JPH07213300A - Ｄｎａの点変異の検出方法及びそれに用いられるプライマー - Google Patents
Ｄｎａの点変異の検出方法及びそれに用いられるプライマーInfo
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- JPH07213300A JPH07213300A JP3416294A JP3416294A JPH07213300A JP H07213300 A JPH07213300 A JP H07213300A JP 3416294 A JP3416294 A JP 3416294A JP 3416294 A JP3416294 A JP 3416294A JP H07213300 A JPH07213300 A JP H07213300A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 明確に、かつ再現性よくＤＮＡの点変異を検
出することができる方法を提供すること。 【構成】 正常型のプライマーと異常型のプライマーを
それぞれ用いた遺伝子増幅法に試料ＤＮＡをかけ、各プ
ライマーを用いた場合に試料ＤＮＡが増幅されるか否か
によって、その試料ＤＮＡ中の点変異を検出する方法で
あって、前記正常型プライマー及び前記異常型プライマ
ーは、そのそれぞれの３’末端が、点変異が予想される
ヌクレオチドに対応するものであり、前記正常型プライ
マーは、該プライマーの３’末端から２番目のヌクレオ
チドの塩基を除き正常型ＤＮＡの増幅領域の端部領域と
完全に相補的な塩基配列を有し、前記異常型プライマー
は、該プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチド
の塩基を除き異常型ＤＮＡの増幅領域の端部領域と完全
に相補的な塩基配列を有する、ＤＮＡの点変異の検出方
法を提供した。
出することができる方法を提供すること。 【構成】 正常型のプライマーと異常型のプライマーを
それぞれ用いた遺伝子増幅法に試料ＤＮＡをかけ、各プ
ライマーを用いた場合に試料ＤＮＡが増幅されるか否か
によって、その試料ＤＮＡ中の点変異を検出する方法で
あって、前記正常型プライマー及び前記異常型プライマ
ーは、そのそれぞれの３’末端が、点変異が予想される
ヌクレオチドに対応するものであり、前記正常型プライ
マーは、該プライマーの３’末端から２番目のヌクレオ
チドの塩基を除き正常型ＤＮＡの増幅領域の端部領域と
完全に相補的な塩基配列を有し、前記異常型プライマー
は、該プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチド
の塩基を除き異常型ＤＮＡの増幅領域の端部領域と完全
に相補的な塩基配列を有する、ＤＮＡの点変異の検出方
法を提供した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡの点突然変異の
検出方法及びそれに用いられるプライマーに関する。本
発明は、遺伝病の診断等に有用である。
検出方法及びそれに用いられるプライマーに関する。本
発明は、遺伝病の診断等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子の点突然変異により引き起こされ
る遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺伝子
のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝
病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。
このような予想される点突然変異を検出する方法とし
て、従来より、遺伝子増幅法（ＰＣＲ（polymerase cha
inreaction)法）を利用した遺伝子の点突然変異の検出
方法が知られている。この方法では、遺伝子増幅法に用
いる一対のプライマーのうち、一方のプライマーとし
て、正常型の遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補
的な正常型プライマーと、異常型の遺伝子の増幅領域の
端部領域に完全に相補的な異常型プライマーとを用い
る。異常型のプライマーは、その３’末端が、予想され
る点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレ
オチドになっている。このような正常型及び異常型プラ
イマーをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅
法にかける。試料遺伝子が正常型であれば、正常型プラ
イマーを用いた場合にはＤＮＡの増幅が起きるが、異常
型プライマーを用いた場合には、プライマーの３’末端
が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミ
スマッチ）のでＤＮＡ鎖の伸長が起きず、ＤＮＡの増幅
は起きない。一方、試料遺伝子が異常型であれば、逆
に、正常型プライマーを用いた場合には増幅が起きず、
異常型プライマーを用いた場合に増幅が起きる。従っ
て、各プライマーを用いた場合に増幅が起きるか否かを
調べることにより、試料遺伝子が正常型か異常型かを判
別することができ、それによって試料遺伝子中の点突然
変異を検出することができる。
る遺伝病が種々知られており、それらの中には、遺伝子
のどの部位がどのように点突然変異することにより遺伝
病が引き起こされるかわかっているものも少なくない。
このような予想される点突然変異を検出する方法とし
て、従来より、遺伝子増幅法（ＰＣＲ（polymerase cha
inreaction)法）を利用した遺伝子の点突然変異の検出
方法が知られている。この方法では、遺伝子増幅法に用
いる一対のプライマーのうち、一方のプライマーとし
て、正常型の遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補
的な正常型プライマーと、異常型の遺伝子の増幅領域の
端部領域に完全に相補的な異常型プライマーとを用い
る。異常型のプライマーは、その３’末端が、予想され
る点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレ
オチドになっている。このような正常型及び異常型プラ
イマーをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅
法にかける。試料遺伝子が正常型であれば、正常型プラ
イマーを用いた場合にはＤＮＡの増幅が起きるが、異常
型プライマーを用いた場合には、プライマーの３’末端
が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミ
スマッチ）のでＤＮＡ鎖の伸長が起きず、ＤＮＡの増幅
は起きない。一方、試料遺伝子が異常型であれば、逆
に、正常型プライマーを用いた場合には増幅が起きず、
異常型プライマーを用いた場合に増幅が起きる。従っ
て、各プライマーを用いた場合に増幅が起きるか否かを
調べることにより、試料遺伝子が正常型か異常型かを判
別することができ、それによって試料遺伝子中の点突然
変異を検出することができる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記した原理によれ
ば、従来法により明確に点突然変異の検出が行えるよう
に思われるが、実際には、正常型プライマーと異常型プ
ライマーとはわずか１塩基の相違があるのみであり、異
常型プライマーを用いて正常型遺伝子を増幅した場合及
び正常型プライマーを用いて異常型遺伝子を増幅した場
合にもある程度の増幅が起きることが多く、明確な判定
が困難となる場合が少なくない。また、ミスマッチプラ
イマーを用いた場合に増幅が起きるか否かは、用いる機
器の種類やその他の微妙な条件によって左右され、再現
性も低い。従って、ミスマッチプライマーを用いた場合
に増幅が完全に起こらないようにするためには、遺伝子
増幅時の温度条件等を極めて厳密に制御する必要があ
り、かなり困難な作業になる。
ば、従来法により明確に点突然変異の検出が行えるよう
に思われるが、実際には、正常型プライマーと異常型プ
ライマーとはわずか１塩基の相違があるのみであり、異
常型プライマーを用いて正常型遺伝子を増幅した場合及
び正常型プライマーを用いて異常型遺伝子を増幅した場
合にもある程度の増幅が起きることが多く、明確な判定
が困難となる場合が少なくない。また、ミスマッチプラ
イマーを用いた場合に増幅が起きるか否かは、用いる機
器の種類やその他の微妙な条件によって左右され、再現
性も低い。従って、ミスマッチプライマーを用いた場合
に増幅が完全に起こらないようにするためには、遺伝子
増幅時の温度条件等を極めて厳密に制御する必要があ
り、かなり困難な作業になる。
【０００４】従って、本発明の目的は、明確に、かつ再
現性よくＤＮＡの点変異を検出することができる方法及
びそのための試薬を提供することである。
現性よくＤＮＡの点変異を検出することができる方法及
びそのための試薬を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、上記の従来法において、正常型プライマーが
異常型ＤＮＡとハイブリダイズする際及び異常型プライ
マーが正常型ＤＮＡとハイブリダイズする際に、プライ
マーの３’末端のみならず、３’末端から２番目のヌク
レオチドもミスマッチさせることにより、厳密な反応条
件の制御を行わなくともＤＮＡ鎖の伸長、ひいてはＤＮ
Ａの増幅を完全に阻害することができ、明確な判定が可
能となることを見出し本発明を完成した。
究の結果、上記の従来法において、正常型プライマーが
異常型ＤＮＡとハイブリダイズする際及び異常型プライ
マーが正常型ＤＮＡとハイブリダイズする際に、プライ
マーの３’末端のみならず、３’末端から２番目のヌク
レオチドもミスマッチさせることにより、厳密な反応条
件の制御を行わなくともＤＮＡ鎖の伸長、ひいてはＤＮ
Ａの増幅を完全に阻害することができ、明確な判定が可
能となることを見出し本発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、正常型のプライマー
と異常型のプライマーをそれぞれ用いた遺伝子増幅法に
試料ＤＮＡをかけ、各プライマーを用いた場合に試料Ｄ
ＮＡが増幅されるか否かによって、その試料ＤＮＡ中の
点変異を検出する方法であって、前記正常型プライマー
は、該プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチド
の塩基を除き正常型ＤＮＡの増幅領域の端部領域と完全
に相補的な塩基配列を有し、前記異常型プライマーは、
該プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドの塩
基を除き異常型ＤＮＡの増幅領域の端部領域と完全に相
補的な塩基配列を有する、ＤＮＡの点変異の検出方法を
提供する。さらに、本発明は、この方法に用いることが
できる正常型プライマー及び異常型プライマーを提供す
る。
と異常型のプライマーをそれぞれ用いた遺伝子増幅法に
試料ＤＮＡをかけ、各プライマーを用いた場合に試料Ｄ
ＮＡが増幅されるか否かによって、その試料ＤＮＡ中の
点変異を検出する方法であって、前記正常型プライマー
は、該プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチド
の塩基を除き正常型ＤＮＡの増幅領域の端部領域と完全
に相補的な塩基配列を有し、前記異常型プライマーは、
該プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドの塩
基を除き異常型ＤＮＡの増幅領域の端部領域と完全に相
補的な塩基配列を有する、ＤＮＡの点変異の検出方法を
提供する。さらに、本発明は、この方法に用いることが
できる正常型プライマー及び異常型プライマーを提供す
る。
【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）は、試料ＤＮ
Ａ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプ
ライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変
性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰
り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる試
料ＤＮＡの領域を指数関数的に増幅させる方法である。
すなわち、変性工程で試料の二本鎖ＤＮＡを変性（一本
鎖二本に解離）し、続くアニーリング工程において各プ
ライマーと、それぞれに相補的な一本鎖試料ＤＮＡ上の
領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各プラ
イマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳
型となる各一本鎖試料ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を伸長
させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、一
本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。
従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上、上記
一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２n 倍
に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在する
ので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よっ
て、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であ
った、極めて微量（１分子でも可）の試料ＤＮＡをも検
出することが可能であり、最近非常に広く用いられてい
る技術である。
Ａ、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプ
ライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変
性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰
り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる試
料ＤＮＡの領域を指数関数的に増幅させる方法である。
すなわち、変性工程で試料の二本鎖ＤＮＡを変性（一本
鎖二本に解離）し、続くアニーリング工程において各プ
ライマーと、それぞれに相補的な一本鎖試料ＤＮＡ上の
領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各プラ
イマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳
型となる各一本鎖試料ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を伸長
させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、一
本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。
従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上、上記
一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２n 倍
に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在する
ので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よっ
て、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であ
った、極めて微量（１分子でも可）の試料ＤＮＡをも検
出することが可能であり、最近非常に広く用いられてい
る技術である。
【０００９】上記の遺伝子増幅法を利用した本発明の方
法では、正常型ＤＮＡを増幅できる正常型プライマー
と、異常型ＤＮＡを増幅できる異常型プライマーをそれ
ぞれ別個に用いて遺伝子増幅法を行う。なお、ここで、
異常型ＤＮＡとは、正常型ＤＮＡのうちの１つのヌクレ
オチドのみが点変異して他のヌクレオチドに置換されて
いるものであり、どの部位のヌクレオチドが変異してい
るかわかっているものである。遺伝病の中にはこのよう
な遺伝子の点変異により引き起こされることがわかって
いるものも多く、どの部位のヌクレオチドがどのヌクレ
オチドに点変異しているかがわかっているものも少なく
ない。本発明の方法は、試料ＤＮＡがこのような予想さ
れる点変異を起こしているか否かを検査する方法であ
る。
法では、正常型ＤＮＡを増幅できる正常型プライマー
と、異常型ＤＮＡを増幅できる異常型プライマーをそれ
ぞれ別個に用いて遺伝子増幅法を行う。なお、ここで、
異常型ＤＮＡとは、正常型ＤＮＡのうちの１つのヌクレ
オチドのみが点変異して他のヌクレオチドに置換されて
いるものであり、どの部位のヌクレオチドが変異してい
るかわかっているものである。遺伝病の中にはこのよう
な遺伝子の点変異により引き起こされることがわかって
いるものも多く、どの部位のヌクレオチドがどのヌクレ
オチドに点変異しているかがわかっているものも少なく
ない。本発明の方法は、試料ＤＮＡがこのような予想さ
れる点変異を起こしているか否かを検査する方法であ
る。
【００１０】なお、遺伝子増幅法を行うためには、常に
一対のプライマーが必要であるから、正常型プライマー
を用いて遺伝子増幅を行う場合でも、異常型プライマー
を用いて遺伝子増幅を行う場合でも、対になる第３のプ
ライマーが必要であることは言うまでもない。すなわ
ち、遺伝子増幅法は正常型プライマー／第３のプライマ
ーの組合せ及び異常型プライマー／第３のプライマーの
組合せをそれぞれ用いて別個に行われる。ここで第３の
プライマーは、点変異とは全く無関係な領域にハイブリ
ダイズするものであり、正常型プライマーの対になる第
３のプライマーと異常型プライマーの対になる第３のプ
ライマーとは同一でも異なっていてもよい。もっとも、
同一のプライマー（すなわち共通のプライマー）を用い
る方がプライマーの調製の手間が省ける。
一対のプライマーが必要であるから、正常型プライマー
を用いて遺伝子増幅を行う場合でも、異常型プライマー
を用いて遺伝子増幅を行う場合でも、対になる第３のプ
ライマーが必要であることは言うまでもない。すなわ
ち、遺伝子増幅法は正常型プライマー／第３のプライマ
ーの組合せ及び異常型プライマー／第３のプライマーの
組合せをそれぞれ用いて別個に行われる。ここで第３の
プライマーは、点変異とは全く無関係な領域にハイブリ
ダイズするものであり、正常型プライマーの対になる第
３のプライマーと異常型プライマーの対になる第３のプ
ライマーとは同一でも異なっていてもよい。もっとも、
同一のプライマー（すなわち共通のプライマー）を用い
る方がプライマーの調製の手間が省ける。
【００１１】正常型プライマーを用いて試料ＤＮＡを増
幅した場合、試料ＤＮＡが正常型であれば増幅が起きる
が、異常型では増幅が起きない。逆に、異常型プライマ
ーを用いて試料ＤＮＡを増幅した場合、試料ＤＮＡが異
常型であれば増幅が起きるが、正常型であれば増幅は起
きない。従って、１つの試料を２つに分け、一方は正常
型プライマーを用いて増幅を行い、他方は異常型プライ
マーを用いて増幅を行い、増幅が起きたか否かを調べる
ことにより、試料ＤＮＡが正常型であるか異常型である
かを明確に知ることができる。特に、ヒトを始め、高等
生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と
母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、こ
の方法によれば、試料遺伝子が正常型のホモか、異常型
のホモか、ヘテロかを区別することもできる（ヘテロの
場合には、正常型遺伝子と異常型遺伝子が共に存在する
から正常型プライマーを用いた場合も異常型プライマー
を用いた場合も増幅が起きる）。
幅した場合、試料ＤＮＡが正常型であれば増幅が起きる
が、異常型では増幅が起きない。逆に、異常型プライマ
ーを用いて試料ＤＮＡを増幅した場合、試料ＤＮＡが異
常型であれば増幅が起きるが、正常型であれば増幅は起
きない。従って、１つの試料を２つに分け、一方は正常
型プライマーを用いて増幅を行い、他方は異常型プライ
マーを用いて増幅を行い、増幅が起きたか否かを調べる
ことにより、試料ＤＮＡが正常型であるか異常型である
かを明確に知ることができる。特に、ヒトを始め、高等
生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と
母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、こ
の方法によれば、試料遺伝子が正常型のホモか、異常型
のホモか、ヘテロかを区別することもできる（ヘテロの
場合には、正常型遺伝子と異常型遺伝子が共に存在する
から正常型プライマーを用いた場合も異常型プライマー
を用いた場合も増幅が起きる）。
【００１２】これまで説明したことは従来法とも共通す
るものであるが、上述のように、従来法では、正常型プ
ライマー／異常型ＤＮＡ及び異常型プライマー／正常型
ＤＮＡの組合せにおいて、プライマーの３’末端のみが
鋳型ＤＮＡと非相補的（ミスマッチ）になっている（す
なわち、プライマーの３’末端が試料ＤＮＡの予想され
る点変異部位に対応する）ので、これらの組合せにおい
ても試料ＤＮＡが増幅される場合がある。このような場
合には、試料ＤＮＡが正常型か異常型かを判別すること
が困難になる。この問題を解決すべく、本発明では、プ
ライマーの配列に工夫がなされている。すなわち、本発
明のプライマーでは、上記組合せにおいて、プライマー
の３’末端のみならず、３’末端から２番目のヌクレオ
チドも鋳型ＤＮＡとミスマッチとなるように設計されて
いる（ダブルミスマッチ）。このように設計した場合、
正常型ＤＮＡと異常型ＤＮＡとは１つのヌクレオチドが
点変異しているだけで他の配列は完全に同一であるの
で、正常型プライマー／正常型ＤＮＡ及び異常型プライ
マー／異常型ＤＮＡの組合せにおいても、プライマーの
３’末端から２番目のヌクレオチドはミスマッチにな
る。しかしながら、３’末端から２番目のヌクレオチド
のみがミスマッチであっても、遺伝子増幅法によりＤＮ
Ａの増幅が起きることがわかった。
るものであるが、上述のように、従来法では、正常型プ
ライマー／異常型ＤＮＡ及び異常型プライマー／正常型
ＤＮＡの組合せにおいて、プライマーの３’末端のみが
鋳型ＤＮＡと非相補的（ミスマッチ）になっている（す
なわち、プライマーの３’末端が試料ＤＮＡの予想され
る点変異部位に対応する）ので、これらの組合せにおい
ても試料ＤＮＡが増幅される場合がある。このような場
合には、試料ＤＮＡが正常型か異常型かを判別すること
が困難になる。この問題を解決すべく、本発明では、プ
ライマーの配列に工夫がなされている。すなわち、本発
明のプライマーでは、上記組合せにおいて、プライマー
の３’末端のみならず、３’末端から２番目のヌクレオ
チドも鋳型ＤＮＡとミスマッチとなるように設計されて
いる（ダブルミスマッチ）。このように設計した場合、
正常型ＤＮＡと異常型ＤＮＡとは１つのヌクレオチドが
点変異しているだけで他の配列は完全に同一であるの
で、正常型プライマー／正常型ＤＮＡ及び異常型プライ
マー／異常型ＤＮＡの組合せにおいても、プライマーの
３’末端から２番目のヌクレオチドはミスマッチにな
る。しかしながら、３’末端から２番目のヌクレオチド
のみがミスマッチであっても、遺伝子増幅法によりＤＮ
Ａの増幅が起きることがわかった。
【００１３】上記した本発明の原理を図１及び図２に基
づき説明する。図１には、正常型プライマーを用いた場
合が模式的に示されている。図１に模式的に示されるよ
うに、正常型ＤＮＡと異常型ＤＮＡは、点変異した単一
のヌクレオチドが異なるのみであり、その他の部分は完
全に同一である。点変異するヌクレオチドが正常型では
凹で、異常型では凸で示されている。一方、正常型プラ
イマーは、その３’末端が点変異することがあるヌクレ
オチドに対応するヌクレオチドになっている。正常型プ
ライマーの３’末端は点変異していない正常型ＤＮＡの
対応ヌクレオチドに相補的であるから、図示のように凸
で示されている（すなわち、凹−凸が相補的な塩基の組
合せ（すなわち、Ａ−Ｔ又はＧ−Ｃ）を示し、凸−凸又
は凹−凹が非相補的な塩基の組合せ（すなわち、Ａ−Ｔ
及びＧ−Ｃ以外の組合せ）を示す）。すなわち、正常型
プライマーの３’末端は正常型ＤＮＡの対応ヌクレオチ
ドとは相補的であるが、異常型ＤＮＡの対応ヌクレオチ
ドとは非相補的である。この点は従来法と同様である。
本発明の方法では、正常型プライマーの３’末端から２
番目のヌクレオチドの塩基も試料ＤＮＡの対応ヌクレオ
チドの塩基と非相補的になっている（図では凸−凸で示
される）。なお、プライマーの３’末端から２番目のヌ
クレオチドに対応する試料ＤＮＡのヌクレオチドは、点
変異するヌクレオチドではないので正常型ＤＮＡでも異
常型ＤＮＡでも同じである（図では凸で示される）。な
お、正常型プライマーの３’末端から２番目の塩基以外
の塩基配列は、正常型ＤＮＡの対応領域（すなわち、遺
伝子増幅法により増幅される領域の端部領域）と完全に
相補的である。従って、図示のように、正常型プライマ
ー／正常型ＤＮＡの組合せでは、プライマーの３’末端
から２番目の塩基のみがミスマッチとなる。この場合に
は、遺伝子増幅法によりプライマーの３’末端に続いて
ＤＮＡ鎖が伸長する。一方、正常型プライマー／異常型
ＤＮＡの組合せでは、プライマーの３’末端及び３’末
端から２番目の２つのヌクレオチドがミスマッチ（ダブ
ルミスマッチ）となり、遺伝子増幅法においてプライマ
ーの３’末端に続くＤＮＡ鎖の伸長は起きない。３’末
端のミスマッチであっても、従来法のようにシングルミ
スマッチの場合にはＤＮＡ鎖の伸長が起きることがある
が、本発明では、ダブルミスマッチとなっているので、
ＤＮＡ鎖の伸長は完全に阻害される。
づき説明する。図１には、正常型プライマーを用いた場
合が模式的に示されている。図１に模式的に示されるよ
うに、正常型ＤＮＡと異常型ＤＮＡは、点変異した単一
のヌクレオチドが異なるのみであり、その他の部分は完
全に同一である。点変異するヌクレオチドが正常型では
凹で、異常型では凸で示されている。一方、正常型プラ
イマーは、その３’末端が点変異することがあるヌクレ
オチドに対応するヌクレオチドになっている。正常型プ
ライマーの３’末端は点変異していない正常型ＤＮＡの
対応ヌクレオチドに相補的であるから、図示のように凸
で示されている（すなわち、凹−凸が相補的な塩基の組
合せ（すなわち、Ａ−Ｔ又はＧ−Ｃ）を示し、凸−凸又
は凹−凹が非相補的な塩基の組合せ（すなわち、Ａ−Ｔ
及びＧ−Ｃ以外の組合せ）を示す）。すなわち、正常型
プライマーの３’末端は正常型ＤＮＡの対応ヌクレオチ
ドとは相補的であるが、異常型ＤＮＡの対応ヌクレオチ
ドとは非相補的である。この点は従来法と同様である。
本発明の方法では、正常型プライマーの３’末端から２
番目のヌクレオチドの塩基も試料ＤＮＡの対応ヌクレオ
チドの塩基と非相補的になっている（図では凸−凸で示
される）。なお、プライマーの３’末端から２番目のヌ
クレオチドに対応する試料ＤＮＡのヌクレオチドは、点
変異するヌクレオチドではないので正常型ＤＮＡでも異
常型ＤＮＡでも同じである（図では凸で示される）。な
お、正常型プライマーの３’末端から２番目の塩基以外
の塩基配列は、正常型ＤＮＡの対応領域（すなわち、遺
伝子増幅法により増幅される領域の端部領域）と完全に
相補的である。従って、図示のように、正常型プライマ
ー／正常型ＤＮＡの組合せでは、プライマーの３’末端
から２番目の塩基のみがミスマッチとなる。この場合に
は、遺伝子増幅法によりプライマーの３’末端に続いて
ＤＮＡ鎖が伸長する。一方、正常型プライマー／異常型
ＤＮＡの組合せでは、プライマーの３’末端及び３’末
端から２番目の２つのヌクレオチドがミスマッチ（ダブ
ルミスマッチ）となり、遺伝子増幅法においてプライマ
ーの３’末端に続くＤＮＡ鎖の伸長は起きない。３’末
端のミスマッチであっても、従来法のようにシングルミ
スマッチの場合にはＤＮＡ鎖の伸長が起きることがある
が、本発明では、ダブルミスマッチとなっているので、
ＤＮＡ鎖の伸長は完全に阻害される。
【００１４】一方、図２に示されるように、異常型プラ
イマーは、その３’末端が凹になっており、正常型ＤＮ
Ａの対応ヌクレオチドとは非相補的で異常型ＤＮＡ対応
ヌクレオチドとは相補的になっている。異常型プライマ
ーの３’末端から２番目のヌクレオチドは、正常型プラ
イマーと同様に、試料ＤＮＡの対応ヌクレオチドとは非
相補的になっている。なお、異常型プライマーの３’末
端から２番目の塩基以外の塩基配列は、異常型ＤＮＡの
対応領域（すなわち、遺伝子増幅法により増幅される領
域の端部領域）と完全に相補的である。従って、図示の
ように、異常型プライマー／正常型ＤＮＡの組合せで
は、プライマーの３’末端及び３’末端から２番目のヌ
クレオチドがダブルミスマッチとなってＤＮＡ鎖の伸長
が起きないが、異常型プライマー／異常型ＤＮＡの組合
せでは、プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチ
ドのみがミスマッチとなってＤＮＡ鎖の伸長が起きる。
イマーは、その３’末端が凹になっており、正常型ＤＮ
Ａの対応ヌクレオチドとは非相補的で異常型ＤＮＡ対応
ヌクレオチドとは相補的になっている。異常型プライマ
ーの３’末端から２番目のヌクレオチドは、正常型プラ
イマーと同様に、試料ＤＮＡの対応ヌクレオチドとは非
相補的になっている。なお、異常型プライマーの３’末
端から２番目の塩基以外の塩基配列は、異常型ＤＮＡの
対応領域（すなわち、遺伝子増幅法により増幅される領
域の端部領域）と完全に相補的である。従って、図示の
ように、異常型プライマー／正常型ＤＮＡの組合せで
は、プライマーの３’末端及び３’末端から２番目のヌ
クレオチドがダブルミスマッチとなってＤＮＡ鎖の伸長
が起きないが、異常型プライマー／異常型ＤＮＡの組合
せでは、プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチ
ドのみがミスマッチとなってＤＮＡ鎖の伸長が起きる。
【００１５】このように、本発明の方法では、正常型プ
ライマー／異常型ＤＮＡ及び異常型プライマー／正常型
ＤＮＡの組合せでは、ダブルミスマッチによりＤＮＡ鎖
の伸長が完全に阻害され、一方、正常型プライマー／正
常型ＤＮＡ及び異常型プライマー／異常型ＤＮＡの組合
せではＤＮＡ鎖の伸長が起きる。よって、本発明の方法
によれば、従来法のように偽陽性を生じることなく、試
料ＤＮＡ中の点変異を明確に検出することができる。
ライマー／異常型ＤＮＡ及び異常型プライマー／正常型
ＤＮＡの組合せでは、ダブルミスマッチによりＤＮＡ鎖
の伸長が完全に阻害され、一方、正常型プライマー／正
常型ＤＮＡ及び異常型プライマー／異常型ＤＮＡの組合
せではＤＮＡ鎖の伸長が起きる。よって、本発明の方法
によれば、従来法のように偽陽性を生じることなく、試
料ＤＮＡ中の点変異を明確に検出することができる。
【００１６】上記した正常型プライマーと異常型プライ
マーの３’末端から２番目の塩基は同一であっても異な
っていてもよい。また、正常型プライマーと異常型プラ
イマーの長さは同一でも異なっていてもよい。正常型プ
ライマーと異常型プライマーの長さが、下記実施例２の
場合のように有意に異なっておれば、第３のプライマー
として共通のものを用いた場合であっても、正常型プラ
イマーを用いて得た増幅産物と異常型プライマーを用い
て得た増幅産物を混合し、この混合物を電気泳動にかけ
ても増幅産物の大きさが異なるためにどちらのプライマ
ーを用いて増幅が起きたかを知ることができ、電気泳動
の手間を減らすことができる。また、正常型プライマー
と異常型プライマーの長さが同じ場合でも、第３のプラ
イマーとして異なったものを用い、増幅産物の長さが正
常型プライマーを用いた場合と異常型プライマーを用い
た場合とで異なるようにすれば同様の効果を得ることが
できる。
マーの３’末端から２番目の塩基は同一であっても異な
っていてもよい。また、正常型プライマーと異常型プラ
イマーの長さは同一でも異なっていてもよい。正常型プ
ライマーと異常型プライマーの長さが、下記実施例２の
場合のように有意に異なっておれば、第３のプライマー
として共通のものを用いた場合であっても、正常型プラ
イマーを用いて得た増幅産物と異常型プライマーを用い
て得た増幅産物を混合し、この混合物を電気泳動にかけ
ても増幅産物の大きさが異なるためにどちらのプライマ
ーを用いて増幅が起きたかを知ることができ、電気泳動
の手間を減らすことができる。また、正常型プライマー
と異常型プライマーの長さが同じ場合でも、第３のプラ
イマーとして異なったものを用い、増幅産物の長さが正
常型プライマーを用いた場合と異常型プライマーを用い
た場合とで異なるようにすれば同様の効果を得ることが
できる。
【００１７】上述のダブルミスマッチを利用する点を除
けば、本発明の方法は従来と同様にして行うことができ
る。すなわち、正常型プライマー及び異常型プライマー
は、オリゴデオキシヌクレオチドから成り、その長さは
特に限定されないが、通常１８〜２５ヌクレオチド、好
ましくは１８〜２０ヌクレオチド程度である。また、遺
伝子増幅法の操作そのものは、この分野において周知で
あり、用いるプライマーの長さやプライマーと試料ＤＮ
Ａとの親和性等を考慮して当業者ならば容易に条件を設
定することができる。この場合、本発明の方法では、上
述のように、ダブルミスマッチを利用することにより偽
陽性の発生を完全に防止できるので、遺伝子増幅法の温
度条件をそれほど厳密に設定しなくても正確な結果を得
ることができる。換言すれば、異なる機器等を用いるこ
と等に起因して温度条件が多少ずれているような場合で
も、再現性良く正確な判定結果を得ることができる。
けば、本発明の方法は従来と同様にして行うことができ
る。すなわち、正常型プライマー及び異常型プライマー
は、オリゴデオキシヌクレオチドから成り、その長さは
特に限定されないが、通常１８〜２５ヌクレオチド、好
ましくは１８〜２０ヌクレオチド程度である。また、遺
伝子増幅法の操作そのものは、この分野において周知で
あり、用いるプライマーの長さやプライマーと試料ＤＮ
Ａとの親和性等を考慮して当業者ならば容易に条件を設
定することができる。この場合、本発明の方法では、上
述のように、ダブルミスマッチを利用することにより偽
陽性の発生を完全に防止できるので、遺伝子増幅法の温
度条件をそれほど厳密に設定しなくても正確な結果を得
ることができる。換言すれば、異なる機器等を用いるこ
と等に起因して温度条件が多少ずれているような場合で
も、再現性良く正確な判定結果を得ることができる。
【００１８】これまでに説明した本発明の方法は、正常
型プライマー及び異常型プライマーの両方ともダブルミ
スマッチを利用したものである。しかし、正常型プライ
マー／正常型ＤＮＡと正常型プライマー／異常型ＤＮＡ
の結合力の差が比較的大きい場合（塩基が対合した場合
（非相補的に対合した場合も含む）、その結合力の強さ
は、各塩基の組合せによりそれぞれ異なるので、同じミ
スマッチといっても、結合力に強弱がある）には、遺伝
子増幅法の温度条件を厳密に設定すれば、正常型プライ
マーの３’末端のみをミスマッチとした、従来の正常型
プライマーを用いても点変異の検出が可能な場合があ
る。同様に、異常型プライマー／異常型ＤＮＡと異常型
プライマー／正常型ＤＮＡの結合力の差が比較的大きい
場合には、遺伝子増幅法の温度条件を厳密に設定すれ
ば、異常型プライマーの３’末端のみをミスマッチとし
た、従来の異常型プライマーを用いても点変異の検出が
可能な場合がある。従って、このような場合、正常型プ
ライマー及び異常型プライマーのいずれか一方のみ上記
ダブルミスマッチとした方法も本発明の方法に含まれる
（請求項２及び４に記載）。なお、この場合に、正常型
プライマーをダブルミスマッチとする場合には、正常型
プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドとして
前記正常型ＤＮＡの対応ヌクレオチドと同一骨格の塩基
を有するものを用い、異常型プライマーをダブルミスマ
ッチとする場合には、異常型プライマーの３’末端から
２番目のヌクレオチドとして異常型ＤＮＡの対応ヌクレ
オチドと同一骨格の塩基を有するものを用いることが好
ましい。塩基の骨格が同一であれば、結合温度に差がな
いので、このようにすれば、正常型プライマーを用いた
場合も異常型プライマーを用いた場合も同じ条件で遺伝
子増幅法を行うことができるので好都合である。
型プライマー及び異常型プライマーの両方ともダブルミ
スマッチを利用したものである。しかし、正常型プライ
マー／正常型ＤＮＡと正常型プライマー／異常型ＤＮＡ
の結合力の差が比較的大きい場合（塩基が対合した場合
（非相補的に対合した場合も含む）、その結合力の強さ
は、各塩基の組合せによりそれぞれ異なるので、同じミ
スマッチといっても、結合力に強弱がある）には、遺伝
子増幅法の温度条件を厳密に設定すれば、正常型プライ
マーの３’末端のみをミスマッチとした、従来の正常型
プライマーを用いても点変異の検出が可能な場合があ
る。同様に、異常型プライマー／異常型ＤＮＡと異常型
プライマー／正常型ＤＮＡの結合力の差が比較的大きい
場合には、遺伝子増幅法の温度条件を厳密に設定すれ
ば、異常型プライマーの３’末端のみをミスマッチとし
た、従来の異常型プライマーを用いても点変異の検出が
可能な場合がある。従って、このような場合、正常型プ
ライマー及び異常型プライマーのいずれか一方のみ上記
ダブルミスマッチとした方法も本発明の方法に含まれる
（請求項２及び４に記載）。なお、この場合に、正常型
プライマーをダブルミスマッチとする場合には、正常型
プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドとして
前記正常型ＤＮＡの対応ヌクレオチドと同一骨格の塩基
を有するものを用い、異常型プライマーをダブルミスマ
ッチとする場合には、異常型プライマーの３’末端から
２番目のヌクレオチドとして異常型ＤＮＡの対応ヌクレ
オチドと同一骨格の塩基を有するものを用いることが好
ましい。塩基の骨格が同一であれば、結合温度に差がな
いので、このようにすれば、正常型プライマーを用いた
場合も異常型プライマーを用いた場合も同じ条件で遺伝
子増幅法を行うことができるので好都合である。
【００１９】本発明はまた、上述したダブルミスマッチ
を利用した、正常型プライマー及び異常型プライマーを
も提供する。
を利用した、正常型プライマー及び異常型プライマーを
も提供する。
【００２０】本発明の方法は、遺伝病の原因となる遺伝
子の点変異の検出や、ガン遺伝子、ガン抑制遺伝子等の
検出に利用できる。また、本発明の方法により点変異が
検出されるものは、必ずしも遺伝子に限定されるもので
なく、遺伝子以外のＤＮＡであってもよい。
子の点変異の検出や、ガン遺伝子、ガン抑制遺伝子等の
検出に利用できる。また、本発明の方法により点変異が
検出されるものは、必ずしも遺伝子に限定されるもので
なく、遺伝子以外のＤＮＡであってもよい。
【００２１】
【実施例】以下、実施例に基づき本発明をより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００２２】下記の実施例ではコレステリルエステル転
送蛋白（ＣＥＴＰ）遺伝子の点変異を検出した。高ＨＤ
Ｌコレステロール（高ＨＤＬ−Ｃ）患者の多くではＣＥ
ＴＰ遺伝子に異常が存在することが知られており、現
在、イントロン１４スプライスドナー部位中に一箇所の
点変異が報告されている。すなわち、正常型遺伝子のＧ
が異常型遺伝子ではＡに変異している。下記の実施例及
び比較例はいずれもこの点変異を検出すべく行った。
送蛋白（ＣＥＴＰ）遺伝子の点変異を検出した。高ＨＤ
Ｌコレステロール（高ＨＤＬ−Ｃ）患者の多くではＣＥ
ＴＰ遺伝子に異常が存在することが知られており、現
在、イントロン１４スプライスドナー部位中に一箇所の
点変異が報告されている。すなわち、正常型遺伝子のＧ
が異常型遺伝子ではＡに変異している。下記の実施例及
び比較例はいずれもこの点変異を検出すべく行った。
【００２３】比較例１ (1) 試料の調製 高ＨＤＬ−Ｃ患者及び健常人から遺伝子試料を調製し
た。これは次のように行った。ＥＤＴＡ・２ナトリウム
採血を行った血液から低速遠心を行ってリンパ球を分離
した。次にこのリンパ球から、フェノール−クロロホル
ム抽出による除タンパク操作を行ってヒトゲノム遺伝子
を抽出した。さらに、エタノール沈殿を行ってヒトゲノ
ム遺伝子の精製を行った。０．１μｇ／μｌの濃度に調
整して、これを遺伝子試料とした。
た。これは次のように行った。ＥＤＴＡ・２ナトリウム
採血を行った血液から低速遠心を行ってリンパ球を分離
した。次にこのリンパ球から、フェノール−クロロホル
ム抽出による除タンパク操作を行ってヒトゲノム遺伝子
を抽出した。さらに、エタノール沈殿を行ってヒトゲノ
ム遺伝子の精製を行った。０．１μｇ／μｌの濃度に調
整して、これを遺伝子試料とした。
【００２４】(2) プライマーの調製 次の塩基配列を有する３種類のプライマーを市販のＤＮ
Ａ合成機を用いて作製した。 共通のフォワードプライマー（１４Ｆ） 5'-CATGAGGATGAATGCTTGTC-3'（20 mer) 正常型プライマー（１４Ｗ１） 5'-CCCCTCCAGCCCACACTTAC-3'（20 mer) 異常型プライマー（１４Ｍ１） 5'-CCCCTCCAGCCCACACTTAT-3'（20 mer) 正常型プライマー（１４Ｗ１）の３’末端は、正常型遺
伝子のＧに相補的であり、一方、異常型プライマー（１
４Ｍ１）の３’末端は、異常型遺伝子のＡに相補的にな
っている。１４Ｆと１４Ｗ１の組合せ又は１４Ｆと１４
Ｍ１のプライマーの組合せを用いて遺伝子増幅法を行う
と、１４Ｆと１４Ｗ１又は１４Ｍ１によって挟まれる１
８７塩基対の領域が増幅される。
Ａ合成機を用いて作製した。 共通のフォワードプライマー（１４Ｆ） 5'-CATGAGGATGAATGCTTGTC-3'（20 mer) 正常型プライマー（１４Ｗ１） 5'-CCCCTCCAGCCCACACTTAC-3'（20 mer) 異常型プライマー（１４Ｍ１） 5'-CCCCTCCAGCCCACACTTAT-3'（20 mer) 正常型プライマー（１４Ｗ１）の３’末端は、正常型遺
伝子のＧに相補的であり、一方、異常型プライマー（１
４Ｍ１）の３’末端は、異常型遺伝子のＡに相補的にな
っている。１４Ｆと１４Ｗ１の組合せ又は１４Ｆと１４
Ｍ１のプライマーの組合せを用いて遺伝子増幅法を行う
と、１４Ｆと１４Ｗ１又は１４Ｍ１によって挟まれる１
８７塩基対の領域が増幅される。
【００２５】(3) 遺伝子増幅法（ＰＣＲ） 遺伝子増幅法に供した反応混合物の組成は次のとおりで
あった。共通のフォワードプライマー５μＭ、正常型又
は異常型プライマー５μＭ、基質（ｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）各１２５μＭ、１０ｍＭ Tr
is-HCl (pH 8.3)、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ MgCl
2 、0.001%(w/v) ゼラチン、遺伝子試料０．１μｇ、Ｔ
ａｑポリメラーゼ０．５ unit 、反応液量２５μｌで行
った。この反応混合物を、変性（９４℃、１分）、アニ
ーリング（６６℃、２分）のサイクルにかけ、３０サイ
クル行った（なお、この系では、アニーリングと変性の
間の機械の温度上昇中にＤＮＡ鎖が伸長されるため、伸
長工程を別途設ける必要はなかった）。
あった。共通のフォワードプライマー５μＭ、正常型又
は異常型プライマー５μＭ、基質（ｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）各１２５μＭ、１０ｍＭ Tr
is-HCl (pH 8.3)、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ MgCl
2 、0.001%(w/v) ゼラチン、遺伝子試料０．１μｇ、Ｔ
ａｑポリメラーゼ０．５ unit 、反応液量２５μｌで行
った。この反応混合物を、変性（９４℃、１分）、アニ
ーリング（６６℃、２分）のサイクルにかけ、３０サイ
クル行った（なお、この系では、アニーリングと変性の
間の機械の温度上昇中にＤＮＡ鎖が伸長されるため、伸
長工程を別途設ける必要はなかった）。
【００２６】(4) 検出 得られたＰＣＲ産物を常法に従ってアガロースゲル電気
泳動にかけ、染色して増幅産物のバンドを検出した。そ
の結果、下記表１に示す、３種類の結果が得られた。
泳動にかけ、染色して増幅産物のバンドを検出した。そ
の結果、下記表１に示す、３種類の結果が得られた。
【００２７】
【表１】
【００２８】このように、試料２と３では、正常型プラ
イマー及び異常型プライマーを用いたいずれの場合にも
ＤＮＡの増幅が見られ、試料の遺伝子型を明確に判定す
ることができなかった。
イマー及び異常型プライマーを用いたいずれの場合にも
ＤＮＡの増幅が見られ、試料の遺伝子型を明確に判定す
ることができなかった。
【００２９】実施例１ 上記比較例１において、異常型プライマーを用いた場合
には、試料１では明確に「増幅せず」という結果が得ら
れたので、上記の系では正常型プライマーにダブルミス
マッチを導入すれば明確な検出が可能であると考えられ
る。従って、実施例１では、正常型プライマーにのみダ
ブルミスマッチを導入し、異常型プライマーとしては比
較例１と同じものを用いた。
には、試料１では明確に「増幅せず」という結果が得ら
れたので、上記の系では正常型プライマーにダブルミス
マッチを導入すれば明確な検出が可能であると考えられ
る。従って、実施例１では、正常型プライマーにのみダ
ブルミスマッチを導入し、異常型プライマーとしては比
較例１と同じものを用いた。
【００３０】すなわち、正常型プライマーとして次の塩
基配列を有する１４Ｗ２プライマーを用いた。 正常型プライマー（１４Ｗ２） 5'-CCCCTCCAGCCCACACTTTC-3'（20 mer) このように、１４Ｗ２では、比較例１で用いた１４Ｗ１
と比較すると、３’末端から２番目の塩基が試料ＤＮＡ
と非相補的な塩基に置換しており、他の配列は１４Ｗ１
と同じである。
基配列を有する１４Ｗ２プライマーを用いた。 正常型プライマー（１４Ｗ２） 5'-CCCCTCCAGCCCACACTTTC-3'（20 mer) このように、１４Ｗ２では、比較例１で用いた１４Ｗ１
と比較すると、３’末端から２番目の塩基が試料ＤＮＡ
と非相補的な塩基に置換しており、他の配列は１４Ｗ１
と同じである。
【００３１】正常型プライマーとして上記１４Ｗ２を用
いることを除き、その他は比較例１と全く同様な操作を
行った。結果を下記表２に示す。
いることを除き、その他は比較例１と全く同様な操作を
行った。結果を下記表２に示す。
【００３２】
【表２】
【００３３】この結果から、試料１が正常型のホモ接合
体、試料２が正常型と異常型のヘテロ接合体、試料３が
異常型のホモ接合体であることが判定された。このよう
に、本発明によれば、従来法では不可能であった点変異
の検出を明確に行うことができた。
体、試料２が正常型と異常型のヘテロ接合体、試料３が
異常型のホモ接合体であることが判定された。このよう
に、本発明によれば、従来法では不可能であった点変異
の検出を明確に行うことができた。
【００３４】実施例２ 実施例２は、正常型プライマー及び異常型プライマーの
両方ともにダブルミスマッチを導入した例である。正常
型プライマーとしては、実施例１で用いた１４Ｗ２を用
いた。共通のフォワードプライマーとしては、下記塩基
配列を有する１４Ｆ３を用いた。また、異常型プライマ
ーとしては、下記塩基配列を有する１４Ｍ２を用いた。 共通のフォワードプライマー（１４Ｆ３） 5'- GGACTCACCATGGGCATTTG-3' （20 mer) 異常型プライマー（１４Ｍ２） 5'-CTCGGCACCCAGTTTCCCCTCCAGCCCACACTTTT-3' （35 me
r) これらのプライマーを用いた場合、１４Ｆ３と１４Ｗ２
の組合せではＣＥＴＰ遺伝子エクソン１４を含む１２０
塩基対の領域が増幅され、１４Ｆ３と１４Ｍ２の組合せ
ではＣＥＴＰ遺伝子エクソン１４を含む１３５塩基対の
領域が増幅される。
両方ともにダブルミスマッチを導入した例である。正常
型プライマーとしては、実施例１で用いた１４Ｗ２を用
いた。共通のフォワードプライマーとしては、下記塩基
配列を有する１４Ｆ３を用いた。また、異常型プライマ
ーとしては、下記塩基配列を有する１４Ｍ２を用いた。 共通のフォワードプライマー（１４Ｆ３） 5'- GGACTCACCATGGGCATTTG-3' （20 mer) 異常型プライマー（１４Ｍ２） 5'-CTCGGCACCCAGTTTCCCCTCCAGCCCACACTTTT-3' （35 me
r) これらのプライマーを用いた場合、１４Ｆ３と１４Ｗ２
の組合せではＣＥＴＰ遺伝子エクソン１４を含む１２０
塩基対の領域が増幅され、１４Ｆ３と１４Ｍ２の組合せ
ではＣＥＴＰ遺伝子エクソン１４を含む１３５塩基対の
領域が増幅される。
【００３５】１４Ｆ３と１４Ｍ２を用いた場合のアニー
リング条件を６５℃、２分に変えたことを除き、比較例
１と全く同様に遺伝子増幅法を行った。反応後、各反応
混合物を混合し、常法によりアガロースゲル電気泳動に
かけて、バンドを染色した。なお、上述のように、正常
型プライマーを用いた場合には増幅産物の長さは１２０
塩基対であり、異常型プライマーを用いた場合には増幅
産物の長さは１３５塩基対であるので、単一のゲル上で
電気泳動を行ったにもかかわらず、染色されたバンドが
正常型プライマーを用いて増幅されたものか異常型プラ
イマーを用いて増幅されたものかを容易に識別すること
ができた。結果を下記表３に示す。
リング条件を６５℃、２分に変えたことを除き、比較例
１と全く同様に遺伝子増幅法を行った。反応後、各反応
混合物を混合し、常法によりアガロースゲル電気泳動に
かけて、バンドを染色した。なお、上述のように、正常
型プライマーを用いた場合には増幅産物の長さは１２０
塩基対であり、異常型プライマーを用いた場合には増幅
産物の長さは１３５塩基対であるので、単一のゲル上で
電気泳動を行ったにもかかわらず、染色されたバンドが
正常型プライマーを用いて増幅されたものか異常型プラ
イマーを用いて増幅されたものかを容易に識別すること
ができた。結果を下記表３に示す。
【００３６】
【表３】
【００３７】この結果から、試料１が正常型のホモ接合
体、試料２が正常型と異常型のヘテロ接合体、試料３が
異常型のホモ接合体であることが判定された。このよう
に、本発明によれば、従来法では不可能であった点変異
の検出を明確に行うことができた。
体、試料２が正常型と異常型のヘテロ接合体、試料３が
異常型のホモ接合体であることが判定された。このよう
に、本発明によれば、従来法では不可能であった点変異
の検出を明確に行うことができた。
【００３８】
【発明の効果】本発明により、試料ＤＮＡ中の点変異を
明確に検出できる方法が提供された。本発明の方法で
は、ダブルミスマッチを利用することにより、偽陽性が
生じないので、遺伝子増幅法の条件をそれほど厳密にし
なくても再現性良く結果が得られ、機種の違い等によっ
て判定結果が異なることはなくなった。また、本発明の
方法によれば、従来法では不可能であったホモ接合とヘ
テロ接合の識別も可能になった。
明確に検出できる方法が提供された。本発明の方法で
は、ダブルミスマッチを利用することにより、偽陽性が
生じないので、遺伝子増幅法の条件をそれほど厳密にし
なくても再現性良く結果が得られ、機種の違い等によっ
て判定結果が異なることはなくなった。また、本発明の
方法によれば、従来法では不可能であったホモ接合とヘ
テロ接合の識別も可能になった。
【図１】本発明の方法の一部を模式的に説明する図であ
る。
る。
【図２】本発明の方法の他の一部を模式的に説明する図
である。
である。
Claims (7)
- 【請求項１】 正常型のプライマーと異常型のプライマ
ーをそれぞれ用いた遺伝子増幅法に試料ＤＮＡをかけ、
各プライマーを用いた場合に試料ＤＮＡが増幅されるか
否かによって、その試料ＤＮＡ中の点変異を検出する方
法であって、前記正常型プライマー及び前記異常型プラ
イマーは、そのそれぞれの３’末端が、点変異が予想さ
れるヌクレオチドに対応するものであり、前記正常型プ
ライマーは、該プライマーの３’末端から２番目のヌク
レオチドの塩基を除き正常型ＤＮＡの増幅領域の端部領
域と完全に相補的な塩基配列を有し、前記異常型プライ
マーは、該プライマーの３’末端から２番目のヌクレオ
チドの塩基を除き異常型ＤＮＡの増幅領域の端部領域と
完全に相補的な塩基配列を有する、ＤＮＡの点変異の検
出方法。 - 【請求項２】 正常型のプライマーと異常型のプライマ
ーをそれぞれ用いた遺伝子増幅法に試料ＤＮＡをかけ、
各プライマーを用いた場合に試料ＤＮＡが増幅されるか
否かによって、その試料ＤＮＡ中の点変異を検出する方
法であって、前記正常型プライマー及び前記異常型プラ
イマーは、そのそれぞれの３’末端が、点変異が予想さ
れるヌクレオチドに対応するものであり、前記正常型プ
ライマーは、該プライマーの３’末端から２番目のヌク
レオチドの塩基を除き正常型ＤＮＡの増幅領域の端部領
域と完全に相補的な塩基配列を有し、前記異常型プライ
マーは、異常型ＤＮＡの増幅領域の端部領域と完全に相
補的な塩基配列を有する、ＤＮＡの点変異の検出方法。 - 【請求項３】 前記正常型プライマーの３’末端から２
番目のヌクレオチドは、前記正常型ＤＮＡの対応ヌクレ
オチドと同一骨格の塩基を有する請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 正常型のプライマーと異常型のプライマ
ーをそれぞれ用いた遺伝子増幅法に試料ＤＮＡをかけ、
各プライマーを用いた場合に試料ＤＮＡが増幅されるか
否かによって、その試料ＤＮＡ中の点変異を検出する方
法であって、前記正常型プライマー及び前記異常型プラ
イマーは、そのそれぞれの３’末端が、点変異が予想さ
れるヌクレオチドに対応するものであり、前記正常型プ
ライマーは、正常型ＤＮＡの増幅領域の端部領域と完全
に相補的な塩基配列を有し、前記異常型プライマーは、
該プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドの塩
基を除き異常型ＤＮＡの増幅領域の端部領域と完全に相
補的な塩基配列を有する、ＤＮＡの点変異の検出方法。 - 【請求項５】 前記異常型プライマーの３’末端から２
番目のヌクレオチドは、前記異常型ＤＮＡの対応ヌクレ
オチドと同一骨格の塩基を有する請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 正常型のプライマーと異常型のプライマ
ーをそれぞれ用いた遺伝子増幅法に試料ＤＮＡをかけ、
各プライマーを用いた場合に試料ＤＮＡが増幅されるか
否かによって、その試料ＤＮＡ中の点変異を検出する方
法に用いられる正常型プライマーであって、その３’末
端から２番目のヌクレオチドの塩基を除き正常型ＤＮＡ
の増幅領域の端部領域と完全に相補的な塩基配列を有す
るプライマー。 - 【請求項７】 正常型のプライマーと異常型のプライマ
ーをそれぞれ用いた遺伝子増幅法に試料ＤＮＡをかけ、
各プライマーを用いた場合に試料ＤＮＡが増幅されるか
否かによって、その試料ＤＮＡ中の点変異を検出する方
法に用いられる異常型プライマーであって、その３’末
端から２番目のヌクレオチドの塩基を除き異常型ＤＮＡ
の増幅領域の端部領域と完全に相補的な塩基配列を有す
るプライマー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3416294A JPH07213300A (ja) | 1994-02-07 | 1994-02-07 | Ｄｎａの点変異の検出方法及びそれに用いられるプライマー |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3416294A JPH07213300A (ja) | 1994-02-07 | 1994-02-07 | Ｄｎａの点変異の検出方法及びそれに用いられるプライマー |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07213300A true JPH07213300A (ja) | 1995-08-15 |
Family
ID=12406517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3416294A Pending JPH07213300A (ja) | 1994-02-07 | 1994-02-07 | Ｄｎａの点変異の検出方法及びそれに用いられるプライマー |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07213300A (ja) |
-
1994
- 1994-02-07 JP JP3416294A patent/JPH07213300A/ja active Pending
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