KR20140027060A - 렘난트형 리포단백질 콜레스테롤의 정량 방법 및 그것을 위한 키트 - Google Patents

렘난트형 리포단백질 콜레스테롤의 정량 방법 및 그것을 위한 키트 Download PDF

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Abstract

분리 조작을 필요로 하지 않고, 간편하고 정확하게 검체 시료 내의 렘난트형 리포단백질 콜레스테롤을 정량하기 위한 방법 및 그것을 위한 키트가 개시되어 있다. 렘난트형 리포단백질을 포함하는 복수 종류의 리포단백질을 포함하는 검체 내의 렘난트형 리포단백질 콜레스테롤의 정량 방법은 (1) 렘난트형 리포단백질 이외의 리포단백질 내의 콜레스테롤을 소거하는 공정과, (2) 잔존하는 렘난트형 리포단백질 내의 콜레스테롤을 정량하는 공정을 포함한다. 공정(1)에 있어서 분자량이 40kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제이고 분자량 40kDa 이하의 소단위를 갖지 않는 콜레스테롤 에스테라아제를 작용시키고, 공정(2)에 있어서 분자량이 40kDa y이하의 콜레스테롤 에스테라아제 또는 분자량 40kDa 이하의 소단위를 갖는 콜레스테롤 에스테라아제를 작용시킨다.

Description

렘난트형 리포단백질 콜레스테롤의 정량 방법 및 그것을 위한 키트{METHOD FOR QUANTIFICATION OF REMNANT-LIKE LIPOPROTEIN CHOLESTEROL AND KIT FOR SAME}
본 발명은 렘난트형 리포단백질(RLP) 내의 콜레스테롤의 정량 방법 및 그것을 위한 키트에 관한 것이다.
혈액 중에 포함되는 리포단백질은 초원심분리에 의한 밀도의 차이로부터 킬로미크론, 초저밀도 리포단백질(VLDL), 중간밀도 리포단백질(IDL), 저밀도 리포단백질(LDL), 고밀도 리포단백질(HDL)로 나뉜다. 이들 리포단백질은 트리글리세리드나 콜레스테롤 등의 지질이나 단백질 등의 함유량이 달라 각각 생체 내에서 상이한 작용을 나타내는 것이 알려져 있다.
RLP는 킬로미크론이나 VLDL 등의 트리글리세리드의 함유량이 많은 리포단백질의 중간 대사산물이고, 통상은 신속하게 대사되어 혈액 내로부터 소실되지만 대사에 어떤 이상이 생겼을 경우 혈액 내에 정체, 축적된다. RLP는 동맥벽에 침착하기 쉬워 동맥경화 야기성 리포단백질의 하나로 생각되고 있다.
RLP 내의 콜레스테롤의 정량 방법으로서는 항아포 A-I 모노클로날 항체 및 항아포 B-100 모노클로날 항체를 함유하는 친화성(affinity) 겔에 의해 혈청으로부터 RLP를 분리하고, 분리한 RLP에 포함되는 콜레스테롤을 측정하는 방법이 알려져 있고, 그것을 위한 시약이 시판되고 있다.
한편, 최근 들어 분리 조작을 필요로 하지 않는 RLP 콜레스테롤의 정량 방법으로서 검체 시료에 콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 옥시다아제 또는 콜레스테롤 데히드로게나아제, 및 포스포리파아제를 작용시키는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 1). 또한, 그 외에도 2종류의 계면활성제를 사용하는 방법(특허문헌 2), 리포단백질 리파아제 활성과 콜레스테롤 에스테라아제 활성의 비율이 12~7000인 콜레스테롤 에스테라아제를 사용하는 방법(특허문헌 3), 벤젠술폰산 구조를 갖는 계면활성제 또는 폴리아크릴산계 계면활성제를 사용하는 방법(특허문헌 4)이 보고되어 있다.
일본 특허 4456715호 공보 WO 2007/066760호 공보 WO 2006/057377호 공보 WO 2007/083523호 공보
본 발명의 목적은 검체 시료 내의 RLP 콜레스테롤을 분리 조작을 필요로 하지 않고, 간편하고 정확하게 정량하기 위한 방법 및 그것을 위한 키트를 제공하는 것에 있다.
본 출원 발명자들은 여러 가지 리포단백질을 함유하는 피검체 시료의 콜레스테롤을 효소적으로 측정할 때 분자량이 40kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제이고 분자량 40kDa 이하의 소단위를 갖지 않는 콜레스테롤 에스테라아제를 작용시키면 RLP 이외의 리포단백질이 반응하고, 분자량이 40kDa 이하의 콜레스테롤 에스테라아제 또는 분자량 40kDa 이하의 소단위를 갖는 콜레스테롤 에스테라아제를 작용시키면 RLP를 포함한 모든 리포단백질이 반응하는 것을 발견했다. 그리고, 이 지견을 이용함으로써 분리 조작을 행하지 않고 간편하게 RLP 내의 콜레스테롤을 정량할 수 있는 것에 생각이 이르러 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1] 렘난트형 리포단백질을 포함하는 복수 종류의 리포단백질을 포함하는 검체 내의 렘난트형 리포단백질 콜레스테롤의 정량 방법으로서,
(1) 렘난트형 리포단백질 이외의 리포단백질 내의 콜레스테롤을 소거하는 공정과,
(2) 잔존하는 렘난트형 리포단백질 내의 콜레스테롤을 정량하는 공정을 포함하고,
상기 공정(1)에 있어서 분자량이 40kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제이고 분자량 40kDa 이하의 소단위를 갖지 않는 콜레스테롤 에스테라아제를 작용시키고, 상기 공정(2)에 있어서 분자량이 40kDa 이하의 콜레스테롤 에스테라아제 또는 분자량 40kDa 이하의 소단위를 갖는 콜레스테롤 에스테라아제를 작용시키는 것을 포함하는 방법.
[2] 상기 공정(1)은 상기 콜레스테롤 에스테라아제와 콜레스테롤 옥시다아제를 작용시켜 발생한 과산화수소를 소거하는 것을 포함하고, 상기 공정(2)는 상기 콜레스테롤 에스테라아제와 콜레스테롤 옥시다아제를 작용시켜 발생한 과산화수소를 정량하는 것을 포함하는 [1]에 기재된 방법.
[3] 상기 공정(1) 및 상기 공정(2)가 비이온계 계면활성제의 존재 하에서 행하여지는 [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[4] 상기 공정(1) 및 상기 공정(2)에서 사용되는 상기 비이온계 계면활성제가 HLB값이 11 이상 13 이하의 폴리옥시에틸렌 유도체, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시알킬렌알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 [1]~[3] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[5] 상기 공정(1)에 있어서 포스포리파아제를 더 작용시키는 [1]~[4] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[6] 적어도 이하의 2종류의 시약 조성물을 포함하는 렘난트형 리포단백질 콜레스테롤 정량용 키트:
(ⅰ) 콜레스테롤 에스테라아제로서 분자량이 40kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제이고 분자량 40kDa 이하의 소단위를 갖지 않는 콜레스테롤 에스테라아제를 포함하고, 피검체 시료 내의 렘난트형 리포단백질 이외의 리포단백질 내 콜레스테롤을 소거해 반응계 밖으로 유도하기 위한 시약 조성물;
(ⅱ) 콜레스테롤 에스테라아제로서 분자량이 40kDa 이하의 콜레스테롤 에스테라아제 또는 분자량 40kDa 이하의 소단위를 갖는 콜레스테롤 에스테라아제를 포함하고, 렘난트형 리포단백질 콜레스테롤을 정량하기 위한 시약 조성물.
[7] 적어도 상기 (ⅰ)의 시약 조성물이 콜레스테롤 옥시다아제를 포함하는 [6]에 기재된 키트.
[8] 상기 (ⅰ) 및 (ⅱ)의 시약 조성물이 적어도 HLB값이 11 이상 13 이하의 폴리옥시에틸렌 유도체, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 비이온 계면활성제를 포함하는 [6] 또는 [7]에 기재된 키트.
상기 (ⅰ)의 시약 조성물이 포스포리파아제를 더 포함하는 [6]~[8] 중 어느 하나에 기재된 키트.
(발명의 효과)
본 발명에 의해 검체 시료 내의 RLP 콜레스테롤을 분리 조작을 필요로 하지 않고, 간편하고 정확하게 정량할 수 있는 신규 방법 및 그것을 위한 키트가 제공되었다.
도 1은 하기 실시예 1에 기재한 본 발명의 방법에 의한 RLP 내 콜레스테롤의 정량 결과와, 항RLP 모노클로날 항체를 사용하는 공지의 방법에 의한 정량 결과의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
도 2는 하기 실시예 2에 기재한 본 발명의 방법에 의한 RLP 내 콜레스테롤의 정량 결과와, 항RLP 모노클로날 항체를 사용하는 공지의 방법에 의한 정량 결과의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
도 3은 하기 실시예 3에 기재한 본 발명의 방법에 의한 RLP 내 콜레스테롤의 정량 결과와, 항RLP 모노클로날 항체를 사용하는 공지의 방법에 의한 정량 결과의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
도 4는 하기 실시예 4에 기재한 본 발명의 방법에 의한 RLP 내 콜레스테롤의 정량 결과와, 항RLP 모노클로날 항체를 사용하는 공지의 방법에 의한 정량 결과의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
도 5는 하기 실시예 5에 기재한 본 발명의 방법에 의한 RLP 내 콜레스테롤의 정량 결과와, 항RLP 모노클로날 항체를 사용하는 공지의 방법에 의한 정량 결과의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
도 6은 하기 실시예 6에 기재한 본 발명의 방법에 의한 RLP 내 콜레스테롤의 정량 결과와, 항RLP 모노클로날 항체를 사용하는 공지의 방법에 의한 정량 결과의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
도 7은 하기 실시예 7에 기재한 본 발명의 방법에 의한 RLP 내 콜레스테롤의 정량 결과와, 항RLP 모노클로날 항체를 사용하는 공지의 방법에 의한 정량 결과의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
리포단백질 내에 포함되는 콜레스테롤로서는 에스테르형 콜레스테롤(콜레스테롤 에스테르) 및 유리형 콜레스테롤이 있다. 본 발명에 있어서 간단히 「콜레스테롤」이라고 하는 경우에는 이것들 양자를 포함한다.
본 발명의 방법으로 정량하려고 하는 RLP란, 킬로미크론 렘난트와 VLDL 렘난트를 합친 리포단백질을 의미한다.
본 발명의 방법에 제공되는 검체는 렘난트형 리포단백질을 포함하는 복수 종류의 리포단백질을 포함하는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 통상 혈액(전혈, 혈청 및 혈장을 포함한다) 등의 체액이나 그 희석물이다.
본 발명에 있어서의 공정(1)에서는 RLP 이외의 리포단백질 내의 콜레스테롤을 선택적으로 소거한다. 여기에서 「소거」란 콜레스테롤을 분해하고, 또한 그 분해물이 이어진 공정(2)에서 검출되지 않도록 하는 것을 의미한다. RLP 이외의 리포단백질에 포함되는 콜레스테롤을 선택적으로 소거하는 방법으로서는, 예를 들면 피검체 시료에 콜레스테롤 옥시다아제, 특정한 콜레스테롤 에스테라아제(후술)를 작용시켜 발생한 과산화수소를 제거하는 방법을 들 수 있다. 과산화수소를 제거하는 방법으로서는 카탈라아제를 작용시켜서 물과 산소로 분해하는 방법, 또는 페록시다아제의 작용에 의해 예를 들면 과산화수소와 반응해서 무색 퀴논을 발생시키는 수소 공여체 화합물을 무색 퀴논으로 전화하는 방법 등을 들 수 있지만 이것들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 제 1 공정에 있어서 특정한 리포단백질 내의 콜레스테롤을 선택적으로 소거하는 방법은 LDL 콜레스테롤의 정량 방법(예를 들면, WO 98/47005, US 6194164 B1 등)이나 HDL 콜레스테롤의 정량 방법(예를 들면, WO 98/26090, US 6479249 B2 등) 등에 널리 채용되어 주지로 되어 있는 것이다(이것들 특허 공보는 참조에 의해 여기에 편입된 것으로 한다). 본 발명의 공정(1)도 후술하는 특정한 콜레스테롤 에스테라아제를 사용하는 것 이외는 이것들 주지의 방법에 의해 실시하는 것이 가능하다. 여기에서 「소거」란, 콜레스테롤을 분해하고, 또한 그 분해물이 이어진 제 2 공정에서 검출되지 않도록 하는 것을 의미한다. RLP 이외의 리포단백질, 즉 HDL, LDL, VLDL 및 CM 등에 포함되는 콜레스테롤을 선택적으로 소거하는 방법으로서는 이하의 방법을 들 수 있다. 즉, 제 1의 방법에서는 피검 시료에 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 옥시다아제를 작용시켜 발생한 과산화수소를 제거한다. 콜레스테롤 에스테라아제의 작용에 의해 리포단백질 내의 에스테르형 콜레스테롤이 가수분해되어서 유리형 콜레스테롤과 지방산이 발생한다. 이어서, 이렇게 발생한 유리형 콜레스테롤과 원래 리포단백질 내에 존재하는 유리형 콜레스테롤이 콜레스테롤 옥시다아제의 작용으로 산화되어서 콜레스테논과 과산화수소가 발생한다. 이렇게 발생한 과산화수소를 제거한다. 과산화수소를 제거하는 방법으로서는 카탈라아제를 작용시켜서 물과 산소로 분해하는 방법, 및 페록시다아제의 작용에 의해 예를 들면 DAOS(N-에틸-N-(2-히드록시술포프로필)-3,5-디메티옥시아닐린)와 같은 과산화수소와 반응해서 무색 퀴논을 발생시키는 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물과 반응시켜서 과산화수소를 무색 퀴논으로 전화하는 방법 등을 들 수 있지만 이것들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 공정(1)에서는 포스포리파아제를 사용해도 사용하지 않아도 되지만, 적합한 포스포리파아제를 사용하면 RLP 이외의 리포단백질 내 콜레스테롤의 소거를 촉진할 수 있다. 포스포리파아제의 바람직한 구체예로서는 포스포리파아제 C(PLC), 스핑고미엘리나제(SPC), 포스파티딜이노시톨 특이적 포스포리파아제 C(PI-PLC, 이상 아사히카세이파머사제), 스핑고미엘리나제(bacillus cereus 유래), 스핑고미엘리나제(staphylococcus aureus 유래), 포스파티딜이노시톨 특이적 포스포리파아제 C(bacillus cereus 유래, 이상 SIGMA사제) 등을 들 수 있지만 이것들에 한정되는 것은 아니다.
계속되는 공정(2)에서는 상기 공정(1)의 산물에 후술하는 특정한 콜레스테롤 에스테라아제를 첨가해서 RLP 내의 콜레스테롤을 효소적으로 정량한다. 콜레스테롤의 효소적인 정량 방법 자체는 이 분야에 있어서 주지이고, 예를 들면 콜레스테롤에 콜레스테롤 옥시다아제 및 콜레스테롤 에스테라아제를 작용시켜 생성한 과산화수소를 페록시다아제와 수소 공여체 및 수소 수용체에 의해 퀴논 색소로 바꾸고, 상기 색소를 흡광도 측정해서 정량하는 방법을 들 수 있다. 이것들은 널리 사용되고 있는 주지의 방법이고, 상기한 WO 98/47005나 WO 98/26090에도 기재되어 있다.
또한, 공정(1)에 있어서 발생한 과산화수소를 카탈라아제로 분해하고, 공정(2)에서 이 카탈라아제를 저해할 필요가 있을 경우는 공정(2)에 있어서 예를 들면 아지드화나트륨과 같은 카탈라아제 저해제를 사용해서 카탈라아제를 저해한다.
본 발명의 공정(1) 및 공정(2)에는 비이온계 계면활성제를 공존시키는 것이 바람직하다. 적합한 계면활성제를 사용하면 각각의 공정에 있어서의 효소 반응을 촉진할 수 있다. 적합한 계면활성제로서는 HLB값이 11 이상 13 이하의 폴리옥시에틸렌 유도체, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시알킬렌알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르를 들 수 있다. 계면활성제의 구체예로서 이뮬겐 A-60, 이뮬겐 707, 이뮬겐 709, 이뮬겐 909(이상 카오사제), 블라우논 DSP-9, 블라우논 DSP-12.5(이상 아오키유시사제) 등을 들 수 있다.
공정(1) 및 공정(2)에서 공존시키는 계면활성제는 동일하여도 달라도 된다. 계면활성제의 반응액 중의 농도는 0.05%~5%가 바람직하고, 0.1%~1%가 보다 바람직하다.
본 발명에서 사용하는 콜레스테롤 옥시다아제로서는 콜레스테롤을 산화시켜서 과산화수소를 생성하는 능력을 갖는 효소이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 동물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤 에스테라아제를 들 수 있다. 이것들은 유전자 조작에 의해 만들어진 것이어도 되고, 화학 수식의 유무도 묻지 않는다.
본 발명에서 사용하는 각 효소의 사용량은 효소에 따라 달라 특별히 제한되는 것은 아니지만 통상 0.001U~2000U/㎖로, 바람직하게는 0.1~1000U/㎖로 사용된다.
본 발명에서 사용하는 수소 공여체로서는 아닐린 유도체가 바람직하고, 아닐린 유도체로서는 N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린(TOOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린(MAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린(TOPS), N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(HDAOS), N-(3-술포프로필)아닐린(HALPS), N-(3-술포프로필)-3-메톡시-5-아닐린(HMMPS) 등을 들 수 있다.
수소 수용체로서는 4-아미노안티피린이나 메틸벤조티아졸론히드라존 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 각 공정은 pH5~pH10에서 행하는 것이 바람직하고, pH6~pH8에서 행하는 것이 더욱 바람직하다.
반응 온도는 각 공정 모두 2℃~45℃에서 행하는 것이 바람직하고, 25℃~40℃에서 행하는 것이 더욱 바람직하다. 반응 시간은 각 공정 모두 1~10분 사이로 행하는 것이 바람직하고, 3~7분으로 행하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명은 공정(1)과 공정(2)에 있어서 각각 다른 특정한 콜레스테롤 에스테라아제를 사용하는 것에 최대의 특징이 있다. 상기와 같이, 본 출원 발명자들은 여러 가지의 리포단백질을 함유하는 피검체 시료의 콜레스테롤을 효소적으로 측정할 때 분자량이 40kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제이고 분자량 40kDa 이하의 소단위를 갖지 않는 콜레스테롤 에스테라아제(이하, 편의적으로 「고분자량 콜레스테롤 에스테라아제」라고 칭하는 경우가 있다)를 작용시키면 RLP 이외의 리포단백질이 반응하고, 분자량이 40kDa 이하의 콜레스테롤 에스테라아제 또는 분자량 40kDa 이하의 소단위를 갖는 콜레스테롤 에스테라아제(이하, 편의적으로 「저분자량 콜레스테롤 에스테라아제」라고 칭하는 경우가 있다)를 작용시키면 RLP를 포함한 모든 리포단백질이 반응하는 것을 발견했다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, RLP 내부에는 에스테르형 콜레스테롤과 함께 트리글리세리드가 다량으로 존재하고 있어 이것이 입체 장해가 되고, 대형의 고분자량 콜레스테롤 에스테라아제는 입자 내부의 에스테르형 콜레스테롤에 접근할 수 없어 반응할 수 없는 것이 아닐까라고 생각된다.
상기 지견을 이용하여 본 발명의 방법에서는 공정(1)에 있어서 고분자량 콜레스테롤 에스테라아제를 작용시키고, 공정(2)에 있어서 저분자량 콜레스테롤 에스테라아제를 작용시킨다. 상기와 같이, 공정(1)에서는 발생한 콜레스테롤(RLP 이외의 리포단백질 유래의 콜레스테롤)이 소거되므로 공정(2)에서는 RLP 콜레스테롤만이 정량된다.
콜레스테롤 에스테라아제 및 그 소단위의 분자량은 일반적인 방법인 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 측정된다. 주지와 같이, SDS-PAGE는 환원 조건 하에서의 전기영동이므로 콜레스테롤 에스테라아제가 복수의 소단위로 구성되는 경우 콜레스테롤 에스테라아제는 각 소단위로 분해되므로 각 소단위의 분자량이 측정된다. 한편, 콜레스테롤 에스테라아제가 소단위를 갖지 않는 경우에는 콜레스테롤 에스테라아제의 분자량이 측정된다.
고분자량 콜레스테롤 에스테라아제의 시판예로서는 콜레스테롤 에스테라아제(CEBP-M; 아사히카세이파머사제, 분자량 62kDa), 콜레스테롤 에스테라아제(CHE-XE; 킥코만사제, 분자량 54kDa) 등을 들 수 있다.
저분자량 콜레스테롤 에스테라아제의 시판예로서는 콜레스테롤 에스테라아제(CEN; 아사히카세이파머사제, 분자량 29.5kDa), 콜레스테롤 에스테라아제 "Amano" 2(CHE2; 아마노엔자임사제, 분자량 30kDa), 콜레스테롤 에스테라아제 "Amano" 3(CHE3; 아마노엔자임사제, 분자량 30kDa) 등을 들 수 있다.
본 발명의 정량 방법을 실시할 시에 사용하는 시약을 복수의 시약 조성물로 나누어도 된다. 본 발명에 있어서는, 시약으로서는 예를 들면 RLP 이외의 리포단백질 내의 콜레스테롤을 소거하는 공정[즉, 공정(1)]을 행하기 위한 시약 조성물과, RLP의 콜레스테롤을 측정하는 공정[즉, 공정(2)]을 행하기 위한 시약 조성물의 2종류의 시약 조성물을 조제할 수 있다.
공정(1)을 행하기 위한 시약 조성물에는 적어도 고분자량 콜레스테롤 에스테라아제가 포함된다. 상기 시약 조성물에는 상기한 계면활성제나 콜레스테롤 옥시다아제, 아닐린 유도체 등의 수소 공여체, 과산화수소를 소거하는 카탈라아제 등을 더 포함시키면 좋다.
공정(2)를 행하기 위한 시약 조성물에는 적어도 저분자량 콜레스테롤 에스테라아제가 포함된다. 상기 시약 조성물에는 계면활성제나 4-아미노안티피린 등의 수소 수용체, 페록시다아제 등을 더 포함시킬 수 있다.
공정(1)을 행하기 위한 시약 조성물 및 공정(2)를 행하기 위한 시약 조성물에는 필요에 따라 1가 양이온(예를 들면, 1가 금속이온), 2가 양이온(예를 들면, 2가 금속이온) 또는 그것들의 염, 폴리음이온(polyanion)(예를 들면, 헤파린, 덱스트란황산염, 포스포텅스텐산염), 혈청 알부민을 첨가해도 된다. 또한, 각 시약 조성물의 pH는 중성 부근, 예를 들면 pH5~pH9, 바람직하게는 pH6~8이고, 완충액을 첨가해서 pH를 조정하면 좋다.
본 발명의 방법에 의해 RLP 내의 콜레스테롤을 정량하기 위해서는 피검체 시료에 공정(1)을 행하기 위한 시약 조성물을 첨가해 반응시키고, 이어서 공정(2)를 행하기 위한 시약 조성물을 첨가해 반응시키고, 흡광도를 측정함으로써 행하면 좋다. 또한 상기와 같이, 공정(1)과 공정(2)에 있어서 상기한 각각 특정한 콜레스테롤 에스테라아제를 사용하는 것 이외는 통상의 방법으로 행할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 근거해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
공정(1)을 행하기 위한 시약 조성물 A[실시예 2 이후에도 공정(1)을 행하기 위한 시약 조성물을 「시약 조성물 A」로 칭한다], 공정(2)를 행하기 위한 시약 조성물 B[실시예 2 이후에도 공정(2)를 행하기 위한 시약 조성물을 「시약 조성물 B」로 칭한다]를 이하와 같이 조제했다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라아제[아사히카세이파머제 CEBP-M] 5U/㎖
콜레스테롤 옥시다아제 2.5U/㎖
카탈라아제 1000U/㎖
TOOS 2.0mmol/ℓ
이뮬겐 A-60(상품명) 0.1%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라아제[아사히카세이파머제 CEN] 4U/㎖
4-아미노안티피린 4.0mmol/ℓ
페록시다아제 20단위/㎖
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
이뮬겐 A-60(상품명) 0.1%(w/v)
혈청 시료 5㎕에 시약 조성물 A 270㎕를 첨가하고, 37℃에서 5분간 반응시킨 후에 시약 조성물 B 90㎕를 첨가해 5분간 반응시키고, 주파장 600nm, 부파장 700nm에서의 흡광도를 측정했다.
비교 대상법으로서 항RLP 모노클로날 항체를 사용하는 오츠카세이야쿠사제의 RLP-콜레스테롤 「JIMRO」Ⅱ(상품명)를 사용해서 RLP 콜레스테롤 농도를 비교했다. 그 결과를 도 1에 나타낸다.
도 1에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 방법은 RLP 콜레스테롤 측정용 시약 RLP-콜레스테롤 「JIMRO」Ⅱ(상품명)를 사용한 방법과 양호한 상관성을 나타냈다.
실시예 2
시약 조성물 A 및 시약 조성물 B를 이하와 같이 조제했다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라아제[아사히카세이파머제 CEBP-M] 5U/㎖
콜레스테롤 옥시다아제 2.5U/㎖
스핑고미엘리나제[아사히카세이파머제 SPC] 2.5U/㎖
카탈라아제 1000U/㎖
TOOS 2.0mmol/ℓ
이뮬겐 A-60(상품명) 0.1%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라아제[아사히카세이파머제 CEN] 4U/㎖
4-아미노안티피린 4.0mmol/ℓ
페록시다아제 20단위/㎖
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
이뮬겐 A-60(상품명) 0.1%(w/v)
실시예 1과 마찬가지의 수순으로 측정을 행하고, RLP-콜레스테롤 「JIMRO」Ⅱ(상품명)에 의해 얻어지는 값과 비교했다. 그 결과를 도 2에 나타낸다.
도 2에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 방법은 RLP 콜레스테롤 측정용 시약 RLP-콜레스테롤 「JIMRO」Ⅱ(상품명)를 사용한 방법과 양호한 상관성을 나타냈다.
실시예 3
시약 조성물 A 및 시약 조성물 B를 이하와 같이 조제했다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라아제[아사히카세이파머제 CEBP-M] 5U/㎖
콜레스테롤 옥시다아제 2.5U/㎖
스핑고미엘리나제[아사히카세이파머제 SPC] 2.5U/㎖
카탈라아제 1000U/㎖
TOOS 2.0mmol/ℓ
이뮬겐 A-60(상품명) 0.1%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라아제[아사히카세이파머제 CEN] 4U/㎖
4-아미노안티피린 4.0mmol/ℓ
페록시다아제 20단위/㎖
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
이뮬겐 709(상품명) 0.1%(w/v)
실시예 1과 마찬가지의 수순으로 측정을 행하고, RLP-콜레스테롤 「JIMRO」Ⅱ(상품명)에 의해 얻어지는 값과 비교했다. 그 결과를 도 3에 나타낸다.
도 3에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 방법은 RLP 콜레스테롤 측정용 시약 RLP-콜레스테롤 「JIMRO」Ⅱ(상품명)를 사용한 방법과 양호한 상관성을 나타냈다.
실시예 4
시약 조성물 A 및 시약 조성물 B를 이하와 같이 조제했다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라아제[아사히카세이파머제 CEBP-M] 5U/㎖
콜레스테롤 옥시다아제 2.5U/㎖
스핑고미엘리나제[아사히카세이파머제 SPC] 2.5U/㎖
카탈라아제 1000U/㎖
TOOS 2.0mmol/ℓ
블라우논 DSP-12.5(상품명) 0.1%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라아제[아사히카세이파머제 CEN] 4U/㎖
4-아미노안티피린 4.0mmol/ℓ
페록시다아제 20단위/㎖
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
이뮬겐 A-60(상품명) 0.1%(w/v)
실시예 1과 마찬가지의 수순으로 측정을 행하고, RLP-콜레스테롤 「JIMRO」Ⅱ(상품명)에 의해 얻어지는 값과 비교했다. 그 결과를 도 4에 나타낸다.
도 4에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 방법은 RLP 콜레스테롤 측정용 시약 RLP-콜레스테롤 「JIMRO」Ⅱ(상품명)를 사용한 방법과 양호한 상관성을 나타냈다.
실시예 5
시약 조성물 A 및 시약 조성물 B를 이하와 같이 조제했다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라아제[아사히카세이파머제 CEBP-M] 5U/㎖
콜레스테롤 옥시다아제 2.5U/㎖
스핑고미엘리나제[아사히카세이파머제 SPC] 2.5U/㎖
카탈라아제 1000U/㎖
TOOS 2.0mmol/ℓ
이뮬겐 A-60(상품명) 0.1%(w/v)
소혈청 알부민 0.1%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라아제[아사히카세이파머제 CEN] 4U/㎖
4-아미노안티피린 4.0mmol/ℓ
페록시다아제 20단위/㎖
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
이뮬겐 A-60(상품명) 0.1%(w/v)
실시예 1과 마찬가지의 수순으로 측정을 행하고, RLP-콜레스테롤 「JIMRO」Ⅱ(상품명)에 의해 얻어지는 값과 비교했다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.
도 5에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 방법은 RLP 콜레스테롤 측정용 시약 RLP-콜레스테롤 「JIMRO」Ⅱ(상품명)를 사용한 방법과 양호한 상관성을 나타냈다.
실시예 6
시약 조성물 A 및 시약 조성물 B를 이하와 같이 조제했다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라아제 [킥코만제 CHE-XE] 5U/㎖
콜레스테롤 옥시다아제 2.5U/㎖
스핑고미엘리나제[아사히카세이파머제 SPC] 2.5U/㎖
카탈라아제 1000U/㎖
TOOS 2.0mmol/ℓ
이뮬겐 A-60(상품명) 0.1%(w/v)
소혈청 알부민 0.1%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라아제[아사히카세이파머제 CEN] 4U/㎖
4-아미노안티피린 4.0mmol/ℓ
페록시다아제 20단위/㎖
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
이뮬겐 709(상품명) 0.1%(w/v)
실시예 1과 마찬가지의 수순으로 측정을 행하고, RLP-콜레스테롤 「JIMRO」Ⅱ(상품명)에 의해 얻어지는 값과 비교했다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.
도 6에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 방법은 RLP 콜레스테롤 측정용 시약 RLP-콜레스테롤 「JIMRO」Ⅱ(상품명)를 사용한 방법과 양호한 상관성을 나타냈다.
실시예 7
시약 조성물 A 및 시약 조성물 B를 이하와 같이 조제했다.
시약 조성물 A
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라아제[아사히카세이파머제 CEBP-M] 5U/㎖
콜레스테롤 옥시다아제 2.5U/㎖
스핑고미엘리나제[아사히카세이파머제 SPC] 2.5U/㎖
카탈라아제 1000U/㎖
TOOS 2.0mmol/ℓ
이뮬겐 A-60(상품명) 0.1%(w/v)
시약 조성물 B
PIPES 완충액, pH6.8 50mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라아제 [아마노엔자임제 CHE-2] 4U/㎖
4-아미노안티피린 4.0mmol/ℓ
페록시다아제 20단위/㎖
아지드화나트륨 0.05%(w/v)
이뮬겐 709(상품명) 0.1%(w/v)
실시예 1과 마찬가지의 수순으로 측정을 행하고, RLP-콜레스테롤 「JIMRO」Ⅱ(상품명)에 의해 얻어지는 값과 비교했다. 그 결과를 도 7에 나타낸다.
도 7에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 방법은 RLP 콜레스테롤 측정용 시약 RLP-콜레스테롤 「JIMRO」Ⅱ(상품명)를 사용한 방법과 양호한 상관성을 나타냈다.

Claims (9)

  1. 렘난트형 리포단백질을 포함하는 복수 종류의 리포단백질을 포함하는 검체 내의 렘난트형 리포단백질 콜레스테롤의 정량 방법으로서:
    (1) 렘난트형 리포단백질 이외의 리포단백질 내의 콜레스테롤을 소거하는 공정과,
    (2) 잔존하는 렘난트형 리포단백질 내의 콜레스테롤을 정량하는 공정을 포함하고,
    상기 공정(1)에 있어서 분자량이 40kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제이고 분자량 40kDa 이하의 소단위를 갖지 않는 콜레스테롤 에스테라아제를 작용시키고, 상기 공정(2)에 있어서 분자량이 40kDa 이하의 콜레스테롤 에스테라아제 또는 분자량 40kDa 이하의 소단위를 갖는 콜레스테롤 에스테라아제를 작용시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 공정(1)은 상기 콜레스테롤 에스테라아제와 콜레스테롤 옥시다아제를 작용시켜 발생한 과산화수소를 소거하는 것을 포함하고, 상기 공정(2)는 상기 콜레스테롤 에스테라아제와 콜레스테롤 옥시다아제를 작용시켜 발생한 과산화수소를 정량하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 공정(1) 및 상기 공정(2)는 비이온계 계면활성제의 존재 하에서 행하여지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공정(1) 및 상기 공정(2)에서 사용되는 상기 비이온계 계면활성제는 HLB값이 11 이상 13 이하의 폴리옥시에틸렌 유도체, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시알킬렌알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공정(1)에 있어서 포스포리파아제를 더 작용시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 적어도 이하의 2종류의 시약 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 렘난트형 리포단백질 콜레스테롤 정량용 키트:
    (ⅰ) 콜레스테롤 에스테라아제로서 분자량이 40kDa을 초과하는 콜레스테롤 에스테라아제이고 분자량 40kDa 이하의 소단위를 갖지 않는 콜레스테롤 에스테라아제를 포함하고, 피검체 시료 내의 렘난트형 리포단백질 이외의 리포단백질 내 콜레스테롤을 소거해 반응계 밖으로 유도하기 위한 시약 조성물;
    (ⅱ) 콜레스테롤 에스테라아제로서 분자량이 40kDa 이하의 콜레스테롤 에스테라아제 또는 분자량 40kDa 이하의 소단위를 갖는 콜레스테롤 에스테라아제를 포함하고, 렘난트형 리포단백질 콜레스테롤을 정량하기 위한 시약 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    적어도 상기 (ⅰ)의 시약 조성물은 콜레스테롤 옥시다아제를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    상기 (ⅰ) 및 (ⅱ)의 시약 조성물은 적어도 HLB값이 11 이상 13 이하의 폴리옥시에틸렌 유도체, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 비이온 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (ⅰ)의 시약 조성물은 포스포리파아제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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