝

iv)의 클론이 원하는 Taq Pol 유전자를 가짐을 임증하기 위해서, 클론을 니트로셀룰로즈 필터상에 올려놓고 콜로니 하이브리드 형성에 의해서 Taq Pol 형질전환체로서 동정한다.

콜로니 하이브리드 형성 : 본 기법은 특정 핵산 서열의 단일 가닥이 상보적인 방사성 단일 가닥 핵산 단편(탐침)과 염기 쌍을 형성(하이브리드 형성)하는 조건을 일으킴으로써 특정 핵산 서열을 동정하는 것이다. 2가지 유형의 DNA가 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지며 그들의 방사능에 의해 검출되는 이중가닥 영역이 형성된다.

Taq Pol 단편을 함유하는 콜로나를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제와 5' 말단에서³²P로 표시된 내 부 올리고 뉴클레오티드 : 서열식별번호 : 15 : GTGGTCTTTG ACGCCAAG를 하이브리드 형성시킴으로써 동정한다. 콜로니 하이브리드 형성은 상기 문헌[Maniatis and ohters]에 개시한 바와 같이 약 5ng/ml의³²P 표지된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 0.5% 차단제(베링제-만하임), 5배 SSDE[10mM 인산 나트륨(pH 7.0), 0.18M NaCl, 1mM EDTA중의 1X SSTE], 0.1% 나트륨 라우로일 샤르코신, 0.02% SDS중에서 수행한다. 하이브리드형성은 42℃에서 4 내지 18시간동안 수행한다. 필터를 2배 SSTE, 실온에서 0.1% SDS로 3회 세척한 다음, 42℃에서 동일한 용액으로 엄격하게 세척한다. 양성(+) 콜로니를 방사선사진법에 의해 동정한다.

서열분석 : Taq Pol DNA가 정확한 방향으로 결합되었는지의 여부를 확인하기 위해서, 유. 에스. 바이오 케미칼사로부터의 시쿼나제^TM키트와 (³⁵S) dATP를 사용하여 문헌[Zhang and others, Double Stranded DNA Sequencing as a Choice for DNA Sequencing, Nucleic Acids Research 16 : 1220(1988)]에 개시된 바와 같이 알칼리 변성의 수퍼코일된(supercoiled) DNA 상에서 DNA 서열 분석을 수행한다. 전형적으로, 10μ1의 수퍼고일된 CsCl-밴드 DNA를 5분동안 20μ1의 0.2M NaOH ,0.2mM EDTA에서 변성시킨다. 용액을 2μ1의 2M 암모늄 아세테이트(pH 4.6)로 중화시키고 60ml의 에탄올로 침전시킨다. 혼합물을 10분동안 원심분리시키고, 80% 에탄올로 1회 세척하고, 10분동안 건조시키고, 7ml의 H₂O에 재현탁시킨다. 5ng의 프라이머와 2μ1의 5배 완충액을 첨가한 후에, 샘플을 65℃로 가열하고 30 내지 45분동안 37℃ 미만으로 냉각시킨다. 이어서 서열화 반응들을 공급자가 지시한 바와 같이 수행한다. 반응들을 때때로 겔기부 근처의 용해를 개선시키기 위해서 나트륨 아세테이트 염구배를 사용사여 6% 서열화 겔상에서 전기영동시킨다. (Sheen and others, Electrolyte Gradient Gels for DNA Sequencing, Bio Tichniques 6 : 942-944, 1989). 한편, 비록 신빙성이 약간 감소되기는 하지만, 고속비등 또는 알칼리 소형제조 방법에 의해 제조된 플라스미드 DNA를 페놀-클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침적시킨 후에 서열화에 사용한다.

단계 B- A)의 벡터를 사용하여 숙주세포를 형질감염시킴.

단계 A)의 벡터를 적합한 숙주를 형질감염시키는데 사용하고 형질전환된 숙주를 증식에 유리한 조건하에서 배양시킨다. 원핵 숙주가 일반적으로 가장 효율적이며 유전공학기법에 편리하고, 따라서 Taq 폴리머라제의 발현에 바람직하다. 가장 빈번히 사용되는 원핵 생물은 DH5α 및 JM103와 같은 이. 콜라이의 다양한 균주들이며, 이 균주들을 하기 실시예에 사용한다. 그러나 숙주가 형질전환된 플라스미드 벡터에 적합한 것으로 선택된 균주인 한은 다른 미생물 균주들도 또한 사용할 수 있다. 숙주 및 플라스미드/벡터의 적합성이란 숙주가 플라스미드/벡터 DNA를 정확하게 복제하고 상기 조절 요소들의 작용을 완전하게 하는 것을 의미한다. 본 발명의 시스템에서, DH5α 및 JM103이 pSCW562에 적합하다.

단계 B의 결합 혼합물 5ml을 문헌[Cohen and others, Proc, National Academy of Science, USA, 69 : 2110(1972)]에 개시된 바와 같이 CaCl₂처리에 의해 수용적으로 제조된 DH5α 또는 JM103 세포 0.1μ1와 혼합한다. 혼합물을 15 내지 30분간 빙상에서 배양한 후에, 90초동안 42℃에서 배양한다. 열충격을 가한후에, 1ml의 LB 배지를 가하고 세포를 37℃에서 1시간동안 배양시킨다.

형질전한체의 선별 : 1시간 배양한 후에, 배양된 혼합물의 분액을 50μlg/ml의 암피실린을 함유하는 LB 한천 플레이트상에확산시키고 18시간동안 37℃에서 배양한다. AMP(마커) 유전자를 갖는 형질전환된 이. 콜리이만이 상기 배지에서 자랄 수 있다. 또한 정확한 방향으로 Taq Pol 유전자를 갖고 있는 형질전환체를 선별하기 위해서, 이미 상기 개시한 기법을 사용하여 콜로니 하이브리드 형성 및 서열 분석을 수행한다.

단계 C-형질전환된 숙주의 배양

정확한 방향으로 Taq Pol 유전자를 함유하는 것으로서 입증된 이. 콜라이 형질전환체를 중간 대수기로 37℃에서 40ml의 LB 육즙에서 배양시키고, 적합하다면, 1mM 이소프로필 -β-D-티오 갈락토사이드(IPTG)로 유도시킨다. 세포를 추가로 2시간동안 또는 밤색 증식시키고 원심분리에 의해 수확한다. 세포를 0.25ml의 50mM 트리스 HCl(pH 7.5), 1mM EDTA, 0.5㎍/ml 류펩틴, 2.4mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드에 재현탁시키고 초음파처리한다. 용해질을 0.25ml의 10Mm 트리스 HCL(pH 8.0), 50mM KCl, 0.5% 트원 20. 05% NP-40으로 희석하고 20분간 74℃에서 가열한다. 빙상에서 15분간 냉각시킨 후에, 4℃에서 10분간 원심분리시켜 부스러기들을 제거한다. 상등액의 분액을 기질로서 활성화된 연어 정자 DNA를 사용하여 DNA 폴리머라제 활성에 대해 분석한다.

DNA 폴리머라제 분석 : 본 분석은 이중가닥 DNA에 형성된 단일가닥의 틈을 채우는 DNA 폴리머라제의 능력을 기본으로 한다. 주형으로서 단일가닥의 틈을 사용하고 합성이 시작되는 프라이머로서 단일가닥 틈의 경계에서 유리 3' 하이드록실 그룹을 사용한다. 구체적으로, 효소 준비물 5μ1를 25mM 트리스(하이드록시메틸) 메틸-3-아미노-프로판 설폰산(TAPS)(22℃에서 pH 9.8), 50mM KCl , 1mM 2-머캅토에탄올, 2 mM MgCl₂, 0.30mg/ml의 활성화된 연어 고환 DNA, dCTP, dTTP, dTTP 각각 0.2mM 및 [8-³H]dATP 0.1mM(200nCi/nmd) 총 50μ1 중에서 10분동안 74℃에서 배양시킨다. 100μ1의 0.15M 나트륨 피로포스페이트, 0.105M 나트륨 EDTA(pH 8.0)을 가한 다음, 빙냉의 10% 트리클로로아세트산(TCA)을 가하여 반응을 정지시킨다. 이어서 15 내지 30분간 빙상에서 유지시킨 후에 미리 적신 25mm 와트만 유리 섬유 필터(GFC) 필터 디스크상에서 진공여과시킨다. 침전된 반응 생성물을 총 12ml의 빙냉각된 10% TCA에 이어서 총 12ml의 빙냉각된 95% 에탄올로 필터상에서 결합되지 않은³H 없이 세척한다. 필터를 진공 건조시키고, 이어서 공기 건조시키고, 이어서 섬광 유체중에서 직접 수를 센다. 희석이 필요한 효소 준비물을 10mM 트리스, 50mM KCl, 10mM MgCl₂, 1.0mg/ml의 젤라틴, 0.5% 노니데트 P40, 0.5% 트윈 20, 1mM 2-머캅토에탄올(pH 8.0)용액으로 희석한다. 1단위의 활성은 74℃에서 30분내에 10 나노몰의 전체 뉴클레오티드를 결합시키는데 필요한 효소의 양이다; 아데닌을 연어 정자 DNA 중의 전체 염기의 약 29.7%를 구성한다.

연어 고환 DNA(시그마 유형 III ; 제품 #D1626)를 TM 완충액(10mM 트리스, 5mM MgCl₂, pH 7.2)에 1.3mg/ml로 용해시키고 4℃에서 24시간동안 서서히 교반한다. 이어서 TM 완충액으로 2.5배 희석하고 0.3M HCl 중에서 수행한 후에 실온에서 동분량의 페놀/클로로포름(1 : 1; 부피 : 부피 TM 완충제로 포화된 페놀)으로 추출한다. 혼합물을 실온에서 5분간 2700xg로 원심분리시켜 상분리를 돕고, 수성상을 모으고 동분량의 클로로포름으로 추출한다. 혼합물을 상기와 같이 원심분리시키고 수성상을 다시 모은다. 수성상중의 활성화된 DNA를 -20℃에서 2 부피의 95% 에탄올로 침전시키고 ; 침전된 혼합물을 -20℃에서 12 내지 18시간동안 유지시킨다. 침전된 DNA를 2℃에서 30분 동안 13,700xg로 원심분리시킴으로써 모은다. 펠릿을 질소 가스 스트림으로 건조시키고 이어서 실온에서 12내지 18시간동안 서서히 진동시키면서 TE(10mM 트리스, 1mM EDTA, pH 7.5)로 3 내지 6mg/ml을 재용해시킨다. 용액을 TE에 대해서 투석하고 이어서 260nm에서 흡광도를 조사함으로서 적합한 농도로 조절한다. 분액(0.5 내지 1.0ml)을 -20℃에서 저정하고 ; 사용하기 위해서, 하나의 바이알을 해동시키고, 이어서 재동결시키기 보다는 4℃에서 유지시킨다.

[폴리머라제 분석의 결과]

Taq Pol 분석의 결과를 표1에 나타낸다. 벡터 pTaq 1이 고유 Taq Pol 서열인 서열식번호 : 1을 갖는 반면, 다른 4개의 플라스미드는 상기 개시한 바와 같이 본 발명에 따라 변경된 서열을 갖는다.

표I는 의외로 pTaq 3(서열식별번호 : 2)가 pTaq 1보다 200배까지 Taq Pol 활성을 발현하며 ; pTaq4(서열식별번호 : 3)는 pTaq 1 활성의 약 10배를 가지며 ; pTaq 5(서열식별번호 : 4)는 실험에 따라서 pTaq 1보다 약 10 내지 50배 크며 ; pTaq 6(서열식별번호 : 5)는 pTaq 1(서열식별번호 : 1)보다 적어도 10배 정도 크다. 이러한 결과는 이외의 것이다.

서열 목록의 짧은 뉴클레오티드 서열은 고유 유전자의 첫번째 30개 뉴클레오티드의 서열 변화를 나타낸다. 이러한 서열이 완전한 상태에서 2,000개 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 완전한 Taq Pol 유전자의 작은 단편만을 나타냄은 물론이다.

[표 1]

ND=측정되지 않음, ON=밤새, +=유도, -=유도되지 않음.

표 I-다양얌한 발현 플라스미드에 의해 암호화된 내열성 DNA 폴리머라제 활성의 분석, 폴리머라제 할성은 유전자 발현 및 폴리머라제 생산의 반영으로서 판단된다.

서열식별

(1) 일반적인 정보

(ⅰ) 출원인 : 마크 알란 설리반

(ⅱ) 발명의 명칭 : 이.콜라이(E. Coil)에서 써머스 아쿠아티커스(Thermus aquaticus) DNA 폴리머라제의 생산을 증가시키는 방법

(iii) 서열 번호 : 14

(iv) 서신 주소 :

(A) 수신인 : 이스트만 코닥 캄파니, 특허부

(B) 번지 : 스테이트 스트리트 343

(C) 시 : 로체스터

(D) 주 : 뉴욕

(E) 국가 : 미합중국

(F) 우편번호 14650-2201

(V) 컴퓨터가 판독할 수 있는 형태 :

(A) 매체 유형 : 디스켓, 3.5인치, 800kb 용량

(B) 컴퓨터 : 애플 매킨토쉬 (Apple Macintosh)

(C) 작동 시스템 : 메켄토쉬 6.0

(D) 소프트웨어 : 롸이트나우(WriteNow)

(vi) 현재 출원 데이타 :

(A) 출원번호 :

(B) 출원인 :

(C) 분류번호 :

(vii) 선행 출원 데이타 : 없음

(viii) 변리사/대리인 정보

(A) 성명 : 도리인 엠. 웰스

(B) 등록번호 : 34,278

(C) 참고/사건 번호 : 58374D-W1100

(IX) 통신정보 :

(A) 전화번호 : (716) 447-0554

(B) 팩스번호 : (716)447-4646

(2) 서열 식별 번호 1에 대한 정보

(i) 서열 특성

(A) 길이 : 2499

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 이중가닥

(D) 형태 : 선형

(ii) 분자유형 : 게놈 DNA

(iii) 가설 : 없음

(iv) 안티-센쓰 : 없음

(vi) 공급원 :

(A)미생물 : 써머스 아쿠아티커스

(B) 단리제 : YT1, ATCC 25104

(vii) 임시 공급원 : 게놈 DNA로부터 증폭시킴

(ix) 특징 :

(A) 이름/핵심 : 펩타이드

(B) 위치 : 1-2496

(C) 긱별범 : 유전자 은행에서 서열을 비교함, 기탁번호 J04639

(X) 간행물 정보 :

(A) 저자 : 에프.씨. 로이어(F.C. Lawyer), 에스 스토펠(S. Stoffel),알.케이. 사이끼(R.K.Saiki), 케이, 마이엠보(K.Myambo), 알, 드러몬드(R. Drummound), 디.에이치. 젤펜드(D.H. Gelfand)

(B) 제목 : 에스케리아 콜라이에서 써머스 아쿠아티커스로부터 DNA 폴리머라제 유전자의 단리, 동정 및 발현

(C) 잡지 : [Journal of Biological Chemisty]

(D) 권 : 264

(E) 판 : 11

(F) 페이지 : 6427-6437

(G) 날자 : 1989년 4월 15일

(xi) 서열 식별 번호 1에 대한 서열 설명 :

(3) 서열 식별 번호 2에 대한 정보 :

(i) 서열 특성

(A) 길이 : 33

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 이중가닥

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열 식별 번호 2에 대한 서열 설명 :

(4) 서열 식별 번호3에 대한 정보 :

(i) 서열 특성

(A) 길이 : 33

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 이중가닥

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열 식별 번호 3에 대한 서열 설명 :

(5) 서열 식별 번호 4에 대한 정보 :

(i) 서열 특성

(A) 길이 : 57

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 이중가닥

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열 식별 번호 4에 대한 서열 설명 :

(6) 서열 식별 번호 5에 대한 정보 :

(i) 서열 특성

(A) 길이 : 57

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 이중가닥

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열 식별 번호 5에 대한 서열 설명 :

(7) 서열 식별 번호 6에 대한 정보 :

(i) 서열 특성

(A) 길이 : 20

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일가닥

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열 식별 번호 6에 대한 서열 설명 :

(8) 서열 식별 번호 7에 대한 정보 :

(i) 서열 특성

(A) 길이 : 23

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일가닥

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열 식별 번호 7 에 대한 서열 설명 :

(9) 서열 식별 번호 8에 대한 정보 :

(i) 서열 특성

(A) 길이 : 24

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 이중가닥

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열 식별 번호 8에 대한 서열 설명

(10) 서열 식별 번호 9에 대한 정보 :

(i) 서열 특성

(A) 길이 : 아미노산 8개

(B) 유형 : 아미노산

(C) 형태 : 선형

(ii) 분자유형 : 단백질

(xi) 서열 식별 번호 9에 대한 서열 설명 :

(11) 서열 식별 번호 10에 대한 정보 :

(i) 서열 특성

(A) 길이 : 18

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일가닥

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열 식별 번호 10에 대한 서열 설명 :

(12) 서열 식별 번호 11에 대한 정보 :

(i) 서열 특성

(A) 길이 : 59

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일가닥

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열 식별 번호 11에 대한 서열 설명 :

(13) 서열 식별 번호 12에 대한 정보 :

(i) 서열 특성

(A) 길이 : 59

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일가닥

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열 식별 번호 12에 대한 서열 설명 :

(14) 서열 식별 번호 13에 대한 정보 :

(i) 서열 특성

(A) 길이 : 48

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일가닥

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열 식별 번호 13에 대한 서열 설명 :

(15) 서열 식별 번호 14에 대한 정보 :

(i) 서열 특성

(A) 길이 : 53

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥 : 단일가닥

(D) 형태 : 선형

(xi) 서열 식별 번호 14에 대한 서열 설명 :

Claims

(A) 서열식별번호 : 2 :

서열식별번호 : 3 :

및

서열식별번호 : 4 :

로 이뤄진 그룹으로부터 선택된 변경된 뉴클레오티드 서열을, 성숙한 고유 단백질의 첫번째 10개 아미노산을 암호화하는 고유 유전자의 첫번째 30개 뉴클레오티드 염기 서열 대신에 치환시키거나, 또는 B)성숙한 고유 단백질의 개시 코돈(ATG)과 성숙된 고유 단백질의 두번째 아미노산에 대한 코돈(AGG) 사이에 GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG의 서열(서열식별번호 : 5)을 삽입시킴으로써 성숙한 고유 단백질의 첫번째 10개 아미노산을 암호화하는 고유 유전자의 첫번째 30개 뉴클레오티드 염기 서열을 변화시킨

Taq 폴리머라제 유전자.
제1항에 있어서, 개시 코돈(ATG)에 인접하여 그로부터 상향으로 제한부위를 갖고 정지 코돈(TGA)에 인접하여 그로부터 하향으로 상기와 동일한 제한부위를 갖는 유전자.
제2항에 있어서, 상기 제한부위가 뉴클레오티드 서열 GAATTC에 의해 암호화된 유전자.
제1항에 있어서,(서열식별번호 : 1)의 상기 고유 서열을(서열식별번호 : 2)으로 변경시킨 유전자.
성숙한 단백질의 첫번째 아미노산 서열로서 Met-Asp-Tyr- Lys- Asp-Asp- Asp-Asp-Lys(서열식별번호 : 9)을 갖는 내열성 써머스 아쿠아티커스(Thermus aquaticus)DNA 폴리머라제.
A i) 서열식별번호 : 2 :

서열식별번호 : 3:

및

서열식별번호 : 4 :

로 이뤄진 그룹으로부터 선택된 변경된 뉴클레오티드 서열을, 성숙한 고유 단백질의 첫번째 10개 아미노산을 암호화하는 고유 유전자의 첫번째 30개 뉴클레오티드 염기 서열 대신에 치환시키거나, 또는 ii) 성숙한 고유 단백질의 개시 코돈(ATG)과 성숙한 고유 단백질의 두번째 아미노산에 대한 코돈(AGG) 사이에 TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG의 서열(서열식별번호 : 8)을 삽입시킴으로써 성숙한 고유 단백질의 첫번째 10개 아미노산을 암호화하는 고유 유전자의 첫번째 30개 뉴클레오티드 염기 서열을 변화시킨, Taq 폴리머라제 유전자를 벡터에 제공하고,

B) 양립성 이.콜라이 숙주를 단계 A)로 벡터로 형질감염시킴으로써 형질전환된 이.콜라이 숙주 세포를 수득하고,

(C) 증식 조건하에서 단계 B)의 형질전환된 세포를 배양시킴으로써 형질전환된 숙주 세포에 의해 합성되는 Taq 폴리머라제를 생산하는 단계들을 포함하는, Taq 폴리머라제의 생산을 증가시키는 방법.
제6항에 있어서, 상기 단계 A)의 벡터가 유도할 수 있는 프로모터를 갖는 방법.
제6항에 있어서, 상기 Taq 폴리머라제의 생산은 이소프로필-β-D-티오갈락토사이드(IPTG)로 유도하는 방법.
A) 서열식별번호 : 2 :

서열식별번호 : 3 :

및

서열식별번호 : 4 :

로 이뤄진 그룹으로부터 선택된 변경된 뉴클레오티드 서열을, 성숙한 고유 Taq 폴리머라제의 첫번째 10개 아미노산을 암호화하는 고유 유전자의 첫번째 30개 뉴클레오티드 염기 서열 대신에 치환시키거나, 또는 B) 성숙한 고유 단백질의 개시 코돈(ATG)과 성숙한 고유 단백질의 두번째 아미노산에 대한 코돈(AGG)사이에 GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG의 서열(서열식별번호 : 5)을 삽입시킴으로써 성숙한 고유 Taq 폴리머라제의 첫번째 10개 아미노산을 암호화하는 고유 유전자의 첫번째 30개 뉴클레오티드 염기 서열을 변화시킨, Taq 폴리머라제를 암호화하는 유전자를 가지며, i) 선별가능한 마커(marker), ii) 적합한 프로모터 및 iii) 유전자 발현을 조절하는데 적합한 조절서열을 갖는 벡터.
제9항의 벡터를 포함하는 이.콜라이 숙주 세포.