CN104749360A - 一种禽流感病毒的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种禽流感病毒检测方法，其包括：将从环境中获取的待测样品注入SPR生化分析仪；在所述SPR生化分析仪中，待测样品在SPR敏感芯片表面反应预定时间；SPR生化分析仪计算出禽流感病毒的浓度数值，并根据预先设定的警戒值进行报警或不报警；其中，所述SPR敏感芯片为其表面固定有禽流感病毒抗体或禽流感病毒抗原的SPR金属片。本发明提出的上述方法灵敏度高，特异性好，无需标记，操作简单；可实现对环境中禽流感病毒的现场、实时、快速检测。本发明通过两种不同的芯片，利用两种检测原理对禽流感病毒进行检测，提高了检测的准确性和可靠性。

Description

一种禽流感病毒的检测方法
技术领域
本发明属于禽流感病毒免疫检测领域，尤其涉及到一种用表面等离子体谐振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技术检测禽流感病毒的方法以及用于上述方法的SPR生化分析仪芯片及试剂盒。
背景技术
人禽流行性感冒又称人禽流感，是由禽甲型流感病毒某些亚型中的一些毒株引起的急性呼吸道传染病。据世界卫生组织资料，禽流感为病毒诱发的动物传染病，通常仅感染鸟类，偶尔感染猪。禽流感病毒具有高度物种特异性，但偶尔也跨越物种屏障，感染人类。
根据抗原特性及其基因的不同，流感病毒分为A、B、C三型，也被称为甲、乙、丙三型。A型(即甲型)攻击力最强，也最常见，禽流感病毒就属于A型流感病毒。流感病毒表面密布的糖蛋白也即抗原结构分H和N两大类，H代表Hemagglutinin(血细胞凝集素)，可帮助病毒与呼吸道黏膜上皮细胞表面的相应受体结合，吸附可宿主的呼吸道上皮细胞上。N代表Neuramidinase(神经氨酸)，可帮助病毒作用于核蛋白的受体，使病毒和上皮细胞的核蛋白结合，在核内组成RNA型可溶性抗原，并渗出至胞质周围，复制子代病毒，以出芽方式排出上皮细胞，排出的病毒扩散至附近细胞，产生炎症反应，临床上出现发热，肌肉痛和白细胞减低等全身毒血症样反应。A型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H分为15个亚型(H1～H15)，N分为9个亚型(N1～N9)，H N组合可以有144种可能。不过，目前仅有3种组合——H1N1、H2N2以及H3N2具有感染人类的能力，其他组合如H5N1型禽流感病毒虽然偶尔也传染给人类，但自然宿主仍然主要是多种禽类和动物。AIV基因共编码至少10种蛋白质(PA、PB1、PB2、HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NS2等)。除NS1与NS2为非结构蛋白外，其余均为结构蛋白，其中HA和NA为糖基化的结构蛋白，其它均为非糖基化结构蛋白。
最早的禽流感记录在1878年，意大利发生鸡群大量死亡，当时被称为鸡瘟。到1955年，科学家证实其致病病毒为甲型流感病毒。此后，这种流行性疾病被更名为禽流感。1999年3月至11月，英国伦巴第地区暴发禽流感，到次年3月1300万只病禽被捕杀。2002年10月，美国加州暴发禽流感，仅加州就销毁326多万只鸡；4月，荷兰发生禽流感，人类感染者达80人，并出现死亡病例。自从2003年以来，禽流感病毒持续在全球蔓延，造成数千万只家禽被宰杀销毁，染病死亡者已达数十人。由于存在大流行的潜在危险，因此引起了广泛的关注。
禽流感被发现100多年来，人类并没有掌握有效的预防和治疗方法，仅能以消毒、隔离、大量宰杀禽畜的方法防止其蔓延。目前，国际上加强了对于禽流感检测技术的研究。禽流感特异性的检测实验可以分为直接检测病毒法和基于抗体的检测方法两类。直接检测法包括传统的病毒培养，以及检测特异性的病毒抗原或核酸。目前，随着仪器微型化和计算技术的发展，人类不仅能够迅速判断病毒的亚型，还能够对病毒的全基因组进行测定，并且对单个病毒进行遗传分析。基于抗体的禽流感病毒检测方法包括传统的琼脂糖凝胶免疫扩散以及红血球凝集抑制法，还有基于ELISA的方法，这些方法提供了禽流感的现场筛查和确定禽流感病毒亚型的检测方法。抗原捕获和侧流ELISA方法(试纸条)是被广泛应用的禽流感检测方法，这些方法最初是应用于人感染禽流感的临床诊断的，后来迅速发展被应用于畜牧业。
但是这些方法具有如下缺点：
ELISA方法操作过程复杂，检测时间长，不适合现场快速检测；试纸条方法简单快速，但是读数具有主观性，准确性低。
SPR检测技术的原理如错误!未找到引用源。所示。具有横磁(Transverse Magnetic，TM)偏振的平行入射光通过棱镜耦合，照射在传感芯片上，入射光与传感芯片表面的金属膜的表面等离子体波发生谐振，在棱镜的另一侧采用光检测装置检测出射光的强度。在金属膜的表面，制备有敏感膜(如抗体、受体等分子)。微流通道覆盖在传感芯片的表面，用于引入待测样品。当待测样品中含有与敏感膜发生特异性反应的物质(如抗原)时，出射光的强度会发生改变。利用SPR检测禽流感病毒可以实现禽流感病毒的现场快速检测，而且具有操作简单，准确性高的特点。目前国内外还没有利用检测禽流感病毒的便携式SPR仪、方法以及试剂盒的相关论文及专利。
发明内容
为解决现有技术中存在的上述问题，本发明将便携式表面等离子体谐振生化分析仪应用于禽流感病毒的检测，并且提供检测方法与芯片以及试剂盒。本发明提出的检测方法无需标记，现场快速、操作简单等特点，可实现自动化。
本发明提出了一种禽流感病毒检测方法，其包括：
步骤1、将从环境中获取的待测样品注入SPR生化分析仪；
步骤2、在所述SPR生化分析仪中，待测样品在SPR敏感芯片表面反应预定时间；
步骤3、SPR生化分析仪计算出禽流感病毒的浓度数值，并根据预先设定的警戒值进行报警或不报警；
其中，所述SPR敏感芯片为其表面固定有禽流感病毒抗体或禽流感病毒抗原的SPR金属片。
其中，所述SPR敏感芯片表面固定有禽流感病毒抗体时，步骤1中所述待测样品直接注入SPR分析仪。
其中，所述SPR敏感芯片表面固定有禽流感病毒抗原时，所述待测样品需要进行预处理，并与禽流感病毒抗体混合后注入SPR分析仪。
其中，所述预处理包括将待测样品经过裂解液裂解并温浴一段时间后注入SPR生化分析仪。
其中，SPR分析仪通过检测SPR敏感芯片表面的折射率的变化而检测禽流感病毒。
其中，所述固定在SPR敏感芯片上的禽流感病毒抗体为针对禽流感病毒表面蛋白NA的抗体，所述固定在SPR敏感芯片上的禽流感病毒抗原是指禽流感内部蛋白M1。
其中，所述SPR敏感芯片为其基板为玻璃或塑料，基板表面有两层金属膜，下层为铬膜，上层为金膜或银膜，上层金膜或银膜的厚度为40-50nm，下层铬膜的厚度为3-7nm。
其中，在所述SPR敏感芯片上固定禽流感病毒抗体或抗原的过程如下：
将表面的金属膜经过葡聚糖修饰的SPR敏感芯片用去离子水清洗，并将其表面吹干；将SPR敏感芯片浸泡在0.4M N-羟基琥珀酰亚胺(EDC)和0.1M N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳二亚胺(NHS)的混合液中，SPR敏感芯片表面进行活化10分钟，活化后用去离子水清洗后吹干；将禽流感病毒抗体用pH4.2-4.6醋酸缓冲液稀释至适当的浓度后，滴加在芯片表面以制备固定有禽流感病毒抗体的SPR敏感芯片，或将禽流感病毒抗原用pH值4.2-4.6醋酸缓冲液稀释至适当的浓度后，滴加在芯片表面以制备固定有禽流感病毒抗原的SPR敏感芯片；20℃反应5分钟；将芯片泡入1M乙醇胺溶液中反应10分钟，以灭活剩余的结合位点；快速将芯片用去离子水吹干，置于4℃保存。
其中，所述裂解液为Triton或SDS，工作浓度为10％-0.5％；温浴的温度为25-45度，温浴的时间10-90分钟。
其中，被检测的禽流感病毒包括所有亚型的完整禽流感病毒颗粒或病毒碎片，以及以任伺已知的方式获得的禽流感病毒结构蛋白；所述待测样品包括水、土壤或空气。
本发明所采用的生化分析仪便携式表面等离子体谐振生化分析仪为中国科学院电子学研究所传感技术国家重点实验室自行研制，但是本发明所述方法并不限于在该仪器上使用，本发明适用于其他任何厂家及型号的生化分析仪便携式表面等离子体谐振生化分析仪，仅需要对标准曲线进行修订。本发明所采用的SPR-2002型表面等离子体谐振生物传感器为中国科学院电子学研究所传感技术国家重点实验室自行研制，但是本发明所述方法并不限于在该仪器上使用，本发明适用于其他任何厂家及型号的表面等离子体谐振生物传感器，仅需要对标准曲线进行修订。
附图说明
图1是现有技术中禽流感病毒检测方法示意图；
图2是本发明中禽流感病毒检测方法流程示意图；
图3是本发明中利用抑制免疫检测法检测禽流感病毒的实时动态曲线；
图4是本发明中利用抑制免疫检测法检测禽流感病毒的标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
本发明公开了一种基于便携式表面等离子体谐振(SPR)生化分析仪的禽流感病毒检测方法，其利用白行研制的便携式SPR生化分析仪以及配套试剂盒，实现对禽流感病毒的现场、实时、快速和无需标记的检测，所述便携式表面等离子谐振生化分析仪已申请专利并获得授权(专利号：CN101592606B)，SPR生化分析仪的尺寸其体积在20×5×10cm3以内，重量小于5kg。当然，本发明中也可以使用普通的SPR生化分析仪来实现。
图2示出了本发明提出的禽流感病毒检测方法流程示意图。如图2所示，该方法包括：
步骤1、将从环境中获取的待测样品如水、空气等与裂解液混合后温浴一段时间后注入SPR生化分析仪，或将未经任何预处理的待测样品单独注入SPR生化分析仪，或将待测样品与抗禽流感病毒抗体混合后注入SPR生化分析仪；
步骤2、在所述SPR生化分析仪中，待测样品在SPR敏感芯片表面反应预定时间，最好小于10分钟；
步骤3、SPR生化分析仪计算出禽流感病毒的浓度数值，并根据预先设定的警戒值进行报警或不报警。
其中，所述SPR敏感芯片包括两种，第一种是将禽流感病毒抗体固定在SPR金属膜上而构成敏感膜，所述禽流感病毒抗体为针对禽流感病毒表面蛋白NA的抗体；第二种是将禽流感病毒抗原固定在SPR金属膜上以构成敏感膜，所述禽流感病毒抗原是指禽流感病毒内部蛋白M1。
下面说明利用SPR敏感芯片A检测禽流感病毒的原理：
固定在芯片表面的禽流感病毒抗体能够和禽流感病毒表面的蛋白NA特异性地结合，当含有禽流感病毒的样品流过芯片表面时，抗体与蛋白NA结合，将样品中的禽流感病毒捕获到芯片的表面，使芯片表面的折射率发生变化，从而产生SPR响应值。SPR响应值与样品中的病毒浓度成正比。由于其检测原理是基于禽流感病毒表面蛋白与抗体的特异性结合，所以在利用敏感芯片A进行检测时，不需要对禽流感病毒进行预处理(裂解)。
利用SPR敏感芯片B检测禽流感病毒的原理是：
将禽流感病毒抗原固定在SPR敏感芯片的表面以构成敏感膜，将待测样品进行预处理，并与抗体混合后流过芯片表面，如果样品中含有禽流感病毒，则在经过预处理(裂解)后，禽流感病毒内部蛋白M1将释放出来，与抗体结合，从而抑制了抗体与芯片表面的蛋白M1结合。样品中病毒的浓度与SPR响应值成反比。将含有已知浓度禽流感病毒的样品与抗禽流感病毒抗体充份混合，然后注入SPR生化分析仪，产生响应值。利用一系列已知浓度的禽流感病毒进行上述实验，将所得一系列响应值作为纵坐标，禽流感病毒的浓度作为横坐标画图，即可得到标准曲线。利用未知浓度的禽流感病毒样品进行上述实验，将此响应值与标准曲线进行比较，则能够计算出样品中所含的禽流感病毒的含量。由于利用敏感芯片B检测是基于禽流感病毒内部蛋白与抗体相互作用的原理，所以需要对样品进行预处理(裂解)，将M1蛋白释放出来进行检测。
图3为利用抑制免疫检测法检测禽流感病毒的实时动态曲线，横坐标为时间，纵坐标不同时间点对应的响应值。利用一系列已知浓度的禽流感病毒进行上述实验，将所得一系列响应值作为纵坐标，禽流感病毒的浓度作为横坐标画图，即可得到标准曲线。
图4为利用抑制免疫检测法检测禽流感病毒的标准曲线。利用未知浓度的禽流感病毒样品进行上述实验，将此响应值与标准曲线进行比较，则能够计算出样品中所含的禽流感病毒的含量。
本发明基于直接免疫检测原理提供了配套试剂盒A，包括：SPR敏感芯片A，阴性及阳性对照，磷酸缓冲液，说明书。
本发明基于抑制免疫检测原理提供了配套试剂盒B，包括：SPR敏感芯片B，抗禽流感病毒抗体，裂解液，阴性及阳性对照，磷酸缓冲液，说明书。
所述SPR敏感芯片的基板材料为玻璃或塑料，基板表面有两层金属膜，包括下层铬膜，和上层金属膜为金膜或银膜，上层金属膜不限于金或银，上层金属膜的厚度为40-50nm，优选为45nm，下层铬膜厚度为3-7nm，优选为5nm。
SPR敏感芯片是在SPR裸金属片上固定特异性敏感膜而制成的，其制备过程如下：将表面的金属膜经过葡聚糖修饰的SPR敏感芯片用去离子水清洗，并将其表面吹干；将芯片浸泡在0.4M N-羟基琥珀酰亚胺(EDC)和0.1M N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳二亚胺(NHS)的混合液(1∶1；v／v)中，芯片表面进行活化10分钟，活化后用去离子水清洗后吹干；将禽流感病毒抗体用pH4.2-4.6醋酸缓冲液稀释至适当的浓度后，滴加在芯片表面以制备第一种SPR敏感芯片A；或将禽流感病毒抗原用pH值4.2-4.6醋酸缓冲液稀释至适当的浓度后，滴加在芯片表面以制备第二种SPR敏感芯片B；20℃反应5分钟；将芯片泡入1M乙醇胺溶液中反应10分钟，以灭活剩余的结合位点；快速将芯片用去离子水吹干，置于4℃保存。
其中，步骤1中样品前处理方法是将样品中的禽流感病毒部份或全部裂解后进行检测，以增强检测灵敏度，裂解液为Triton或SDS，工作浓度为10％-0.5％，优选为1％；温浴的温度为25-45度，优选为37度，温浴的时间10-90min，优选为30min；样品不经过裂解前处理也可以直接进行应急检测。
利用本发明提出的基于便携式SPR生化分析仪检测禽流感病毒的方法，被检测的禽流感病毒包括所有亚型的完整禽流感病毒颗粒或病毒碎片，以及以任何已知的方式获得的禽流感病毒结构蛋白。
利用本发明提出的基于便携式SPR生化分析仪检测禽流感病毒的方法，含有禽流感病毒的待测样品包括病毒培养物、咽喉试子、血清样品、水，但不限于这几类样品。
利用本发明跳出的基于便携式SPR生化分析仪检测禽流感病毒的方法，可作为一种判断环境样品(如河流、土壤、空气)是否被禽流感病毒污染方法。
本发明将更为细致地描述，并以以下的例子和实验作为参考，但不限于以下的例子和实验。在一个利用便携式表面等离子体谐振(SPR)生化分析仪检测禽流感病毒的实验中，只要是SPR敏感芯片表面的特异性敏感膜，能够特异性地结合禽流感病毒并且在便携式SPR生化分析仪中配套使用，各种变化和修饰都在本发明保护范围内，不背离本发明。本发明的保护范围不应限于此实施方式。
本发明实施例中提出的制备第一种SPR敏感芯片的方法包括：葡聚糖修饰SPR裸金属膜芯片的金属膜表面，然后用去离子水清洗，并将其表面吹干。将上述芯片浸泡在0.4M N-羟基琥珀酰亚胺(EDC)和0.1M N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳二亚胺(NHS)的混合液(1∶1；v／v)中10分钟，对芯片表面进行活化。活化后用去离子水清洗后吹干。将禽流感病毒抗体用pH值4.2-4.6醋酸缓冲液稀释至适当的浓度(ug／mL-mg／mL级)后，滴加在芯片表面，20℃反应20分钟。将芯片表面用去离子水清洗后，将芯片泡入1M乙醇胺溶液中反应10分钟，以灭活剩余的结合位点，制备出SPR敏感芯片A。将芯片用去离子水吹干，置于4℃保存。
本发明实施例中提出的制备第二种SPR敏感芯片的方法包括：葡聚糖修饰SPR裸金属膜芯片的金属膜表面，然后用去离子水清洗，并将其表面吹干。将上述芯片浸泡在0.4M N-羟基琥珀酰亚胺(EDC)和0.1M N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳二亚胺(NHS)的混合液(1∶1；v／v)中10分钟，对芯片表面进行活化。活化后用去离子水清洗后吹干。将禽流感病毒抗原用pH值4.2-4.6醋酸缓冲液稀释至适当的浓度((ug／mL-mg／mL级))后，滴加在芯片表面，20℃反应20分钟。将芯片表面用去离子水清洗后，将芯片泡入1M乙醇胺溶液中反应10分钟，以灭活剩余的结合位点，制备出SPR敏感芯片B。将芯片用去离子水吹干，置于4℃保存。
本发明实施例中提出的对待测样品进行前处理包括：在待测样品中加入裂解液(如1％Triton-X100，或1％SDS)，室温(20℃)放置30分钟。
用磷酸缓冲液稀释后的待测样品与抗禽流感病毒结构蛋白抗体混合后通入芯片表面反应10分钟，记录相对响应值，以相对响应值为纵坐标，禽流感病毒浓度为横坐标作图，绘制标准曲线。
用磷酸缓冲液稀释后的含有未知浓度病毒的样品与抗禽流感病毒抗体混合后通入芯片表面反应10分钟，记录相对响应值，所得的相对响应值与标准曲线相比，计算病毒含量。
本发明提出的上述方案中，对于禽流感病毒的检测不仅采用直接免疫法，还采用抑制免疫法。抑制免疫检测法是将禽流感病毒抗原固定在SPR敏感芯片的表面以构成敏感膜，将含有已知浓度禽流感病毒的样品与抗禽流感病毒抗体充份混合，然后注入SPR生化分析仪，产生响应值。利用一系列已知浓度的禽流感病毒进行上述实验，将所得一系列响应值作为纵坐标，禽流感病毒的浓度作为横坐标画图，即可得到标准曲线。利用未知浓度的禽流感病毒样品进行上述实验，将此响应值与标准曲线进行比较，则能够计算出样品中所含的禽流感病毒的含量。
直接免疫法是将禽流感病毒抗体固定在SPR敏感芯片的表面以构成敏感膜，将含有已知浓度禽流感病毒的样品注入SPR生化分析仪，产生响应值。利用一系列已知浓度的禽流感病毒进行上述实验，将所得一系列响应值作为纵坐标，禽流感病毒的浓度作为横坐标画图，即可得到标准曲线。利用未知浓度的禽流感病毒样品进行上述实验，将此响应值与标准曲线进行比较，则能够计算出样品中所含的禽流感病毒的含量。直接检测法：操作简单，只需要将样品通入SPR敏感芯片表面即可；表面包被的物质为禽流感病毒抗体，SPR敏感芯片的保质期限低于抑制检测法所使用的SPR敏感芯片。
抑制免疫法：操作过程较直接法略微复杂，需要将样品与抗体混合后再通入SPR敏感芯片表面。SPR敏感芯片表面包被的物质为禽流感病毒抗原，因此该SPR敏感芯片的保质期限高于直接检测法所使用的SPR敏感芯片。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种禽流感病毒检测方法，其包括：
步骤1、将从环境中获取的待测样品注入SPR生化分析仪；
步骤2、在所述SPR生化分析仪中，待测样品在SPR敏感芯片表面反应预定时间；
步骤3、SPR生化分析仪计算出禽流感病毒的浓度数值，并根据预先设定的警戒值进行报警或不报警；
其中，所述SPR敏感芯片为其表面固定有禽流感病毒抗体或禽流感病毒抗原的SPR金属片。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述SPR敏感芯片表面固定有禽流感病毒抗体时，步骤1中所述待测样品直接注入SPR分析仪。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述SPR敏感芯片表面固定有禽流感病毒抗原时，所述待测样品需要进行预处理，并与禽流感病毒抗体混合后注入SPR分析仪。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述预处理包括将待测样品经过裂解液裂解并温浴一段时间后注入SPR生化分析仪。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中，SPR分析仪通过检测SPR敏感芯片表面的折射率的变化而检测禽流感病毒。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述固定在SPR敏感芯片上的禽流感病毒抗体为针对禽流感病毒表面蛋白NA的抗体，所述固定在SPR敏感芯片上的禽流感病毒抗原是指禽流感内部蛋白M1。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述SPR敏感芯片为其基板为玻璃或塑料，基板表面有两层金属膜，下层为铬膜，上层为金膜或银膜，上层金膜或银膜的厚度为40-50nm，下层铬膜的厚度为3-7nm。
8.如权利要求1所述的方法，其中，在所述SPR敏感芯片上固定禽流感病毒抗体或抗原的过程如下：
将表面的金属膜经过葡聚糖修饰的SPR敏感芯片用去离子水清洗，并将其表面吹干；将SPR敏感芯片浸泡在0.4M N-羟基琥珀酰亚胺(EDC)和0.1M N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳二亚胺(NHS)的混合液中，SPR敏感芯片表面进行活化10分钟，活化后用去离子水清洗后吹干；将禽流感病毒抗体用pH4.2-4.6醋酸缓冲液稀释至适当的浓度后，滴加在芯片表面以制备固定有禽流感病毒抗体的SPR敏感芯片，或将禽流感病毒抗原用pH值4.2-4.6醋酸缓冲液稀释至适当的浓度后，滴加在芯片表面以制备固定有禽流感病毒抗原的SPR敏感芯片；20℃反应5分钟；将芯片泡入1M乙醇胺溶液中反应10分钟，以灭活剩余的结合位点；快速将芯片用去离子水吹干，置于4℃保存。
9.如权利要求4所述的方法，其中，所述裂解液为Triton或SDS，工作浓度为10％-0.5％；温浴的温度为25-45度，温浴的时间10-90分钟。
10.如权利要求1所述的方法，其中，被检测的禽流感病毒包括所有亚型的完整禽流感病毒颗粒或病毒碎片，以及以任何已知的方式获得的禽流感病毒结构蛋白；所述待测样品包括水、土壤或空气。
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