JPH0795034B2

JPH0795034B2 - 電気化学ルミネセンス測定を行うための方法と装置

Info

Publication number: JPH0795034B2
Application number: JP1505930A
Authority: JP
Inventors: エイ．カミン，ラルフ; オー．ホール，リー; ケイ．レランド，ジョナサン
Original assignee: IGEN Inc
Current assignee: IGEN Inc
Priority date: 1988-04-29
Filing date: 1989-04-28
Publication date: 1995-10-11
Anticipated expiration: 2010-10-11
Also published as: SG48842A1; ZA893206B; ATE155247T1; AU620871B2; DE68928835T2; EP0417140B1; JPH03503451A; DE68928168D1; EP0601634A1; EP0417140A1; WO1989010551A1; IL90105A0; DE68928168T2; EP0417140A4; IL90105A; ATE172299T1; DE68928835D1; CA1333847C; EP0601634B1; AU3564989A

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、電気化学ルミネセンス（ECL）現象に関し、
より詳しくは、電気化学ルミネセンス現象を測定するの
に適した装置を使用するECL測定法の検出限界および精
度を改善するシステムおよび方法に関する。

発明の背景電気化学ルミネセンス測定技術は電気化学検出技術およ
び化学ルミネセンス検出技術から誘導された技術であ
る。電気化学（EC）は、一般に、化学変化に対する電気
の関係および化学的エネルギーと電気的エネルギーとの
相互変換に関連している。化学ルミネセンス（CL）に基
づく分析法または検出技術は、たとえば未知の量の測定
しようとする対象アナライト（alalyte）を含有する試
料と化学ルミネセンス標識と結合する、既知の量の反応
剤との混合物の形成を一般に含む結合分析技術を包含す
る。この混合物を、インキュベートし、標識を有する反
応剤をアナライトに結合させる。インキュベーシンの後
に、この混合物を２つのフラクション、すなわち結合フ
ラクションと非結合フラクションとに分離する。結合フ
ラクションは、アナライトに結合した、標識を有する反
応剤であり、そして非結合フラクションは、残留する非
結合反応剤である。CL測定が次いで、行なわれる。これ
らのフラクションのうちの一方または両方を、たとえば
これらのフラクションに酸化剤を添加することによっ
て、化学的にルミネセンスを生じさせる。標識を有する
反応剤の結合フラクションおよび非結合フラクション
は、それぞれ異なる量の光を発光する。特定の波長にお
ける、化学ルミネセンスの測定レベルは、結合フラクシ
ョンの量および（または）非結合フラクションの量をそ
れぞれ示しており、これらの測定値から、当業者は、試
料中のアナライトの量を決定することができる。

電気化学ルミネセンス（ECL）検出技術は、対象アナラ
イトの存在およびその量に係る敏感で、制御できる測定
法を提供する。ECL技術では、インキュベートされた試
料を、ボルタンメトリックな作用電極、すなわち電圧を
印加すると、そこから酸化還元反応用の電流を通すこと
ができる電極にさらす。このECL混合物は、CLK混合物が
反応するようには、化学環境のみとは反応せず、またEC
では反応が生じるようには、電場のみでは反応しない。
むしろ、電気化学ルミネセンスは、そのECL分子から、
対象の電気化学ルミネセンス波長で光を制御して発光さ
せる特定の方法および特定の時点で、作用電極に電圧を
印加することによって、誘発される。対象の測定値は、
ECにおけるような電極における電流ではなく、光の強度
である。このECL操作条件は、この測定法の正確性およ
び精度を増大させるために制御されなければならない。

しかしながら、この制御の鍵は、どのような操作条件が
ECL測定法に対して効果を有し、これらの効果が如何に
発現されるか、そしてこのECL測定プロセスを如何に制
御すれば、非常に厳格な限界内で再現性を有する測定結
果を提供できるかということを認識することである。EC
L化合物、対象アナライトおよび（または）これらが存
在する緩衝溶液に包含される化学的挙動は高度に複雑で
ある。ECL化合物は、プリカーサー成分と光を発光する
ように反応しなければならない。ECL測定プロセス中に
生起する化学変化および化学反応の一般的性質は、現
在、既知であると考えられているが、各測定に貢献する
全ての因子およびこれらの因子がどの程度まで貢献しお
よび（または）組み合わされるのかに関して理論的に予
想できる程充分に正確には、その特定の性質は知られて
いない。

それにもかかわらず、その操作を制御することができ、
各測定に関する少なくとも初期の条件を正確に、かつま
た精密に得ることができる装置を提供することは極めて
有利なことである。この初期条件の制御に関する一つの
観点は、ECL反応を誘発させる作用電極の表面状態に関
連している。EC技術は、その電流測定を改善するように
作用電極のクリーニングおよびコンディショニングを行
うことを包含する。

本発明によって、慣用のEC技術において電流測定を改善
する技術がECL技術では必ずしも望ましいものでもある
いは有用なものでもないことが見い出された。ECL測定
法の初期条件は、異なる必須要件に適合しなければなら
ない。慣用のEC技術によるクリーニングの結果の分析は
電流応答にもとづいているのに対し、ECL技術では、結
果の評価に、光強度が基準として使用される。

本発明者によって、また光のECL測定の精度および検出
限度が、作用電極表面の状態およびレドックス（還元／
酸化）状態に対し、および、レドックス状態が得られ、
維持される方法に対して、非常に感受性であることが見
い出された。固形のボルタンメトリックな作用電極の慣
用のクリーニングおよび（または）コンディショニング
の方法は、たとえば電極の燃焼、研磨、荒引きを包含し
ており、通常、引き続いて、電気化学的予備処理が行な
われていた。これらの方法は、多くの場合に、作用電極
をセルから取り出し、そして（または）手でクリーニン
グする必要があるという欠点を有していた。

ECL測定中における非再現性の結果は、少なくとも部分
的には、慣用のクリーニング／コンディションニング方
法中およびその後の可変性条件による作用電極の表面の
レドックス状態の非再現的な変化に由来するものと考え
られる。さらにまた、ECL技術が生物学的試料マトリッ
クス、たとえば血清または血漿に由来する試料、に対し
て行なわれた場合には、これらの生物学的分子のうちの
若干が測定中に作用電極と反応することがあり、電極を
汚すことがある。

ECL測定の制御に関するもう一つの観点は、対象アナラ
イトと、試料をECL測定セルに導入する手段と、セル内
における作用電極の使用および操作との間の関係にあ
る。従来の、複雑な生物学的成分または生化学的成分を
用いる試料のECL測定は、試料を「ビーカー」またはバ
ッチ系に静止させて行なわれていた。より迅速な分析方
法を提供するためには、クリーニングのために分解する
必要がない連続的なもしくは流動性の系が必要である。

本発明の目的および要旨従って、本発明の目的は、上記の従来技術の問題を回避
する、電気化学ルミネセンス測定法の制御を改良する方
法および装置を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、ECL測定法における精度の
改善をもたらす、ECLセルの作用電極のin−situ操作の
ための方法および装置を提供することにある。

本発明のさらにもう一つの目的は、ECLセルの作用電極
のin−situ操作のための方法および装置において、コン
ディショニング工程中に生成される、作用電極表面のレ
ドックス状態が測定工程が始まるまで維持される方法お
よび装置を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、流通通過式ECLセルにおい
て、分析の測定工程および（または）定量工程を行なう
ことによって、生物学的マトリックスの分析試料を測定
する方法および装置を提供することにある。

本発明のさらにもう一つの目的は、作用電極を測定と測
定との間に、クリーニングすることができ、かつまたコ
ンディショニングすることができる、流通通過式（flow
−through）ECLセルを用いる方法を提供することにあ
る。

本発明のさらにもう一つの目的は、有利なプリカーサー
成分と結合されている対象アナライトの分析を行なうた
めの方法および装置であって、その測定を流通通過式EC
Lセル内の流動条件の下に増強することができる方法お
よび装置を提供することにある。

本発明のこれらの目的およびその他の目的、態様ならび
に特徴は、以下に詳細に記述する好適態様から添付図面
を参照して、明白になるであろう。これらの記載におい
て、同一の番号は同一の要素および部品を表わすものと
する。

図面の簡単な説明第１図は、本発明による装置の一態様の側面横断面図で
ある；第２図は、第１図の装置に接続することができる電圧制
御系のブロック式ダイアグラムである；第３図は、本発明に従って適用することができる代表的
電圧シグナルを例示するシグナルダイアグラムである；第４図は、白金／オキザレート（Pt/オキザレート）環
境に係る、本発明による方法の第一の態様に適用された
電圧シグナルのシグナルダイアグラムである；第５図は、金電極／トリプロピルアミン（Au/TPA）環境
に係る、本発明による方法の第二の態様において適用さ
れた電圧のシグナルダイアグラムである。

第６図は、Au/TPA環境からのデータを描き入れたグラフ
である；そして第７図は、Pt/TPA環境からのデータを描き入れたグラフ
である。

好適態様の詳細な説明本発明は、その測定が検出限界および精度の両方で改善
さるようにECLセルにおいて作用電極を操作することに
関するものである。

本出願の譲受人の雇用者によって、譲渡の義務の下に開
発されたECL技術は、多成分の液体試料中に比較的小さ
い濃度で存在する対象アナライトを、或る量のこのよう
な試料中で検出する方法であり、この方法は、ａ）試料
を試薬と接触させる工程、ここで、この試薬は（ｉ）こ
の試薬に放射線の反復放射を誘導させるのに有効な適当
な供給源からの或る量の電気化学的エネルギーにさらさ
れると、電磁放射線を反復放射するように誘導されるこ
とができるものであり、かつ（ii）対象アナライトと結
合することができるものであり、そしてこの接触は、ア
ナライトと試薬とが結合するのに適する条件の下に行わ
れるものであり、ｂ）生成する試料を、この試薬に放射
線の反復放射を誘導させるのに有効な、適当な供給源か
らの、或る量の電気化学的エネルギーにさらす工程、お
よびｃ）このようにして放射される電磁放射線を検出
し、これによって、試料中の対象アナライトの存在を検
出する工程、を包含する。

このECL技術分野に提供される方法は、異種分析方式
で、すなわち非結合の、標識を有する試薬を、結合し
た、標識を有する試薬から分離し、その後、結合した、
または非結合の、標識を有する試薬を電気化学的エネル
ギーにさらす分析方式で行なうことができ、あるいは同
種分析方式で、すなわち非結合の、標識を有する試薬お
よび結合した、標識を有する試薬を一緒に、電気化学的
エネルギーにさらす分析方式で、行なうことができる。
同種分析方式では、結合した、標識を有する試薬によっ
て放射さる電磁放射線（光）の強度は、非結合の、標識
を有する試薬によって放射される電磁放射線（光）の強
度に比較して、大きいか、または小さいかのどちらかで
ある。結合した成分と非結合の成分のそれぞれの存在ま
たは非存在が、この強度の差の測定によって決定でき
る。

このようなECL技術の一つにおいては、対象のアナライ
トと結合しない試薬はいずれも、試料を電気化学的エネ
ルギーにさらす以前に、試薬と接触させた試料から分離
される。もう一つの技術では、試料を試薬と接触させる
以前に、試料を処理して、対象アナライトを固定する。
この対象アナライトを固定する手段は当業者に充分に知
られており、これは試料と特別の表面との接触を包含す
る。

このECL技術は、当分野で充分に知られているように、
種々の検定形式および定量分析形式で使用することがで
きる。定量分析では、既知量のECL試薬を使用し、電気
化学ルミネセンスの測定値を既知標準と相互間連させ、
存在するアナライトの量を計算することができる。当業
者に充分に知られている方法によって、正分析、可逆分
析、競合分析およびサンドイッチ分析を行なうことがで
きる。競合分析では、たとえば多成分の液体試料中の対
象アナライトの量を定量的に決定する方法は以下のよう
にして行う。通常は試料中には存在しない相補性物質上
の結合部位を対象アナライトと競合することのできる電
気化学ルミネセンス試薬の既知量およびこの相補性物質
の既知量と、試料と接触させ、この接触を、対象アナラ
イトと試薬とがこの相補性物質に競合して結合するよう
な適当な条件の下に行なう。生成する試料を、電気化学
的エネルギーにさらし、放射される放射線の量を定量測
定し、これによって、試料中に存在する対象アナライト
の量を定量的に決定する。

対象アナライトは、たとえば試料中に存在する完全細
胞、完全細胞の一部の粒子、ウイルス、プリオン、バイ
ロイド、核酸、タンパク質、リポタンパク質、リポ多
糖、グリコタンパク質、ヘプチド、ホルモン、薬理学的
製剤、非生物学的ポリマー、合成有機分子、有機金属分
子または無機分子であることができる。さらにまた、対
象アナライトは、試料中に存在する、完全細胞、完全細
胞の一部の粒子、ウイルス、プリオン、バイロイドまた
は核酸であることができる。

試料は、たとえば固形、エマルジョン、懸濁液、液体ま
たは気体から誘導されるものであることができる。さら
にまた、試料は、たとえば水、食物、血液、血清、血
漿、尿、糞便、組織、唾液、オイル、有機溶剤または空
気に由来するものであることができる。さらにまた、試
料は、たとえばアセトニトリル、ジメチルスルホキシ
ド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−ピロリジネン
またはtert−ブチルアルコールを含有することができ
る。試料はまた、還元剤または酸化剤を含有することが
できる。

試料と接触させる試薬は、たとえば完全細胞、完全細胞
の一部の粒子、ウイルス、プリオン、バイロイド、リピ
ド、脂肪酸、核酸、多糖類、タンパク質、リポタンパク
質、リポ多糖、グリコタンパク質、ペプチド、細胞代謝
物、ホルモン、薬理学的製剤、トランキライザー、バル
ビツレート、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、ア
ミノ酸、糖、非生物学的ポリマー、合成有機分子、有機
金属分子、無機分子、ビオチン、アビジンまたはストレ
プタビジンに結合している電気化学ルミネセンス化学分
子を含有することができる。一例において、この試薬
は、抗体、抗原、核酸、ハプテン、リガンド、酵素、ビ
オチン、アビジンまたはストレプタビジンに結合してい
る、電気化学ルミネセンス分子である。試薬は、また、
電気化学ルミネセンス分子に結合している対象アナライ
トあるいは電気化学ルミネセンス分子に結合している対
象アナライトの同族体であることもできる。

この電気化学ルミネセンス化学分子は、たとえば金属含
有有機化合物であって、その金属が、ルテニウム、オス
ミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、パラ
ジウム、モリブデン、テクネチウムおよびタングステン
からなる群より選ばれる化合物を包含することができ
る。

上記記載は、ECL測定技術が多くの異なる対象アナライ
トおよび多成分液体試料中におけるそれらの存在を定性
的におよび定量的に検出するための、種々の方法および
分析に、広く適用できることを示している。これらのEC
L技術をさらに充分に説明するために、本出願と共通に
譲渡されたPCT特許出願No.US87/00987を参照すべきであ
り、この公報をここに組入れる。

前記したように、これらのECL技術は、同一試料中に存
在する多種の対象アナライト、すなわち２種または３種
以上の対象アナライトの検出を包含することができる。
ECL測定が定量的に行なわれる場合には、測定は精度よ
く、かつ正確であらねばならない。測定の精度とは、そ
の反復可能性、すなわち同一初期条件および同一試料に
よる測定が同一の結果を生じる程度を意味する。正確と
は測定濃度が実際の濃度に近いことを意味する。このよ
うなECL測定の精度を増大させるために、本発明では、
電気化学的エネルギーを供給する電極を高度に反復可能
な方法で条件調整して、電極に特定の表面を生成させ
る。この特定の表面は、必要に応じて、測定を開始する
まで維持することができる。このことは、特別の試料が
測定に提供された場合に、その結果の再現性があること
を意味する。

ECL測定はそれぞれ、装置の電極系に、より詳しくは、
そのボルタンメトリックな作用電極に、試料をさらし、
次いでこの作用電極に対して、電気化学ルミネセンスが
誘発されるような既知の電圧波形（voltage waveform）
を印加することによって行われる。この既知の電圧波形
は、多くの場合に、第一電圧から第二電圧へ、再び第一
電圧を経由して第三電圧へ、次いで再び第一電圧へ戻る
電圧掃引の形態を有する。このECL反応の性質は、ECL測
定プロセス中に、試料が作用電極表面に隣接する薄い層
中で化学的に変化するようなものである。

試料の化学変化に係る定性的性質は、次の通りであると
考えられる。上で引用した、共通に譲渡された出願に於
て、TAGの用語で表わされている電気化学ルミネセンス
分子（electrochemiluminescent moiety）は、アナライ
トと結合することができるか、あるいはアナライトと結
合することはできないが、それぞれの場合に、作用電極
から受け取る電気的エネルギーによって誘発される化学
反応の結果として、励起状態に励起させることができ
る。たとえば、TAGは、以下の反応で、２＋から３＋の
状態に酸化させることができる： TAG²⁺→TAG³⁺＋e^- （１）この反応は、電極表面に直接に触れている試料液体の薄
層においてだけ生じることが知られている。

酸化されたTAG（TAG³⁺）は、TAG³⁺を還元して、TAG²⁺で
はあるが電子的に励起した状態にあるものに戻すことが
できる強力な還元剤P⁰と反応させることができる場合に
は、発光する。この分子は、TAGを緩衝溶液中で、高濃
度のプリカーサーＰと混合することによって得られる。
このプリカーサーＰは有利には、以下で詳細に説明する
ように、オキザレートまたはトリプロピルアミン（TP
A）である。電極からのエネルギーは、先ず次の通り
に、プリカーサーＰの酸化を生じさせる：Ｐ→P⁺＋e^- （２）次いで、酸化されたプリカーサーP⁺は、一分子的に再配
列することができ、強力なプリカーサーP⁰を生じる： P⁺→P⁰ （３）式（１）、（２）および（３）の反応はいずれも、作用
電極の電圧が誘発値に達する場合には、測定スイープ
（measurement sweep）の一部で生起し、ここで、TAG³⁺
は還元剤P⁰と化学的に反応し、TAG²⁺を生成させる：こ
れは電子的に励起した状態にあり、星印（★）で、以下
の通りに示される： TAG³⁺＋P⁰→TAG^２＋★＋P_D （４）（式中、P_Dは、式（２）におけるようには反応性でない
修飾されているプリカーサーである）。このとき励起さ
れたTAG^２＋★は発光する、すなわち下記のとおりに、
光を発する： TAG^２＋★→TAG²⁺＋hc/λ （５）（式中、ｈはプランク定数であり、ｃは光速であり、そ
してλは放射された光の波長である）。

上記の定性的な説明は、正確であると考えられるが、定
量的性質およびこれらの反応のECL測定値に対する効果
は知られていない。

本発明を正確に説明するために、以下で使用される、い
くつかの用語の正確な意味をここで定義する。これらの
用語は、従来技術において、種々の事柄を意味するため
に、汎用されているが、本明細書においては、これらの
用語は、ここに定義したように解釈されるべきである。

「クリーニング」この用語は、装置内に導入された試料であって、試料プ
ローブ、試料をECLセルに導く管系およびECLセルそれ自
体（その作用電極を含むが、これに限定されない）内に
残留する試料中に含有されている、望ましくない化学種
を、物理的に、電気化学的におよび（または）化学的に
除去することを定義するために使用する。タンパク質は
このような種の一例であり、これは電極のクリーニング
を要求する電極の汚染を生じさせることとなる。クリー
ニングは、クリーニング溶液の存在の下に、電極を処理
することを包含する。このようなクリーニング溶液の有
利な例は、前記のクリーニングの目的は提供される、た
とえば洗剤および塩類などの添加成分を含有する希釈
酸、希釈塩基またはいずれかの緩衝溶液を包含すること
ができる。クリーニングはまた、クリーニング溶液と混
合された空気を制御して導入する方法を包含し、この場
合には、空気のパルスによって分離される溶液のパルス
がセル中に押し入り、作用電極を横切る。さらにまた、
下記の本発明の態様におけるように、少なくとも作用電
極のクリーニングプロセスは部分的に、作用電極および
対極に望ましい電気化学的電圧波形を印加し、選ばれた
電圧シグナルを選ばれた化学的環境と組合せることを包
含することができる。

「コンディショニング」この用語は、少なくとも作用電極をコンディショニング
溶液に同時的にさらしている間の望ましい電気化学的電
圧波形の及ぼす一般的貢献を定義するために使用されて
いる。このコンディショニング溶液は、クリーニング溶
液と異なっていてもよく、あるいは同一であってもよ
い。また、このコンディショニング処理は、作用電極の
表面状態を試料測定用に調整する方法としても作用し、
また再現性を得るための手段を包含する。ECL測定が前
記の化学理論に従うTAGまたはTAGged結合体の測定であ
る場合には、コンディショニング溶液の成分は、対象の
TAGged結合体またはTAGおよびブランク（すなわちTAGを
含有しない）測定溶液の連続測定を最適にするものにす
る。有利なコンデイショニング溶液はブランク測定用緩
衝液であってもよい。

「測定」この用語は、対象アナライトである所望の化学物質から
の電気化学ルミネセンスを検出し、引き続いて定量測定
または定性測定することを意味する。上記に説明されて
いる本発明に従い、この測定は、TAGまたはTAGged結合
体あるいはブランク（すなわち、TAGを含有しない）測
定溶液のいずれもの測定であってもよい。ここでもま
た、この測定溶液は、クリーニング溶液および（また
は）コンディショニング溶液とは異なるものであって
も、あるいは同一のものであってもよい。測定溶液の例
には、以下に記述するECL化学の特別の例に示されてい
る緩衝成分がある。対象アナライトは一般に、ECL TAG
光出力を増大させ、TAGを含有しない光出力を減少さ
せ、測定を再現性にする助けとなり、かつまた一般的洗
剤湿潤を得るという目的のために選ばれる測定溶液中に
存在させる。

「電気化学的貢献」全サンプリングサイクルのクリーニングおよび（また
は）コンディショニングに対する電気化学的貢献は、作
用電極が１種または２種以上の選ばれた溶液にさらされ
ている間に行われる特定の化学および測定に有利である
ことが証明されている、作用電極に印加され電圧波形の
組合せを包含する。これらの波形には、これらに制限さ
れないが、パルス掃引、一定電圧あるいはこれらのいず
れかの組合せが包含される。これらの電圧波形において
は、少なくとも３種の対象電位、すなわち上限電圧、下
限電圧および操作前電位電圧（preoperative potential
voltage）または保持電位電圧（hold potential volta
ge）がある。

機械的／化学的環境には以下に示す２種の別々の態様が
存在する。これらの環境の定義を以下に示す。

「Pt/オキザレート環境」この環境では、白金（Pt）作用電極を使用する。プリカ
ーサーはオキザレートであり、これはシュウ酸の水溶性
塩、有利にはナトリウム塩またはカリウム塩である。オ
キザレートは、コンディショナー／界面活性剤ととも
に、水性緩衝溶液中に配合する。

「Au/TPA環境」この環境では、金（Au）作用電極を使用する。プリカー
サーはトリプロピルアミン（TPA）であり、これはコン
ディショナー／界面活性剤とともに、水性緩衝溶液中に
存在させる。

本発明はこれらの２種の環境に制限されない。たとえ
ば、白金電極をTAP化学作用下に使用することができ、
または金電極をオキザレート化学作用下に使用すること
ができ、あるいは異なる電極材料を使用することもでき
る。別の例として、TPA化学作用を三級アルキルアミン
のいずれをも包含するように広げることもできる。これ
らの環境およびその他の環境はいずれも、本発明の範囲
内にある。

上記定義を使用し、本発明の態様に従って、電気化学ル
ミネセンス現象を測定するのに適するセルの作用電極を
その場で（in−situ）操作する方法は、次の工程を含
む：（ａ）少なくとも１種の溶液の存在の下に、作用電極に
可変性電圧を印加することによって、作用電極をクリー
ニングし、そしてコンディショニングし；（ｂ）この可
変性電圧を、予め定められた方向で変え、予め定められ
た操作前電位に到達させることによって、このクリーニ
ングおよびコンディショニング工程を停止し；次いで
（ｃ）試料溶液に作用電極をさらし、その後作用電極に
印加する電圧を操作前電位から変えて、測定工程を開始
する。

この方法の変法においては、測定工程は、可変性電圧が
操作前電位に達し、クリーニングおよびコンディショニ
ング工程が止められたならばすぐに開始することがで
き、あるいは停止工程の後に、作用電極を操作前電位に
連続的に保持する工程を加え、次いで測定工程も開始す
ることもできる。作用電極はまた、これを操作前電位に
連続的に維持しながら、溶液に連続的にさらすこともで
きる。作用電極が選ばれた金属から形成されている場合
には、クリーニングおよびコンディショニング工程を、
作用電極が、その金属に関して選ばれるレドックス状
態、たとえば操作前電位によって維持されている酸化状
態にあるようにして停止させ、その後、測定工程を開始
することができる。たとえば、作用電源が白金、あるい
はその還元状態から形成されている場合や、たとえば作
用電極が金から形成されている場合に、このような方法
を行なうことができる。レドックス状態はまた、特定の
試料溶液に関連して選択することもできる。クリーニン
グおよびコンディショニング工程は、作用電極を横切る
空気のパルスによって分離されたクリーニング溶液のパ
ルスを通すことを包含し、１つの溶液がクリーニングお
よびコンディショニング溶液であってもよい。

このクリーニングおよびコンディショニング工程は、作
用電極に、クリーニング溶液の存在の下に、第一の可変
性電圧を印加することによる作用電極のクリーニング工
程と、作用電極に、コンディショニング溶液の存在の下
に、第二の可変性電圧を印加することによる作用電極の
コンディショニング工程とに分けることもできる。測定
工程は、作用電極を試料溶液にさらしながら、この作用
電極に印加される電圧の少なくとも一つの測定掃引を包
含することもでき、この場合には、各測定掃引を試料溶
液中での発光を誘発するように適合させる。測定工程は
また、２つまたは３つ以上のこのような測定掃引を包含
することもできる。

本発明のこの態様に従って、電気化学ルミネセンス現象
の測定に適するセルの作用電極のin−situ操作用の装置
は、溶液を受け入れるのに適しており、電気化学ルミネ
センス測定を行なうためのセル手段、セル手段と組合さ
れており、セル手段内の溶液にさらされるのに適する作
用電極手段、および選ばれた溶液をセル手段に供給する
ための液体輸送手段を含む。この装置はさらに、電圧源
に接続するのに適しており、セル手段がその中に少なく
ともクリーニング溶液を含有している、少なくとも電気
化学的クリーニング操作の間、およびセル手段がその中
にコンディショニング溶液を含有しているコンディショ
ニング操作の間、作用電極手段に選ばれた電圧シグナル
を供給するための電圧制御手段、予め定められた操作前
電位に到達させるために、印加電圧シグナルを予め定め
られた方向で変えることによって、コンディショニング
操作を止めるための工程制御手段を含む電圧制御手段、
および電圧制御手段が作用電極手段に印加される電圧シ
グナルを操作前電位から変える前に、測定工程のため
に、試料溶液をセル手段に供給する液体輸送手段を制御
する工程制御手段を含んでいる。

この装置において、電圧制御手段は、コンディショニン
グ操作の停止から、測定工程が開発される時点まで、作
用電極手段を操作前電位に連続的に維持することができ
る。

作用電極をin−situでクリーニングし、そしてコンディ
ショニングすることができ、制御可能な初期条件をうる
ことができる本発明の上記態様は、流通通過式構成の利
点を有する本発明のもう一つの態様に密接に関連してい
る。この態様は、生物学的マトリックスで分析を行なう
方法を包含し、この方法は次の工程を含む：（ａ）生物
学的マトリックスの試料および電気化学ルミネセンス分
子を含有する溶液を、電気化学的エネルギー源を含む流
通通過式セル中に流入させる、（ｂ）このエネルギー源
をこの溶液にさらす、（ｃ）この分子に電磁放射線の放
射を生じさせるような量の電気化学的エネルギーに、こ
の溶液がさらされるように、このエネルギー源を操作す
る、（ｄ）放射された電磁放射線の強度を検出する、次
いで（ｅ）この溶液をセルの外に流出させる。有利に
は、このエネルギー源は、作用電極を包含する。この分
析方法は結合分析であることができ、あるいはより詳し
くは免疫検定法であることができ、ECL分子は結合され
ていても、または結合されていなくてもよい。

さらに広義には、本発明のこの態様は、生物学的マトリ
ックスで分析を行なう方法に具現化されこの方法は、次
の工程を含む：（ａ）生物学的マトリックスの試料およ
び電気化学ルミネセンス分子を含有する溶液を、流通通
過式セルに流入させる、（ｂ）この分子に電磁放射線の
放射を生じさせるような量の電気化学的エネルギーに、
この溶液をさらす、（ｃ）放射される電磁放射線の強度
を検出する、次いで（ｄ）この溶液をセルの外に流出さ
せる。

生物学的マトリックスの分析を行なう、有利な方法は、
次の工程を含む：（ａ）流通通過式セルに溶液を流入さ
せる、ここでの溶液は、電気化学ルミネセンス分子、三
級アルキルアミン成分および緩衝成分を含有し、このル
ミネセンス分子と三級アルキルアミン成分とは、印加さ
れる電気化学的エネルギーに応答して化学的に反応し、
電磁放射線の放射を誘発する分子を生成するものであ
る、（ｂ）この分子に電磁放射線の放射を生じさせる、
（ｃ）放射された電磁放射線の強度を検出する、次いで
（ｄ）溶液をセルの外に流出させる。この三級アリキル
アミン成分は有利には、トリプロピルアミンを包含する
ことができ、この電気化学的エネルギーは金または白金
の作用電極により印加することができ、そして溶液はEC
L誘発工程の間、流動させておくことができる。

本発明のもう一つの態様によれば、それぞれの電気化学
ルミネセンス分子を含有する、生物学的マトリックスの
分析試料の測定を行なう方法は次の工程を含む：（ａ）
測定セルを初期化する（initializing）、ここでの初期
化工程は、このセルに第一の溶液を流入し、この第一の
溶液に作用電極をさらし、次いで第一の溶液をセルの外
に流出させることによって、セルの作用電極をクリーニ
ングし、そしてコンディショニングすることを包含し、
次いで（ｂ）分子の電気化学ルミネセンスを測定する、
ここでこの測定工程は、複数の試料のうちの第一の試料
を含有する第二の溶液をセル中に流入させ、この第二の
溶液に作用電極をさらし、この試料を作用電極からの電
気化学的エネルギーにさらすことによって、この試料中
の電磁放射線の放射を生じさせ、放射された電磁放射線
の強度を検出し、次いでこのセルからこの第二の溶液を
流出させることを包含し、上記の初期化工程および測定
工程は、連続的な試料が連続的に測定されるように交互
様式で反復される。この方法では、第一の溶液は、第二
の溶液と同一であることができ、あるいは第一の溶液が
第二の溶液と異なっていてもよい。

ここで図面を参照するが、初めに第１図を参照すると、
ここには本発明の方法の実施に適する、有利なECL装置1
0が示されている。以下の記載から明白になるように、
本発明の方法は装置10における使用に制限されず、むし
ろ対象アナライトの電気化学ルミネセンスを誘発させる
電気化学的エネルギーを供給する作用電極またはその他
の誘発性表面を利用する全てのタイプのECL装置で、有
利に使用することができる。しかしながら、装置10は流
通通過式セルであり、このような装置は結合検定試料を
包含する全てのタイプの試料に対して、明瞭な利点を有
する。

装置10は、電気化学セル12、光検出／測定デバイス14
（これは、有利には光電子増倍管（PMT）、フットダイ
オード、電荷連成デバイス、写真フィルムまたは写真エ
マルジョンなどであってもよい）、およびポンプ16（こ
れは、有利には液体をセルに、セル中で、およびセルか
ら輸送するための、蠕動式ポンプである）を有する。別
様には、ポジティブ配水ポンプ（Positive displacemen
t pump）を使用することもできる。シャッターメカニズ
ム18には、セル12とPMT14との境界を与え、ECL測定期間
中に、PMT14がセル12にさらされるようにだけ、制御し
て開口するものである。シャッターメカニズムは、たと
えば管理期間中は閉めておくことができる。また、装置
10は、第１図には示されていないが、その中の種々の部
品を据え付けるための、およびPMT14を、ECL測定期間
中、いずれの外部の光からも遮断するための遮光外装を
有する。

セル12それ自体は、第一の据え付け台20を有し、入口管
22および出口管24はこの台を通過しており、そしてこの
台は、有利にはステンレス鋼から形成することができ
る。据え付け台20は、第一の外側面26および第二の内側
面28を有し、この内側面28はセル12の試料保持空間30の
一面を定めている。この空間で、セル12は装置10の相当
する操作の期間中、クリーニング溶液および（または）
コンディショニング溶液および（または）測定溶液を保
持している。入口管22および出口管24は据え付け台20
を、その外側面26からその内側面28まで通っており、試
料保持空間30中に開口している。有利にはステンレス鋼
から形成されている第二の据え付け台32はまた、第一の
外側面34および第二の内側面36を有する。第二の据え付
け台32は、管状スペーサー38によって、第一の据え付け
台20と分離されており、このスペーサーは、有利にはテ
フロンまたはその他の非汚染性物質から形成される。す
なわち、この据え付け台30の外側面34は試料保持空間30
の第二の側面の一部を定めている。スペーサー38は、外
側部分40および中心孔42を有し、この孔の内縁部44は試
料保持空間30の側壁を定めている。外側部分40は、第一
の据え付け台20の内側面28を第二の据え付け台32の外側
面34にシールしており、これによって、これらの２つの
面28,34との間の試料保持空間からの溶液の流出が防止
されている。据え付け台32はさらに、中心孔46を有し、
ここで試料保持空間30の第二の面の残部を外側面34の連
続部分として定めるために窓48がシールして備えられて
いる。窓48は、ECL分子によって発光される電気化学ル
ミネセンス光の波長において、実質的に透明である物質
から形成される。従って、窓48は、有利にはガラス、プ
ラステイック、石英などから形成される。

人口管22は、スペーサー38に隣接しているその第一の末
端50で、試料保持空間30を横切っており、そして出口管
24は、スペーサー38に隣接しているその第二の末端52
で、試料保持空間30を横切っている。従って、人口管2
2、試料保持空間30および出口管24の組合せによって、
セル12に入り、セルを通り、そしてセルから出る溶液
の、狭く、実質的に単層状の流れのための連続的流通通
路が提供される。

第一の据え付け台20の内側面28上には、作用電極系54を
配置する。この作用電極系54は、図示された態様におい
て、第一および第二の作用電極56および58を包含する。
別の態様では、１個だけの作用電極を有利に使用するこ
とができ、あるいは電極56だけが作用電極であることも
できる。作用電極56、58において、目的の電気化学的反
応およびECL反応が生じる。作用電極56、58は、固形の
ボルタンメトリック電極であり、従って、有利には白
金、金、炭素またはこの目的に有効であるその他の物質
から形成されることができる。作用電極56、58に接続し
ているワイヤーコネクター60、62はそれぞれ、第一の据
え付け台20を通過して外部に出ている。

第２図に示されているように、コネクター60、62は両方
ともに、電圧制御系66の、第一の「作用電極」末端64に
接続されている。電圧制御系66は有利には、作用電極5
6、58に電圧シグナルを供給するために、および、場合
により、ECL測定中に、そこから流れる電流を測定する
ために、ポテンショスタット（potentiostat）の様相で
動作する。別様には、コネクター60、62は、各操作のた
めに、電圧制御系66の末端が分離されるように接続する
こともできる。

電圧制御系66の電位調節動作はまた、対極68を通して、
また、場合により有利には、参照電極70を通して行われ
る。図示された態様において、据え付け台32は、ステン
レス鋼から形成されており、そして対極68は、据え付け
台32の露出面72、74に存在する。対極72、74および作用
電極56、58は、試料保持空間30内の溶液に対し、電位を
印加するための境界面を提供しており、この面は試料に
おける化学反応にエネルギーを与え、かつまた電気化学
ルミネセンスを誘発させ、そして（または）セル12の表
面のクリーニングおよびコンディショニングのためのエ
ネルギーを供給する。ECL測定プロセス中に、若干の電
気化学的反応が対極72、74で生じるが、これらの反応
は、電気化学ルミネセンスの発光を刺激する種類のもの
ではなく、従って考慮する必要はない。対極72、74は、
ワイヤーコネクター76によって、電圧制御系66の第二の
「対極」の末端78に接続されている。

参照電極70は、参照電圧を提供し、作用電極56、58によ
り印加される電圧は、この参照電圧を基準としており、
たとえば、この参照に対して＋1.2ボルトである。参照
電極70は有利には、出口管24の、セル12から間隔をあけ
た位置80に位置しており、ワイヤーコネクター82によっ
て、電圧制御系66の、第三の「参照電極」の末端84に接
続されている。この三電極形式では、電流は参照電極70
を通っては流れない。参照電極70は三電極形式の操作態
様において、平衡で、既知の、安定な電圧を供給するた
めに使用することができ、従って、有利には鎖／塩化群
（Ag/AgCl）から構成されているか、あるいは飽和カロ
メル電極（SCE）である。電圧制御系66は、作用電極56
および対／参照電極としての電極58のみを使用する二電
極操作形態でも動作することができる。この二電極操作
形式では、対／参照電極58は、電圧制御系66の電圧制御
系末端78および84に電気的に接続する。この場合には、
電圧制御系66は、基本的にバッテリーとして動作する。
電圧制御系66は、作用電極56および対電極58に電圧シグ
ナルを供給し、かつまた、場合により、参照電極を通っ
て流れる電流を測定する。参照電極70は、別称で「擬−
参照」（“quasi−reference"）電極と称することがで
き、白金、金、ステンレス鋼またはその他の材料から形
成することができる。この電極は安定性の低い電圧であ
るが、溶液と接触すると測定可能な電圧を供給する。二
電極および三電極の両方の形式において、参照電極70ま
たは58は、基準値を提供し、この基準値に対して、作用
電極56に印加される電圧を測定する目的に使用される。
平衡な電圧参照は一般に、より有利であると考えられ
る。電圧制御系66は、そのポテンショスタット動作にお
いて、参照電極70に対して、既知の電圧を作用電極56,5
8に供給し、かつ作用電極56,58と対局72,74との間を流
れる電流を測定しながら、各種電極を制御する。この目
的のためのポテンショスタットは充分に知られており、
従って、電圧制御系66の内部構造は、上記の機能を生じ
る、慣用の市販されているポテンショスタットのいずれ
にも相当することができ、従って、これは本発明それ自
体の一部を構成するものではない。確かに、装置10は、
別の態様として、内部電圧制御系66を使用することなく
形成することもでき、電極56,58,72,74および70に対す
る必要電圧シグナルの供給を別々に制御する、外部ポテ
ンショスタットに接続するのにも適している。以下で説
明する具体的な様相で印加される、これらの電圧シグナ
ルは、作用電極56,58の表面、有利には、全体として、
セル12の表面に、反復可能な初期状態を提供する。この
特徴がECL測定における精度の改善に、充分に貢献す
る。

ポンプ16は有利には、出口管24に位置しており、試料空
間からの溶液を矢印Ａの方向で、入口管22中に「引き込
む」。溶液は、入口管22、試料保持空間30および出口管
24を通って流れ、対照電極70を過ぎて、矢印Ｂの方向に
流出される。別の態様では、ポンプ16は入口管22に位置
しており、溶液を装置10を通過するように「押し出
す」。有利には、入口管22、試料保持空間30および出口
管24を通る、この同一流動経路を、セル12を通過する全
ての溶液および流体のために使用する。これにより、各
流体は、セル12から出る先行の流体を強制的に排出させ
る、流体力学的クリーニング作用を行なう。ポンプ16
は、いずれかの期間の間、特定の溶液をセル12内に保留
させるために、その動作が抑制されるように制御するこ
とができる。

本発明の態様に従って、上記に定義されているタイプの
化学的／機械的環境が、以下に示すクリーニング／コン
ディショニングルーチンを使用することによって得られ
る有利な結果を損なうことなく、セル12のような流通通
過式セルを使用して、生物学的マトリックスの分析試料
におけるECL現象の測定を可能にすることが見い出され
た。このような分析には、対象アナライトが抗体または
抗原である免疫検定が含まれる。その他の分析として
は、たとえばアビジン−ビオチン（タンパク質結合）、
レクチン−炭水化物、レセプター−リガンドおよび核酸
ハイブリッド形成などの結合分析が含まれる。試料それ
自体は充分に反応する必要はない、すなわち平衡になる
必要はない。これらの分析試料の複雑な化学的／生物学
的性質は、電極を汚し、電極及び他の表面への吸着をひ
きおこす傾向が特にあるようである。しかしながら、流
通通過式セルは容易に分解することはできない。しか
し、本発明者らはこのような分析試料の改善された精度
のECL測定を本発明に従って、確実に行なうことができ
ることを証明した。すなわち、本発明は、流通通過環境
において、このような「汚れた」試料の分析を実施可能
にする、効果的なクリーニングおよびコンディショニン
グ操作を包含している。

流通通過式構造は、作用電極に可変性電圧を印加するこ
と、あるいは作用電極を操作前電位に連続的に保持する
ことを可能にすると同時に、１種または２種以上の溶液
に連続的にさらすことを可能にする。すなわち、作用電
極56,58（または対極および参照電極72,74,70）が空気
にさらされることはない。空気にさらされると、回路が
参照電極70に対してオープンとなり、未知の、無作為の
電圧ゆらぎが生じ、これが、以下に示す有利なクリーニ
ング／コンディショニング方法が達成しようとしている
作用電極56,58の表面状態の再現性を破壊する。

さらにまた、この流通通過式構造は、電極系54をクリー
ニングし、そしてコンディショニングする初期化工程
と、１種または２種以上の測定波形または掃引がECLを
誘発させる測定工程との間の迅速な抗体を可能にする。

さらにもう一つの開発によって、TPA溶液中の結合分析
およびその他の試料の、白金作用電極を用いるECL測定
が、測定工程の間、試料溶液が作用電極56,58を連続的
に通過して流動している場合、および以下に定義する、
上限電圧が充分に高い場合には、増強されることが見い
出された。流動するPt/TPA環境において、光反射が増強
されるという発見は、予想外のことであり、かつまた驚
くべきことである。

ここで、第３図〜第５図を参照すると、第３図には、電
圧制御系66によって印加することができる電圧シグナル
のいくつかのタイプが示されている。これらの電圧シグ
ナルは、第３図の区域Ａに示されているようなパルスシ
グナル、区域Ｂに示されているような三角形掃引シグナ
ルおよび区域Ｃに示されているような先端が切られた三
角形のシグナルを包含することができる。一定電圧、こ
のぎり歯様シグナルおよび非対象シグナルを包含する、
その他の波形も使用することもできる。第３図に示され
ているように、種々のタイプのパルスシグナルは、上限
電圧Vuと下限電圧Vlとの間で変化する。印加される上限
電圧および下限電圧の大きさを制限するたとは、たとえ
ばその電圧が参照電極に対して正（ポジティブ）であり
すぎる場合に、水溶液から生じる酸素の発砲を防止する
のに有利である。第３図には３種のシグナルが示されて
おり、これらの全部が同じ上限電圧Vuおよび下限電圧Vl
を有しているが、特定の電圧シグナルは、異なる上限電
圧および下限電圧を有する各波形を含むことができるも
のと理解されるべきである。さらにまた、第３図では、
上限電圧Vuが正の電圧として示されており、そして下限
電圧Vlが負の電圧として示されているが、特定の用途に
おける両電圧は正であって、負であってもよい。第３図
は、電圧制御系66から作用電極56,58に印加することが
できる、異なる形状の波形を単に例示しようとするもの
である。第３図、ならびに第４図および第５図に示され
ている電圧は、参照電極70に対する、作用電極56,58に
現われる電圧であると理解されよう。以下に記載されて
いる電圧はいずれも、Ag/AgClを基準にした電圧であ
る。

第４図には、Pt/オキザレート環境において、作用電極5
6,58に印加することができる、有利な可変性電圧シグナ
ルが示されている。この態様では、オギザレートのシグ
ナル溶液が、クリーニングおよびコンディショニングの
両方に使用される。

第４図に示されているように、この電圧シグナルは、ク
リーニング操作期間中の、時点t₀から時点t₁までの初期
期間を含んでいる。このクリーニング部分は、−0.7ボ
ルトから＋1.5ボルトまでの、２サイクルのパルスシグ
ナルを含んでいる。その後、時点t₁からt₂までのコンデ
ィショニング工程期間で、作用電極56,58は、セル12の
他の面とともに、＋1.5ボルトの一定のコンディショニ
ング電位の適用によって、コンディショニングされる。
このコンディショニング工程は、時点t₂で電位も下降方
向に移動させ、この態様では＋1.1ボルトである、予め
定められた操作前または保持電位に到達させることによ
って、停止される。この操作前電位、すなわちレドック
ス状態は、次いで、測定工程を開始するまでの時間の
間、電圧制御系66によって保持することができる。時点
t₂から測定工程が開始される時点t₃までに、セル12内に
保有されているコンディショニング流体は、試料流体の
導入によって置き換える。しかしながら、本発明の態様
において、電圧制御系66から印加される電圧は、測定工
程の開始まで、変えない。本発明によって、印加電位を
予め定められた方向（この場合には、下降方向）に移動
させ、予め定められた操作前電位（この場合には、＋1.
1ボルト）に到達させることによってコンディショニン
グ工程を停止し、及び、その後で、測定工程の開始ま
で、作用電極56,58を、この操作前電位から変えないこ
とによって、ECL測定がさらに精確になり、かつまた、E
CL現象のさらに敏感な検出が得られることが見出され
た。この測定工程は、時点t₂とt₃との間のいずれの時点
においても開始できるものと考えられる。しかし、時点
t₃で開始すれば印加電圧が、ECLが誘発させるような大
きさを有する時点t₄〜t₅で生じるデータを、測定窓から
実際に記録することにより、最も容易に目で見ることが
できる。

第５図には、本発明の方法の第二の態様が示されてお
り、この場合には、クリーニング／コンディショニング
／測定操作期間中に印加される特定の電圧シグナルは、
Au/TPA環境に適応されている。この態様では、クリーニ
ング溶液、コンディショニング溶液および測定溶液が全
部、異なっている。詳細に言えば、時点t₆において、ク
リーニング工程が始まり、水酸化ナトリウム（NaOH）の
クリーニング溶液がセル12に導入される。ピークの大き
さが＋2.0ボルトであるシグナルパルスが印加される時
点t₇まで、その電圧は０ボルトの一定値に保持する。次
いで、時点t₈で、この電圧を−0.2ボルトに戻し、時点t
₁₀までこの電圧を維持する。時点t₈と時点t₁₀との間の
中間時点t₉において、クリーニング溶液を、ポンプ16に
よって除去し、次いでコンディショニング溶液をセル12
に供給し、コンディショニング操作を始める。このコン
ディショニング溶液は有利には、対象アナライトをセル
12に供給するブランク緩衝溶液であることができる。時
点t₁₀において、ほぼ２期間の三角形波形を、コンディ
ショニング工程に印加する。この波形はまず−1.0ボル
トに向って下降方向に向かい、次いで＋２ボルトのピー
クまで上昇方向に向かう。コンディショニング工程は、
時点t₁₁で、印加電圧を＋0.4ボルトの操作前電位に下降
方向で移動させることによって、停止する。その後、作
用電極56,58は、時間t₁₂まで、測定試料導入のために、
この操作前電位に維持することができる。この時点で、
印加電圧をこの操作前電圧から−1.0ボルトに下降方向
で変え、次いで測定工程期間中、上昇方向で、変える。
この場合に、実際の測定は時点t₁₃から時点t₁₄までの間
に、測定窓を通して行われる。

本発明に係る方法の上記２つの態様は、それらの特定の
化学的環境に対して特異的であり、本発明はこれら２つ
の特定の例に制限されないものと理解されるべきであ
る。しかしながら、これらの２つの態様は、有利な結果
が得られる、本発明の局面を示している。これらの態様
は両方ともに、クリーニングおよびコンディショニング
の両方の成果が得られるクリーニング工程およびコンデ
ィショニング工程を包含している。さらにまた、これら
の態様では両方ともに、印加される電圧を、操作前電位
に達するまで、予め定められた方向で変えることによっ
て、それらの操作前電位がそれぞれ得られる。これらの
２つの態様は両方ともに、この予め定められた方向を下
降方向として有するが、本発明の別の態様では、操作前
電位を得るために、印加電圧を上昇方向で変えることも
できる。

選ばれたクリーニング工程およびコンディショニング工
程の後、印加電圧を予め定められた方向で変え、予め定
められた操作前電位に到達させることによる、この停止
方法の重要性は、これによって、作用電極56,58の表面
が、この系の精度を改善するために、制御して反復する
ことができるECL測定のための初期条件を決定する、再
現性のある制御された状態におかれることにある。さら
にまた、作用電極56,58の表面が、この制御された表面
状態に到達すると、その後、この表面状態は、測定工程
が開始されるまでのいずれの期間の間も、維持すること
ができる。印加電圧を予め定められた電位に保持するこ
とによって、作用電極56,58の条件調整された表面状態
は、変化することなく保持されるものと考えられる。さ
らにまた、操作前位置が制御可能に達成されておらず、
また維持されていない、従来技術系ではいずれも、作用
電極56,58に現われる電圧におけるゆらぎまたは変化
が、結果の変動および従来技術において見い出される精
度の欠落の原因であると考えられる。

従って、第４図に点線で示されているように、測定工程
は、時点t₅で必ずしも始める必要はなく、むしろ早い時
点t₁₅、中間時点t₂およびt₃のいずれの時点でも開始す
ることができる。確かに、第５図に点線で示されている
ように、本発明による方法は、コンディショニング工程
が終了したならばすぐに、すなわち電圧を予め定められ
た方向で変えることによって、操作前電位がコンディシ
ョニング工程の終了時点で達成された時点で測定工程を
始める場合には、この操作前電位をいずれかの時間にわ
たり保持する必要はない。Pt/オキザレート環境では、
コンディショニング工程の停止時点における作用電極5
6,58の表面状態は酸化された状態であると信じられる。
この酸化状態にある表面に、測定工程が始まるまで、＋
1.1ボルトの予め定められた電位が保持されるものと信
じられる。

相応して、Au/TPA環境では、コンディショニング工程の
停止時点における、作用電極56,58の表面状態は、還元
された状態にあるものと信じられ、操作前電位＋0.4ボ
ルトがこの還元状態の表面に保持されるものと信じられ
る。

電極に印加する電圧は、クリーニング工程、コンディシ
ョニング工程及び試料測定工程のそれぞれにおいて、−
５ボルト〜＋５ボルトの広い範囲にわたることができ
る。好ましくは、これらの電圧は、これらの工程のそれ
ぞれにおいて、＋1.5ボルト〜＋３ボルトの間で変え
る。使用する正確な数値の決定は、十分に当該技術の範
囲内にある。

クリーニング工程、コンディショニング工程および試料
測定工程のそれぞれの、開始から終了までの経過時間
は、10マイクロ秒から数分間まで広く変えることがで
き、代表的には、１ミリ秒〜40秒の範囲である。この点
でも、当業者は、各工程のそれぞれに対して最適の時間
を、いずれか与えられた系に関して決定することができ
る。

本発明による方法の追加の例を、ここで特定の化学的／
機械的環境の完全な記述によって、示す。

例Ｉ Pt/オキザレート環境方法および材料１）溶液ａ）試料測定緩衝液ｂ）クリーニング／コンディショニング溶液：（ａ）と
同一。

ｃ）試料測定緩衝液中のTAGRu(bpy)_３Cl_２（MW＝749g/
モル）の較正溶液は、1mM、１μＭ、および1nMの原液か
ら調整した。

Ru（bpy）_３は、トリス（2,2′−ビピリジル）ルテニウ
ム（II）である。

２）装置三電極セル操作ａ）流通通過式セル：作用電極−１個または２個ともに、Ptディスク対極−ステンレス鋼製フェースプレート参照電極−Ag/AgCl テフロンガスケット（.030″厚み）ステンレス鋼／プレキシガラスフェースプレート入口管＝.042″同上ポリプロピレン吸引速度 2ml/分ｂ）ポテンショスタット： Princeton Applied Research Model 273 ｃ）ルミネセンス測定系（luminometer）： Berthold Biolumat LB9500T（光子計測） PMT＝Hamamatsu R374（低量赤色感受性管） PMT電圧＝＋1375V 電流および光量子出力は、kipp＆Zonen記録計で記録し
た。

二電極セル操作作用電極として、１個だけのPtディスクを使用し、もう
一つのPtディスクは対／参照組合せ電極として使用する
点でだけ、三電極セル操作を変えた。

３）ECL測定サイクル（三電極セル操作）ａ）クリーニング／コンディショニング方法：クリーニング／コンディショニング溶液1.0mlを、流通
通過式ECLセル中に吸引した。この溶液を静止させてお
き、＋1.5V〜−0.7V（Ag/AgClに対して）のパルスをポ
テンショスタットから60秒間、各電位で３秒のパルス巾
で印加した。この印加電位を次いで＋1.5Vに進め、この
電位を10秒間維持し、次いで＋1.1Vの保持または操作前
電位に進めた。本発明に従い、この操作前電位は、測定
工程が始まるまで保持することができる。

ｂ）試料測定方法印加電位を、＋1.1Vに保持しながら、試料溶液1.0mlを
流通通過式ECLセル中に吸引した。この試料溶液の流動
は、静止測定のために止めた。次いで、印加電位を、50
mV/秒で、＋1.1Vから1.9Vに掃引して、ECLを測定する、
測定掃引を行なった。

４）ECL測定サイクル（二電極セル操作）電位を変えると、参照電位における変化に反映する。

ａ）クリーニング／コンディショニング方法：クリーニング／コンディショニング溶液1.0mlを、流通
通過式ECLセル中に吸引した。この溶液を静止させてお
き、＋2.2V〜−2.2Vのパルス（Pt擬−参照／対極に対し
て）を、ポテンショスタットから、各電位で３秒間のパ
ルス巾で、60秒間、印加した。この印加電位を次いで、
＋2.2Vに進め、この電位を10秒間維持し、次いで＋1.5V
の操作前電位に進めた。この操作前電位はまた、測定工
程が始まるまで保持することができる。

ｂ）試料測定方法：印加電位を＋1.5Vに保持しながら、試料溶液1.0mlを流
通通過式ECLセル中に吸引した。静止測定のために、こ
の試料溶液の流動を止めた。次いで、印加電圧を、50mV
/秒で、＋1.5Vから＋2.5Vに掃引し、ECLを測定する、測
定掃引を行なった。

データ−Pt/オキザレート環境に係る例Ｉ１）本発明による方法を使用して得られたデータを、異
なる方法を使用して得られたデータと、次いで比較し、
ポテンショスタットの転換の効果およびクリーニング／
コンディショニング工程を試料測定工程との間に、クリ
ーニング処理／コンディショニングで処理された電極を
空気および水にさらす効果を測定した。この異なる方法
として使用された方法は、オープンサーキットクリーニ
ングを表す「OCC」と称されている「ビーカー式」また
はバッチ式ECL法をまねて、この流通通過式セルを操作
する方法であった。本発明による方法では、操作前電位
を、測定工程が始まるまで保持した。この方法は、クロ
ーズドサーキットクリーニングに係り「OCC」と称する
ことにする。

ａ）二電極形式：この実験を二電極形式で先ず行なっ
た。

そのデータは下記のとおりである。

このデータは、CCCのデータの精度が、OCCのデータの精
度に比較して、格別に改善されていることを示してい
る。この効果は、ECL測定を真に反復可能にする、本発
明の極めて有利な特徴である。

ｂ）三電極形式：三電極形式においては、OCC法は、ポ
テンショスタットの転換を包含したが、電極は水または
空気にさらさなかった。この場合に、特定のTAG溶液は1
00nMの濃度を有していた。データは、下記のとおりであ
る。

この場合もまた、CCCのデータは優れた精度を示してい
る。％CVは、２ポイントだけのために計算できないが２
つのOCCのポイントは広く離れている。

２）次いで、得られたデータを比較し、この特定の環境
において、試料測定溶液が測定工程の期間中、すなわち
ECL分子が発光するように誘導されている期間中、流動
しているか、または静止しているかによる効果を評価し
た。このデータは下記のとおりである。流動速度（ml/分） ECLカウント 0.0 （静止） 15,380 2.1 13,100 3.7 12,560 5.0 12,420 緩衝液中の100nMTAGを使用すると、流動ECLカウントは
幾分減少したが、静止ECLカウントの80％のレベルにあ
った。

３）次いで、得られたデータを比較し、各測定工程の前
にそれぞれ、電極のクリーニングおよびコンディショニ
ング工程を行なった場合の効果を、測定工程の間にクリ
ーニングまたはコンディショニングを行なわずに、順次
測定工程を行なった場合に比較して評価した。これらの
２種の異なる条件の下に、２種の異なる測定溶液を試験
した。電極は、全ての場合に、１回目の測定工程の前
に、クリーニング／コンディショニングを行なった。

ａ）測定溶液は緩衝液中のTAGであった。

ｉ）クリーニング／コンディショニング行なわない場合
（×1000カウント） 7.50,6.00,5.00,4.25,3.70 平均＝5.29（28.5％CV） ii）クリーニング／コンディショニングを行なった場合
（×1000カウント） 7.45,7.50,7.60,7.55,7.50,7.70 平均＝7.55（1.2％CV）ｂ）測定溶液は２％血清（GIBOC Labs）/98％緩衝液中
のTAGであった。

ｉ）クリーニング／コンディショニングを行なわない場
合（×1000カウント）： 3.92,1.72,0.36,0.20 平均＝1.55（111％CV） ii）クリーニング／コンディショニングを行なった場合
（×1000カウント）： 3.92,4.25 平均＝4.09 両方の場合において、クリーニングおよびコンディショ
ニングを行なった場合の測定は、格別に優れた精度を示
す。これは、各測定工程の前に行なわれる、実質的に同
一のクリーニングおよびコンディショニング工程によっ
て確立される制御された初期状態によるものであると信
じられる。

例II Au/TPA環境方法および材料１）溶液ａ）TPA（トリプロピルアミン）緩衝液組成は下記のと
おりであった： 30.8g KH₂PO₄・H₂O 111.4g Na₂PO₄・7H₂O 19.1ml トリプロピルアミン NaOH（50％）によりpH7.5に調整 1.0ml Triton×−100（TM）（非イオン性界面活性剤） 1.0ml Tween20（TM）（非イオン性界面活性剤）水を加えて、2.0にした。

ｂ）較正溶液 TPA緩衝液（上記参照） TAG（例Ｉに記載の通り） TAG−抗体（TAG−Ab）この抗体は、Kirkegaard ＆ Perry Laboratories,Inc.
（KPL）,2Cessna Court,Gaithersburg,MD20879から入手
した、ヤギ抗マウス抗体であった。抗体のTAGへの結合
は、通常の文献記載のカップリング法を使用して、アル
デヒド官能性基を経て行なった。この結合体TAG−Abは
精製した。

ｃ）クリーニング溶液 H₂O中の0.2M NaOH 0.5％Triton×−100 ｂ）試料測定溶液： TPA緩衝液（100％）５％ハイブリードマ増殖培地 TAG−Ab:抗体に結合させたRu（bpy）₃Cl₂ （MW＝749g/モル）。

５％ハイブリドーマ増殖培地（HGM）は、J.R.Scientifi
c,Inc.,One Harter Avenue,Suite8.Woodland,Californi
a95695から入手した。

Iscove's Modified Dubecco's Media（IMDM）の希釈さ
れ、修飾させた形態である。Dulbecco,R.およびFreema
n,G.（1959）Virology8.398頁、Smith,J.D.,Freeman,
G.,Vogt,M.およびDulbecco,R.（1960）Virology12,155
頁参照。Tissue Culture Standards Committee,In Vitr
o5:2,93頁およびIscove,N.N.およびMelchers,F.J.Exper
imental Medicine147,923頁。100％HGMは、200mIMDM（J
R Scientific lot C077201）、40ml牛胎児血清（バッチ
67,HI）、2ml 5×10^-3M2−メルカプトエタノール（バッ
チ39）、2mlカナマイシン硫酸塩（10,000mg/ml、lot13N
2672、4mlHAT（10^-2ヒポキサンチン、４×10^-5Mアミノ
プテリン、1.6×10^-3Mチミジン；ストックGIBCO）、40m
l1゜MCM一次ミクロファージコンディショニング培地（1
1/7/86、採取４）を含有する。これを20分の１に、緩衝
溶液で希釈し、５％HGMを調整する。

２）装置（三電極セル操作のみ）ａ）流通通過式セル：作用電極−両方ともに、Auディスク対極−ステンレス鋼フェースプレート参照電極−Ag/AgCl テフロンガスケット（.030″厚さ）ステンレス鋼／プレキシガラスフェースプレート人口管＝.042″同上ポリプロピレン吸引速度＝2ml/分ｂ）ポテンショスタット： Oxford ｃ）ルミネセンス測定計： Berthold Riolemat LB9500T（光子カウンテイング） PMT＝Hamamatsu R374（低量赤色感受性管） PMT電圧＝＋1350V 電流および光子出力は、Kipp＆Zonen記録計で記録し
た。

３）ECL測定サイクル（三電極セル操作）クリーニング／コンディショニング／試料測定方法：このデータの採取に使用された総サイクルは、６工程で
あった。各工程には同一の印加電圧波形を使用した。各
サイクルは、２回のコンディショニング工程（溶液は流
動させる）、１回の試料測定工程（測定溶液は流動また
は静止）、２回のクリーニング工程、この工程の後毎に
１回のコンディショニング工程を行なう（コンディショ
ニング溶液は流動させる）を有した。この電気化学的サ
イクルでは、各工程に、下記の印加電圧掃引を一定の50
0mV/秒で使用した：＋0.3Vから−0.7Vに、＋2.2Vに、そして＋0.3Vに戻す試料容積は1.0mlであった。

データーAu/TPM環境１）下記のデータは、例Ｉの１）のデータに相当し、こ
れらのデータは、クリーニング／コンディショニング工
程と試料測定工程との間における、ポテンショスタット
の転換効果を評価するために得た。この場合に、電極は
空気にも、水にもさらさなかった。操作前電位は＋0.4V
酸化状態であった。

TAG−Abを測定するCCC法の％CVは、OCC法に比較して約5
0％小さく、他方、ブランク緩衝液％CV CCC/OCC比はさ
らに小さい。

これらの結果を確認するために、この試験を再度行な
い、次のデータを得た。

これらの結果は、OCC法が、有利な初期状態を破壊する
無作為の電圧ゆらぎに対して防護されていないことを証
明する点で、１回目の試験よりもさらに明瞭である。

２）下記のデータは例Ｉの２）のデータに相当し、これ
らのデータは、測定工程中に、測定溶液が流動している
か、あるいは静止しているかの効果を証明するものであ
る。この場合に、TAGはRu（フェナントロリン）であっ
た。この化合物はトリス（ジスルホネート化4,7−ジフ
ェニル−1,10−フェナントロリン）ルテニウム（II）で
ある。印加電圧波形は、Ag/AgCl参照に対して、−0.5V
の一定の下限電圧を有するパルス波形であった。上限電
圧値を＋1.35〜＋2.55Vで変えて、別々の測定を行なっ
た。データを第６図に示す。Au/TPA環境に関して、溶液
が流動している場合の増強は見られない。

３）下記のデータは、ECLデータの大きさに対する、操
作前電位の選択の効果およびこの電位に近づく方向の選
択の効果を評価し、またその検出限界、すなわち効果的
に測定することができる最小濃度を測定するために採取
したものである。操作前電位に、下降方向で、すなわち
高い電圧から近づいた場合には、電極表面は、比較的酸
化されているものと考えられ、従って、下降接近によっ
て得られた操作前電位を「酸化」と表示する。これに対
し、操作前電位に、低い電圧から上昇方向で接近した場
合には、電極表面は、比較的還元されているものと考え
られ、従って、この上昇接近によって得られた操作前電
位を「還元」と表示する。

これらの試験では、第５図に示されているタイプの電圧
波形を使用した。この波形は、酸化操作前電位の場合
は、そのまま使用されたが、還元操作前電位の場合は、
コンディショニング掃引の余分の半サイクルを加えた波
形を使用した。

下記のデータはまた、最良の結果を得るためには、試料
測定溶液が異なるたびに、異なる操作前電位が要求され
ることがあることを証明している。

ａ）この場合には、測定溶液は100％緩衝溶液中の、抗
体に結合されたTAG（TAG−Ab）であった。ブランク溶液
は100％緩衝液であった。データは表１に示した通りで
あった。

（Ｓ）試料および（Ｂ）ブランクの欄で、上の方のデー
タはECLカウントであり、そして下の方のデータは％CV
である。これらの条件の下に、操作前電位を0.44V酸化
で最適にした場合に、TAG−Ab測定値（Ｓ）は、その他
の被験操作前電位のいずれの場合よりも、約４倍大き
い。さらにまた、シグナル対ブランク比S/Bはまた、２
〜５倍大きい。このように、本発明によれば、低濃度の
ECL分子効果的に検出することができる。

ｂ）100％緩衝液中の、TAG−Abの溶液に係り選択された
操作前電位は、他の溶液に対する最良の操作前電位では
必ずしもない。このことを証明するために、同一濃度の
TAG−Abを95％緩衝溶液および５％HGM（ハイブリドーマ
増殖培地）と組合せた。この一つの変化を与えて、同一
試験を行なった場合に得られたデータを、表２に示す。

TAG−Abの濃度は変えられていないので、この検出され
たTAG−AbシグナルＳは変化しないものと予想された。
しかしながら、この場合のデータは、別の操作前電位で
得られたデータ値とほぼ等しい値にまで減少する。Ｓの
数値がいずれも、最適化されていない操作前電位に係る
表１に示されている数値にほぼ等しいことは確かなこと
である。この第二の測定溶液のための最適操作前電位は
約＋0.60V酸化されたものと推定される。

４）生物学的マトリックスの試料、すなわち免疫検定が
ECL流通通過式セル中で効果的に測定できることを証明
するために、下記のデータを得る。この場合に、TAGは
抗ヒトIgGと結合させた。３回の測定を行ったが、６種
の濃度のECL分子のそれぞれにおいて、本発明によるク
リーニングおよびコンディショニング工程を、それぞれ
先行させた。データを表３に示す。

抗ヒトIgb（ng/ml）の免疫検定/ECL検出の例各％CV値がいずれも、生物学的マトリックスが作用電極
に吸着されることが予想されるタンパク質およびその他
の分子を包含しているにもかかわらず、低いことが判
る。従って、測定は、装置を手でクリーニングするため
に分解することなく、順次行うことができる。

例III Pt/TPA環境１）次いで、測定工程中に、測定溶液を流動させること
による効果を、測定溶液が静止されている場合と比較す
るために、データを採取した。

この試験において、溶液および装置は、作用電極デイス
クが白金から形成されている以外は、Au/TPM環境におけ
るデータの項（２）におけるものと同一であった。同一
の印加電圧波形を使用した。

データを第７図に示す。試料測定溶液が流動している場
合には、静止測定に比較して、＋1.8Vまたはそれ以上の
上限電圧を用いる測定で、劇的な増強を見い出すことが
できる。

本明細書において、本発明の態様を、添付図面を引用し
て詳細に説明したが、本発明がこれらの制限されないこ
と、そしてまた、請求の範囲に規定されている、本発明
の範囲および精神から逸脱することなく、種々の変更お
よび修正が当業者によってなされうることは、明白であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者レランド，ジョナサンケイ. アメリカ合衆国20877 メリーランド州ゲイサーズバーグ，アパートメント２，ノースサミットアベニュー 384 (56)参考文献特開昭56−6162（ＪＰ，Ａ) 特開昭56−155834（ＪＰ，Ａ) 米国特許4166755（ＵＳ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】電気化学ルミネセンス試薬によって発せら
れる電磁放射の強度によって電気化学ルミネセンス現象
を測定するのに適するセルの作用電極をそのままの状態
で操作する方法において、（ａ）上記作用電極に、少なくとも一種の溶液の存在の
下に、可変性電圧を印加することによって、この作用電
極をクリーニングおよびコンディショニングする工程；（ｂ）上記可変性電圧を、予め定められた操作前電位に
達するように、予め定められた方向で変えることによっ
て、上記クリーニングおよびコンディショニングの工程
を停止する工程；および（ｃ）操作前電位がすでに確立され、かつ上記作用電極
に印加される電圧を上記操作前電位に対して変える前の
時点で電気化学ルミネセンス試薬によって発せられた電
磁放射の強度を測定することに向けられた測定工程を開
始する工程、を含む上記方法であって、上記試薬は有効な放射源からの有効量の電気化学エネル
ギーに暴露すると電磁放射を繰り返し発するように誘導
することができるものであり、上記作用電極は、測定工
程の開始から測定工程の間を通して、電気化学ルミネセ
ンス試薬を含む試料溶液に連続的に暴露され、そして上
記作用電極に印加された電圧は測定工程の間中、上記操
作前電位に対して変化するものである、上記方法。
【請求項２】上記測定工程を、上記可変性電圧が、上記
クリーニングおよびコンディショニングの工程を停止す
るために上記（ｂ）の工程により操作前電位に到達させ
たならば、直ちに開始する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】上記作用電極が選ばれた金属から形成され
ており、上記クリーニング／コンディショニングの工程
を、この金属に関して選択されるレドックス状態にある
上記作用電極により上記（ｂ）の工程により停止させ
る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】上記レドックス状態が、上記測定工程の開
始まで、操作前電位によって維持されている酸化状態で
ある、請求項３に記載の方法。
【請求項５】上記のクリーニングおよびコンディショニ
ングの工程を、上記試料溶液に関して選ばれるレドック
ス状態にある、上記作用電極により上記（ｂ）の工程に
より停止させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】上記のクリーニングおよびコンディショニ
ングの工程が、上記作用電極を横切る空気のパルスによ
って分離されている、クリーニング溶液のパルスを通す
ことを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】上記のクリーニングおよびコンディショニ
ングの工程が、上記作用電極にクリーニング溶液の存在
の下に、第一の可変性電圧を印加することにより、この
作用電極をクリーニングする工程および上記作用電極に
コンディショニング溶液の存在の下に、第二の可変性電
圧を印加することによって、この作用電極をコンディシ
ョニングする工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】上記測定工程が、上記作用電極を上記試料
溶液にさらしながら、この作用電極に印加される電圧
の、少なくとも一つの掃引を包含し、この掃引はそれぞ
れ、上記試料溶液のルミネセンスを誘発させるのに適す
るものである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】上記測定工程が、複数の上記掃引を包含す
る、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】上記停止工程の後に引続いて、上記作用
電極を上記操作前電位に、上記測定工程の開始まで連続
的に保持する工程を行なう、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】電気化学ルミネセンス試薬によって発せ
られる電磁放射の強度によって電気化学ルミネセンス現
象を測定するのに適する電気化学ルミネセンスアッセイ
セルの作用電極をそのままの状態で操作するための装置
において、（ａ）その中に溶液を受け入れるのに適している、電
気化学ルミネセンス測定を行なうためのセル手段；（ｂ）上記セル手段と組合されており、上記セル手段
内の溶液にさらされるのに適している作用電極手段；（ｃ）上記セル手段に選ばれた溶液を供給するための
流体輸送手段；（ｄ）少なくとも、上記セル手段がその中に少なくと
もクリーニング溶液を含有している電気化学的クリーニ
ング操作中、および上記セル手段がその中に少なくとも
コンディショニング溶液を含有しているコンディショニ
ング操作中、上記作用電極に選ばれた電圧シグナルを供
給するための電圧供給源に接続するのに適している電圧
制御手段を含み、ここでこの電圧制御手段は、印加電圧
シグナルを予め定められた方向で変え、予め定められた
操作前電位に到達させることによって、上記コンディシ
ョニング操作を停止させるものであり、上記セル手段は、上記電圧制御手段が上記作用電極に印
加される電圧シグナルを上記操作前電位から変化させる
前に、測定工程のための上記流動輸送手段によって試料
溶液を供給されており、上記試薬は有効な放射源からの有効量の電気化学エネル
ギーに暴露すると電磁放射を繰り返し発するように誘導
することができるものであり、上記測定工程は操作前電位がすでに確立され、かつ上記
作用電極に印加される電圧を上記操作前電位に対して変
える前の時点で電気化学ルミネセンス試薬によって発せ
られた電磁放射の強度を測定することに向けられてお
り、上記電圧制御手段はまた電気化学ルミネセンス誘導ポテ
ンシャルを供給するものであり、上記作用電極は、測定工程の開始から測定工程の間を通
して、電気化学ルミネセンス試薬を含む試料溶液に連続
的に暴露され、そして上記作用電極手段に印加された電
圧は測定工程の間中、上記操作前電位に対して変化する
ものである、上記装置。
【請求項１２】上記電圧制御手段が、上記作用電極を、
上記操作の停止から上記測定工程の開始まで、上記操作
前電位に連続的に維持する、請求項11に記載の装置。
【請求項１３】上記作用電極が選ばれた金属から形成さ
れており、上記コンディショニング操作がこの金属に関
して選ばれるレドックス状態にある上記作用電極により
上記（ｄ）に記載のように停止される、請求項11に記載
の装置。
【請求項１４】上記レドックス状態が、上記測定工程の
開始まで、上記操作前電位によって維持されている酸化
状態である、請求項13に記載の装置。
【請求項１５】上記レドックス状態が、上記測定工程の
開始まで、上記操作前電位によって維持されているレド
ックス状態にある、請求項13に記載の装置。
【請求項１６】生物学的マトリックス中で電気化学ルミ
ネセンス分子の分析を行なう方法において、（ａ）上記生物学的マトリックスの試料および電気化
学ルミネセンス分子を含有する溶液を、電気化学的エネ
ルギー源を包含する流通通過式セル中に流入する工程；（ｂ）このエネルギー源を上記溶液にさらす工程；（ｃ）上記溶液を或る量の電気化学的エネルギーにさ
らすように上記エネルギー源を操作し、上記分子の電磁
放射線の反射放射を誘発させる工程；（ｄ）放射された電磁放射線の強度を検出する工程；
および（ｅ）上記溶液を上記セルの外に流出させる工程を含
む方法であって、上記電気化学ルミネセンス分子は有効な放射源からの有
効量の電気化学エネルギーに暴露すると電磁放射線を繰
り返し発するように誘導することができるものである上
記方法。
【請求項１７】第二の生物学的マトリックスで第二の分
析を行なうために、上記工程（ａ）〜（ｅ）を反復する
工程をさらに含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】生物学的マトリックス中で電気化学ルミ
ネセンス分子の分析を行なう方法において、（ａ）上記生物学的マトリックスの試料および電気化
学ルミネセンス分子を含有する溶液を流通通過式セル中
に流入する工程；（ｂ）この試料を或る量の電気化学的エネルギーにさ
らし、上記分子に電磁放射線の反復放射を誘発させる工
程；（ｃ）放射された電磁放射線の強度を検出する工程；
および（ｄ）上記溶液を上記セルの外に流出させる工程を含む方法であって、上記電気化学ルミネセンス分子は有効な放射源からの有
効量の電気化学エネルギーに暴露すると電磁放射線を繰
り返し発するように誘導することができるものである上
記方法。
【請求項１９】第二の生物学的マトリックスで第二の分
析を行なうために、上記工程（ａ）〜（ｅ）を反復する
工程をさらに含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】生物学的マトリックスで電気化学ルミネ
センス分子の分析を行なう方法において、（ａ）溶液を流通通過式セルに流入する工程、この工
程において、上記溶液は、電気化学ルミネセンス分子、
三級アルキルアミン成分および緩衝成分を含有してお
り、上記分子および上記三級アルキルアミン成分は、印
加される電気化学エネルギーに応答して、化学的に反応
し、この分子に電磁放射線の放射を誘発させるものであ
る；（ｂ）上記分子に電磁放射線の反復放射を誘発させる
工程；（ｃ）放射された電磁放射線の強度を検出する工程；
および（ｄ）上記溶液を上記セルの外に流出させる工程を含む方法であって、上記電気化学ルミネセンス分子は有効な放射源からの有
効量の電気化学エネルギーに暴露すると電磁放射線を繰
り返し発するように誘導することができるものである上
記方法。
【請求項２１】上記三級アルキルアミン成分がトリプロ
ピルアミンを包含し、上記電気化学的エネルギーが白金
作用電極から印加され、そして上記溶液が上記誘発工程
の期間中、流動している、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】上記溶液が誘発工程の期間中、流動して
いる、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】第二の生物学的マトリックスで第二の分
析を行なうために、上記工程（ａ）〜（ｄ）を反復する
工程をさらに包含する、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】それぞれの電気化学ルミネセンス分子を
含有する分析試料の測定を行なう方法において、この方
法が、（ａ）分析測定セルを初期化する工程、ここでこの初
期化工程は、上記セルの作用電極を、このセル中に少な
くとも一種の第一の溶液を流入することによってクリー
ニングおよびコンディショニングし、この作用電極を第
一の溶液にさらし、次いでこの第一の溶液を上記セルの
外に流出させることを包含しており；（ｂ）分子の電気化学ルミネセンスを測定する工程、
ここでこの測定工程は、上記試料の中の第一のものを含
有する少なくとも一種の第二の溶液を上記セル中に流入
し、上記作用電極をこの第二の溶液にさらし、この試料
を上記作用電極からの電気化学的エネルギーにさらすこ
とによって、この試料に、電磁放射線の放射を誘発さ
せ、この放射された電磁放射線の強度を検出し、次いで
上記第二の溶液を、上記セルの外に流出させることを包
含しており；而して、上記の初期化工程および測定工程は、上記試料
中のそれぞれのものの順次測定を行なうために、交互様
相で反復できるものである、を含む方法であって、上記電気化学ルミネセンス分子は有効な放射源からの有
効量の電気化学エネルギーに暴露すると電磁放射線を繰
り返し発するように誘導することができるものである上
記方法。
【請求項２５】電気化学ルミネセンスの分子の分析を行
うための装置において、（ａ）電気化学ルミネセンス分子を含有する溶液を受
け入れるのに適しているセル手段、（ｂ）上記セル手段と作用上組み合わされており、上
記溶液に作用的にさらすのに適している作用電極手段、
および（ｃ）上記作用電極に選ばれた電圧シグナルを供給す
るため、電圧供給源に作用的に接続するのに適している
電圧制御手段、ここで該電圧制御手段は、上記セルを初
期化するための選ばれた操作前電圧シグナルおよび上記
分子の電気化学ルミネセンスを誘起するための選ばれた
測定電圧シグナルを供給するものである、を含む方法であって、上記電気化学ルミネセンス分子は有効な放射源からの有
効量の電気化学エネルギーに暴露すると電磁放射線を繰
り返し発するように誘導することができるものである上
記方法。