JP6625078B2 - 血液サンプルのアッセイ法 - Google Patents
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Description
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(iii)ポリエチレングリコール(PEG)(Viikari J,(1976)Scan J Clin Lab Invest 35:265−8)、および
(iv)デキストラン硫酸−Mg2+(Finley et al(1978)Clin Chem 24:931−3)。
LDL=総CH−(HDL+TG/2)
を用いてコンピュータで決定される。
総コレステロール=HDL+非HDL
に従うHDLおよび総コレステロールの読取り、ならびにHDLアッセイに対する非HDLの効果についての所定の標準曲線(実施例6)を伴う反復プロセスにおいて部分的に補正され得る。
i)前記血液細胞含有サンプルを、サンプルを希釈する試薬混合物と接触させるステップと、
ii)血液細胞を実質的に除去して、実質的に無細胞のサンプルを提供するステップと、
iii)前記サンプルを、前記第2の成分の反応を一時的および/または競合的に防止する役割を果たす少なくとも1つの試薬と接触させ、それにより、ブロック化された第2の成分を生成するステップと、
iv)前記サンプルを、前記少なくとも1つの分析物の各分析物の少なくとも1つの構成物のための少なくとも1つの転換酵素を含む少なくとも1つの試薬混合物と接触させ、それにより、その分析物または各分析物の選択的反応によって、検出可能な反応生成物を直接または間接的に生成させるステップであって、前記分析物または前記分析物の1つが前記第1の成分であるステップと、
v)1つまたは複数の前記検出可能な反応生成物をモニターするステップと、
vi)1つまたは複数の前記検出可能な生成物の量および/または1つまたは複数の前記検出可能な生成物の形成速度と、前記血液サンプル中の前記少なくとも1つの分析物またはそのそれぞれの濃度とを関連付けるステップであって、測定不能な(架空の)終点を推定することによって、少なくとも前記第1の成分の濃度が対応する検出可能な反応生成物と関連付けられるステップと
を含み、ステップiii)は、ステップiv)に至るまで(ステップiv)を含む)の任意の段階で、ただしステップv)〜vi)よりも前に実行されることが可能であり、ステップiii)の試薬はサンプルに別箇に適用されてもよいし、またはステップi)もしくはiv)の試薬混合物中に含まれていてもよい。
a)前記サンプルを希釈するように配合された第1の試薬混合物と、
b)細胞分離ユニットと、
c)(ブロック)前記第2の成分の反応を一時的および/または競合的に防止する役割を果たす第2の試薬であって、それにより、ブロック化された第2の成分を生成する第2の試薬と、
d)前記少なくとも3つの異なる分析物の選択的転換を引き起こし、それにより、各分析物に対応する検出可能な間接的生成物を生成するように配合された少なくとも3つのさらなる試薬混合物と
を含む。
CHの場合:
(i)コレステロールエステラーゼ+コレステロールオキシダーゼ+ペルオキシダーゼ、または
(ii)コレステロールエステラーゼ+コレステロールデヒドロゲナーゼ。
TGの場合:
(iii)リパーゼ+グリセロールキナーゼ+グリセロール−3−リン酸オキシダーゼ+ペルオキシダーゼ。
(i)PEG/シクロデキストリン法(米国特許第5691159号明細書)では、硫酸化アルファ−シクロデキストリンはMg2+の存在下で非HDLとの可溶性複合体を形成し、これにより、PEG修飾酵素による分解に対して抵抗性になる。
(ii)ポリアニオン法(米国特許第5773304号明細書)はポリアニオンまたは界面活性剤(米国特許第7851174号明細書)と共に合成ポリマーを使用し、非HDLをブロック化して、特定の洗剤による可溶化および酵素測定に対して抵抗性にする。
(iii)免疫学的方法(米国特許第6162607号明細書)は、全ての非HDL中のアポリポタンパク質Bの存在と、HDL中のその非存在とを利用する。アポBに対する抗体は、コレステロール酵素との反応に対して非HDLをブロックする。
(iv)クリアランス法(米国特許第6479249号明細書)では、非HDLは発色しない反応において最初に消費される。次に特定の洗剤が添加され、発色反応において酵素とHDLとの反応が可能になる。
(v)促進剤/洗剤法(米国特許第6818414号明細書)は、促進剤を用いてHDLの非エステル化コレステロールを分解して反応を促進し、発色しないプロセスで、形成したH2O2を除去する。第2のステップでは、HDLコレステロールは、発色プロセスにおいてHDL特異的な洗剤を用いて分解される。
(i)米国特許第5888827号明細には、Mg2+の存在下で界面活性剤およびシクロデキストリンにより非LDLをマスクし、PEG修飾酵素による分解に対して抵抗性にする方法が記載されている。
(ii)米国特許第5925534号明細書には、ポリアニオンおよび界面活性剤を用いてサンプル中のLDLを保護し、非LDLを酵素的に除去できるようにし、そこで脱保護薬の添加によりLDL関連CHの酵素的な決定を可能にする方法が記載されている。
(iii)米国特許第6057118号明細書および米国特許第6194164号明細書には、LDL関連CHを決定する前に非LDL関連CHを酵素反応において選択的に除去するために特定の界面活性剤を用いる2つの異なる方法が記載されている。
(i)米国特許第6986998号明細には、HDLおよびLDLをブロックするためにそれぞれアルブミンおよびカリックスアレーンを用いる方法が記載されており、クロモバクテリウム・ビスコスム(Chromobacterium viscosum)からのVLDL選択的酵素を用いる酵素反応においてVLDLの選択的な分解が可能になる。
(ii)米国特許第7208287号明細書には、酵素反応においてVLDLを選択的に分解するために特定の界面活性剤を用いる方法が記載されている。
(i)米国特許第6811994号明細書には、選択的な界面活性剤およびポリエチレングリコール修飾酵素を用いて、特定のリポタンパク質以外のリポタンパク質をブロックすることが記載されている。
(ii)国際公開第2004/087945号パンフレットおよび米国特許出願公開第2009/0226944号明細書には、選択的な界面活性剤を用いて、検出可能な生成物を生成しない反応において非LDLからTGを除去し、次にLDLと関連したTGを検出可能な生成物に転換することが記載されている。
(iii)国際公開第2000/06112号パンフレットには、選択的な界面活性剤を用いて、検出可能な生成物を生成しない反応においてVLDLおよび/またはIDL以外のリポタンパク質からTGを除去し、次にVLDLおよび/またはIDLと関連したTGを検出可能な生成物に転換することが記載されている。
非HDLと関連したコレステロールの存在下におけるHDL関連コレステロールの架空の最終測定値の推定
Cobas Mira plus機器(ABX Diagnostics)において、Wako HDL−C Lタイプの試薬およびプロトコル(表4)を使用して、66mg/dLのHDL、255mg/dLのLDLおよび300mg/dLのTGを含有するサンプルを分析した。吸光度を600nmでモニターした(図1、黒丸)。64mg/dLのHDLを含有するが、有意な量のLDLを含有しないキャリブレータも同じ方法で分析した(図1、白丸)。サンプルの進行曲線は最初の200〜300秒間はほぼ同一であったが、その後、サンプル中の非HDLのコレステロールが脱ブロック化されて転換されるにつれて発散した。他の非HDLと関連したコレステロールの存在下におけるHDL関連コレステロールの転換は、従って、測定可能な終点を持たない。唯一の測定可能な終点は、HDL+非HDL中に存在するコレステロール(すなわち、総コレステロール)のものであろう。しかしながら、サンプルの進行曲線の最初の200秒間(太線)から、一次アルゴリズム
Y=Ymax(1−e(−K(X−X0)))
を用いてHDL関連コレステロールの架空の終点が計算され得る(点線)。これは、ほとんど同じ濃度(66mg/dLに対して64mg/dL)のHDLのみを含有するキャリブレータの真の終点と一致する。酵素反応の動態学に従うためのその他の周知のアルゴリズムも同様にして使用され得る。
TGアッセイにおける終点、定点および推定終点測定の比較
Roche TG試薬(表5)を25℃で貯蔵し、様々な時点でサンプルを取り出し、186mg/dLのトリグリセリドを含有する血漿サンプルを測定するために使用した。血漿サンプルを一定分量に分けて−40℃で凍結して貯蔵し、測定の前に解凍した。LabSystems Multiscan RCプレートリーダーにおいて、測定を周囲温度(20〜22℃)で実施した。反応が完了するまで進行曲線を追跡し、終点を決定した。さらに、4パラメータのロジスティック関数を用いて、進行曲線の最初の300秒に基づいて終点を推定した。得られた推定終点を、真の終点、推定のために使用される時間300秒間の最後の吸光度と比較した。図2に示されるように、推定終点は真の終点に従ったが、定点測定は、わずか5か月の貯蔵後に、真の終点との比較においてすでに著しく低下した。従って、終点推定および定点法はいずれもわずか300秒間の試験区間を可能にするが、定点測定は、試薬の任意の合理的な寿命を通してサンプルに正確な値を提供するためにキャリブレータの包含を必要とするであろう。対照的に、推定終点の計算は、キャリブレータを包含することなく精度を保持し得る。
Roche HDLアッセイの終点推定
ABX technologiesからの「Cobas Mira plus」機器において、RocheからのHDLC3試薬(表6)を用いて、8つの異なる血清サンプルのHDLレベルを決定した。進行曲線の最初の100秒を使用し、4パラメータのロジスティック関数を用いて架空の終点を推定した。図3に示されるように、推定終点(吸光度単位)は、決定されたHDLレベルと非常によく相関した。
実施例4
AfinionHDLアッセイ(ポイント・オブ・ケア)−大型臨床機器アッセイ法との比較
SiemensからのAdvia機器および試薬、基準方法において49の血清サンプルのHDLレベルを決定した。Afinionポイント・オブ・ケア装置において、Wako HDL−C L−タイプの試薬(表4)を用いる推定終点法によってもサンプルを測定した。進行曲線を160秒間モニターし、2つの異なるアルゴリズム:一次方程式(表3、1型)およびロジスティック方程式(表3、log変換型)を用いて終点を推定した。ABX PentraからのHDLダイレクトCP試薬(表7)を用いてCobas Mira plusにおいてそのHDLレベルが決定されたTrina Bionosticsからのキャリブレータを用いる別の実験でAfinionにおいて確立されたキャリブレーション曲線を用いて、推定終点を濃度に変換した。図4は、44の血清サンプルについて、Afinion方法と基準方法(一次予測−黒丸、ロジスティック適合−白丸)との相関関係を示す。Afinion方法により測定される平均HDLレベルは、一次曲線およびロジスティック曲線の適合をそれぞれ用いて、基準方法と比べて0.4%(0.4mg/dL)および1.1%(0.6mg/dL)低く、傾斜因子は0.96および1.06であった。
Afinion HDLアッセイ−ポイント・オブ・ケアアッセイ法との比較
Cholestechからのポイント・オブ・ケアアッセイシステム、LDXシステム脂質プロファイルGluにおいて、42の血清サンプルのHDLレベルを決定した。また、実施例4に本質的に記載されるようにAfinion HDL方法によってもサンプルを測定し、HDL値を計算した。図5は、42の血清サンプルについて、AfinionおよびLDX方法の相関関係を示す。LDX方法では、15mg/dL未満のHDL値は<15mg/dLで報告され、100mg/dLを超える値は>100mg/dLで報告されるので、直線回帰(n=10)においてこれらの値(白丸)を省いた。Afinionによって測定される平均HDLレベルは、LDX法と比べて1%(0.5mg/dL)高く、傾斜因子は1.03であった。
非HDLの平行転換の影響に対する多成分アッセイ法におけるHDLの推定終点の補正
サンプル中の総CHの同時測定に基づいた分析後の計算によって、同時に転換された非HDLの影響に対してHDLアッセイを補正する可能性を例示するために、以下の実験を実施した:
(i)Cobas Mira plus機器およびWako HDL−C Lタイプの試薬およびプロトコル(表4)を用いて、純粋なHDL(Wako High Unit HDL−C)の調製物からHDLのキャリブレーション曲線を作成した。キャリブレーション曲線の作成において、進行曲線の最初の300秒からの推定終点の吸光度、および一次関数を用いる曲線の適合を使用した:
HDL=1.2+136.3ABS(1)
(ii)2つの異なる濃度のHDLおよび4つの異なる濃度のLDLの純粋なHDLおよび純粋なLDLの混合物(Wako High Unit LDL−C)から、非HDLの平行転換によるHDL測定値への影響に対するキャリブレーション曲線を作成した。測定されるHDLの増大を非HDL濃度の関数としてプロットした。増大は非HDL濃度と指数関数的に相関した。
HDLの増大=2.433exp^0.008499非HDL(2)
非HDL=CH−HDL(3)
0、60、90または120mmol/LのNaClが添加された400μLのHDL−C LタイプのR1(Wako)に、2μLの全血を添加した。混合した後、サンプルの吸光度を660nmで測定した。この波長において、ヘモグロビンからの吸収は存在しないが、無傷の細胞からの強い妨害(光の散乱による)があった。NaClが添加されないR1はほとんど完全な溶解を引き起こしたが、120mmol/LのNaClが添加されたR1はほんのわずかな細胞溶解を生じた。
(mmol/L) (AU) (%)
0 0.062 100
60 1.306 23
90 1.569 7
120 1.615 4
HDL試薬R1を全般的な希釈緩衝液として使用することのトリグリセリドの測定に対する効果
Afinionポイント・オブ・ケア機器において、全般的な希釈緩衝液としてのHDL試薬R1(表)およびRoche TG試薬(表5)を用いて46の血清サンプのTGレベルを決定した。
希釈緩衝液 Goodの緩衝液、pH 7.0
NaCl 175mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.9mmol/L
ペルオキシダーゼ 2400U/L
アスコルビン酸オキシダーゼ 2700U/L
抗ヒトアポ−β−リポタンパク質抗体
ウェル番号2の底にフィルタパッドを置くことによってろ過能力が備えられたAfinion機器において、全血のための全般的な希釈およびろ過緩衝液としてのHDL R1(非HDLブロッキング)試薬の適用性を調査した。希釈/ろ過緩衝液は、NaClを175mMまで添加することによって非溶解性にされたHDL−C Lタイプの試薬1(R1)(表4)であった。
HDLと関連したコレステロールの存在下における非HDL関連コレステロールの架空の最終測定値の推定。認定検査室の方法との比較。
HDLを保護し、全ての他のリポタンパク質(非HDL)と関連したコレステロールが検出可能な生成物に転換されるHDL特異性ブロックポリマー(HDL−X、Wako,Japan)を使用することにより、非HDLを直接決定するための方法を構築した。HDL特異性ブロックポリマーの原料として、Wako HDL−C L−M/2−PM試薬(Wako,日本)からの試薬1を使用した。試薬1の正確な組成は入手できないが、Goodの緩衝液pH7.0、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、HMMPS、カタラーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼおよびHDLブロックポリマーを含有することが開示されている。試薬1にペルオキシダーゼ(peroxidise)(6000U/L)、4−アミノアンチピリン(aminoantipurin)(0.8mmol/L)およびアジ化ナトリウム(0.025%)を補充することによって、HDLを一時的に保護しながら非HDLを検出可能な生成物に転換する試薬を配合した。
非HDL=CH−HDL
に従って非HDL値を計算した。
Afinionポイント・オブ・ケア分析器において決定された全血および血漿の脂質プロファイル
60人の健康なボランティアから入手した15μLの新しい全血において、Afinion分析器を用いてCH、TGおよびHDLの血漿レベルを決定した。これらのデータから、Friedewaldの式、LDL=CH−(HDL+TG/5)を用いて、LDLレベルをmg/dL単位で計算した。同じサンプルの血漿画分も入手し(1000gで10分間の遠心分離による)、同じ分析物についてAfinionにおいて測定した。使用した試薬は、表4(HDL)、表5(TG)および表10(CH)に記載されるものであった。TGおよびCHについて反応の終点を決定した。HDL反応の測定不能な終点は、進行曲線の最初の100秒および一次方程式を用いる曲線適合(表3)を用いて推定した。実施例9に記載されるように全血ヘマトクリットを決定し、各特定の全血サンプルについて得られたヘマトクリット値を用いて各結果を(1−ヘマトクリット)で除することによって、全血結果を血漿結果に変換した。図8は、60のサンプルについて、全血および血漿において得られた血漿レベル間の相関関係を示す。
1. 血液細胞含有サンプルの血漿部分において少なくとも1つの分析物の濃度を測定するための酵素的方法であって、前記サンプルが第1の成分および第2の成分を含有し、前記第2の成分が存在しかつブロック化されていない場合に、前記第2の成分が前記第1の成分の測定を妨害し、
i)前記血液細胞含有サンプルを、前記サンプルを希釈する試薬混合物と接触させるステップと、
ii)前記血液細胞を実質的に除去して、実質的に無細胞のサンプルを提供するステップと、
iii)前記サンプルを、前記第2の成分の反応を一時的に防止する役割を果たす少なくとも1つの試薬と接触させ、それにより、ブロック化された第2の成分を生成するステップと、
iv)前記サンプルを、前記少なくとも1つの分析物の各分析物の少なくとも1つの構成物のための少なくとも1つの転換酵素を含む少なくとも1つの試薬混合物と接触させ、それにより、前記分析物または各分析物の構成物の選択的反応により、検出可能な反応生成物を直接または間接的に生成させるステップであって、前記分析物または前記分析物の1つが前記第1の成分であるステップと、
v)1つまたは複数の前記検出可能な反応生成物をモニターするステップと、
vi)1つまたは複数の前記検出可能な生成物の量および/または1つまたは複数の前記検出可能な生成物の形成速度と、前記血液サンプル中の前記少なくとも1つの分析物またはそのそれぞれの濃度とを関連付けるステップであって、測定不能な(架空の)終点を推定することによって、少なくとも前記第1の成分の濃度が対応する検出可能な反応生成物と関連付けられるステップと
を含み、ステップiii)が、ステップiv)に至るまで(ステップiv)を含む)の任意の段階で、ただしステップv)もしくはvi)よりも前に実行されることが可能であり、ステップiii)の前記試薬が前記サンプルに別箇に適用されてもよいし、またはステップi)もしくはiv)の少なくとも1つの試薬混合物中に含まれていてもよい、酵素的方法。
2. 前記第1の成分および前記第2の成分が、共通の脂質構成物を有するが異なるタンパク質構成物を有するリポタンパク質成分である、実施形態1に記載の方法。
3. 前記少なくとも1つの構成物のための転換酵素が、コレステロール、トリグリセリドまたはリン脂質のための転換酵素などの、前記少なくとも1つの分析物の脂質構成物のための転換酵素である、実施形態1または2に記載の方法。
4. 前記少なくとも1つの分析物が、完全に、および/またはVLDL、IDL、LDL、HDLおよび非HDLからなる群からの特定のリポタンパク質と関連して、コレステロール、トリグリセリドまたはリン脂質の群からのものである、実施形態1〜3のいずれか一つに記載の方法。
5. 前記第1の成分が、VLDL、IDL、LDL、HDLおよび非HDLから選択される少なくとも1つのリポタンパク質構成物と関連した、コレステロール、トリグリセリドまたはリン脂質から選択される脂質構成物(例えば、HDLと関連したコレステロールなど)を有する1つの分析物である、実施形態4に記載の方法。
6. 前記第1の成分が非HDLコレステロールである、実施形態4に記載の方法。
7. 前記血液細胞含有サンプルが全血サンプルである、実施形態1〜6のいずれか一つに記載の方法。
8. ステップi)およびiii)がステップii)の前に実行される、実施形態1〜7のいずれか一つに記載の方法。
9. ステップi)およびiii)が同時に実行される、実施形態8に記載の方法。
10. ステップi)において前記サンプルを希釈する前記試薬混合物が、ステップiii)において前記第2の成分の反応を一時的に防止する役割を果たす前記少なくとも1つの試薬を含む、実施形態9に記載の方法。
11. 血液細胞含有サンプルの血漿部分において少なくとも3つの異なる分析物の濃度を測定するための酵素的方法であって、前記サンプルが第1の成分および第2の成分を含有し、前記第2の成分が存在しかつブロック化されていない場合に、前記第2の成分が前記第1の成分の測定を妨害し、
i)前記血液細胞含有サンプルを、前記サンプルを希釈する試薬混合物と接触させるステップと、
ii)前記血液細胞を実質的に除去して、実質的に無細胞のサンプルを提供するステップと、
iii)前記サンプルを、前記第2の成分の反応を一時的に防止する役割を果たす少なくとも1つの試薬と接触させ、それにより、ブロック化された第2の成分を生成するステップと、
iv)前記無細胞サンプルを少なくとも3つの部分に分割し、各部分を、脂質転換酵素を含む少なくとも3つの試薬混合物の少なくとも1つと接触させ、それにより、少なくとも3つの異なる分析物のそれぞれの選択的反応により、それぞれの検出可能な反応生成物を(直接または間接的に)生成させるステップであって、前記分析物の1つが前記第1の成分であるステップと、
v)前記検出可能な反応生成物をモニターするステップと、
vi)前記検出可能な生成物の量および/または前記検出可能な生成物の形成(または消費)速度と、前記血液サンプル中の前記少なくとも3つの異なる分析物の濃度とを関連付けるステップであって、測定不能な(架空の)終点を推定することによって、少なくとも前記第1の成分の濃度が対応する検出可能な反応生成物と関連付けられるステップと
を含み、ステップiii)が、ステップiv)に至るまで(ステップiv)を含む)の任意の段階で、ただしステップv)もしくはvi)よりも前に実行されることが可能であり、ステップiii)の前記試薬が前記サンプルに別箇に適用されてもよいし、またはステップi)もしくはiv)の少なくとも1つの試薬混合物中に含まれていてもよい、酵素的方法を含む、実施形態1〜10のいずれか一つに記載の方法。
12. 前記方法が、前記血液細胞含有サンプルの血漿部分において、前記第1の成分および第1の分析物としての少なくとも1つの特定のリポタンパク質と関連したコレステロールの濃度と、第2の分析物としての総コレステロールの濃度と、第3の分析物としての総トリグリセリドの濃度とを含む脂質プロファイルを決定するステップを含む、実施形態1〜11のいずれか一つに記載の方法。
13. ステップiv)が、
iv)前記無細胞サンプルまたはその一部を、脂質転換酵素を含む少なくとも1つの試薬混合物と接触させるステップであって、前記少なくとも1つの試薬混合物が前記ブロック化された第2の成分の存在下で反応して、特定のリポタンパク質または特定のリポタンパク質群(例えば、HDLまたは非HDL)と関連したコレステロールの少なくとも部分的に選択的な反応を引き起こすステップ
を含む、実施形態12に記載の方法。
14. ステップiv)が、
iv)前記無細胞サンプルの第1の部分を、脂質転換酵素を含む少なくとも1つの試薬混合物と接触させるステップであって、前記少なくとも1つの反応混合物が前記ブロック化された第2の成分の存在下で反応して、特定のリポタンパク質または特定のリポタンパク質群(例えば、HDLまたは非HDL)と関連したコレステロールの少なくとも部分的に選択的な反応を引き起こすステップと、
前記無細胞サンプルの第2の部分を、脂質転換酵素を含む少なくとも1つの試薬混合物と接触させるステップであって、前記少なくとも1つの反応混合物が前記第2の部分内の総コレステロールと反応するステップと、
前記無細胞サンプルの第3の部分を、脂質転換酵素を含む少なくとも1つの試薬混合物と接触させるステップであって、前記少なくとも1つの反応混合物が前記第3の部分内の総トリグリセリドと反応するステップと、
前記第1の成分(例えば、HDLコレステロールなど)、総コレステロールおよび総トリグリセリドのそれぞれに対応する検出可能な反応生成物を付随して生成するステップと
を含む、実施形態12または13に記載の方法。
15. 前記第1の成分が、脂質構成物(例えば、コレステロール)およびタンパク質構成物を有するリポタンパク質であり、かつ前記第2の成分が、前記第1の成分の前記タンパク質構成物以外のタンパク質と関連した同じ脂質構成物を含む、実施形態1〜14のいずれか一つに記載の方法。
16. ステップiii)における前記ブロック化された第2の成分の存在または生成が、ステップiv)における前記分析物または分析物の構成物のいずれかの反応を妨害しない、実施形態1〜15のいずれか一つに記載の方法。
17. 前記検出可能な生成物が測光法で検出可能である、実施形態1〜16のいずれか一つに記載の方法。
18. 前記血液サンプルの希釈が少なくとも10倍である、実施形態1〜17のいずれか一つに記載の方法。
19. 前記実質的に無細胞のサンプルが5%未満の血液細胞を含有する、実施形態1〜18のいずれか一つに記載の方法。
20. ステップii)がろ過によって実行される、実施形態1〜19のいずれか一つに記載の方法。
21. ステップii)が、5%以下の血液細胞の溶解を引き起こすことなどによって、細胞溶解を実質的に引き起こさずに実行される、実施形態1〜20のいずれか一つに記載の方法。
22. ステップii)が、前記成分のいずれかを5%以下だけ低減することなどによって、血漿脂質成分に実質的に影響を与えることなく実行される、実施形態1〜21のいずれか一つに記載の方法。
23. 前記第2の成分の反応を一時的に防止する役割を果たす前記少なくとも1つの試薬が、前記第1の成分よりも前記第2の成分に特異的な少なくとも1つの抗体を含む、実施形態1〜22のいずれか一つに記載の方法。
24. 前記第2の成分の反応を一時的に防止する役割を果たす前記少なくとも1つの試薬が、前記第2の成分のリポタンパク質構成物に特異的な少なくとも1つの抗体などの少なくとも1つの特定の結合剤を含む、実施形態1〜23のいずれか一つに記載の方法。
25. 20μL以下の血液を必要とする、実施形態1〜24のいずれか一つに記載の方法。
26. 適切なアルゴリズムを使用して、少なくとも前記第1の成分の測定不能な終点が決定される、実施形態1〜25のいずれか一つに記載の方法。
27. 前記アルゴリズムが一次速度式またはロジスティック関数である、実施形態26に記載の方法。
28. 前記ブロック化された第2の成分の実際のまたは潜在的な脱ブロック化のために、前記測定不能な終点を測定することができない、実施形態1〜27のいずれか一つに記載の方法。
29. 複数の分析物を測定するための、実施形態1〜28のいずれか一つに記載の方法。
30. 終点を推定することによって、前記各分析物の濃度が対応する検出可能な生成物の形成または消費と関連付けられ、前記終点の少なくとも1つが測定不能な(架空の)終点である、実施形態29に記載の方法。
31. 血液細胞含有サンプルの血漿部分において少なくとも3つの異なる分析物の濃度を決定する際に使用するためのキットであって、前記サンプルが第1の成分および第2の成分を含有し、前記第2の成分が存在しかつブロック化されていない場合に、前記第2の成分が前記第1の成分の測定を妨害し、
a)前記サンプルを希釈するように配合された第1の試薬混合物と、
b)細胞分離ユニットと、
c)(ブロック)前記第2の成分の反応を一時的および/または競合的に防止する役割を果たす第2の試薬であって、それにより、ブロック化された第2の成分を生成する第2の試薬と、
d)前記少なくとも3つの異なる分析物の選択的転換を引き起こし、それにより、各分析物に対応する検出可能な間接的生成物を生成するように配合された少なくとも3つのさらなる試薬混合物と
を含むキット。
32. 前記試薬c)が、前記試薬混合物a)中に含まれる、実施形態31に記載のキット。
33. 前記少なくとも3つの分析物が、総コレステロール、総トリグリセリド、およびHDL関連コレステロールを含む、実施形態31または32に記載のキット。
Claims (18)
- 血液細胞含有サンプルの血漿部分において非HDLコレステロールの濃度を測定するための酵素的方法であって、
前記サンプルが非HDLコレステロールおよびHDLコレステロールを含有し、
i)前記血液細胞含有サンプルを、前記サンプルを希釈する試薬混合物と接触させるステップと、
ii)前記血液細胞を実質的に除去して、実質的に無細胞のサンプルを提供するステップと、
iii)前記サンプルを、HDLコレステロールの反応を一時的に防止する役割を果たす少なくとも1つの試薬と接触させ、それにより、ブロック化されたHDLコレステロールを生成するステップと、
iv)前記サンプルを、コレステロールの転換酵素を含む少なくとも1つの試薬混合物と接触させ、それにより、非HDLコレステロールの選択的反応により、検出可能な反応生成物を直接または間接的に生成させるステップと、
v)1つまたは複数の前記検出可能な反応生成物をモニターするステップと、
vi)1つまたは複数の前記検出可能な反応生成物の量と、前記血液サンプル中の非HDLコレステロールの濃度とを関連付けるステップであって、
下記式(1)〜(6)
(1) Y=Y max −Y max *e^(-k(X-X 0 ))
(2) Y=Y max +(Y 0 −Y max )*e^(-kX)+X*C
(3) Y=Y 0 +(Y max −Y 0 )/(1+10^(logX 50 -logX)*B
(4) Y=Y max +(Y 0 −Y max )/(1+(X/X 50 ) B
(5) Y=Y 0 +(Y max −Y 0 )/(1+(X/X 50 ) B
(6) Y=Y max +(Y 0 −Y max )/(1+(X/X 50 ) B +X*C
(式中、Y 0 はX=0におけるYであり、Y max はX=無限大におけるYであり、kは速度定数であり、X 50 はYの最大の半分におけるXであり、Bは傾斜因子、傾斜の険しさであり、Cは併発反応の傾斜因子である)
から選択される、一次速度式またはロジスティック関数に基づくアルゴリズムを用いて、キャリブレータを用いずに、測定不能な(架空の)終点を推定することによって、非HDLコレステロールの濃度が対応する検出可能な反応生成物と関連付けられるステップと
を含み、
ステップiii)が、ステップiv)に至るまで(ステップiv)を含む)の任意の段階で、ただしステップv)もしくはvi)よりも前に実行されることが可能であり、ステップiii)の前記試薬が前記サンプルに別箇に適用されてもよいし、またはステップi)もしくはiv)の少なくとも1つの試薬混合物中に含まれていてもよい、
酵素的方法。 - 前記血液細胞含有サンプルが全血サンプルである、請求項1に記載の方法。
- ステップi)およびiii)がステップii)の前に実行される、請求項1または2に記載の方法。
- ステップi)およびiii)が同時に実行される、請求項3に記載の方法。
- ステップi)において前記サンプルを希釈する前記試薬混合物が、ステップiii)においてHDLコレステロールの反応を一時的に防止する役割を果たす前記少なくとも1つの試薬を含む、請求項4に記載の方法。
- 血液細胞含有サンプルの血漿部分において、非HDLコレステロール、総コレステロールおよび総トリグリセリドの濃度を測定するための酵素的方法であって、
前記サンプルがHDLコレステロールおよび非HDLコレステロールを含有し、
i)前記血液細胞含有サンプルを、前記サンプルを希釈する試薬混合物と接触させるステップと、
ii)前記血液細胞を実質的に除去して、実質的に無細胞のサンプルを提供するステップと、
iii)前記サンプルを、HDLコレステロールの反応を一時的に防止する役割を果たす少なくとも1つの試薬と接触させ、それにより、ブロック化されたHDLコレステロールを生成するステップと、
iv)前記無細胞サンプルを少なくとも3つの部分に分割し、各部分を、脂質転換酵素を含む少なくとも3つの試薬混合物の少なくとも1つと接触させ、それにより、非HDLコレステロール、総コレステロールおよび総トリグリセリドのそれぞれの選択的反応により、それぞれの検出可能な反応生成物を直接または間接的に生成させるステップと、
v)前記検出可能な反応生成物をモニターするステップと、
vi)前記検出可能な反応生成物の量と、前記血液サンプル中の非HDLコレステロール、総コレステロールおよび総トリグリセリドの濃度とを関連付けるステップであって、
下記式(1)〜(6)
(1) Y=Y max −Y max *e^(-k(X-X 0 ))
(2) Y=Y max +(Y 0 −Y max )*e^(-kX)+X*C
(3) Y=Y 0 +(Y max −Y 0 )/(1+10^(logX 50 -logX)*B
(4) Y=Y max +(Y 0 −Y max )/(1+(X/X 50 ) B
(5) Y=Y 0 +(Y max −Y 0 )/(1+(X/X 50 ) B
(6) Y=Y max +(Y 0 −Y max )/(1+(X/X 50 ) B +X*C
(式中、Y 0 はX=0におけるYであり、Y max はX=無限大におけるYであり、kは速度定数であり、X 50 はYの最大の半分におけるXであり、Bは傾斜因子、傾斜の険しさであり、Cは併発反応の傾斜因子である)
から選択される、一次速度式またはロジスティック関数に基づくアルゴリズムを用いて、キャリブレータを用いずに、測定不能な(架空の)終点を推定することによって、非HDLコレステロールの濃度が対応する検出可能な反応生成物と関連付けられるステップと
を含み、ステップiii)が、ステップiv)に至るまで(ステップiv)を含む)の任意の段階で、ただしステップv)もしくはvi)よりも前に実行されることが可能であり、ステップiii)の前記試薬が前記サンプルに別箇に適用されてもよいし、またはステップi)もしくはiv)の少なくとも1つの試薬混合物中に含まれていてもよい、
酵素的方法。 - ステップiv)が、
iv)前記無細胞サンプルの第1の部分を、脂質転換酵素を含む少なくとも1つの試薬混合物と接触させるステップであって、前記少なくとも1つの反応混合物が前記ブロック化されたHDLコレステロールの存在下で反応して、非HDLコレステロールの少なくとも部分的に選択的な反応を引き起こすステップと、
前記無細胞サンプルの第2の部分を、脂質転換酵素を含む少なくとも1つの試薬混合物と接触させるステップであって、前記少なくとも1つの反応混合物が前記第2の部分内の総コレステロールと反応するステップと、
前記無細胞サンプルの第3の部分を、脂質転換酵素を含む少なくとも1つの試薬混合物と接触させるステップであって、前記少なくとも1つの反応混合物が前記第3の部分内の総トリグリセリドと反応するステップと、
非HDLコレステロール、総コレステロールおよび総トリグリセリドのそれぞれに対応する検出可能な反応生成物を付随して生成するステップと
を含む、請求項6に記載の方法。 - ステップiii)における前記ブロック化されたHDLコレステロールの存在または生成が、ステップiv)における反応を妨害しない、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能な生成物が測光法で検出可能である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血液サンプルの希釈が少なくとも10倍である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記実質的に無細胞のサンプルが5%未満の血液細胞を含有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- ステップii)がろ過によって実行される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- ステップii)が、細胞溶解を実質的に引き起こさずに実行される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- ステップii)が、血漿脂質成分に実質的に影響を与えることなく実行される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- HDLコレステロールの反応を一時的に防止する役割を果たす前記少なくとも1つの試薬が、非HDLコレステロールよりもHDLコレステロールに特異的な少なくとも1つの抗体を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- HDLコレステロールの反応を一時的に防止する役割を果たす前記少なくとも1つの試薬が、HDLコレステロールのリポタンパク質構成物に特異的な少なくとも1つの特定の結合剤を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 20μL以下の血液を必要とする、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ブロック化されたHDLコレステロールの実際のまたは潜在的な脱ブロック化のために、前記測定不能な終点を測定することができない、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
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