HUT62334A - Process for increasing thermus aquaticus dna-polymerase production in escherichia coli - Google Patents
Process for increasing thermus aquaticus dna-polymerase production in escherichia coli Download PDFInfo
- Publication number
- HUT62334A HUT62334A HU913365A HU336591A HUT62334A HU T62334 A HUT62334 A HU T62334A HU 913365 A HU913365 A HU 913365A HU 336591 A HU336591 A HU 336591A HU T62334 A HUT62334 A HU T62334A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- atg
- gac
- seq
- aag
- cgt
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
A találmány a génsebészet területére tartozó témával foglalkozik. Közelebbről, a találmány tárgya egy természetes gén megváltoztatása, hogy ezáltal egy Escherichia coli-ban jobban expresszálódó mutáns formát kapjunk.
A rekombináns techonológia egyik nagy eredménye az idegen fehérjék magas szintű expressziója (túltermelése) prokarióta sejtekben, például Escherichia coli-ban (E.coli). Az utóbbi években ez a technológia megjavította a gyógyászatilag és tudományosan fontos fehérjék hozzáférhetőségét, amelyek közül néhány már a klinikai gyakorlatban és tudomány területén alkalmazható. A fehérjék túltermelését prokarióta sejtekben úgy igazolják, hogy közvetlenül mérik az enzim aktivitását egy alkalmas szubsztráttal, illetve mérik a termelt specifikus fehérje fizikai mennyiségét. Magas szintű fehérjetermelést lehet elérni, ha megjavítjuk a fehérjét kódoló gén expresszióját. A gén expressziójának egy fontos szempontja a fehérjét kódoló nukleotid-szekvencia transzlációjának hatékonysága. Nagy érdeklődésre tarthat számot az olyan bakteriális enzimek termelésének fokozása, amelyek hasznos reagensek a nukleinsav-biokémiában, ilyenek például a DNS ligáz, a DNS polimeráz és így tovább.
Ez a technológia sajnos nem mindig eredményez magas szintű fehérjetermeiét. Az alacsony fehérje szint egyik oka az, hogy az idegen fehérjét kódoló nukleotid-szekvenciák nem transzlálódnak elég hatékonyan. A fehérjetermelési szint megsokszorozása többek között a hatékony transzláció biztosításától függ.
Számos laboratóriumban végzett alapos vizsgálat alap ján már ismert, hogy egy gén N-terminálisát kódoló nukleotidszekvencia egyike azoknak a faktoroknak, amelyek erősen befolyásolják a transzláció hatékonyságát. Az is ismert, hogy a gén kezdeténél elhelyezkedő kodonok megváltoztatásával leküzdhető a gyenge transzláció problémája. Az egyik stratégia szerint a kódoló szekvencia első részét újra tervezik anélkül, hogy megváltoztatnák a kódolt fehérje aminosavszekvenciáját, mivel a genetikai kód degenerációját használják a kodon-szelekció megváltoztatására.
Ezen vizsgálatok az alapján azonban nem lehet előre megmondani, hogy mely bázisok fontosak, vagy mely szekvenciákat kellene megváltoztatni egy adott fehérje esetében. A kutatónak ezért lényegében egy tapasztalati megközelítést kell alkalmaznia, ha egy fehérje termelését az említett rekombináns technikák alkalmazásával próbálja optimalizálni.
Az empirikus megközelítés munkaigényes. Általában számos szintetikus oligonukleotiddal, amelyek az összes lehetséges, a korrekt aminosav-szekvenciának megfelelő kodont tartalmazzák, helyettesítik az N-terminális kódoló régiót. Számos különböző módszer alkalmazható ezek után arra, hogy kiválassázák azt az oligonukleotidot, amely magas expreszsziós szintet biztosít. Egy másik megközelítés szerint az eredeti szekvencia random mutagén kezelésével egy sorozat származékot állítanak elő. Különféle módszereket lehet azután alkalmazni az egyetlen olyan oligonukleotid kiválasztására, amely magas expressziós szintet biztosít. Egy másik módszer szerint származékokat úgy állítanak elő, hogy az eredeti szekvenciát random mutagenezisnek vetik alá. Széleskörű átvizsgálási módszerekkel azután remélhető, hogy találnak olyan kiónt, amely magaszintű expressziót biztosít. Ezt a jelöltet vizsgálják azután az optimálsi szekvencia megállapítására, és azt a szekvenciát használják az eredeti génben a megfelelő fragmentek kicserélésére. Ez az úgynevezett shot-gun megközelítés igen munkaigényes.
Ezeket az unalmas stratégiákat alkalmazzák a célból, hogy olyan fehérje szintézisének termelékenységét fokozzák, amely a változatlan (természetes) génről csak kis mennyiségben keletkezik. A Thermus aquaticus-ból származó hőstabil DNS polimeráz (Taq Pol) például egy ilyen fehérjetermék.
A Taq Pol a nukleotid trifoszfátoknak olyan nukleinsavszállá történő kapcsolódását katalizálja, amely egy nukleinsav templát-lánccal komplementer. A hőstabil Taq polimeráznak a nukleinsav amplifikálására történő alkalmazása a polimeráz láncreakcióban (PCR) egy kulcslépés volt a PCR olyan szintre történő fejlesztésében, amilyen jelentős szerepet játszik ma ez a reakció a molekuláris biológiában. A Taq polimerázt kódoló gént klónozták, szekvenálták és Escherichia coliban fejezték ki, így azonban csak kismennyiségű Taq polimerázt kaptak.
A probléma az, hogy jóllehet a Taq polimeráz számos forrásból hozzáférhető a kereskedelmi forgalomban, de drága, részben azért, mert a jelenleg alkalmazott módszerekkel csak kis mennyiség nyerhető ki. Szükség van tehát a Taq polimeráz fokozott termelésére, hogy a megnövekedett igényeket ki lehessen elégíteni, és a termelés gazdaságosabb legyen.
Az 1. ábrán egy vektor, a pSCW562 plazmid megfelelő genetikai alkotóelemei láthatók, amely vektort az Escherichia coli gazdaszervezet transzformálására használjuk.
A találmány tárgya egy Taq polimeráz gén, amelyben a természetes gén első harminc nukleotid bázisának szekvenciáját, amelyek az érett természetes fehérjében az első harminc aminosavat kódolják, megváltoztatjuk (A) úgy, hogy egy módosított nukleotid szekvenciával helyettesítjük, amely szekvenciát az alábbi csoportból választjuk ki:
2. sz. szekvenciarészlet
ATG CGT GGT ATG CTG CCT CTG TTT GAG CCG AAG33
3. sz. szekvenciarészlet
ATG CGT GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG33
4. sz. szekvenciarészlet
ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG CGT GGT ATG36
CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG57 vagy (B) úgy, hogy az érett fehérje első aminosavát kódoló
ATG kodon és az érett fehérje második aminosavát kódoló AGG kodon közé az alábbi szekvenciát illesztjük be:
5. sz. szekvenciarészlet
GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG
A találmány tárgya továbbá eljárás a Taq polimeráz termelésének fokozására a fenti megváltoztatott gén alkalmazásával.
A találmány alkalmazásával a polimeráz aktvitási szintet 200-szorosra lehet növelni. A találmány szerinti rekombináns polimeráz működés szempontjából megkülönböztethetetlen a természetes Taq polimeráztól.
A találmány tárgya eljárás Taq polimeráz termelésének fokozására Escherichia coliban oly módon, hogy a gén 5' régiójában a polimeráz N-terminálisát kódoló kiválasztott nukleotid szekvenciákat megváltoztatjuk.
Az eljárással négy olyan nukleotid szekvenciát alakítunk ki, amelyek a természetes Thermus aquaticus polimeráz (Taq polimeráz) génjétől egy vagy néhány nukleotidban különböznek. Ha a változást bevisszük a természetes génbe, és Escherichia coliba transzfektáljuk, akkor ezek a DNS szekvenciák a gén megnövekedett kifejeződését okozzák, amit az enzim megnövekedett aktivitásával lehet igazolni. A növekedés mértéke változó, számos faktortól függ, például a szekvencia megváltoztatásától, az IPTG indukciótól, az Escherichia coli inkubációs idejétől stb.
A találmány szerinti gének egyébként megegyeznek a természetes Taq polimeráz génnel, az eltérés csupán annyi, hogy a természetes szekvenciát a találmány szerinti módon módosítottuk. Ahol ezeket a változtatásokat végeztük, azokat a helyeket részletesen leírjuk, és mind a példákban, mind a szekvenciák listájában bemutatjuk. Változások csak a fehérje N-terminálisát kódoló régióban vannak. Pontosabban, változta tásokat az érett természetes fehérje génjében csak a tizenegyedik aminosavat (lizin) kódoló tizenyegyedik (AAG) kodon előtt hajtunk végre. A tizenegyedik kodont nem változtatjuk meg, de a listákon bemutatjuk mint egy olyan pontot, amely lezárja változtatások helyét, illetve egy olyan pontot, amely előtt a találmány szerint a változtatásokat végezzük.
Az említett változtatásokon kívül a Taq polimeráz gén szekvenciájának többi része változatlan marad.
A Taq polimeráz gén kifejezésen a Thermus aquaticus hőstabil DNS polimerázát kódoló nukleotid szekvenciát értjük, beleértve a természetes gén mutáns formáit is (spontán vagy indukált), ameddig a mutációk nem okoznak lényeges változásokat a természetes polimeráz lényeges aktivitásában.
A Taq polimeráz kifejezésen a Taq polimeráz gén által kódolt polimerázt értjük.
A természetes kifejezésen a Taq polimeráz gén változatlan nukleotid-szekvenciáját, illetve a Taq polimeráz változatlan aminosav-szekvenciáját értjük, ahogyan a gén, illetve az enzim a természetes formájában a T. aquaticusban előfordul. Lásd az 1. sz. szekvenciát.
Általánosságban a találmány szerinti megoldás az alábbi lépésekből áll:
A) előállítjuk a találmány szerinti Taq polimeráz gént tartalmazó vektort,
B) az A) lépésben kapott vektorral kompatibilis Escherichia coli gazdasejteket transzfektálunk, így transzformált Escherichia coli gazdasejteket kapunk; és
C) a B) lépés szerinti transzformált sejteket olyan körülmények között tenyésztjük, hogy lehetővé váljon a Taq polimeráz előállítása a transzformált gazdasejtek által.
A találmány szerinti eljárásban az alábbi baktérium törzseket, plazmidokat, fágokat és reagenseket alkalmazzuk.
Baktérium törzsek
A Thermus aquaticus YT-I, ATCC 25104 törzset használjuk a természetes DNS izolálására. Az összes klónozási és plazmid manipulációs kísérletben alkalmazott Escherichia coli gazda törzset, a DH5a-t [F“ teta80 dlacZ deltaM15 delta (lacZYA-argF) U169 recAl endAl hsdR17(rK~, 1¾4-) supE44 thil gyrA relAl] a BRL-től vásároltuk.
A JM103 törzset [thi”, strA, supE, endA, sbcB, hsdR”, D(lac-pro), F' traD36, proAB, laclQ, lacZDM15] [Yanisch-Perron és munkatársai, Improved M13 Phage cloning Vectors and Hőst Strains: Nucleotide Sequences of M13mpl8 and pUC19 Vectors, Gene, 33., 103-119 (1985)] szintén használtuk a fehérje expressziós kísérletekben.
A mutagén kezelésben használt egyszálú DNS előállításához a CJ236-t alkalmaztuk (pCJ105, dut ung thi relA) [Kunkel és munkatársai, Rapid and Efficient Site-specific Mutagenesis without Phenotypic Selection, Methods Enzymol. 154. 367-382 (1987)].
Az R 408 fi fágot használtuk [Russel és munkatársai, An Improved Filamentous Helper Phage fór Generating SingleStranded DNA, Gene, 45, 333-338 (1986)] segítőként arra, hogy a mutagenézis céljára egyszálú DNS-t állítsunk elő. Az összes klónozási és kifejezési kísérletben a pSCW562 plazmi dót vagy annak származékát, a pTaql-et használtuk. A pSCW562 rajzát az 1. ábrán mutatjuk be. Ha a természetes Taq polimeráz gént beépítjük a pSCW562-be, akkor a kapott plazmid jele pTaql. Ha a természetes Taq polimeráz gént mutagenezissei megváltoztatjuk, akkor a mutáns plazmidok jele pTaq3, pTaq4, pTaq5 vagy pTaqő, attól a nukleotid szekvenciától függően, amelyikkel mutagenizáltuk.
Reagensek
A vegyszereket a Sigma International Biotechnologies Inc.-tői vagy az Eastman Kodak-tól vásároltuk. Az LB táptalajt a Gibco-tól vásároltuk. Az enzimeket a New England Biolabs, IBI, BRL, Boehringer-Mannheim vagy az U.S. Biochemicals cégektől vásároltuk, és az előállító utasításai szerint használtuk. A DNS szekvenáláshoz használt Sequenase™ készletet az U.S.Biochemicals-tól vásároltuk. A radioaktív izotópokat az Amersham-től vásároltuk. A Taq polimerázt a Cetus-tól vásároltuk.
Eljárás a Taq polimeráz termelésének növelésére
A lépés: A találmány szerinti Tag polimeráz gént tartalmazó vektor előállítása
A találmány értelmében az egyik módszer a Taq polimeráz gént tartalmazó vektor előállítására az alábbi:
- előállítjuk a természetes DNS-t a Thermus aquaticus-ból;
- a természetes Taq polimeráz DNS-t amplifikáljuk, és a DNS fragment mindkét végén restrikciós hasítási helyeket építünk bele,
- a második lépés szerinti DNS fragmenteket megfelelő vektorba ligáljuk,
- helyspecifikus mutagenezist alkalmazunk a természetes DNS nukleotid szekvenciájának megváltoztatására, és
- a találmány szerinti megváltoztatott nukleotid szekvenciát tartalmazó vektorokat átvizsgáljuk.
i) A T. aquaticus természetes géniének előállítása
Az összes DNS manipulációt ismert előiratok szerint végeztük [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1982); Ausebel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, New York (1987)]. A
T. aquaticusból [YT-1, ATCC 25104 törzs] az össz-DNS-t egy 40 ml-es tenyészetből izoláljuk, amelyet egy éjszakán át 70 °Con növesztettünk ATCC #461 táptalajban. A sejteket centrifugálással ülepítjük, egyszer 10 mmol/1 TRIS-HC1 (pH=8,0), 1 mmol/1 EDTA pufferrel (TE) mossuk, majd 5 ml TE pufferben szuszpendáljuk. 1 mg/ml koncentrációban lizozimet adunk hozzá, majd az oldatot 30 percig 37 °C-n inkubáljuk. 50 mmol/1 EDTA-t, 0.5 % nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) és 100 gg/ml proteináz K~t adunk hozzá, és az oldatot 4 óra hosszat 50 °C-on inkubáljuk. A mintát fenol és kloroform 1:1 térfogatarányú elegyével háromszor, majd kloroformmal egyszer extraháljuk, és a DNS-t 0,3 mol/1 végkoncentrációjú nátriumacetát és 2 térfogat etanol hozzáadásával kicsapjuk. A DNS-t egy üvegbotra felcsavarva kinyerjük, 70 %-os etanollal mossuk, majd TE pufferben feloldjuk.
ii) A természetes Tag polimeráz gén amplifikálása és restrikciós helyek beépítése
Nagymennyiségű Taq polimeráz gén előállításának leggyorsabb módja a gén publikált nukleinsav szekvenciájának alkalmazásán alapul [Lawyer et al., Isolation, Characterization and Expression in Escherichia coli of the DNA Polymerase from Thermus aquaticus, Journal of Biological Chemistry, 264, 6427-6437 (1989)] olyan indító molekulák tervezésére, amelyek a PCR reakcióban a genomiális DNS amplifikálására használhatók. A teljes DNS szekvenciát lásd az 1. sz. szekvencia alatt.
A PCR egy, a szakterületen jól ismert amplifikálási technika [Saiki et al., Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase, Science, 239, 487-491 (1988)], amely egy olyan reakciósort foglal magában, amellyel nagymennyiségű specifikus ismert nukleinsav szekvenciát lehet előállítani. A PCR alkalmazásához az kell, hogy az amplifikálandó nukleinsav-szekvenciát elegendő részletességgel ismerjük ahhoz, hogy a kiválasztott nukleinsav-szekvenciával megfelelő mértékben komplementer oligonukleotid indító molekulákat lehessen tervezni, azaz olyanokat, amelyek hibridizálódnak vele, és extenziós termékek szintetizálódnak róla.
Az indító molekulák olyan természetes vagy szintetikus eredetű oligonukleotidok, amelyek DNS szintézis iniciációs pontjaiként képesek működni, ha olyan körülmények közé kerülnek, ahol egy a nukleinsav szállal komplementer primer extenziós termék szintézise indukálódik, azaz a négy különböző nukleotid-trifoszfát és termostabil enzimek jelenlétében, megfelelő pufferben, alkalmas hőmérsékleten.
Az i) pont szerinti Taq polimeráz DNS PCR amplifikációját Saiki és munkatársai módszerével végezzük, egy Ericomp thermocyelérben. Az indító molekulákat a Taq polimeráz gén publikált szekvenciája alapján tervezzük (Lawyer et al.).
Az amplifikáló elegyek körülbelül 100 ng Thermus aquaticus DNS-t tartalmaznak, valamint 1 gmolt az egyes indító molekulákból, 200-200 μιηοΐ ATP-t, dGTP-t, dCTP-t és dTTP-t és 2 egység Taq polimerázt 0,05 ml-ben. Az elegyet 10 másodpercre 97°C-ra melegítjük, majd 40 °C-on 30 másodpercig hagyjuk illeszkedni, végül 5 ciklusban 5 percig 72 °C-on hagyjuk növekedni. A további 20 ciklusban az illeszkedés hőmérsékletét 55°C-ra emeljük, a növekedés idejét pedig 3 percre csökkentjük. Az elegyet végül 15 percig 72°C-on inkubáljuk, hogy maximalizáljuk a teljesen kétszálú termék keletkezését. A teljes PCR reakcióelegyet 1,0 %-os agaróz gélen frakcionáljuk, majd a 2,5 kb méretű Taq polimeráz gént kivágjuk és extraháljuk. Az agaróz gélből a DNS fragmenteket a fagyasztás-préselés technika alkalmazásával nyerjük ki. Az agaróz darabokat feldaraboljuk, szárazjégben fagyasztjuk, majd 37°C-on gyorsan megolvasztjuk. A kapott keveréket centrifugálással egy Millipore 0,45 μπι-es Durapore membránon átszűrjük. A szűrletet vízzel telített fenollal egyszer, majd fenol és kloroform 1:1 térfogatarányú elegyével egyszer, majd kloroformmal egyszer extraháljuk. A DNS-t etanolos kicsapással kinyerjük.
Restrikciós helyek beépítése: annak érdekében, hogy a Taq polimeráz gént a PCR során ki tudjuk vágni és ki tudjuk nyerni, valamint hogy a Taq polimeráz gént kényelmesen tudjuk klónozni egy expressziós vektorba, két restrikciós hasítási helyet építünk be a gén két végére. Pontosabban, egy restrikciós hasítási helyet építünk be közvetleül a start (ATG) kodon elé, attól fölfelé, a másikat pedig közvetlenül a stop (TGA) kodon után (1. 6. és 7. szekvenciarészlet). A restrikciós helyeket képező nukleotidokat a PCR-ben alkalmazott szintetikus indító molekulával építjük be. Az alábbiakban ismertetett példákban az EcoRI restrikciós hasítási helyet képező GAATTC nukleotid szekvenciát építjük be az indító molekulákba.
Más restrikciós hasítási helyek is alkalmazhatók a találmány szerinti eljárás megvalósítása során, azzal a feltétellel, hogy 1) az expressziós vektor rendelkezik azzal a megfelelő hasítási hellyel, ahova a Taq DNS-t be lehet építeni, 2) a restrikciós hely nem található meg a Taq polimeráz génben.
Amint az 1. ábrán látható, az EcoRI csak az egyik a pSCW562 plazmidon található restrikciós helyek közül. Megtalálható rajta még például az Xbal és Sphl hasítási hely. Természetesen más expressziós vektorok, amelyek más restrikciós hasítási helyeket tartalmaznak, további, a találmány szerinti eljárásban alkalmazható restrikciós hasítási helyeket szolgáltathatnak.
Ha a megfelelő enzimmel emésztjük, akkor ezek a restrikciós hasítási helyek olyan tapadó végeket szolgáltat nak, amelyek egyszerűen ligálhatók az expressziós vektoron található, megfelelően emésztett restrikciós helyekhez. A restrikciós hasítási helyek nem érintik a Taq polimeráz aminosav-szekvenciáját.
Másik módszer: a fentiekben ismertetett PCR technika helyett a természetes Taq polimeráz gént szokásos klónozási módszerrel állítjuk elő. Ebben az esetben a restrikciós hasítási helyeket helyspecifikus mutagenezissei vihetjük be a génbe. A két eljárás végterméke nem különböztethető meg egymástól .
iii) A DNS fragmentek liqálása egy vektorba
A ii) lépésben kapott DNS-t ezután egy megfelelő expressziós vektorhoz ligáljuk. A klónozáshoz választott vektor a pSCW562, amely a riboszómális kötőhely után 11 bázispárral egy EcoRI restrikciós hasítási helyet tartalmaz, valamint az erős tac (trp-lac hibrid) promotert (1. ábra). A Taq polimeráz gén nem tartalmaz EcoRI restrikciós hasítási helyet, ezért a PCR indító molekulákat úgy tervezzük, hogy az 5' végükhöz közel EcoRI restrikciós hasítási helyeket tartalmazzanak [ii) lépés], ezzel lehetővé válik, hogy a pSCW562 EcoRI hasítási helyére közvetlenül klónozzuk.
Az EcoRi hasítási hely mellett a pSCW562 vektor tartalmaz még
1) θ9Υ Fi fág replikációs origót,
2) egy plazmid replikációs origót (ŐRI),
3) egy antibiotikum rezisztencia markert (AMP),
4) egy transzkripció terminációs szekvenciát a restrikciós hasítási hely után.
Ezt a plazmidot a rekombináns DNS technika jól ismert módszereivel állítjuk elő [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1982)]. Ez a plazmid azonban nem kritikus a találmány szempontjából. Bármely, egy promotert és restrikciós hasítási helyeket tartalmazó vektor használható ebben az eljárásban.
A ii) lépésben kapott, EcoRI restrikciós enzimmel emésztett PCR terméket 1%-os agaróz gélen elválasztjuk, majd eluáljuk. A pSCW562 vektort egy éjszakán át EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük (10 egység/Mg), majd borjúbél alkalikus foszfatázzal kezeljük (1 egység/Mg), fenol és kloroform 1:1 térfogatarányú elegyével extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk, és TE pufferben oldjuk. Az előállított vektorból körülbelül 200 ng-ot elegyítünk 500 ng tisztított PCR termékkel, majd 18 órán át 50 mmol/1 TRIS-HC1 (pH=7,8), 10 mmol/1 MgC12, 20 mmol/ ditiotreitol, 1 mmol/1 ATP, 0,5 Weissegység T4 DNS ligáz összetételű, 20 gliter össztérfogatú oldattal elegyítjük.
iv) Helvspecifikus mutagenezis alkalmazása a természetes Tag polimeráz gén nukleotid-szekvenciáiának megváltoztatására
A helyspecifikus mutagenezis egy valamely DNS fragment nukleotid-szekvenciájának megváltoztatására oly módon, hogy a kiválasztott nukleotidok specifikus helyettesítését, beépítését vagy kivágását végezzük a megváltoztatandó szekvenciában. A módszer magában foglalja az in vitro DNS szintézis indítását kémiailag szintetizált, a templát szekvenciához képest nukleotid eltérést tartalmazó oligonukleotidokkal. A szintetikus oligonukleotidok elindítják a DNS szintézisét, és beépülnek a keletkező heteroduplex molekulába. Gazdasejtek transzformálása után ez a heteroduplex homoduplexeket eredményez, amelyeknek a szekvenciája a mutagén nukleotidokat tartalmazza. A mutáns kiónokat a szakterületen jártas szakember számára ismert vizsgálati módszerekkel szelektáljuk, úgymint jelzett próbához való nukleinsav— hibridizálással és DNS szekvenálással.
Helyspecifikus mutagenézis alkalmazásával a Taq polimerázból olyan mutáns géneket készítettünk, amelyekben a természetes érett fehérje első tíz aminosavát kódoló első harminc nukleotid bázist változtattuk meg
A) helyettesítve egy módosított nukleotid-szekvenciával, amelyet az alábbi csoportból választottunk:
| 1. | példa - | 2. | szekvenciarészlet | ||||
| ATG | CGT | CGT | ATG | CTG CCT | CTG | TTT GAG CCG AAG | 33 |
| 2. | példa - | 3. | szekvenciarészlet | ||||
| ATG | CGT | GGG | ATG | CTG CCC | CTC | TTT GAG CCC AAG | 33 |
| 3 . | példa - | 4. | szekvenciarészlet | ||||
| ATG | GAC | TAC | AAG | GAC GAC | GAT | GAC AAG CGT CGT ATG | 36 |
| CTG | ccc | CTC | TTT | GAG CCC | AAG | 57 |
vagy (4. példa) (B) úgy, hogy az érett fehérje első aminosavát kódoló
ATG kodon és az érett fehérje második aminosavat kódoló AGG kodon közé az alábbi szekvenciát illesztjük be:
5. szekvenciarészlet
GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG 24
A fenti példákban a megváltoztatott bázisokat vastagítva nyomtatjuk. Ezeknek a változásoknak a polimeráz aktivitásra gyakorolt hatását az I. táblázatban mutatjuk be. A fenti példákat csak illusztrálás céljából adjuk meg a korlátozás szándéka nélkül.
Ezekben a példákban az összes génmódosítást helyspecifikus mutagenezissei hajtottuk végre. A szakterületen azonban alternatív módszerek is ismertek, amelyek ugyanezeket az eredményeket adják. A Taq polimeráz génben a fentiekben leírt változtatásokat közvetlenül úgy is végrehajthatjuk, hogy a PCR-hez az 5' indító molekulát úgy tervezzük meg, hogy a találmány szerinti nukleotid szekvenciákat tartalmazza.
Egy másik változat szerint a gén első tíz kodonját közrefogó egyedi restrikciós hasítási helyeket építünk be a génbe. Ez lehetővé teszi az N-terminálist kódoló szekvencia eltávolítását restrikciós enzimmel emésztés és egy szintetikus kétszálú fragmenttel történő helyettesítés útján. Mindegyik említett módszer alkalmazható a fentiekben ismertetett nukleotid változtatások végrehajtására.
A helyspecifikus mutagenezist lényegében Kunkel et al. módszerével végezzük [Rapid and Efficient Site-specific Mutagenesis without Phenotypic selection, Methods Enzymol.,
154, 367-382 (1987)], egy BioRad-tól vásárolható készlet alkalmazásával. Az egyszálú plazmid DNS-t úgy állítjuk elő, hogy a pTaql plazmidot hordozó CJ236 törzs korai exponenciális fázisban levő tenyészetét R408-cal fertőzzük, körülbelül 10-20-szoros multiplicitással. Miután egy éjszakán át 37°C-on tenyésztettük, a sejteket centrifugálással eltávolítjuk, a fágot 5 % polietilén-glikol és 0,5 mol/1 NaCl hozzáadásával kicsapjuk. A fágokat centrifugálással ülepítjük, és a DNS-t fenol és kloroform 1:1 térfogatarányú elegyével izoláljuk, majd etanollal kicsapjuk. A mutagén oligonukleotidokat T4 polinukleotid kinázzal foszforilezzük, majd mindegyikből 9 pmólt illesztünk körülbelül 3 pmól egyszálú plazmid DNS-sel. Az illesztett elegyet T4 DNS-polimerázzal meghoszszabbítjuk, ligáljuk, majd DH5a vagy JM103 törzsbe transzformáljuk. A transzformánsokból izoláljuk a plazmid DNS-t az úgynevezett gyors forralásos módszerrel [Holmes and Quigley, A Rapid Boiling Method fór the Preparation of Bacterial Plasmids, Anal. Biochem., 114. 193-199 (1981)], majd EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, hogy azonosítsuk azokat a kiónokat, amelyek mutagenezisen estek át.
v) A Tag polimeráz gént tartalmazó vektorok keresése Annak igazolására, hogy az iv) lépésben kapott kiónok hordozzák a keresett Taq polimeráz gént, a kiónokat nitrocellulóz szűrőlapra visszük át, majd telephibridizálással azonosítjuk a Taq polimeráz transzformánsokat.
Telephibridizálás: Ezzel a technikával specifikus nukleinsav-szekvenciák azonosíthatók, ha olyan körülmények között végezük, hogy a specifikus nukleinsav-szekvencia egy«· ··*· · · * • ···· · · · ·· · • ·· · If 9 9
- 19 szálú formája képes hibridizálni egy komplementer radioaktív egyszálú nukleinsav fragmenttel (próba). A kétszálú régiók ott alakulnak ki, ahol a két különböző DNS molekula komplementer nukleinsav szekvenciákkal rendelkezik, és ezeket radioaktivitásuk alapján lehet kimutatni.
A Taq polimeráz fragmentet tartalmazó telepeket a következő szekvenciával rendelkező belső oligonukleotiddal való hibridizálás alapján azonosítjuk:
15. szekvenciarészlet:
GTGGTCTTTG ACGCCAAG amelyet az 5' végén T4 polinukleotid kináz alkalmazásával 32P-vel jelöltünk. A telephibridizálást Maniatis és munkatársai leírása szerint végezzük [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1982)], 5XSSPE [1XSSPE 10 mmoll nátrium-foszfát (pH=7,0), 0,18 mol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA], 0,1 % nátrium-lauril-szarkozinát, 0,02 % SDS, 0,5 % blokkoló anyag (Boehringer-Mannheim) összetételű elegyben, amely 5 ng/ml 32P-vel jelzett oligonukleotidot tartalmaz. A hibridizálást 42°C-on végezzük 4-18 óra hosszat. A szűrőlapokat 2XSSPE, 0,1 % SDS összetételű oldatban háromszor mossuk szobahőmérsékleten, majd szigorú körülmények között 42°C-on, ugyanilyen összetételű oldatban. A pozitív telepeket autoradiográfiával azonosítjuk.
Szekvencia-elemzés: annak igazolására, hogy a Taq polimeráz DNS a megfelelő orientációban épült be, a DNS szék20 venciáját elemezzük, lúggal denaturált supercoiled DNS alkalmazásával [Zhang et al., Double Stranded DNA sequencing as a Choice fór DNA sequencing, Nucleic Acids Research, 16, 1220 (1988)], Sequenase™ készlet (U.S. Biochemicals) alkalmazásával, (35S)dATP segítségével. Tipikusan 1,0 pliter supercoiled, cézium-kloridon tisztított DNS-t denaturálunk 20 μΐ 0,2 mol/l-es NaOH, 0,2 mmol/1 EDTA összetételű oldatban 5 percig. Az oldatot 2 μΐ ammónium-acetáttal (pH=4,6) semlegesítjük, majd 60 ml etanollal kicsapjuk. Az elegyet 10 percig centrifugáljuk, 80 %-os etanollal egyszer mossuk, 10 percig szárítjuk, majd 7 ml vízben szuszpendáljuk. Miután hozzáadtunk 5 ng indító molekulát és 2 μΐ 5X puffért, a mintákat 65°C-ra melegítjük, és 30-45 perc alatt hagyjuk 37 eC-ra hűlni. A szekvenálási reakciót ezután a gyártó előírásai szerint hajtjuk végre. A reakcióelegyeket 6 %-os szekvenáló gélen elektroforetizáljuk, alkalmanként nátrium-acetát gradienst alkalmazva, hogy a gél aljánál megjavítsuk a feloldást [Sheen and others, Electrolyte Gradient Gels fór DNA Sequencing, Bio Techniques, 6, 942-944 (1988)]. Egy másik megoldás szerint a gyors forralásos vagy lúgos miniprep módszerrel előállított plazmid DNS-t használjuk a szekvencia meghatározására fenol és kloroform 1:1 térfogatarányú elegyével való extrakció után, de a megbízhatóság ekkor valamelyest csökken.
B lépés: Gazdaseitek transzfektálása az A) lépésben kapott vektorral
Az A) lépésben előállított vektort használjuk a megfelelő gazdaszervezet transzfektálására, majd a transzformált gazdaszervezetet megfelelő körülmények között tenyésztjük. Általában a prokarióta gazdasejtek a leghatékonyabbak és a legelőnyösebbek a génmanipulációs technikák alkalmazására, ennélfogva előnyösen alkalmazhatók a Taq polimeráz expresszálására. A prokariótákat leggyakrabban az Escherichia coli különböző törzsei képviselik, például a DH5a és a JM103, amely törzseket az alábbiakban következő példákban használunk. Azonban más mikroorganizmus törzsek is használhatók, mindaddig amíg a gazdaként kiválasztott törzs kompatibilis azzal a plazmid vektorral, amellyel transzformáljuk. A gazdasejt és a plazmid vektor kompatibilitása azt jelenti, hogy a gazdasejt helyesen szaporítja a plazmid vektor DNS-t, és lehetővé teszi a fenti szabályozó elemek megfelelő működését. A mi rendszerünkben a DH5a és a JM103 kompatibilis a pSCW562-vel.
A B lépésben keletkezett ligáló elegyből 5 Mliter-t elegyítünk 0,1 /xliter DH5a vagy JM103 sejtszuszpenzióval, amelyeket CaC12 kezeléssel teszünk kompetenssé [Cohen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 69, 2110 (1972)]. Miután jégen inkubáltuk 15-30 percig, az elegyet 90 másodpercre 42°C-ra tesszük. A hősokk után egy ml LB táptalajt adunk hozzá, és a sejteket egy óra hosszat 37 ’C-on inkubáljuk.
Transzformánsok szelekciója: az egyórás inkubálási idő elteltével az inkubált elegyből alikvot részeket 50 gg/ml ampicillint tartalmazó LB agarlemezekre szélesztünk, majd 18 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk. Csak az AMP (marker) gént tartalmazó transzformált Escherichia coli képes ezen a táptalajon növekedni. Hogy azokat a transzformánsokat szelektáljuk, amelyek a Taq polimeráz gént a helyes orientációban tartalmazzák, telephibridizálást és szekvenálást végzünk a fentiekben leírt technikák alkalmazásával.
C lépés: A transzformált gazdaseitek tenyésztése
Azokat az Escherichia coli transzformánsokat, amelyekről igazoltuk, hogy a Taq polimeráz gént a helyes a orientációban tartalmazzák, 40 ml LB táptalajban 37 ’C-on az exponenciális fázis közepéig tenyésztjük, és ahol alkalmas, ott 1 mmól izopropil-B-D-tiogalaktoziddal (IPTG) indukáljuk. A sejteket vagy további két óra hosszat, vagy egy éjszakán át hagyjuk növekedni, majd centrifugálással kinyerjük. A sejteket 0,25 ml 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,5, 1 mmol/1 EDTA, 0,5 Mg/ml leupeptin, 2,4 mmol/1 fenilmetil-szulfonil-fluorid összetételű oldatban szuszpendáljuk, majd ultrahangos kezeléssel feltárjuk. A lizátumot 0,25 ml 10 mmol/1 TRIS-HC1 (pH=8,0), 50 mmol/1 KC1, 0,5 % Tween 20, 0,5 % NP-40 összetételű oldattal hígítjuk, majd 20 percig 74 °C-on tartjuk.
Miután 15 percig jégen tartottuk, a törmeléket centrifugálással eltávolítjuk (10 perc, 4°C). A felülúszó frakcióból vett alikvot részeket megvizsgáljuk, hogy tartalmaznak-e DNS polimeráz aktivitást, lazac sperma DNS-t használva szubsztrátként.
DNS polimeráz vizsgálat: Ez a vizsgálat azon alapul, hogy a DNS polimeráz képes a kétszálú DNS-en található egyszálú részeket feltölteni. Az egyszálú részeket használja templátként, és az egyszálú részt határoló szabad 3’ hidroxilcsoportot indító molekulaként, amelynél a szintézis be indul. Részletesebben, 5 Mliter enzimpreparátumot inkubálunk 10 percig 74 °C-on 50 Mliter össztérfogatban, az alábbi öszszetételű oldatban: 25 mmol/1 TRIS-(hidroximetil)-metil-3-amino-propán-szulfonsav (TAPS) (pH=9,8 22°C-on), 50 mmol/1 KC1, 1 mmol/1 2-merkapto-etanol, 2 mmol/1 MgCl2, 0,30 mg/ml aktivált lazac sperma DNS, 0,2-0,2 mmól dCTP, dGTP, dTTP, és 0,1 mmól (200 nCi/nmól) [8-3H]dATP. A reakciót úgy állítjuk le, hogy 100 gliter 0,15 mol/1 nátrium-pirofoszfát, 0,105 mol/1 nátrium-EDTA (pH=8,0) összetételű oldatot, majd ezt követően jéghideg 10 %-os triklór-ecetsavat (TCA) adunk hozzá. Ezt az elegyet azután 15-30 percig jégen tartjuk, majd vákuummal átszűrjük egy előre nedvesített 25 mm átmérőjű Whatman üvegszálas szűrőn (GFC). A kicsapott reakcióterméket a beépületlen 3H-tól tisztára mossuk összesen 12 ml jéghideg 10 %-os TCA, majd 12 ml jéghideg 95 %-os etanol alkalmazásával. A szűrőket vákuumban, majd levegőn szárítjuk, végül közvetlenül mérjük szcintillációs folyadékban. A hígítást igénylő enzimpreparátumokat 10 mmol/1 TRIS-HC1, 50 mmol/1 KC1, 10 mmol/1 MgCl2, 1,0 mg/ml zselatin, 0,5 % nonidet P40, 0,5 % Tween 20, 1 mmol/1 2-merkapto-etanol (pH=8,0) összetételű oldattal hígítjuk. Egy aktivitás egység az az enzimmennyiség, amely ahhoz kell, hogy 10 nmól össz-nukleotidot 30 perc alatt 74°C-on beépítsen; a lazac sperma DNS nukleotidjainak körülbelül 29,7 %-a adenin.
A lazac here DNS-t (Sigma III típus; #D1626 termék)
1,3 mg/ml TM pufferben [10 mmol/1 TRIS-HC1 (pH=7,2) 5 mmol/1 MgCl2] oldunk, majd 4 °C-on 24 óra hosszat lassan keverjük. Az oldatot azután 2,5-szeresére hígítjuk TM pufferrel, 0,3 mol/1 NaCl végkoncentrációt állítunk be, majd szobahőmérsékleten azonos térfogatú fenol—kloroform 1:1 térfogatarányú eleggyvel (a fenol TM pufferrel van telítve) extraháljuk. Az elegyet 5 percig szobahőmérsékleten centrifugáljuk 2700 gvel, hogy segítsük a fázisok szétválását, majd a vizes fázist összegyűjtjük, és azonos térfogatú kloroformmal extraháljuk. Az elegyet a fentiek szerint centrifugáljuk, és a vizes fázist ismét kinyerjük. A vizes fázisban levő aktivált DNS-t -20°C-on 2 térfogat 95 %-os etanollal kicsapjuk, a kicsapási elegyet 12-18 óra hosszat -20 °C-on tartjuk. A kicsapott DNSt centrifugálással kinyerjük (13700 g, 30 perc, 2 °C). A csapadékot nitrogénáramban szárítjuk, majd újraoldjuk 3-6 mg/ml TE pufferben [10 mmol/1 TRIS-HC1 (pH=7,5), 1 mmol/1 EDTA], lassú himbálás közben szobahőmérsékleten 12-18 óra hosszat. Az oldatot TE pufferrel szemben dializáljuk, majd beállítjuk a megfelelő koncentrációt, a 260 nm-en mért abszorbancia alapján. Alikvot részeket (0,5-1,0 ml) tárolunk -20°C-on; a felhasználáshoz egy fiolát megolvasztunk, majd 4°C-on tartjuk, ahelyett hogy visszafagyasztanánk.
5. A polimeráz vizsgálat eredményei
A Taq polimeráz vizsgálat eredményeit az I. táblázatban foglaltuk össze. A pTaql vektor hordozza az 1. szekvenciarészletet, amely megfelel a természetes Taq polimeráz szekvenciának, míg a többi négy plazmid olyan szekvenciákat hordoz, amelyeket a fentiek alapján, a találmány szerint megváltoztattunk .
Az I. táblázat azt mutatja, hogy a pTaq3 (2. szekvenciarészlet) meglepő módon 200-szor annyi Taq polimeráz aktivitást fejez ki, mint a pTaql; a pTaq4 (3. szekvenciarészlet) körülbelül tízszer annyi aktivitást fejez ki, mint a pTaql; a pTaq5 (4. szekvenciarészlet) a kísérlettől függően 10-50-szer többet fejez ki, és a pTaq6 (5. szekvenciarészlet) legalább tízszer jobb, mint a pTaql (1. szekvenciarészlet). Ezek váratlan eredmények.
A szekvenciák listáján szereplő rövid nukleotid szekvenciák a természetes gén első 30 nukleotidjához viszonyítva jelentenek változást. Ezek a szekvenciák a teljes, 2000-nél több nukleotidot tartalmazó Taq polimeráz génnek csak egy kis részét jelentik.
I. TÁBLÁZAT
Expressziós plazmidokon kódolt hőstabil DNS polimeráz aktivitás vizsgálata. A polimeráz aktivitást a gén expressziójának és a polimeráz termelésének mértékeként értékeljük.
(Egység/mg fehérje)
| Gazda Kinyerési id Indukció Plazmid | DH5a ő 0/N | DH5a 0/N + | JM103 2 óra + | JM103 2 óra + | JM103 0/N + | JM103 JM103 | |
| 2 óra | 2 óra + | ||||||
| 1. szekv.r. pTaql | 40 | 90 | 100 | 270 | 1030 | 60 | 180 |
| 2. szekv.r. pTaq3 | 7290 | 19240 | 4150 | 4510 | 27420 | 11400 | i 21810 |
| 3. szekv.r. pTaq4 | 470 | 1050 | 1080 | 1570 | 5080 | 900 | 2360 |
| 4. szekv.r. pTaq5 | nd | nd | 6060 | 4610 | 14190 | 3500 | 10700 |
| 5. szekv.r. | 2486 | 7644 | nd | nd | nd | nd | nd |
pTaq6
Megjegyzés:
nd = nincs meghatározva 0/N = éjszakán át + = indukció
- = nincs indukció
Claims (10)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Taq polimeráz gén, azzal jellemezve, hogy a természetes génben a természetes protein első tíz aminosavát kódoló első harminc nukleotid bázis meg van változtatva, oly módon, hogyA) az alábbi módosított nukleotid szekvenciák valamelyikével helyettesítjük:
ATG 2. szekvenciarészlet 33 CGT CGT ATG CTG CCT CTG TTT GAG CCG AAG ATG CGT GGG 3. szekvenciarészlet ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG 33 ATG GAC TAC 4. szekvenciarészlet AAG GAC GAC GAT GAC AAG CGT CGT ATG 36 CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG 57 vagy (B) az érett fehérje első aminosavát kódoló ATG kodon és az érett fehérje második aminosavat kódoló AGG kodon közé az alábbi szekvenciát illesztjük be:5. szekvenciarészletGAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG 24 - 2. Az 1. igénypont szerinti gén, azzal jellemezve, hogy közetlenül a start (ATG) kodon előtt egy restrikciós hasítási helyet tartalmaz, és ugyanazt a restrikciós hasítási helyet tartalmazza közvetlenül a stop (TGA) kodon után.
- 3. A 2. igénypont szerinti gén, azzal jellemezve, hogy a restrikciós hasítási helyeket a GAATTC nukleotid szekvencia kódolja.
- 4. Az 1. igénypont szerinti gén, azzal jellemezve, hogy a természetes szekvencia:1. szekvenciarészletATG AGG GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG 33 a következő szekvenciára van megváltoztatva:2. szekvenciarészletATG CGT CGT ATG CTG CCT CTG TTT GAG CCG AAG 33.
- 5. Hőstabil Thermus aquaticus DNS polimeráz, azzal jellemezve, hogy az érett fehérjében az első aminosav szekvencia az alábbi:9. szekvenciarészletMet-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys.
- 6. Eljárás a Taq polimeráz termelésének fokozására, azzal jellemezve, hogyA) egy olyan Taq polimeráz gént tartalmazó vektort állítunk elő, amelyben az érett természetes fehérje első tíz aminosavát kódoló első harminc nukleotidot megváltoztatjuk, oly módon hogyi) az alábbi módosított nukleotid szekvenciák valamelyikével helyettesítjük:2. szekvenciarészletATG CGT CGT ATG CTG CCT CTG TTT GAG CCG AAG333. szekvenciarészletATG CGT GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG334. szekvenciarészletATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG CGT CGT ATG36CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG57 vagy ii) az érett fehérje első aminosavát kódoló ATG kodon és az érett fehérje második aminosavat kódoló AGG kodon közé az alábbi szekvenciát illesztjük be:8. szekvenciarészletTAC AAG GAC GAC GAT GAT AAGB) az A) lépésben kapott vektorral egy kompatibilis Escherichia coli gazdasejtet transzfektálunk,C) és a kapott transzformált E. coli sejteket megfelelő körülmények között növesztjük.
- 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az A) lépésben indukálható promoterrel rendelkező vektort állítunk elő.
- 8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Taq polimeráz termelését izopropil-B-D-tio-galaktoziddal (IPTG) indukáljuk.• · · · ···· · • · · ’ « · · • ····« · · ·«· ♦·· · ·· · «
- 9. Taq polimeráz gént tartalmazó vektor, azzal jellemezve, hogy a természetes génben a természetes Taq polimeráz első tíz aminosavát kódoló első harminc nukleotid bázis meg van változtatva, oly módon, hogyA) az alábbi módosított nukleotid szekvenciák valamelyikével helyettesítjük:2. szekvenciarészletATG CGT CGT ATG CTG CCT CTG TTT GAG CCG AAG333. szekvenciarészletATG CGT GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG334. szekvenciarészletATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG CGT CGT ATG36CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG57 vagy (B) az érett fehérje első aminosavát kódoló ATG kodon és az érett fehérje második aminosavat kódoló AGG kodon közé az alábbi szekvenciát illesztjük be:5. szekvenciarészletGAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG és az említett vektor tartalmaz:i) szelektálható markereket, ii) egy megfelelő promotert és iii) a gén expresszióját szabályozó alkalmasV szabályozó szekvenciát.
- 10. Escherichia coli gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a9. igénypont szerinti vektort tartalmazza.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/602,848 US6083686A (en) | 1990-10-26 | 1990-10-26 | Increased production of Thermus aquaticus DNA polymerase in E. coli |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU913365D0 HU913365D0 (en) | 1992-01-28 |
| HUT62334A true HUT62334A (en) | 1993-04-28 |
Family
ID=24413037
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU913365A HUT62334A (en) | 1990-10-26 | 1991-10-25 | Process for increasing thermus aquaticus dna-polymerase production in escherichia coli |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6083686A (hu) |
| EP (1) | EP0482714B1 (hu) |
| JP (1) | JPH0759195B2 (hu) |
| KR (1) | KR940005592B1 (hu) |
| AT (1) | ATE136932T1 (hu) |
| AU (1) | AU8469091A (hu) |
| CA (1) | CA2052827A1 (hu) |
| CS (1) | CS324291A3 (hu) |
| DE (1) | DE69118809T2 (hu) |
| DK (1) | DK0482714T3 (hu) |
| ES (1) | ES2086479T3 (hu) |
| HU (1) | HUT62334A (hu) |
| IL (1) | IL99852A0 (hu) |
| NO (1) | NO914191L (hu) |
| SG (1) | SG52453A1 (hu) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5846717A (en) | 1996-01-24 | 1998-12-08 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage |
| US5994069A (en) | 1996-01-24 | 1999-11-30 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of nucleic acids by multiple sequential invasive cleavages |
| US6872816B1 (en) | 1996-01-24 | 2005-03-29 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid detection kits |
| US5843654A (en) * | 1992-12-07 | 1998-12-01 | Third Wave Technologies, Inc. | Rapid detection of mutations in the p53 gene |
| US5888780A (en) * | 1992-12-07 | 1999-03-30 | Third Wave Technologies, Inc. | Rapid detection and identification of nucleic acid variants |
| US5614402A (en) * | 1992-12-07 | 1997-03-25 | Third Wave Technologies, Inc. | 5' nucleases derived from thermostable DNA polymerase |
| US6372424B1 (en) | 1995-08-30 | 2002-04-16 | Third Wave Technologies, Inc | Rapid detection and identification of pathogens |
| US5719028A (en) * | 1992-12-07 | 1998-02-17 | Third Wave Technologies Inc. | Cleavase fragment length polymorphism |
| US5541311A (en) * | 1992-12-07 | 1996-07-30 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid encoding synthesis-deficient thermostable DNA polymerase |
| US7691573B2 (en) | 1992-12-07 | 2010-04-06 | Third Wave Technologies, Inc. | Cleavage of nucleic acids |
| US6673616B1 (en) | 1992-12-07 | 2004-01-06 | Third Wave Technologies, Inc. | Methods and compositions for characterizing nucleic acids |
| US6100078A (en) * | 1994-04-01 | 2000-08-08 | Gen-Probe Incorporated | Purified DNA polymerase from bacillus stearothermophilus ATCC 12980 |
| US7122364B1 (en) | 1998-03-24 | 2006-10-17 | Third Wave Technologies, Inc. | FEN endonucleases |
| US7195871B2 (en) | 1996-01-24 | 2007-03-27 | Third Wave Technologies, Inc | Methods and compositions for detecting target sequences |
| US6706471B1 (en) | 1996-01-24 | 2004-03-16 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage |
| US6875572B2 (en) | 1996-01-24 | 2005-04-05 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid detection assays |
| US5985557A (en) | 1996-01-24 | 1999-11-16 | Third Wave Technologies, Inc. | Invasive cleavage of nucleic acids |
| US6291164B1 (en) | 1996-11-22 | 2001-09-18 | Invitrogen Corporation | Methods for preventing inhibition of nucleic acid synthesis by pyrophosphate |
| ATE530652T1 (de) | 1996-11-29 | 2011-11-15 | Third Wave Tech Inc | Fen-1-endonucleasen, mischungen und spaltungsverfahren |
| US6346379B1 (en) * | 1997-09-11 | 2002-02-12 | F. Hoffman-La Roche Ag | Thermostable DNA polymerases incorporating nucleoside triphosphates labeled with fluorescein family dyes |
| US8182991B1 (en) | 1997-11-26 | 2012-05-22 | Third Wave Technologies, Inc. | FEN-1 endonucleases, mixtures and cleavage methods |
| DE19810879A1 (de) | 1998-03-13 | 1999-09-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Polymerasenchimären |
| US6130045A (en) * | 1998-06-11 | 2000-10-10 | Clontech Laboratories, Inc. | Thermostable polymerase |
| US7179590B2 (en) * | 2000-04-18 | 2007-02-20 | Roche Molecular Systems, Inc | High temperature reverse transcription using mutant DNA polymerases |
| US20050042629A1 (en) | 2002-09-13 | 2005-02-24 | Applera Corporation | Thermus scotoductus nucleic acid polymerases |
| AU2002346498A1 (en) | 2001-11-30 | 2003-06-17 | Applera Corporation | Thermus brockianus nucleic acid polymerases |
| WO2003048309A2 (en) | 2001-11-30 | 2003-06-12 | Applera Corporation | Thermus thermophilus nucleic acid polymerases |
| WO2010062777A2 (en) | 2008-11-03 | 2010-06-03 | Kapabiosystems | Modified type a dna polymerases |
| WO2012097318A2 (en) | 2011-01-14 | 2012-07-19 | Kap Abiosystems | Modified dna polymerases for improved amplification |
| KR101948248B1 (ko) * | 2011-11-18 | 2019-02-14 | 한국생명공학연구원 | 단백질 발현 미세 조절방법 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4703004A (en) * | 1984-01-24 | 1987-10-27 | Immunex Corporation | Synthesis of protein with an identification peptide |
| US4782137A (en) * | 1984-01-24 | 1988-11-01 | Immunex Corporation | Synthesis of protein with an identification peptide, and hybrid polypeptide incorporating same |
| US4889818A (en) * | 1986-08-22 | 1989-12-26 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
| EP0372005A4 (en) * | 1987-10-30 | 1990-06-26 | Oncogen | EXPRESSION SYSTEMS FOR THE PREPARATION OF POLYPEPTIDES IN PROKARYOTIC CELLS. |
| IL88923A (en) * | 1988-01-12 | 1995-07-31 | Hoffmann La Roche | Gene encoding a thermostable dna polymerase from thermus aquaticus said dna polymerase and its purification |
-
1990
- 1990-10-26 US US07/602,848 patent/US6083686A/en not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-09-24 AU AU84690/91A patent/AU8469091A/en not_active Abandoned
- 1991-10-04 CA CA002052827A patent/CA2052827A1/en not_active Abandoned
- 1991-10-22 AT AT91202731T patent/ATE136932T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-10-22 DE DE69118809T patent/DE69118809T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-22 ES ES91202731T patent/ES2086479T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-22 DK DK91202731.5T patent/DK0482714T3/da active
- 1991-10-22 EP EP91202731A patent/EP0482714B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-22 SG SG1996004754A patent/SG52453A1/en unknown
- 1991-10-25 HU HU913365A patent/HUT62334A/hu unknown
- 1991-10-25 KR KR1019910018801A patent/KR940005592B1/ko active IP Right Grant
- 1991-10-25 NO NO91914191A patent/NO914191L/no unknown
- 1991-10-25 JP JP3280052A patent/JPH0759195B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-25 CS CS913242A patent/CS324291A3/cs unknown
- 1991-10-25 IL IL99852A patent/IL99852A0/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0482714A1 (en) | 1992-04-29 |
| JPH0759195B2 (ja) | 1995-06-28 |
| US6083686A (en) | 2000-07-04 |
| KR920008186A (ko) | 1992-05-27 |
| IL99852A0 (en) | 1992-08-18 |
| ATE136932T1 (de) | 1996-05-15 |
| DE69118809D1 (de) | 1996-05-23 |
| NO914191D0 (no) | 1991-10-25 |
| CS324291A3 (en) | 1992-05-13 |
| DE69118809T2 (de) | 1996-09-26 |
| ES2086479T3 (es) | 1996-07-01 |
| NO914191L (no) | 1992-04-27 |
| DK0482714T3 (da) | 1996-05-13 |
| CA2052827A1 (en) | 1992-04-27 |
| HU913365D0 (en) | 1992-01-28 |
| SG52453A1 (en) | 1998-09-28 |
| KR940005592B1 (ko) | 1994-06-21 |
| JPH05130871A (ja) | 1993-05-28 |
| AU8469091A (en) | 1992-05-07 |
| EP0482714B1 (en) | 1996-04-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT62334A (en) | Process for increasing thermus aquaticus dna-polymerase production in escherichia coli | |
| HONG et al. | A potyvirus polymerase interacts with the viral coat protein and VPg in yeast cells | |
| US5939292A (en) | Thermostable DNA polymerases having reduced discrimination against ribo-NTPs | |
| JPH09506783A (ja) | テルモトガ・ネアポリタナからクローニングされたｄｎａポリメラーゼおよびその変異体 | |
| JPH06504196A (ja) | モルモシポ・アフリカヌスからの純化された熱安定性核酸ポリメラーゼ | |
| JPH06500020A (ja) | サーモトガ・マリチマ由来の熱安定性核酸ポリメラーゼ | |
| MXPA97005961A (en) | Thermostable dna polymerase, modification | |
| JP2000501616A (ja) | テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスからの熱安定性ｄｎａポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性が除去されているその変異体酵素 | |
| JP2001523098A (ja) | 複数のサブユニットからなるａｓｌｖ逆転写酵素の生成のための方法 | |
| JP2003525603A (ja) | サーモアクチノマイセス−ブルガリス由来の好熱性ポリメラーゼ | |
| Burns et al. | Thermal energy requirement for strand separation during transcription initiation: the effect of supercoiling and extended protein DNA contacts | |
| EP1064296B1 (en) | Thermostable dna polymerase from thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus | |
| US7078170B2 (en) | Reaction mixtures for target amplification of nucleic acid with mutant RNA polymerase | |
| WO1998002535A1 (fr) | Procede pour effectuer une mutagenese dirigee | |
| WO2007117331A2 (en) | Novel dna polymerase from thermoanaerobacter tengcongenesis | |
| US12006519B2 (en) | Polymerase mutants and use with 3′-OH unblocked reversible terminators | |
| Wright et al. | Chromogenic identification of oligonucleotide-directed mutants | |
| JP3679536B2 (ja) | 耐熱性ｄｎａ合成酵素 | |
| Coleclough | [11] Cell-free expression of large collections of cDNA clones using positive-selection λ phage vectors | |
| JPH0675506B2 (ja) | 試験管内遺伝子合成 | |
| Rand et al. | T4 RNA ligase: New structural studies on an unusual but useful enzyme | |
| CN118086243A (zh) | 一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用 | |
| KR100482530B1 (ko) | 부위특이적 변이 도입방법 | |
| US20040157213A1 (en) | Fungal reverse transcriptases with enhanced capabilities | |
| JPH08173160A (ja) | Ｄｎａの特定部位の突然変異導入方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |