CN114369586A

CN114369586A - Taq DNA聚合酶突变体及其应用和产品、基因、质粒和基因工程菌

Info

Publication number: CN114369586A
Application number: CN202210274396.3A
Authority: CN
Inventors: 刁含文; 林春
Original assignee: Nanjing Jujiang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Jujiang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-03-21
Filing date: 2022-03-21
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2042-03-21
Also published as: CN114369586B

Abstract

本发明提供了一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用和产品、基因、质粒和基因工程菌，涉及生物技术领域。本发明提供的Taq DNA聚合酶突变体，将Taq DNA聚合酶的第142位Asp突变为Lys，第695位Arg突变为Trp。该Taq DNA聚合酶突变体常温下聚合酶活性显著降低，解决了Taq DNA聚合酶在常温条件下也具备DNA聚合酶活性的问题，提升了PCR反应的特异性，对于复杂样本的检测灵敏度显著提升，能够用于制备核酸扩增产品中。

Description

Taq DNA聚合酶突变体及其应用和产品、基因、质粒和基因工程菌

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用和产品、基因、质粒和基因工程菌。

背景技术

现今所使用Taq polymerase是美国微生物学家T.Brook从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。即使在相对较高的温度条件下依然具备DNA聚合酶活性，基于此特性通过设计相应的引物以及提供dNTP原料就可以实现DNA的体外扩增，这也就是现在生物技术的核心技术之一：聚合酶链式反应技术(PCR反应)。但实现体外DNA的扩增复制最关键的就是DNA聚合酶的活性和酶属性，Taq DNA聚合酶具备非常好的使用性能而被应用于PCR技术中。随着基于PCR技术的革新与应用范围的拓展，Taq DNA聚合酶已经不足以满足对精细的分子诊断中的定量分析的要求。目前Taq DNA聚合酶虽有在高温条件下的DNA聚合酶活性，但是在常温条件下也具备DNA聚合酶活性，这使得对于PCR实验的细节要求一直比较高，并且始终无法避免局部的常温导致引物的非特异性扩增，最终影响到PCR实验结果。在此背景之下对于热启动技术的开发也不断在推进，目前热启动技术核心在于抑制Taq DNA聚合酶常温下的活性反应。为解决这一属性，可对Taq DNA聚合酶的解决方法有：1）抗体修饰法，利用Taq DNA聚合酶特异抗原决定簇的单克隆抗体在常温下与Taq DNA聚合酶结合让其失去聚合酶活性，当温度超过70℃时抗体失活同时释放出聚合酶活性；2）琼脂糖包埋法，低熔点的琼脂糖的熔点为60-70℃，在室温25-37℃时即可凝固，通过琼脂糖包埋的Taq DNA聚合酶在PCR反应阶段就可以融化释放Taq DNA聚合酶，使得在常温条件下不与引物结合。3）变异Taq DNA聚合酶，Klen Taq在删除N端缺失之后其在常温下的聚合酶反应会受到产物的反馈抑制。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种Taq DNA聚合酶突变体，以解决上述问题中的至少一种。

本发明的第二目的在于提供上述Taq DNA聚合酶突变体在制备核酸扩增产品中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种核酸扩增产品，包括上述Taq DNA聚合酶突变体。

本发明的第四目的在于提供一种编码上述Taq DNA聚合酶突变体的基因。

本发明的第五目的在于提供一种重组质粒，包括上述编码Taq DNA聚合酶突变体的基因。

本发明的第六目的在于提供一种基因工程菌，能够表达上述Taq DNA聚合酶突变体。

第一方面，本发明提供了一种Taq DNA聚合酶突变体，将Taq DNA聚合酶的第142位Asp突变为Lys，第695位Arg突变为Trp；

所述Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作为进一步技术方案，表达所述Taq DNA聚合酶突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

第二方面，本发明提供了上述Taq DNA聚合酶突变体在制备核酸扩增产品中的应用。

第三方面，本发明提供了一种核酸扩增产品，包括上述Taq DNA聚合酶突变体。

第四方面，本发明提供了一种编码Taq DNA聚合酶突变体的基因。

第五方面，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括载体和上述基因。

作为进一步技术方案，所述载体为pET-28a。

第六方面，本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌含有上述重组质粒。

作为进一步技术方案，所述基因工程菌为大肠杆菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的Taq DNA聚合酶突变体，将Taq DNA聚合酶的第142位Asp突变为Lys，第695位Arg突变为Trp。该Taq DNA聚合酶突变体常温下聚合酶活性显著降低，解决了TaqDNA聚合酶在常温条件下也具备DNA聚合酶活性的问题，提升了PCR反应的特异性，对于复杂样本的检测灵敏度显著提升，能够用于制备核酸扩增产品中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为Taq NDA聚合酶三维模拟图；

图2为Taq NDA聚合酶突变体重组质粒构建流程图；

图3为37℃下的Taq DNA聚合酶活性测试结果；

图4 Taq酶纯度测试结果；

图5大肠杆菌发酵液PCR实验结果。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

为解决常温条件下Taq NDA聚合酶与引物结合产生非特异性条带，本发明的方法研究出对于Taq DNA聚合酶进行突变使其在常温条件下封闭聚合酶活性的方法。本发明首先基于原始氨基酸序列进行理性设计（SWISS MODEL建模分析与分子对接AutoDock 4，分子动力学模拟(Amber 18)）分析其构象差异确定其突变点，Taq NDA聚合酶三维模拟如图1所示，以短片段dsDNA作为底物进行分子对接模拟，通过前期实验筛选与测试，选择对ASP142位点和ARG695位点进行突变。

所述Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

mrgmlplfepkgrvllvdghhlayrtfhalkglttsrgepvqavygfaksllkalkedgdavivvfdakapsfrheayggykagraptpedfprqlalikelvdllglarlevpgyeaddvlaslakkaekegyevriltadkdlyqllsdrihvlhpegylitpawlwekyglrpdqwadyraltgdesdnlpgvkgigektarklleewgsleallknldrlkpairekilahmddlklswdlakvrtdlplevdfakrrepdrerlraflerlefgsllhefgllespkaleeapwpppegafvgfvlsrkepmwadllalaaarggrvhrapepykalrdlkeargllakdlsvlalreglglppgddpmllaylldpsnttpegvarryggewteeageraalserlfanlwgrlegeerllwlyreverplsavlahmeatgvrldvaylralslevaeeiarleaevfrlaghpfnlnsrdqlervlfdelglpaigktektgkrstsaavlealreahpivekilqyreltklkstyidplpdlihprtgrlhtrfnqtatatgrlcccdpnlqnipvrtplgqrirrgfiaeegwllvaldysqielrvlahlsgdenlirvfqegrdihtetaswmfgvpreavdplmrraaktinfgvlygmsahrlsqelaipyeeaqafieryfqsfpkvrawiektleegrrrgyvetlfgrrryvpdlearvksvreaaermafnmpvqgtaadlmklamvklfprleemgarmllqvhdelvleapkeraeavarlakevmegvyplavplevevgigedwlsake（SEQ ID NO.1）。

所述Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

mrgmlplfepkgrvllvdghhlayrtfhalkglttsrgepvqavygfaksllkalkedgdavivvfdakapsfrheayggykagraptpedfprqlalikelvdllglarlevpgyeaddvlaslakkaekegyevriltakkdlyqllsdrihvlhpegylitpawlwekyglrpdqwadyraltgdesdnlpgvkgigektarklleewgsleallknldrlkpairekilahmddlklswdlakvrtdlplevdfakrrepdrerlraflerlefgsllhefgllespkaleeapwpppegafvgfvlsrkepmwadllalaaarggrvhrapepykalrdlkeargllakdlsvlalreglglppgddpmllaylldpsnttpegvarryggewteeageraalserlfanlwgrlegeerllwlyreverplsavlahmeatgvrldvaylralslevaeeiarleaevfrlaghpfnlnsrdqlervlfdelglpaigktektgkrstsaavlealreahpivekilqyreltklkstyidplpdlihprtgrlhtrfnqtatatgrlcccdpnlqnipvrtplgqrirrgfiaeegwllvaldysqielrvlahlsgdenlirvfqegrdihtetaswmfgvpreavdplmrraaktinfgvlygmsahrlsqelaipyeeaqafiewyfqsfpkvrawiektleegrrrgyvetlfgrrryvpdlearvksvreaaermafnmpvqgtaadlmklamvklfprleemgarmllqvhdelvleapkeraeavarlakevmegvyplavplevevgigedwlsake（SEQ ID NO.2）。

在一些优选的实施方式中，表达所述Taq DNA聚合酶突变体的核苷酸序列如SEQID NO.3所示：

ATGCGTGGTATGTTACCTTTGTTTGAACCCAAAGGCCGCGTTCTTCTCGTCGATGGACATCACCTAGCTTATCGAACTTTCCATGCCCTGAAGGGGTTAACCACATCTCGGGGTGAGCCAGTACAAGCAGTGTACGGCTTTGCGAAATCCTTGCTTAAGGCTCTCAAAGAAGACGGAGATGCCGTTATTGTCGTATTCGACGCAAAGGCGCCGTCATTTAGACACGAGGCTTATGGGGGTTACAAAGCCGGCAGGGCACCTACGCCCGAAGATTTCCCACGTCAGCTAGCGCTGATCAAGGAGTTAGTGGACTTGCTTGGACTCGCTCGCCTAGAAGTTCCGGGGTATGAGGCCGATGACGTCCTGGCATCGTTAGCGAAAAAGGCTGAAAAAGAGGGTTACGAAGTACGAATATTGACTGCCAAGAAAGATCTTTATCAACTCCTAAGTGACCGGATTCATGTGCTGCACCCTGAGGGCTACTTAATCACCCCCGCATGGTTGTGGGAAAAGTATGGACTTAGACCAGATCAGTGGGCGGACTACAGGGCTCTCACAGGGGATGAGAGCGACAATCTACCGGGTGTTAAAGGCATAGGAGAAAAGACGGCCCGTAAACTGTTAGAGGAATGGGGGTCTTTGGAGGCACTTCTCAAGAACCTAGATCGCCTGAAACCTGCGATTCGAGAAAAGATCTTAGCTCATATGGACGATTTGAAACTTTCCTGGGACCTCGCCAAGGTCCGGACTGATCTACCCCTGGAGGTAGACTTTGCAAAAAGAAGGGAACCAGATCGTGAGCGCTTACGAGCGTTCTTGGAACGGCTTGAGTTTGGTTCACTCCTACACGAATTCGGCCTGTTAGAGTCGCCGAAGGCTTTGGAAGAGGCCCCTTGGCCCCCACCGGAAGGAGCATTTGTGGGGTTCGTTCTTAGTAGAAAAGAGCCTATGTGGGCGGACCTCCTAGCTCTGGCCGCAGCGAGGGGTGGCCGTGTCCATCGCGCTCCCGAACCATATAAGGCCTTACGAGATTTGAAAGAGGCACGGGGACTTCTCGCGAAGGACCTAAGCGTACTGGCTTTAAGAGAAGGGTTGGGTCTTCCGCCTGGCGATGACCCCATGCTCCTAGCCTACCTGTTAGATCCATCTAATACCACACCGGAGGGAGTGGCAAGGCGTTATGGGGGTGAATGGACGGAGGAAGCGGGCGAGCGCGCTGCCTTGTCCGAACGACTTTTTGCAAACCTCTGGGGACGGCTAGAGGGGGAAGAGAGACTGTTATGGTTGTACAGGGAAGTTGAGCGTCCTCTTTCAGCGGTCCTCGCTCACATGGAAGCCACTGGTGTACGCCTAGACGTGGCATATCTGCGAGCGTTATCGTTGGAGGTTGCTGAAGAGATAGCCCGGCTTGAAGCAGAGGTCTTCAGACTCGCGGGCCATCCCTTTAATCTAAACAGTAGGGATCAACTGGAACGTGTATTATTCGACGAGTTGGGACTTCCAGCTATTGGGAAAACCGAAAAGACAGGTAAACGCAGCACGTCTGCCGCAGTGCTCGAGGCGCTACGAGAAGCTCACCCGATCGTTGAGAAGATACTGCAGTACCGGGAATTAACTAAATTGAAGTCCACCTATATTGATCCTCTTCCCGACCTCATCCATCCAAGAACAGGCAGGCTACACACGCGTTTTAATCAAACTGCCACCGCAACAGGACGCCTGTGTTGCTGTGATCCGAACTTACAGAATATACCTGTCCGAACGCCCTTGGGGCAACGGATTAGAAGGGGTTTCATCGCGGAGGAAGGCTGGCTTCTCGTAGCTCTAGACTACTCACAGATAGAGCTGCGTGTGTTAGCCCATTTGTCGGGAGATGAAAACCTTATTCGCGTTTTTCAAGAGGGGCGAGACATCCACACTGAAACCGCAAGTTGGATGTTCGGTGTCCCACGGGAGGCGGTAGATCCGCTCATGAGAAGGGCTGCCAAAACAATAAATTTTGGCGTGCTATATGGAATGAGCGCACATCGTCTGTCTCAGGAATTAGCGATTCCTTACGAGGAAGCTCAAGCCTTCATCGAGTGGTATTTTCAGTCCTTCCCCAAGGTTCGCGCATGGATAGAAAAAACGTTGGAGGAAGGGCGACGGAGAGGTTACGTCGAGACTCTTTTTGGCAGGCGTCGCTATGTACCAGACCTCGAAGCGCGAGTGAAGTCAGTTCGGGAGGCTGCCGAAAGAATGGCATTCAACATGCCGGTCCAAGGAACCGCGGCTGATCTAATGAAACTGGCCATGGTAAAGTTATTTCCTAGGTTGGAGGAAATGGGGGCACGTATGCTTCTCCAGGTGCACGACGAGCTAGTTCTGGAAGCGCCCAAAGAGCGCGCTGAAGCCGTCGCACGATTAGCGAAGGAGGTAATGGAAGGTGTGTACCCATTGGCTGTTCCGCTTGAGGTCGAAGTAGGCATTGGAGAGGATTGGCTCTCGGCCAAAGAA（SEQID NO.3）。

本发明提供的Taq DNA聚合酶突变体，将Taq DNA聚合酶的第142位Asp突变为Lys，第695位Arg突变为Trp。该Taq DNA聚合酶突变体常温下聚合酶活性显著降低，可降低PCR技术中的引物二聚体从而降低非特异性扩增，同时提高对样品的灵敏度。

本发明提供的Taq DNA聚合酶突变体常温下聚合酶活性低，对于复杂样本的检测灵敏度高，PCR反应的特异性好，能够用于制备核酸扩增产品中。

第三方面，本发明提供了一种核酸扩增产品，包括上述Taq DNA聚合酶突变体。该核酸扩增产品灵敏度高，特异性好。

第五方面，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括载体和上述编码TaqDNA聚合酶突变体的基因。

在一些优选的实施方式中，所述载体包括pET-28a，或者本领域技术人员所熟知的其他载体，本发明中载体优选为pET-28a。

在一些优选的实施方式中，所述基因工程菌包括但不限于大肠杆菌；

所述大肠杆菌包括BL21(rosseta)，优选为BL21(rosseta)。

下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

以下实施例中所用的引物如下表所示：

实施例1

1）对Taq DNA聚合酶进行突变的具体过程如下：本发明所述Taq DNA聚合酶是通过pET28-作为载体构建表达的，为快速准确地构建获得重组载体，并且以大肠杆菌BL21作为最终的宿主，本发明采用的Golden gate组装技术设计PCR引物。

2）具体实施如下：依据Taq DNA聚合酶的原始氨基酸序列输入到Codon Optimizer软件中同时输入大肠杆菌基因组序列信息，导出Taq DNA聚合酶对应的核酸序列，如SEQ IDNO.3所示。

3）依据Taq DNA聚合酶核酸序列设计引物。

4）以本团队先前的pMD-18-Taq DNA聚合酶质粒为模板（其中Taq DNA聚合酶片段的核酸序列如SEQ ID NO.3所示），以P1/P2为引物，以pMD-18-Taq DNA为模板获得野生型Taq DNA聚合酶ARG695位点突变体基因片段，PCR反应体系设置如下：

注：此处的2 x Proofast^TMMaster Mix购买来自南京巨匠生物科技有限公司。

反应程序：预变性95℃ 5min、变性95℃ 15s、退火58℃ 15s、延伸72℃ 20s、循环30、在延伸72℃ 5min。

5）将上述所获得的PCR产物进行琼脂糖核酸电泳，通过胶回收（ATGPure™ GelDNA Extraction Mini Kit）获得突变体片段1。

6）将上述所获得的ARG695突变的Taq DNA聚合酶的线性化重组载体DNA片段按照如下体系进行自环化重组反应。

注：5×UFO Buffer为本公司自主研发配制而成最利于重组反应的缓冲液。

将上述所获得的重组连接产物取10 μl转化至100 μl DH5a感受态中，置于冰上冷击30 min，然后42 ℃热击45 s，再置于冰上冷击5 min，加入890 μl LB培养基之后置于37℃、200rpm摇床孵育1h。4000rpm离心1min收集菌体，留100μl上清重悬之后涂布到Amp抗性的平板中，筛选出阳性克隆子。通过M13F引物与M13R引物进行菌落PCR验证，挑取阳性克隆转接测序。

7）将上述所获得的ARG突变体重组质粒提取获取高纯度质粒，并以此为模板以同样的方式用引物P3/P4克隆突变ASP142位点为LYS，通过菌落PCR验证、质粒PCR验证以及测序测试突变结果。

8）如图2所示，将测序验证突变成功的Taq DNA聚合酶重组质粒，按如下酶切体系分别切割pET28-a质粒与pMD-18T-D142K/R695W获取线性化载体pET-28a以及D142K/R695W突变基因。

9）将上述所得的酶切产物跑琼脂糖核酸电泳，切取正确的条带用南京巨匠生物科技有限公司ATGPure™ PCR product purification kit试剂盒回收获得DNA片段。

10）将上述所获得的D142K/R695W基因片段与pET-28a载体DNA片段按照如下体系进行重组反应。

11）将上述所获得的重组连接产物取10 μl转化至100 μl BL21(rosseta)感受态中，置于冰上冷击30 min，然后42 ℃热击45 s，再置于冰上冷击5 min，加入890 μl LB培养基之后置于37℃、200rpm摇床孵育1h。4000rpm离心1min收集菌体，留100μl上清重悬之后涂布到Kan抗性的平板中，筛选出阳性克隆子。通过T7引物与T7terminator引物进行菌落PCR验证，挑取阳性克隆转接测序。

12）获得一级种子，再按1%的接种量转接至50ml LB培养基中获得二级种子，再转接5ml二级种子至500ml LB培养基中与37℃继续2-4h至OD600=0.2-0.8时加入0.1-1mMIPTG诱导剂诱导Taq DNA聚合酶突变体的表达。

13）将诱导发酵之后的菌液离心收集，称量菌泥重量，按1：5~1:10的稀释比用悬菌Buffer ：20-50mM Tris-HCl、100-800mM KCl、0.1-0.5mM DTT、0.1mM-2mM EDTA、PH=7.8，重悬菌体；将菌体充分混匀之后通过高压均值匀浆机破碎细胞，破碎条件为600-750bar、循环破碎三次。离心收集上清、过膜除杂。

14）向上述粗酶液上清溶液中加入0.2mol/L-5mol/L的硫酸铵盐析将蛋白质沉积，再用13000 rpm离心10min收集蛋白沉淀。

15）将上步骤所获得的沉淀用Buffer ：20-50mM Tris-HCl、100-800mM KCl、0.1-0.5 mM DTT、0.5%曲拉通X-100、PH=7.8，冲洗；再用0.22 μm的滤膜过滤。

16）向所得到的粗蛋白液中加入10mM咪唑通过Ni离子亲和层析纯化以获得目的蛋白，具体先通过平衡Buffer冲洗柱材料，再将已加入咪唑的粗蛋白液流加到Ni柱当中，利用HIS-Tag标签的亲和性与Ni离子结合。通过100mM-500mM咪唑洗脱杂蛋白与目的蛋白。

17）为进一步得到高纯度的目的蛋白，将所得的原酶液再通过阳离子柱进行纯化除杂，所采用的条件为500mM-2M KCl梯度洗脱。

18）将所获得的洗脱液进行50Kda过膜浓缩至1mg/ml。所得原液20μl进行SDS-PAGE实验分析，具体为取20μl待测样品加入5μl 5×Loading Buffer，置于沸水中加热5min，制作8%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，结果如图4，本发明所获得的Taq DNA聚合酶有较高的纯度超过97%。

试验例1：D142K/R695W突变体Taq在普通PCR中的应用

通过严格的纯化步骤获取得到Taq DNA聚合酶原酶液，并将野生型Taq DNA聚合酶和突变体Taq DNA聚合酶分别配制成ATGStart™ Taq Plus DNA Polymerase（P302）。

将野生型Taq DNA聚合酶和突变体Taq DNA聚合酶分别在常温下和4℃低温下配制PCR反应体系，实际测试中对所设计的大肠杆菌16srDNA进行测试，所用引物为27F/1492R进行测试，测试反应体系如下：

测试PCR反应程序为：

实验结果如图5所示。图中从左至右依次为marker和1-8泳道，其中，泳道1，2为常温下以野生型Taq DNA聚合酶配制PCR反应体系；泳道3，4为4℃低温下以野生型Taq DNA聚合酶配制PCR反应体系；泳道5，6为常温下以突变体Taq DNA聚合酶配制PCR反应体系；泳道7，8为4℃低温下以突变体Taq DNA聚合酶配制PCR反应体系。说明本发明提供的突变体TaqDNA聚合酶能够用于PCR中。

试验例2：常温下的Taq DNA聚合酶活性测试

将上述所获得的纯酶液、野生型Taq DNA聚合酶和某公司抗体修饰的Taq DNA聚合酶分别配置成1×Reaction Buffer：20 mM Tris-HCl、1.8 mM MgCl₂、22mM KCl、0.06%IGEPAL® CA-630、0.05% Tween® 20、22 mM NH₄Cl (pH 8.9 @ 25°C)。

常温条件下的酶活力测试：

在上述反应体系置于37℃下反应30min，通过测试dsDNA的吸光值OD260对比不同Taq在常温条件下的聚合酶活性的活力大小，结果如图3所示。

从图3中可以看出，本发明提供的Taq DNA聚合酶突变体在37℃的聚合酶活性相较于野生型Taq DNA聚合酶显著降低，取得了与抗体修饰的Taq DNA聚合酶相似的技术效果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 南京巨匠生物科技有限公司

<120> Taq DNA聚合酶突变体及其应用和产品、基因、质粒和基因工程菌

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 832

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn

370 375 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu

385 390 395 400

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

405 410 415

Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu

420 425 430

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile

515 520 525

Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr

530 535 540

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Cys Cys

565 570 575

Cys Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln

580 585 590

Arg Ile Arg Arg Gly Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala

595 600 605

Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly

610 615 620

Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr

625 630 635 640

Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro

645 650 655

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly

660 665 670

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

675 680 685

Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg

690 695 700

Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val

705 710 715 720

Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg

725 730 735

Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro

740 745 750

Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His

770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala

785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro

805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

820 825 830

<210> 2

<211> 832

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Lys Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn

370 375 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu

385 390 395 400

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

405 410 415

Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu

420 425 430

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile

515 520 525

Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr

530 535 540

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Cys Cys

565 570 575

Cys Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln

580 585 590

Arg Ile Arg Arg Gly Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala

595 600 605

Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly

610 615 620

Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr

625 630 635 640

Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro

645 650 655

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly

660 665 670

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

675 680 685

Ala Gln Ala Phe Ile Glu Trp Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg

690 695 700

Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val

705 710 715 720

Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg

725 730 735

Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro

740 745 750

Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His

770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala

785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro

805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

820 825 830

<210> 3

<211> 2496

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atgcgtggta tgttaccttt gtttgaaccc aaaggccgcg ttcttctcgt cgatggacat 60

cacctagctt atcgaacttt ccatgccctg aaggggttaa ccacatctcg gggtgagcca 120

gtacaagcag tgtacggctt tgcgaaatcc ttgcttaagg ctctcaaaga agacggagat 180

gccgttattg tcgtattcga cgcaaaggcg ccgtcattta gacacgaggc ttatgggggt 240

tacaaagccg gcagggcacc tacgcccgaa gatttcccac gtcagctagc gctgatcaag 300

gagttagtgg acttgcttgg actcgctcgc ctagaagttc cggggtatga ggccgatgac 360

gtcctggcat cgttagcgaa aaaggctgaa aaagagggtt acgaagtacg aatattgact 420

gccaagaaag atctttatca actcctaagt gaccggattc atgtgctgca ccctgagggc 480

tacttaatca cccccgcatg gttgtgggaa aagtatggac ttagaccaga tcagtgggcg 540

gactacaggg ctctcacagg ggatgagagc gacaatctac cgggtgttaa aggcatagga 600

gaaaagacgg cccgtaaact gttagaggaa tgggggtctt tggaggcact tctcaagaac 660

ctagatcgcc tgaaacctgc gattcgagaa aagatcttag ctcatatgga cgatttgaaa 720

ctttcctggg acctcgccaa ggtccggact gatctacccc tggaggtaga ctttgcaaaa 780

agaagggaac cagatcgtga gcgcttacga gcgttcttgg aacggcttga gtttggttca 840

ctcctacacg aattcggcct gttagagtcg ccgaaggctt tggaagaggc cccttggccc 900

ccaccggaag gagcatttgt ggggttcgtt cttagtagaa aagagcctat gtgggcggac 960

ctcctagctc tggccgcagc gaggggtggc cgtgtccatc gcgctcccga accatataag 1020

gccttacgag atttgaaaga ggcacgggga cttctcgcga aggacctaag cgtactggct 1080

ttaagagaag ggttgggtct tccgcctggc gatgacccca tgctcctagc ctacctgtta 1140

gatccatcta ataccacacc ggagggagtg gcaaggcgtt atgggggtga atggacggag 1200

gaagcgggcg agcgcgctgc cttgtccgaa cgactttttg caaacctctg gggacggcta 1260

gagggggaag agagactgtt atggttgtac agggaagttg agcgtcctct ttcagcggtc 1320

ctcgctcaca tggaagccac tggtgtacgc ctagacgtgg catatctgcg agcgttatcg 1380

ttggaggttg ctgaagagat agcccggctt gaagcagagg tcttcagact cgcgggccat 1440

ccctttaatc taaacagtag ggatcaactg gaacgtgtat tattcgacga gttgggactt 1500

ccagctattg ggaaaaccga aaagacaggt aaacgcagca cgtctgccgc agtgctcgag 1560

gcgctacgag aagctcaccc gatcgttgag aagatactgc agtaccggga attaactaaa 1620

ttgaagtcca cctatattga tcctcttccc gacctcatcc atccaagaac aggcaggcta 1680

cacacgcgtt ttaatcaaac tgccaccgca acaggacgcc tgtgttgctg tgatccgaac 1740

ttacagaata tacctgtccg aacgcccttg gggcaacgga ttagaagggg tttcatcgcg 1800

gaggaaggct ggcttctcgt agctctagac tactcacaga tagagctgcg tgtgttagcc 1860

catttgtcgg gagatgaaaa ccttattcgc gtttttcaag aggggcgaga catccacact 1920

gaaaccgcaa gttggatgtt cggtgtccca cgggaggcgg tagatccgct catgagaagg 1980

gctgccaaaa caataaattt tggcgtgcta tatggaatga gcgcacatcg tctgtctcag 2040

gaattagcga ttccttacga ggaagctcaa gccttcatcg agtggtattt tcagtccttc 2100

cccaaggttc gcgcatggat agaaaaaacg ttggaggaag ggcgacggag aggttacgtc 2160

gagactcttt ttggcaggcg tcgctatgta ccagacctcg aagcgcgagt gaagtcagtt 2220

cgggaggctg ccgaaagaat ggcattcaac atgccggtcc aaggaaccgc ggctgatcta 2280

atgaaactgg ccatggtaaa gttatttcct aggttggagg aaatgggggc acgtatgctt 2340

ctccaggtgc acgacgagct agttctggaa gcgcccaaag agcgcgctga agccgtcgca 2400

cgattagcga aggaggtaat ggaaggtgtg tacccattgg ctgttccgct tgaggtcgaa 2460

gtaggcattg gagaggattg gctctcggcc aaagaa 2496

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gccttcatcg agtggtattt tcagtccttc cc 32

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gggaaggact gaaaatacca ctcgatgaag gc 32

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

agtacgaata ttgactgcca agaaagatct tt 32

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

aaagatcttt cttggcagtc aatattcgta ct 32

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

caggaaacag ctatgacc 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

taatacgact cactatagg 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

tgctagttat tgctcagcgg 20

Claims

1.一种Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，将Taq DNA聚合酶的第142位Asp突变为Lys，第695位Arg突变为Trp；

所述Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，表达所述Taq DNA聚合酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.权利要求1-2任一项所述的Taq DNA聚合酶突变体在制备核酸扩增产品中的应用。

4.一种核酸扩增产品，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的Taq DNA聚合酶突变体。

5.编码权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体的基因。

6.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括载体和权利要求5所述的基因。

7.根据权利要求6所述的重组质粒，其特征在于，所述载体为pET-28a。

8.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有权利要求6或7所述的重组质粒。

9.根据权利要求8所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为大肠杆菌。