CN109609595A - 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒及其应用 - Google Patents

一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，属于生物检测技术领域。该试剂盒由试剂R1和试剂R2组成；试剂R1包括：胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、磷脂酶、过氧化氢酶、显色剂和缓冲液；试剂R2包括：过氧化物酶、4‑氨基安替比林、防腐剂和缓冲液。试剂R1还包括壳多糖。该试剂盒采用过氧化物酶法进行测定，具有准确性高、特异性高且线性范围广等优点。

Description

一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒及其应用。
背景技术
人血清中的脂蛋白根据密度不同，主要分为：乳糜微粒(chylomicrons，CM)、极低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein，VLDL)、中间密度脂蛋白(intermediate-density lipoprotein，IDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)和高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)。
胆固醇又称胆甾醇，以游离胆固醇的形式或以和脂肪酸结合的胆固醇酯的形式存在于血液脂蛋白中，例如：小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等。
Fishe首次提出低密度脂蛋白颗粒具有多分散度，根据颗粒相对大小分为A、B两型，A型为较大的颗粒，B型主要由直径小于25.5nm的小颗粒组成，密度较大，可称小而密低密度脂蛋白，其所携带的胆固醇称之为小而密低密度脂蛋白胆固醇即sdLDL-C(Fisher WR.Heterogeneity of plasma LDL:manifestations of the physiologic phyenomenonin man.Metabolism,1983,32(3):283-291.)。
与普通低密度脂蛋白胆固醇相比，sdLDL-C半衰期长、穿透力强、更易被氧化，其致动脉粥样硬化能力更强，是评价冠状动脉粥样硬化性心脏病即冠心病的风险因素。因此，临床上将sdLDL-C的高低作为冠心病和动脉粥样硬化的辅助诊断指标之一。
检测sdLDL-C的方法有梯度凝胶电泳法、密度梯度超速离心法、核磁共振光谱法等。其中，美国Atherotech Diagnostics公司Vertical AutoProfile(VAP)胆固醇检测系统是一种扩展型脂质特征测定产品，可报告22种血液胆固醇成分(包括对非空腹LDL亚型及脂蛋白所有子类的直接测定)，密度梯度超速离心法是目前国际上小而密低密度脂蛋白胆固醇测定的参考方法；美国Quantimetrix公司的Lipoprint脂蛋白分类检测系统采用管式聚丙烯酰氨凝胶电泳原理，可完全分离鉴定所有脂蛋白(含7种LDL亚型，10种HDL亚型)。但上述方法有由于设备的局限性，在临床实验室无法推广。目前，通常使用清除法测定sdLDL-C，该法采用双试剂、通过清除非sdLDL-C以达到测定sdLDL-C的目的。比如，中国专利CN108410950A公开了一种高效、特异的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，该专利使用表面活性剂清除法测定sdLDL-C，适用于全自动生化分析仪检测；但是小而密低密度脂蛋白由直径小于25.5nm的小颗粒组成，表面活性剂难以对小颗粒进行准确识别、造成错误地清除sdLDL-C导致检测结果偏低的问题。再如，中国专利CN108841918A公开了一种小而密低密度脂蛋白胆固醇试剂盒，稳定性好，操作简单，但是，选用叠氮钠及放射线酮作防腐剂，对试剂R2中胆固醇酯酶的活性抑制较大，难以准确测定sdLDL-C的含量。
因此，十分需要一种准确度高的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒。
发明内容
针对现有技术在sdLDL-C含量测定过程中存在的准确性差的缺陷，本发明提供一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，该试剂盒准确性高、特异性高且具有较宽的线性范围的，适用于临床全白动或半自动生化分析。
为了实现上述技术效果，本发明采用如下技术方案实现：
一方面，本发明提供了一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1和试剂R2；
所述的试剂R1包括：胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、磷脂酶、过氧化氢酶、显色剂和缓冲液；
所述的试剂R2包括：过氧化物酶、4-氨基安替比林、防腐剂和缓冲液。
所述的试剂R1还包括壳多糖。
优选地，所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中，所述的试剂R1包括：胆固醇酯酶1000.0-3000.0U/L、胆固醇氧化酶1000.0-3000.0U/L、磷脂酶10.0-50.0KU/L、过氧化氢酶1000.0-3000.0KU/L、显色剂0.5-5.0mmol/L、缓冲液50.0-150.0mmol/L和壳多糖0.2-2.5g/L；
所述的试剂R2包括：过氧化物酶5000.0-7000.0U/L、4-氨基安替比林1.0-5.0mmol/L、防腐剂0.05-0.5mL/L和缓冲液50.0-150.0mmol/L。
更优选地，所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中，所述的试剂R1包括：胆固醇酯酶1500.0-2500.0U/L、胆固醇氧化酶1200.0-2000.0U/L、磷脂酶20.0-40.0KU/L、过氧化氢酶1500.0-2500.0KU/L、显色剂1.0-4.0mmol/L、缓冲液75.0-125.0mmol/L和壳多糖0.5-2.0g/L；
所述的试剂R2包括：过氧化物酶5500.0-6500.0U/L、4-氨基安替比林1.3-4.0mmol/L、防腐剂0.1-0.4mL/L和缓冲液75.0-125.0mmol/L。
进一步优选地，所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中，所述的试剂R1包括：胆固醇酯酶1800.0-2200.0U/L、胆固醇氧化酶1400.0-1700.0U/L、磷脂酶25.0-35.0KU/L、过氧化氢酶1800.0-2200.0KU/L、显色剂1.5-3.0mmol/L、缓冲液90.0-110.0mmol/L和壳多糖0.7-1.5g/L；
所述的试剂R2包括：过氧化物酶5800.0-6200.0U/L、4-氨基安替比林1.5-2.5mmol/L、防腐剂0.15-0.3mL/L和缓冲液90.0-110.0mmol/L。
其中，所述的显色剂为N-乙基-N-(2-羟基-3磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸和2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠中的一种或几种；优选地，所述的显色剂为N-乙基-N-(2-羟基-3磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐。
其中，所述的防腐剂为Proclin300、叠氮钠和硫柳汞中的一种或几种；优选地，所述的防腐剂为Proclin300。
其中，所述的缓冲液为pH值为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、pH值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液和pH值为7.0的硼酸盐缓冲液中的一种或几种；优选地，所述的缓冲液为pH值为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液。
再进一步优选地，所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中，所述的试剂R1包括：胆固醇酯酶2000.0U/L、胆固醇氧化酶1500.0U/L、磷脂酶30.0KU/L、过氧化氢酶2000.0KU/L、N-乙基-N-(2-羟基-3磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐2.0mmol/L、pH值为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液100.0mmol/L和壳多糖1g/L；
所述的试剂R2包括：过氧化物酶6000.0U/L、4-氨基安替比林2.0mmol/L、Proclin3000.2mL/L和pH值为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液100.0mmol/L。
所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中，还包括小而密低密度脂蛋白胆固醇标准品冻干粉2g。
另一方面，本发明还提供了一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒的使用方法：
本试剂盒适用于杜邦AR、日立7080/7170/7600/7180、迈瑞BS320、迪瑞CS600、雅培C8000、东芝TBA40FR、奥林巴斯AU2700、贝克曼DXC800、西门子ADVIA2400、罗氏P800等全自动生化分析仪。
(1)将150μL试剂R1和3μL待测样本混合均匀，37℃孵育5min后得到反应液1，测定吸光度A1，测定主波长为600nm、次波长为700nm；
(2)加入50μL试剂R2混合均匀，常温反应5min，得到反应液2，测定吸光度A2，测定主波长为600nm、次波长为700nm；
(3)按照步骤(1)-(2)，对不同浓度的小而密低密度脂蛋白胆固醇标准品的吸光度进行测定，得到吸光度A空白和A标准；
(4)以标准品的吸光度变化值ΔA(A标准-A空白)为纵坐标，以相应的标准品浓度c为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程；
(5)计算样本的吸光度变化值ΔA(A2-A1)，根据标准曲线方程，得到样本中小而密低密度脂蛋白胆固醇浓度。
本发明提供了该试剂盒在测定人血清小而密低密度脂蛋白胆固醇含量中的应用。
本发明与现有技术相比，本发明的有益效果有：
(1)本发明提供的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分简单，各试剂组分以较优浓度进行配比即可准确测定sdLDL-C含量，线性范围可达3.0mmol/L；
(2)本发明提供的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中，过氧化氢酶以1000.0KU/L的浓度即可清除非sdLDL(HDL、VLDL、CM)、减少其对sdLDL-C含量测定的干扰；
(3)本发明提供的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中，以较为安全生物防腐剂Proclin300作为防腐剂，能够较好地保持体系中酶的活性，以0.1-0.5mL/L的浓度即可维持试剂的稳定性；
(4)本发明提供的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒通过添加壳多糖，准确度显著提高，理论浓度与实测浓度的线性相关系数r≧0.9900；
(5)本发明提供的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，所需标本量少(3μL血清即可)，且基本不受血红蛋白、胆红素、抗坏血酸和甘油三酯等影响；当红蛋白、胆红素、抗坏血酸和甘油三酯分别高至5g/L、400mg/L、500mg/L和10g/L时，对sdLDL-C测定无明显影响。
附图说明
图1为小而密低密度脂蛋白胆固醇标准曲线。
图2为小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒线性范围。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
测试条件与方法：
仪器：日立7080全自动生化分析仪
参数：
主波长 600nm 样品 3μL
次波长 700nm 试剂R1 150μL
反应温度 37℃ 试剂R2 50μL
反应方向 升方向 反应类型 终点法
操作步骤：
实施例1
本实施例的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：
试剂R1包括：胆固醇酯酶1000.0U/L、胆固醇氧化酶1000.0U/L、磷脂酶10.0KU/L、过氧化氢酶1000.0KU/L、2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸0.5mmol/L、pH值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液50.0mmol/L和壳多糖0.2g/L；
试剂R2包括：过氧化物酶5000.0U/L、4-氨基安替比林1.0mmol/L、叠氮钠0.05mL/L和pH值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液50.0mmol/L。
实施例2
本实施例的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：
试剂R1包括：胆固醇酯酶3000.0U/L、胆固醇氧化酶3000.0U/L、磷脂酶50.0KU/L、过氧化氢酶3000.0KU/L、2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸5.0mmol/L、pH值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液150.0mmol/L和壳多糖2.5g/L；
试剂R2包括：过氧化物酶7000.0U/L、4-氨基安替比林5.0mmol/L、叠氮钠0.5mL/L和pH值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液150.0mmol/L。
实施例3
本实施例的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：
试剂R1包括：胆固醇酯酶1500.0U/L、胆固醇氧化酶1200.0U/L、磷脂酶20.0KU/L、过氧化氢酶1500.0KU/L、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠1.0mmol/L、pH值为7.0的硼酸盐缓冲液75.0mmol/L和壳多糖0.5g/L；
试剂R2包括：过氧化物酶5500.0U/L、4-氨基安替比林1.3mmol/L、硫柳汞0.1mL/L和pH值为7.0的硼酸盐缓冲液75.0mmol/L。
实施例4
本实施例的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：
试剂R1包括：胆固醇酯酶2500.0U/L、胆固醇氧化酶2000.0U/L、磷脂酶40.0KU/L、过氧化氢酶2500.0KU/L、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠4.0mmol/L、pH值为7.0的硼酸盐缓冲液125.0mmol/L和壳多糖2.0g/L；
试剂R2包括：过氧化物酶6500.0U/L、4-氨基安替比林4.0mmol/L、硫柳汞0.4mL/L和pH值为7.0的硼酸盐缓冲液125.0mmol/L。
实施例5
本实施例的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：
试剂R1包括：胆固醇酯酶1800.0U/L、胆固醇氧化酶1400.0U/L、磷脂酶25.0KU/L、过氧化氢酶1800.0KU/L、N-乙基-N-(2-羟基-3磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐1.5mmol/L、pH值为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液90.0mmol/L和壳多糖0.7g/L；
试剂R2包括：过氧化物酶5800.0U/L、4-氨基安替比林1.5mmol/L、Proclin3000.15mL/L和pH值为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液90.0mmol/L。
实施例6
本实施例的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：
试剂R1包括：胆固醇酯酶2200.0U/L、胆固醇氧化酶1700.0U/L、磷脂酶35.0KU/L、过氧化氢酶2200.0KU/L、N-乙基-N-(2-羟基-3磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐3.0mmol/L、pH值为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液110.0mmol/L和壳多糖1.5g/L；
试剂R2包括：过氧化物酶6200.0U/L、4-氨基安替比林2.5mmol/L、Proclin3000.3mL/L和pH值为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液110.0mmol/L。
实施例7
本实施例的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒组分及其浓度如下：
试剂R1包括：胆固醇酯酶2000.0U/L、胆固醇氧化酶1500.0U/L、磷脂酶30.0KU/L、过氧化氢酶2000.0KU/L、N-乙基-N-(2-羟基-3磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐2.0mmol/L、pH值为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液100.0mmol/L和壳多糖1g/L；
试剂R2包括：过氧化物酶6000.0U/L、4-氨基安替比林2.0mmol/L、Proclin3000.2mL/L和pH值为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液100.0mmol/L。
对比例1
中国专利CN108424952A公开试剂盒。
对比例2
与实施例1相比，试剂R1中不含壳多糖。
对比例3
与实施例1相比，试剂R1中壳多糖浓度为0.1g/L。
对比例4
与实施例1相比，试剂R1中壳多糖浓度为3.0g/L。
对比例5
与实施例2相比，试剂R1中不含壳多糖。
实验例1小而密低密度脂蛋白胆固醇标准曲线
采用小而密低密度脂蛋白胆固醇标准品，sdLDL-C标准品浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mmol/L，以实施例7为例，按照上述测定步骤得到小而密低密度脂蛋白胆固醇标准曲线(如图1所示)。其中，标准品的吸光度变化值ΔA(A标准-A空白)为纵坐标，以相应的标准品浓度c为横坐标，标准曲线方程：y＝1.0217x-0.0151，R2＝0.9936。
实验例2小而密低密度脂蛋白胆固醇试剂盒线性范围的测试
使用生理盐水分别配制浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mmol/L的小而密低密度脂蛋白胆固醇标准品，分别用实施例和对比例测定sdLDL-C含量，结果如表1所示：
表1线性范围对比
结果表明：在0-3.0mmol/L浓度范围内，本发明试剂盒的测试值能够达到理论值且二者相关性较好(图2)，而对比例在样本浓度为2.0mmol/L时，测试结果远低于理论值，不能满足要求，由此可见本试剂盒的线性范围较广。
实验例3小而密低密度脂蛋白胆固醇试剂盒准确度的测试
使用实施例1-7所述试剂，测定临床样本的sdLDL-C含量。其中，将密度梯度超速离心法测得的sdLDL-C含量作为评价该试剂盒的准确度的标准。
使用本发明试剂盒测定临床样本的sdLDL-C含量(每例测定3次，计算平均值M)，将密度梯度超速离心法测得的sdLDL-C含量作为评价该试剂盒的准确度的标准，计算相对偏差。如表2所示，本试剂盒通过添加壳多糖，与密度梯度超速离心法测得结果的相对偏差均小于5％，使得sdLDL-C含量测试结果更加准确；而未添加叔壳多糖的对比例所得结果均与密度梯度超速离心法的结果偏差较大。
表2试剂盒准确度对比
实验例4干扰实验
在正常人血清中各自添加一定量的血红蛋白、胆红素、抗坏血酸和甘油三酯等，同时加入等体积的去离子水作为无干扰物血清，使用实施例1-7的sdLDL-C测定试剂盒，同时测定这些样本的浓度。以干扰程度为5％为测定系统对干扰物的最高忍受限，血清中血红蛋白5g/L以下、胆红素400mg/L以下、抗坏血酸500mg/L以下和甘油三酯10g/L以下，不影响sdLDL-C测定结果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括试剂R1和试剂R2；
所述的试剂R1包括：胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、磷脂酶、过氧化氢酶、显色剂和缓冲液；
所述的试剂R2包括：过氧化物酶、4-氨基安替比林、防腐剂和缓冲液。
2.根据权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1还包括壳多糖。
3.根据权利要求2所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1包括：胆固醇酯酶1000.0-3000.0U/L、胆固醇氧化酶1000.0-3000.0U/L、磷脂酶10.0-50.0KU/L、过氧化氢酶1000.0-3000.0KU/L、显色剂0.5-5.0mmol/L、缓冲液50.0-150.0mmol/L和壳多糖0.2-2.5g/L；
所述的试剂R2包括：过氧化物酶5000.0-7000.0U/L、4-氨基安替比林1.0-5.0mmol/L、防腐剂0.05-0.5mL/L和缓冲液50.0-150.0mmol/L。
4.根据权利要求3所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1包括：胆固醇酯酶1500.0-2500.0U/L、胆固醇氧化酶1200.0-2000.0U/L、磷脂酶20.0-40.0KU/L、过氧化氢酶1500.0-2500.0KU/L、显色剂1.0-4.0mmol/L、缓冲液75.0-125.0mmol/L和壳多糖0.5-2.0g/L；
所述的试剂R2包括：过氧化物酶5500.0-6500.0U/L、4-氨基安替比林1.3-4.0mmol/L、防腐剂0.1-0.4mL/L和缓冲液75.0-125.0mmol/L。
5.根据权利要求4所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1包括：胆固醇酯酶1800.0-2200.0U/L、胆固醇氧化酶1400.0-1700.0U/L、磷脂酶25.0-35.0KU/L、过氧化氢酶1800.0-2200.0KU/L、显色剂1.5-3.0mmol/L、缓冲液90.0-110.0mmol/L和壳多糖0.7-1.5g/L；
所述的试剂R2包括：过氧化物酶5800.0-6200.0U/L、4-氨基安替比林1.5-2.5mmol/L、防腐剂0.15-0.3mL/L和缓冲液90.0-110.0mmol/L。
6.根据权利要求5所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，其特征在于：所述的显色剂为N-乙基-N-(2-羟基-3磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸和2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠中的一种或几种。
7.根据权利要求5所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，其特征在于：所述的防腐剂为Proclin300、叠氮钠和硫柳汞中的一种或几种。
8.根据权利要求5所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液为pH值为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、pH值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液和pH值为7.0的硼酸盐缓冲液中的一种或几种。
9.根据权利要求5-8任一项所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1包括：胆固醇酯酶2000.0U/L、胆固醇氧化酶1500.0U/L、磷脂酶30.0KU/L、过氧化氢酶2000.0KU/L、N-乙基-N-(2-羟基-3磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐2.0mmol/L、pH值为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液100.0mmol/L和壳多糖1g/L；
所述的试剂R2包括：过氧化物酶6000.0U/L、4-氨基安替比林2.0mmol/L、Proclin3000.2mL/L和pH值为7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液100.0mmol/L。
10.如权利要求9所述的试剂盒在测定血清小而密低密度脂蛋白胆固醇含量中的应用。
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