ES2241264T3

ES2241264T3 - Metodo para el analisis de una muestra por medio de una prueba de la reaccion de enlace por electroquimiluminiscencia.

Info

Publication number: ES2241264T3
Application number: ES99907282T
Authority: ES
Inventors: Martin Egger; Gabriele Punzmann; Gunter Muller; Ursula Pauselius-Fuchs
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1998-01-30
Filing date: 1999-01-23
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2019-01-23
Also published as: EP1051621A1; ATE293791T1; JP2002502035A; US6599473B1; DE19803528A1; JP4388693B2; EP1051621B1; DE59911941D1; WO1999039206A1

Abstract

Método para el análisis de una muestra líquida, en particular, de un líquido del cuerpo, en lo que se refiere a una sustancia que en ella se encuentra, por medio de un procedimiento basado en una reacción de enlace o unión de electroquimiluminiscencia, en el cual transcurre una secuencia de reacciones que como mínimo incluye una reacción de enlace bioquímica específica y conduce a la formación de un complejo característico para el análisis, que contiene una sustancia trazador quimiluminiscente, y a la unión del complejo con la micropartícula magnética y en una célula de medida(2) con un electrodo de trabajo(4) para la determinación de la concentración de las micropartículas marcadas transcurre un ciclo de detección con una secuencia que consta de los pasos siguientes: - una etapa de limpieza (20), en la que en el electrodo de trabajo(4) se aplica un potencial oxidante(C1O) y/o reductor (C1R) fuerte adecuado para la limpieza electroquímica, - una etapa de acondicionamiento(22), en la que seaplica al electrodo de trabajo una secuencia de pulsos de potencial variante reductor y oxidante (CO1, CR1, CO2, CR2...), - una etapa de captación(23), en la que la muestra con las micropartículas contacta de tal modo con el electrodo de trabajo (4), que las micropartículas por la acción del campo magnético de un imán colocado en el lateral del electrodo de trabajo(4) alejado de la muestra se depositan en una zona de depósito o sedimento(4a) del electrodo de trabajo dirigida a la muestra. - una etapa de medición(21), en la que se aplica un potencial en el electrodo de trabajo que estimula o excita la reacción de ECL y se mide la luz procedente de la sustancia marcador a consecuencia de la electroquimiluminiscencia, para determinar la concentración de la sustancia marcador en la zona de sedimento (4a) del electrodo de trabajo(4), que se caracteriza porque, para la mejora de la deposición uniforme de micropartículas entre la etapa de acondicionamiento (22) y la etapa de captación (23) se añade un pulso de potencial adicional (DIP) con un potencial oxidante o reductor en el desarrollo de la tensión del ciclo de detección, en el que el pulso de potencial (DIP) adicional antes de que el electrodo de trabajo (4) entre en contacto (momento tp) con la muestra se reduzca a un potencial neutro, ni oxidante ni reductor.

Description

Método para el análisis de una muestra por medio de una prueba de la reacción de enlace por electroquimiluminiscencia.

La invención se refiere a un método para el análisis de una muestra respecto a una sustancia que en ella se encuentra.

En el análisis de una muestra líquida generalmente se pretende calcular (análisis cuantitativo) la concentración de una sustancia (análito) contenida en ella. En la mayoría de casos es suficiente una afirmación de si el análito (en una concentración que se encuentra por encima del valor límite) se encuentra en la muestra (análisis cualitativo). En el campo de la medicina, al que especialmente se refiere la invención, tiene un papel muy importante el análisis de líquidos corporales (sobre todo sangre, suero sanguíneo y orina), de los análitos contenidos en ellos como, por ejemplo, hormonas, anticuerpos, antígenos o medicamentos.

La invención estudia la mejoría de un tipo determinado de método de análisis, que sintetizando puede denominarse análisis de la reacción de enlace por electroquimiluminiscencia (a continuación se denomina "ECL-BBA" el análisis del enlace o unión bioquímica por electroquimiluminiscencia). Dicho método presenta las características siguientes.

a) El fundamento de la selectividad analítica es una reacción de enlace bioquímica específica con la participación de sustancias bioquímicas, que únicamente son capaces de enlazar unas con otras de forma selectiva. A ellas pertenecen sobre todo las reacciones de enlace inmunoquímico entre anticuerpos y antígenos o haptenos, con los cuales los anticuerpos se enlazan de forma específica. Otras reacciones de enlace bioquímicas son los enlaces proteínicos, en particular entre avidina y biotina, el enlace de lectina-hidrato de carbono, el enlace entre receptores y ligandos y la hibridación de ácidos nucleicos.

Dichas reacciones de enlace bioquímicas específicas se han empleado desde hace tiempo para fines analíticos. Existen numerosos procesos de reacción distintos de una o varias etapas ("protocolos de ensayo"), que en definitiva con la participación del análito y de cómo mínimo una sustancia que se enlaza de forma específica contenida en el sistema de reactivos ("reactivo de enlace")conducen a la formación de un complejo característico para el análisis. Este complejo contiene en general (pero no necesariamente) el análito.

b) Para que el complejo, cuya concentración constituye una medida del resultado analítico buscado, pueda ser detectable se emplea generalmente una sustancia marcador ("etiqueta o trazador"), que se acopla a un reactivo de enlace del sistema de reactivos, por ejemplo un anticuerpo. La unidad de sustancia marcador y reactivo de enlace se denomina conjugado.

La invención se refiere a un método, en el cual la sustancia marcador es apta para una reacción de ECL. Si dicha sustancia se expone a un electrodo voltamétrico a un potencial eléctrico adecuado, emite luz que puede medirse fotométricamente. En general, en esta reacción participa una segunda sustancia electroquímicamente activa, que se denomina "precursor". En la práctica, se emplea como etiqueta o trazador de la ECL sobre todo un complejo de rutenio (rutenio-tris(bipiridilo)), en combinación con la TPA (tripropilamina) como precursor. Ambas sustancias electroquímicamente activas reaccionan en el electrodo, respectivamente, emitiendo un electrón dando una especie fuertemente reductora o bien oxidante. La siguiente reacción redox lleva al trazador de ECL a un estado excitado, del cual recae en el estado básico por la emisión de un fotón. La reacción del trazador de ECL es preferiblemente una reacción en círculo, de manera que una única molécula trazador emite una multitud de fotones tras aplicar una tensión en el electrodo.

c) En el método, al que se refiere la invención, las moléculas del complejo características para el análisis marcadas con ECL, se fijan a micropartículas magnéticas ("Beads"). En la práctica, se emplean bolitas de poliestireno magnetizadas con un diámetro de típicamente unos 2 hasta 3 \mum. La fijación se realiza por medio de un par de elementos del enlace bioquímico específico, destacando en particular el par estreptavidina-biotina. Las Beads se recubren de polímero de estreptavidina. A la molécula del complejo se enlaza la biotina.

Las Beads con el complejo marcado unido a ellas se colocan en la célula de medición de un aparato medidor, que presenta los electrodos necesarios (en general, un electrodo de trabajo, un contraelectrodo y, en particular en el caso de un principio de medición potenciométrico, un electrodo de referencia) para crear el campo eléctrico requerido para estimular la reacción de ECL. En un campo magnético de un imán dispuesto bajo el electrodo de trabajo se disponen las Beads en la superficie del electrodo de trabajo. Puesto que esto habitualmente tiene lugar en células de paso en el caso de una muestra líquida que circula de forma continuada, la deposición de las cuentas producida magnéticamente se denomina "captación".

Tras la etapa de captación se efectúa generalmente una etapa de lavado, en la cual un líquido de lavado se hace circular por el electrodo de trabajo y elimina los componentes perturbadores. Después se aplica un potencial eléctrico requerido para activar la reacción de ECL y se mide la luz luminiscente resultante por medio de un fotorreceptor apropiado. La intensidad de la luz de luminiscencia es una medida de la concentración de las Beads marcadas en la superficie del electrodo de trabajo y ésta de nuevo es una medida de la concentración del análito en la muestra. Para calcular la concentración buscada de la señal de luminiscencia medida sirve una calibración.

Se comentan y se describen en la literatura numerosas variantes diferentes de este tipo de método de ECL-BBA, en el que las alteraciones o variaciones pueden referirse a cada uno de los aspectos parciales mencionados.

En cuanto al aspecto parcial a) las pruebas o ensayos se distinguen por los diferentes protocolos de ensayo (por ejemplo, el ensayo sándwich y el ensayo competitivo, respectivamente en una diversidad de subvariantes posibles). Existe una diferencia fundamental entre el ensayo homogéneo, que no requiere ninguna separación entre las moléculas de complejo formadas y el conjugado que no forma complejo y el ensayo heterogéneo, en el cual dicha separación ligado/libre es necesaria. La presente invención es aplicable a los protocolos de ensayo más diferentes, siempre que de algún modo transcurra una serie de reacciones, que como mínimo englobe una reacción de enlace bioquímica específica y conduzca a la formación de un complejo característico para el análisis, que esté marcado con el trazador de ECL.

En cuanto al aspecto parcial b), la invención es de aplicación universal, es decir, independiente del trazador o etiqueta de ECL empleada y de otros componentes eventuales de la reacción de ECL. Se ha experimentado especialmente para los ensayos en los cuales el mencionado complejo de rutenio se emplea unido al TPA.

En lo que se refiere al aspecto parcial c) la invención se dirige exclusivamente al ensayo, en el que el complejo característico para el análisis está ligado a micropartículas magnéticas y estas micropartículas son depositadas en un campo magnético de un imán en la superficie de un electrodo de trabajo. Por lo demás, la invención también depende de las variaciones del aspecto parcial c) y por ejemplo, puede utilizarse con materiales y tamaños distintos de Beads así como con distintos métodos para fijar el complejo a los Beads.

Información más detallada sobre el método de ECL-BBA puede extraerse de la literatura pertinente. Se hace especial referencia a las publicaciones siguientes, cuyo contenido se refiere al componente de la presente descripción:

1): G.F. Blackburn et al. "Electrochemiluminiscence Detection for Development of Immunoassays and DNA Probe Assays for Clinical Diagnostics", Clin. Chem. 37 (1991), 1534-1539

2): J.K. Leland und M.J. Powell: "Electrogenerated Chemiluminiscence: An oxidative-reduction type ECL Reaction Sequence using tripropyl amine", J. Electrochem. Soc., 137 (1990), 3127-3131

3): J.H. Kenten et al.,: "Improved Electrochemiluminiscent Label for DNA Probe Assays: Rapid Quantitative Assays of HIV-1 Polymerase Chain Reaction Products", Clin. Chem. 38 (1992), 873-879

4): N.R. Hoyle: "The Application of Electrochemiluminiscence to Immunoassay-based Analyte Measurement" in "Bioluminiscence and Chemiluminiscence"; Proceedings of the 8^{th} International Symposium on Bioluminiscence and Chemiluminiscence, Cambridge, September 1994, A.K. Campbell et al.(edit.), John Wiley & Sons

5): WO 89/10551

6): WO 90/11511

Tal como se ha mencionado, la medición de la luz de ECL habitualmente tiene lugar en una célula de medición del flujo. Esta contiene un estrecho canal para la circulación del líquido de prueba, en el que el electrodo de trabajo está situado en una de las paredes que limitan el canal de flujo. Para poder medir con la misma célula de medida las diferentes muestras una tras otra, la célula, y en particular el electrodo de trabajo, se deben limpiar de las Beads y otro tipo de impurezas depositadas en los mismos entre cada una de las mediciones. Este proceso de limpieza debe ser rápido y eficaz para garantizar un elevado rendimiento del aparato de análisis y una buena exactitud del análisis.

La limpieza se lleva a cabo, por tanto, no solo físicamente (paso de burbujas de aire) y químicamente (paso de un líquido de limpieza, que contiene entre otras cosas detergentes), sino que también electroquímicamente, aplicando un potencial fuertemente oxidante y/o reductor en el electrodo de trabajo. El potencial es generalmente tan elevado, que en la superficie del electrodo de trabajo se forman burbujas de gas. Gracias a ello la limpieza resulta eficaz, pero el equilibrio electroquímico de la superficie del electrodo se ve alterado tan fuertemente que se requiere una etapa de acondicionamiento en conexión a la etapa de limpieza, en la cual se aplica una secuencia de pulsos al electrodo de trabajo, que cubre todo el margen de trabajo del potencial del material correspondiente del electrodo.

En la célula se lleva a cabo, a consecuencia de ello, un ciclo de detección, que comprende sucesivamente una etapa de limpieza, una etapa de acondicionamiento, una etapa de captación y una etapa de medición. Durante la etapa de limpieza y de acondicionamiento un líquido de limpieza o bien de acondicionamiento se encuentra en la célula. El líquido de prueba con las Beads es conducido al principio de la etapa de captación a la célula de medición del flujo. En las pruebas o ensayos heterogéneos se añade una etapa de lavado adicional entre la etapa de captación y la etapa de medición. El ciclo de detección se explica con detalle en las citas bibliográficas 1) hasta 6), sobre todo en el documento WO 89/10551.

El método ECL-BBA se caracteriza, en comparación con otros métodos de análisis, que se basan en el enlace específico del componente bioquímico, por una manipulación simple, una sensibilidad elevada, un gran campo dinámico de las concentraciones medibles, un análisis económico y una capacidad de automatización buena (con los aparatos de análisis correspondientes).

Para alcanzar un incremento mayor en la exactitud del análisis, se ha propuesto un método conforme a la reivindicación 1.

La relación entre un desarrollo de la tensión que se produce en el electrodo de trabajo durante el ciclo de detección y la calidad del análisis se comenta en el documento WO 89/10551 (cita 5). Después debe ajustarse un valor del potencial constante para mejorar la reproducibilidad del resultado del análisis al final de la etapa de acondicionamiento, que se conoce como "potencial preoperativo". Este "potencial preoperativo" debe mantenerse constante hasta que el electrodo de trabajo entre en contacto con el líquido de prueba y se realice la medición del ECL. El "potencial preoperativo" debe ser o bien un potencial oxidante o un potencial reductor dependiendo del material del electrodo de trabajo y dependiendo de los electrolitos empleados.

En el ámbito de la invención se ha constatado que en contraposición a la teoría de la cita 5), puede conseguirse una mejora esencial de la deposición uniforme de las Beads en la superficie del electrodo de trabajo y por tanto una mejora de la reproducibilidad y exactitud del análisis, cuando en el desarrollo de la tensión del ciclo de detección se añade el pulso de potencial adicional. Básicamente se trata de que por un lado este consigue un potencial oxidante o reductor y por otro lado se reduce a un potencial neutro (ni oxidante ni reductor), antes de que la muestra sea conducida a la célula de medición y por tanto sea puesta en contacto con el electrodo de trabajo.

Mientras que mediante el "potencial preoperativo" del documento WO 89/10551 pueden verse influenciados los componentes decisivos de la muestra para la creación de la señal del ECL, según la invención se consigue una mejoría considerable mediante un pretratamiento electroquímico adicional del electrodo. Que de todo ello resulte una mejoría de la deposición de las Beads es algo inesperado, porque se debería aceptar que la distribución de Beads depende de las propiedades del campo magnético, mientras que las medidas electroquímicas de acondicionamiento y limpieza tienen como objetivo mejorar la creación de señales.

Un pulso de potencial en este sentido es un cambio a corto plazo de la tensión aplicada al electrodo de trabajo, durante el cual se consigue un valor del potencial oxidante o reductor, en el que la tensión eléctrica se encuentra en un campo neutro antes y después del pulso de potencial. La forma del desarrollo del potencial no se produce. No es pues necesario que el desarrollo de la tensión tenga una forma definida geométricamente (por ejemplo, rectángulo, triángulo o función escalonada).

Como potencial oxidante se designa un potencial eléctrico del electrodo de trabajo, en el cual su superficie en contacto con el líquido de acondicionamiento está oxidada. De acuerdo con ello, un potencial es reductor cuando una reducción electroquímica de la superficie metálica del electrodo de trabajo actúa en contacto con el líquido de acondicionamiento. Un potencial es neutro cuando prácticamente no se forma ninguna capa de óxido o bien híbrida en una superficie metálica brillante.

Este estado se denomina zona de doble capa del metal correspondiente.

Los valores en general válidos para el potencial máximo del pulso adicional y para el valor del potencial, al cual se atribuye su potencial, no pueden ser publicados porque estos valores del potencial dependen del material del electrodo de trabajo, del electrodo de referencia, al cual se refiere el potencial (y en menor grado) de la composición del líquido de acondicionamiento. El experto puede extraer información más detallada de los datos publicados, en particular de los ciclovoltamogramas del material del electrodo empleado. En cualquier caso, los valores pueden ser determinados de forma experimental de un potencial oxidante, reductor o neutro.

La invención se explica con más detalle a continuación con ayuda de un ejemplo de ejecución representado esquemáticamente en las figuras. Se muestran:

Figura 1 una representación esquemática de la unidad de detección de un aparato de análisis ECL-BBA,

Figura 2 una representación gráfica del desarrollo del potencial en el electrodo de trabajo durante un ciclo de detección

Figura 3 un ciclovoltamograma de un electrodo de platino.

La unidad de detección representada en la figura 1 constituye aquella parte de un aparato de análisis, que realiza automáticamente el ciclo de detección. Además, dicho aparato de análisis presenta unidades para llevar a cabo la secuencia de la reacción, que conduce a la formación de un complejo marcado con un trazador de ECL (cuya concentración es característica para el análisis) y a su enlace con las micropartículas magnéticas. Estas partes no se representan en la figura 1.

El núcleo de la unidad de detección 1 es una célula de paso de flujo electroquímico 2, en la cual en un canal estrecho de paso 3 se disponen un electrodo de trabajo 4 y un contraelectrodo 5 de tal manera que contactan por un líquido que circula por el canal de paso 3. El contraelectrodo 5 está colocado preferiblemente, tal como se ha representado, frente al electrodo de trabajo 4 (es decir, en el lado situado enfrente del canal de flujo 3). Un electrodo de referencia 7 esta colocado en la tubería del líquido marcada con 8 de la unidad de detección 1, generalmente por fuera del canal de flujo 3. Para aspirar el líquido se emplea frecuentemente una bomba de émbolo de movimiento alternativo de precisión 9, que se incorpora río abajo desde la célula de paso a la tubería del líquido 8.

Río arriba desde la célula de flujo 2 se conectan a la tubería 8 varios recipientes de líquido, de los cuales el líquido probablemente puede ser absorbido a la célula de paso 2, por ejemplo por medio de una válvula de varios pasos 10. En un caso representado, estos son un recipiente 12 con líquido de limpieza, un recipiente 13 con líquido de acondicionamiento y un recipiente 14 con líquido de prueba. El recipiente del líquido de prueba 14 tiene habitualmente la forma de un tubo de ensayo (tubo de reacción) y se encuentra en un rotor de mecanizado 15, en el que tienen lugar también los pasos necesarios para efectuar las reacciones de enlace. De los tubitos de ensayo colocados en el rotor de mecanizado 15 se representa con claridad únicamente la mitad de uno.

En la célula de medición del flujo 2 se ha dispuesto un imán 17 en el lateral del electrodo de trabajo 4 alejado del canal de flujo 3. En un caso representado, se trata de un imán permanente, el cual por medio de una mecánica de movimiento 18 se desplaza de la posición de captación representada (en la cual al menos uno de sus polos, a ser posible el más cercano, está en el electrodo de trabajo 4) a una posición de reposo alejada del electrodo de trabajo 4. Alternativamente puede emplearse también un electroimán conectable y desconectable.

En el lateral del canal de flujo 3 situado frente a la zona de captación 3a se ha colocado un fotomultiplicador como detector de luz 19 de manera que su área fotosensible transcurre paralelamente a la superficie del electrodo de trabajo 4 dirigida hacia el canal de flujo 3 (y que se aleja del imán 17) denominada zona de deposición 4a.

Para el manejo del aparato y el tratamiento de la señal del fotodetector 19 se ha previsto una unidad electrónica 16, a la que están conectados los elementos de la unidad de detección 1 (se representan de forma únicamente parcial los tubos de conexión).

Para el funcionamiento de la unidad de detección 1 es esencial que durante cada una de las etapas del proceso de un ciclo de detección, el desarrollo del potencial aplicado al electrodo de trabajo 4 (respecto al líquido que está en contacto con éste y por tanto respecto al electrodo de referencia) presente unas características determinadas, que se explican con detalle a continuación con ayuda de la representación gráfica de dicho desarrollo del potencial en la figura 2. La figura se refiere a una forma de ejecución con un electrodo de trabajo de platino. Los valores de la tensión U que se indican en las ordenadas se miden frente a un electrodo de referencia Ag/AgCl y se aplican frente a un tiempo t en segundos. El ciclo de detección se repite del mismo modo para cada análisis. La siguiente descripción empieza con la etapa de limpieza.

Se lleva a cabo una etapa de limpieza 20 después de la medición para liberar la zona de deposición 4a del electrodo de trabajo 4 de las Beads adheridas al mismo y de las diversas impurezas o alteraciones de la superficie del electrodo. Para ello se aplica un potencial fuerte oxidante y/o reductor C1O o bien C1R al electrodo de trabajo como soporte electroquímico del proceso de limpieza, cuyo valor del potencial es generalmente superior a cualquier otro potencial (oxidante o reductor) del ciclo de detección. Es preferible, tal como se ha representado, un potencial oxidante C1O, cuyo valor sea superior al potencial asimismo oxidante de la etapa de medición previa 21. En el caso representado, la etapa de limpieza contiene dos pulsos reductores más pequeños C1R1 y C2R2. Sin embargo, esto no es obligatorio. La invención es apropiada para cada ciclo de detección en el cual durante la etapa de limpieza se aplique un potencial oxidante o reductor al electrodo de trabajo, que sea tan fuerte que seguidamente para crear de nuevo un equilibrio electroquímico se necesite una etapa de acondicionamiento. Durante toda la etapa de limpieza se hace circular por medio de la bomba 9 el líquido de limpieza desde el recipiente 12 a través de la tubería 8 y por tanto a través del canal de paso 3.

La etapa de acondicionamiento siguiente 22 sirve para que después de la etapa de limpieza 20 se recupere el equilibrio electroquímico requerido en la superficie del electrodo. Con esta finalidad, se aplica una secuencia de pulsos de potencial reductores y oxidantes al electrodo de trabajo, que aparecen en la figura 2 como CO1, CR1, CO2, CR2, CO3 y CR3.

A ser posible la secuencia de pulsos de acondicionamiento - tal como se representa - consta de una serie periódica de pulsos de potencial oxidantes y reductores, en la que se prefiere especialmente un número par de pulsos de potencial reductores y oxidantes. La duración de cada pulso de acondicionamiento es en la práctica menor a un segundo, y se prefieren los valores menores de 0,7 segundos y mayores de 0,1 segundo y muy especialmente los valores entre aproximadamente 0,3 segundos y 0,5 segundos.

Para la invención lo característico es que en conexión con la etapa de acondicionamiento 22 y antes del punto t_{p} indicado en la figura 2, en el que se bombea la muestra desde el recipiente de muestras 14 a través de la válvula 10 en el canal de flujo 3 (por tanto las Beads que se encuentran en el líquido de prueba se ponen en contacto con el electrodo de trabajo 4), se añada un pulso de potencial al desarrollo de la tensión del ciclo de detección, que se caracteriza en la figura 2 con DIP como "pulso para mejorar la deposición". Esto pulso de potencial adicional es tan elevado que, para un periodo de duración muy corto eficaz para la influencia electroquímica de la superficie del electrodo (preferiblemente como mínimo de unos 0,05 segundos, se prefiere en particular como mínimo de 0,1 segundos) alcanza un valor de potencial oxidante o reductor. Además es esencial que el potencial antes del punto t_{p} se reduzca a un valor de potencial neutro (ni oxidante ni reductor). Se prefiere especialmente el caso representado de un DIP oxidante, en el que de nuevo preferiblemente a un pulso de potencial reductor CR previo sigue una etapa de acondicionamiento 22.

Resulta preferible que el pulso de potencial adicional DIP tenga la misma polaridad que el desarrollo del potencial, que excita la reacción de ECL durante la etapa de medición 21, en la que el valor máximo del pulso de potencial adicional DIP es inferior al valor máximo del desarrollo del potencial que estimula la reacción de ECL.

En el marco de la invención se ha constatado que por medio del DIP es posible preparar de forma óptima la superficie del electrodo para la etapa de captación y al mismo tiempo ajustar o coordinar las propiedades de los Beads (por ejemplo, las propiedades superficiales, el potencial zeta, la adherencia, etc.). Mediante la optimización experimental del DIP se puede ajustar la muestra de deposición de manera que equivalga de forma óptima a las exigencias de un método de detección del ECL.

En el empleo de un electrodo de trabajo de platino el valor máximo del pulso de potencial DIP adicional equivale preferiblemente a una tensión de cómo mínimo 0,6 V, preferiblemente de cómo mínimo 0,8 V, frente a un electrodo de referencia de Ag/AgCl. Por lo que es preferible que el valor máximo del pulso de potencial adicional DIP corresponda a una tensión de cómo máximo 1,6 V, preferiblemente cómo máximo 1,2V, frente a un electrodo de referencia de Ag/AgCl.

En el momento t_{p} el imán 17 se encuentra en la posición de captación representada en la figura 1. Las micropartículas que circulan por el canal de paso 3 con el líquido de prueba son depositadas en la superficie del electrodo de trabajo por la acción de su campo magnético. Durante la etapa de captación 23 e incluso durante la etapa de lavado 24 siguiente, el potencial del electrodo de trabajo se encuentra preferiblemente - tal como se representa - en una zona neutra. En el método anteriormente conocido el electrodo de trabajo está separado de los potenciostatos durante estas etapas, es decir se encuentra en un potencial no definido. Conforme al documento WO 89/10551, en este segmento del ciclo de detección el "potencial preoperativo" allí descrito, es decir un potencial oxidante o reductor constante, se aplica al electrodo de trabajo 4.

Visto desde el potencial del electrodo de trabajo, la etapa de captación 23 y la etapa de lavado 24 así como la etapa de medición 21 siguiente se realizan de forma habitual, y en el punto t_{w} se conecta la válvula de varios pasos 10 de manera que en lugar del líquido de prueba el líquido de acondicionamiento es absorbido del recipiente 13 a la tubería 8, el cual sirve asimismo como líquido de lavado para la separación ligado/libre.

En lugar de un pulso de potencial DIP adicional pueden añadirse varios pulsos de potencial entre la etapa de acondicionamiento 22 y la etapa de captación 23 en el desarrollo de la tensión del ciclo de detección, por lo que preferiblemente todos los DIPs son reductores o bien oxidantes. La duración total del tiempo en la cual un DIP o bien varios DIPs se encuentran en una zona oxidante o reductora debería ser como mínimo de 0,05 segundos en cada ciclo de detección, preferiblemente de cómo mínimo 0,1 segundos y como máximo de un segundo, preferiblemente como máximo de 0,3 segundos.

La figura 3 muestra un voltamograma cíclico de un electrodo de platino. Este tipo de mediciones se realiza habitualmente siempre que el potencial aplicado al electrodo frente a un electrodo de referencia varía en una forma triangular y por tanto las curvas de corriente/tensión se registran del modo representado. El ciclovoltamograma aquí representado es el resultado de la medición de un electrodo de platino en contacto con una solución de ácido sulfúrico 1M. Los valores de la tensión que se indican en las abscisas se refieren a un electrodo normal de hidrógeno. En las ordenadas se representa un flujo de corriente I en mA/cm^{2}.

Observando el desarrollo de la corriente-tensión que procede del punto A en la dirección de la flecha, el potencial se encuentra inicialmente en una zona, en la que solamente fluye una corriente apenas medible, que es causada por la carga de una capa doble. Esta zona se designa en la literatura angloparlante como "double-layer region". En la zona de la curva B el flujo de corriente aumenta fuertemente. Aquí se alcanza un valor del potencial oxidante en el sentido de la presente invención, es decir, la superficie de platino se oxida electroquímicamente. El área bajo la curva corresponde a la cantidad de carga consumida para la oxidación.

Cuando la tensión aplicada al electrodo disminuye tras conseguir un valor máximo (aquí es de unos 1,5 V), el flujo de corriente es de nuevo escaso, pero luego aumenta de nuevo en la zona en la que se agota la capa de óxido (zona de la curva C). Tras la descomposición de la capa de óxido la intensidad de la corriente en la zona de la doble capa cae de nuevo cerca de cero, hasta que la tensión alcanza un valor, en el cual se produce una reducción del platino (antes básicamente puro). Esta subida en la zona de la curva D marca un valor de potencial reductor en el sentido de la presente invención. La zona de tensión entre el potencial oxidante y el reductor se denomina zona N o neutra. Tras la vuelta del potencial a unos 0,1 V, la capa de reducción en la superficie del platino en la zona de la curva E se desintegra.

Ejemplo

Con un aparato Elecsys 2010 de Boehringer Mannheim GmbH se han realizado ensayos comparativos para comparar los resultados con y sin DIP. El ciclo de detección correspondía al de la figura 2, en el que en los ensayos con DIP se añadía un impulso oxidante adicional en forma rectangular con una altura de impulso de + 0,9V y una duración del impulso de 0,2 seg. Para un ensayo de PSA (PSA = antígeno específico de la próstata) se daban los valores siguientes sin DIP.

TABLA 1

1

Con DIP se obtenía los valores siguientes:

TABLA 2

2

Las abreviaciones de las columnas tienen el significado siguiente:

Conc: Concentración teórica de la muestra de calibración empleada

N: Número de mediciones realizadas

MW: Valor medio de la señal de medición en unidades arbitrarias

VK: Coeficiente de variación de la señal en tanto por ciento

Se observa que el DIP conduce a una mejoría esencial de la dinámica de la señal (cociente del MW máximo y mínimo). Este valor es con DIP de 909 y por tanto aproximadamente un 25% mayor que sin DIP (726). Además mejora notablemente la precisión que se expresa por medio de la altura del coeficiente de variación VK.

Mediante la observación visual y las imágenes de vídeo durante el ciclo de análisis se puede constatar que las Beads se depositan básicamente de forma estable. Sin DIP se produce un desplazamiento de las Beads durante la etapa de lavado, que es perjudicial para la exactitud de la medición, especialmente porque lleva a pérdidas de las Beads ya depositadas del electrodo de trabajo.

Claims

1. Método para el análisis de una muestra líquida, en particular, de un líquido del cuerpo, en lo que se refiere a una sustancia que en ella se encuentra,

por medio de un procedimiento basado en una reacción de enlace o unión de electroquimiluminiscencia,

en el cual transcurre una secuencia de reacciones que como mínimo incluye una reacción de enlace bioquímica específica y conduce a la formación de un complejo característico para el análisis, que contiene una sustancia trazador quimiluminiscente, y a la unión del complejo con la micropartícula magnética

y en una célula de medida(2) con un electrodo de trabajo(4) para la determinación de la concentración de las micropartículas marcadas transcurre un ciclo de detección con una secuencia que consta de los pasos siguientes:

-: una etapa de limpieza (20), en la que en el electrodo de trabajo(4) se aplica un potencial oxidante(C1O) y/o reductor (C1R) fuerte adecuado para la limpieza electroquímica,

-: una etapa de acondicionamiento(22), en la que se aplica al electrodo de trabajo una secuencia de pulsos de potencial variante reductor y oxidante (CO1, CR1, CO2, CR2...),

-: una etapa de captación(23), en la que la muestra con las micropartículas contacta de tal modo con el electrodo de trabajo (4), que las micropartículas por la acción del campo magnético de un imán colocado en el lateral del electrodo de trabajo(4) alejado de la muestra se depositan en una zona de depósito o sedimento(4a) del electrodo de trabajo dirigida a la muestra.

-: una etapa de medición(21), en la que se aplica un potencial en el electrodo de trabajo que estimula o excita la reacción de ECL y se mide la luz procedente de la sustancia marcador a consecuencia de la electroquimiluminiscencia, para determinar la concentración de la sustancia marcador en la zona de sedimento (4a) del electrodo de trabajo(4),

que se caracteriza porque,

para la mejora de la deposición uniforme de micropartículas entre la etapa de acondicionamiento (22) y la etapa de captación (23) se añade un pulso de potencial adicional (DIP) con un potencial oxidante o reductor en el desarrollo de la tensión del ciclo de detección, en el que el pulso de potencial (DIP) adicional antes de que el electrodo de trabajo(4) entre en contacto (momento t_{p}) con la muestra se reduzca a un potencial neutro, ni oxidante ni reductor.

2. Método conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza porque el pulso de potencial último que precede al pulso de potencial adicional (DIP) de la etapa de acondicionamiento (22) es un pulso de potencial reductor
(CR3).

3. Método conforme a una de las reivindicaciones 1 ó 2, que se caracteriza porque el pulso de potencial adicional (DIP) es un pulso de potencial oxidante.

4. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque en la etapa de acondicionamiento se aplican pulsos de potencial oxidante (CO1, CO2..) y reductor (CR1, CR2,..) alternativamente, en el electrodo de trabajo(4).

5. Método conforme a la reivindicación 4, que se caracteriza porque el número de pulsos de potencial reductor y oxidante es el mismo.

6. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque el pulso de potencial adicional (DIP) tiene la misma polaridad que el desarrollo del potencial que estimula la reacción de ECL durante la etapa de medición (21) y el valor máximo del pulso de potencial adicional (DIP) es menor que el valor máximo del desarrollo del potencial que estimula la reacción de ECL.

7. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque el electrodo de trabajo es un electrodo de platino y el valor máximo del pulso de potencial adicional (DIP) corresponde a una tensión de cómo mínimo 0,6 V, preferiblemente como mínimo 0,8 V, frente a un electrodo de referencia de Ag/AgCl.

8. Método conforme a la reivindicación 7, que se caracteriza porque el valor máximo del pulso de potencial adicional (DIP) equivale a una tensión de cómo mínimo 1,6 V, preferiblemente como mínimo 1,2 V, frente a un electrodo de referencia de Ag/AgCl.

9. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque para mejorar la deposición de las micropartículas se añaden varios pulsos de potencial adicionales entre la etapa de acondicionamiento (22) y la etapa de captación (23) en el desarrollo de la tensión del ciclo de detección, por lo que el último pulso de potencial adicional previo al contacto del electrodo de trabajo con la muestra se reduce a un potencial neutro, ni oxidante ni reductor.

10. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque la duración total del periodo en el que al menos un pulso de potencial adicional se encuentra en una zona de potencial oxidante o reductor, es en cada ciclo de detección como mínimo de 0,05 segundos, preferiblemente como mínimo de 0,1 segundos.

11. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque la duración total del periodo en el que al menos un pulso de potencial adicional se encuentra en una zona de potencial oxidante o reductor, es en cada ciclo de detección como máximo de 1 segundo, preferiblemente como máximo de 0,3 segundos.