JP2002159299A - 物質の測定法 - Google Patents

物質の測定法

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JP2002159299A JP2001266872A JP2001266872A JP2002159299A JP 2002159299 A JP2002159299 A JP 2002159299A JP 2001266872 A JP2001266872 A JP 2001266872A JP 2001266872 A JP2001266872 A JP 2001266872A JP 2002159299 A JP2002159299 A JP 2002159299A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 臨床診断に有用な検体中の共存する他成分の
影響を軽減した測定法及び測定試薬を提供する。 【構成】 検体中の物質を酵素反応を利用して化学量論
量の過酸化水素に導き、これをパーオキシダーゼの存在
下色素源と反応させ、呈色した反応液の可視部における
吸収を測定することにより比色定量する方法において、
一般式（Ｉ） ｛Ｒ1及びＲ2は水素又は置換もしくは非置換の低級アル
キル、Ｒ3は水素或いはＲ3とＲ1とが一緒になって−Ｒ3
−Ｒ1−として−ＮＨ−（ＣＨ2）n−（式中、ｎは２〜
４の整数）、Ｒ4は単結合又はアルキレン、Ｒ5はＯ-又
はＲ6−Ｘ-（Ｒ6は置換もしくは非置換のアルキレン、
ＸはＣＯＯ、ＳＯ2Ｏ又はＯＰＯ2Ｏ）、ＹはＲ7−ＮＨ
−（Ｒ7は置換数１〜３のヒドロキシで置換されていて
もよいコラノイル基）｝で表される化合物を存在させか
つ自動分析機を用いて測定することを特徴とする物質の
測定法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床診断に有用な、オ
キシダーゼ等の酵素反応系を利用し生成する過酸化水素
の定量を手段とする、物質の測定法および測定試薬に関
する。
【０００２】
【従来の技術】従来、酵素を使用した物質の測定には、
測定するための酵素の他、正確な測定値を得るために、
検体中の妨害物を消去したり妨害物の影響を回避する目
的で、種々の界面活性剤、酵素、添加物等が使用されて
いる。例えば、検体中のアスコルビン酸は、被測定物よ
り酸化酵素によって発生する過酸化水素を還元消費し、
過酸化水素を色素に導いて測定する方法では測定値を低
下させてしまう。検体中のビリルビンも同様な過酸化水
素の妨害物としてあげられており（臨床化学、８巻、１
号、６３−７２頁）、その対策として、特開昭６４−５
４９９号公報記載の酵素を用いる方法、クリニカルケミ
ストリー、２６巻、２号、２２７−２３１頁（１９８０
年）記載の鉄シアノ化合物を用いる方法、特公昭５８−
２２２００号公報記載の鉄キレート剤を用いる方法、特
開平３−１１９９９７号公報記載のベルリン酸あるいは
フェロセンを用いる方法等が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記方法によりビリル
ビンの影響はかなり軽減されるが、含量の少ない被測定
物の場合は、やはりビリルビンの影響が大きな意味を持
ってくる。例えば、被測定物の含量が数ｍＭのときにビ
リルビンの影響が仮に５％程度の影響であった場合、被
測定物の含量がその１０分の１のときには、発生する過
酸化水素が１０分の１であるのでその影響はおおよそ１
０倍の数１０％程度となり、無視できない状態となる。
【０００４】低含量の物質の測定において、ビリルビン
の影響をより軽減した方法および試薬が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、検体中の物質
を、酵素反応を利用して化学量論量の過酸化水素に導
き、これをパーオキシダーゼの存在下色素源と反応さ
せ、呈色した反応液の可視部における吸収を測定するこ
とにより比色定量する方法において、一般式（Ｉ）
【０００６】
【化２】
【０００７】｛式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なっ
て、水素または置換もしくは非置換の低級アルキルを表
し、Ｒ3は水素を表すか、あるいはＲ3とＲ1とが一緒に
なって−Ｒ3−Ｒ1−として−ＮＨ−（ＣＨ2）n−（式
中、ｎは２〜４の整数を表す）を表し、Ｒ4は単結合ま
たはアルキレンを表し、Ｒ5はＯ-またはＲ6−Ｘ-（式
中、Ｒ6は置換もしくは非置換のアルキレンを表し、Ｘ
はＣＯＯ、ＳＯ2ＯまたはＯＰＯ2Ｏを表す）を表し、Ｙ
は水素、ポリオキシエチレンまたはＲ7−ＮＨ−（式
中、Ｒ7は置換数１〜３のヒドロキシで置換されていて
もよいコラノイル基を表す）を表す｝で表される化合物
を存在させることを特徴とする物質の測定法に関する。
【０００８】また本発明は、検体中の物質を酵素反応を
利用して化学量論量の過酸化水素に導く酵素、パーオキ
シダーゼ、色素源および一般式（Ｉ）
【０００９】
【化３】
【００１０】｛式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なっ
て、水素または置換もしくは非置換の低級アルキルを表
し、Ｒ3は水素を表すか、あるいはＲ3とＲ1とが一緒に
なって−Ｒ3−Ｒ1−として−ＮＨ−（ＣＨ2）n−（式
中、ｎは２〜４の整数を表す）を表し、Ｒ4は単結合ま
たはアルキレンを表し、Ｒ5はＯ-またはＲ6−Ｘ-（式
中、Ｒ6は置換もしくは非置換のアルキレンを表し、Ｘ
はＣＯＯ、ＳＯ2ＯまたはＯＰＯ2Ｏを表す）を表し、Ｙ
はＲ7−ＮＨ−（式中、Ｒ7は置換数１〜３のヒドロキシ
で置換されていてもよいコラノイル基を表す）を表す｝
で表される化合物を含む検体中の物質の定量試薬に関す
る。
【００１１】以下、式（Ｉ）で表される化合物を化合物
（Ｉ）という。式（Ｉ）の各基の定義において、低級ア
ルキルとしては、直鎖または分枝状の炭素数１〜７の、
例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブ
チル、イソブチル、sec-ブチル、tert- ブチル、ペンチ
ル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル
等があげられ、アルキレンとしては、直鎖または分枝状
の炭素数１〜２０の、例えば、メチレン、エチレン、プ
ロピレン、１−メチルエチレン、ブチレン、オクチレ
ン、ノニレン、デシレン、ウンデシレン、ドデシレン、
トリデシレン、ノナデシレン、エイコシレン等があげら
れ、ポリオキシエチレンとしては、重合度１〜５００の
ポリオキシエチレンがあげられる。
【００１２】置換低級アルキルおよび置換アルキレンの
置換基としては、同一または異なって、置換数１〜３
の、例えば、ヒドロキシ、低級アルコキシ、アミノ、ハ
ロゲン等があげられる。置換基の定義において、低級ア
ルコキシの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同
意義を表し、ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素
の各原子を意味する。コラノイル基上のヒドロキシの置
換位置としては、３位、７位、１２位等があげられる。
【００１３】本発明の系が適用される生体成分中の被測
定物質と測定に使用される酵素類としては、尿酸（ウリ
カーゼ、パーオキシダーゼ）、クレアチニン（クレアチ
ニナーゼ、クレアチナーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、
パーオキシダーゼ）、コレステロール（コレステロール
オキシダーゼ、パーオキシダーゼ）、トリグリセライド
（リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グ
リセロール−３−リン酸オキシダーゼ、パーオキシダー
ゼ）、ポリアミン（ポリアミンアミドヒドロラーゼ、ポ
リアミンオキシダーゼ、プトレスシンオキシダーゼ、パ
ーオキシダーゼ）、胆汁酸（３−α−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、パーオキシダー
ゼ）、１，５−アンヒドログルシトール（１，５−アン
ヒドログルシトールオキシダーゼ、ピラノースオキシダ
ーゼ、パーオキシダーゼ）、ピルビン酸（ピルビン酸オ
キシダーゼ、パーオキシダーゼ）、乳酸（乳酸オキシダ
ーゼ、パーオキシダーゼ）、リン脂質（ホスホリパーゼ
Ｄ、コリンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ）、尿素
（ウレアアミドリアーゼ、ピルベートキナーゼ、ピルビ
ン酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼ）等があげられ
る。
【００１４】また、本発明は、酵素活性を測定する系、
例えば、Ｎ−アセチルグルコサミナーゼ（Ｎ−アセチル
グルコサミンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ）、モノ
アミンオキシダーゼ（パーオキシダーゼ）等の活性を測
定する系、あるいは、酵素活性を測定することにより検
体中の電解質の量を測定する系、例えば、カルシウム
（ホスホリパーゼＤ、コリンオキシダーゼ、パーオキシ
ダーゼ）、マグネシウム（グリセロールキナーゼ、グリ
セロール−３−リン酸オキシダーゼ、パーオキシダー
ゼ）、カリウム（ピルベートキナーゼ、ピルビン酸オキ
シダーゼ、パーオキシダーゼ）等の量を測定する系にも
応用できる。これらの系に使用するパーオキシダーゼの
使用量としては、１〜１００ｋｕ／ｌが好適である。
【００１５】色素源としては、４−アミノアンチピリン
とトリンダー試薬のカップリング色素系が使用される。
トリンダー試薬としては、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピ
ルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５
−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−
ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル
−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホ
プロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ
−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−
ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−スルホプロピルアニリ
ン、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香
酸、フェノール等があげられる。
【００１６】化合物（Ｉ）は、市販品であるかまたは下
記製造法により得ることができる。化合物（Ｉ）におい
て、Ｒ5 がＲ6 −Ｘ- （式中、Ｒ6 およびＸは前記と同
意義を表す）である化合物（Ｉａ）は、次の反応工程に
より得られる。
【００１７】
【化４】
【００１８】［式中、Ｒ5aはＲ5 の定義中のＲ6 −Ｘ-
（式中、Ｒ6 およびＸは前記と同意義を表す）を表し、
Ｒ8 はハロゲンを表し、Ｒ9 は水素またはアルカリ金属
を表すか、Ｒ8 とＲ9 が一緒になって単結合を表し、Ｒ
1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ6 、ＸおよびＹは前記と同意
義を表す］ Ｒ9 の定義におけるアルカリ金属は、リチウム、ナトリ
ウム、カリウム等を表し、Ｒ8 の定義におけるハロゲン
は前記と同義である。
【００１９】化合物（Ｉａ）は、アミン（II）の酸付加
塩を、塩基の存在下、水と有機溶媒との２相系中でフリ
ー体とした後、もしくはフリー体のアミン（II）を直
接、化合物（III ）と、有機溶媒中、必要により塩基の
存在下反応させることにより得ることができる。アミン
（II）の酸付加塩の酸としては、塩酸、臭化水素酸等の
無機酸、フマル酸、マレイン酸等の有機酸があげられ、
酸付加塩をフリー体とするための塩基としては、水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化アルカリ金属、
炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の炭酸アルカリ金属、
水酸化カルシウム等の水酸化アルカリ土類金属等があげ
られる。有機溶媒としては、塩化メチレン、クロロホル
ム、二塩化エタン等のハロゲン化炭化水素類、ジエチル
エーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類、ト
ルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類等が用いられ
る。
【００２０】化合物（III ）との反応において用いられ
る有機溶媒および塩基としては、上記と同様のものがあ
げられる。反応は、０℃から用いた溶媒の沸点で、３０
秒〜１０時間で終了する。上述した製造法における目的
化合物は、有機合成化学で常用される精製法、例えば、
濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマト
グラフィー等に付して単離精製することができる。
【００２１】化合物（Ｉ）の具体例を第１表に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】
【表３】
【００２５】次に、本発明の測定法について説明する。
本発明を実施するに際しては、一般に、ｐＨ２〜１１、
好ましくは４〜１０の緩衝剤、例えば、リン酸、トリス
−塩酸、グッド緩衝剤等の５〜５００Ｍ溶液中に化合物
（Ｉ）を０．１〜１００ｍＭ、好ましくは１〜５０ｍＭ
含有させ、これに１〜１００ｋｕ／ｌのパーオキシダー
ゼおよび４−アミノアンチピリン／トリンダー試薬等の
色素源を加え、さらに０．１〜１００ｋｕ／ｌのウリカ
ーゼ等の酸化酵素を加えて試験液とする。この溶液に検
体を加え、３０〜４５℃、好ましくは３７℃で１〜３０
分間加温し反応させる。反応後、生成色素の極大吸収波
長（５００〜８００ｎｍの範囲）で吸光度を測定し、標
準液の吸光度と比較することにより検体の濃度を算出す
る。
【００２６】化合物（Ｉ）は、同一分子上に、四級アミ
ンの様にカチオンに荷電する基およびカルボキシル、ス
ルホ、リン酸基等の様にアニオンに荷電する基を有し、
化合物（Ｉ）の中には界面活性効果を有するものもあ
る。その場合は、検体中の濁りの成分を測定試薬中で可
溶化させるために他の界面活性剤を使用しない場合もあ
るが、界面活性剤を使用して可溶化することも構わな
い。界面活性剤としては、一般に可溶化に用いられるノ
ニオン、アニオンまたはカチオンの界面活性剤があげら
れる。また、通常酵素反応に用いられる緩衝液あるいは
安定化剤等も効果に関係がなく、使用しても構わない。
緩衝剤の濃度としては、１０〜４００ｍＭがあげられ
る。また、従来ビリルビンの影響等を軽減するために使
用されてきた、フェロシアン化カリウム、フェロシアン
化ナトリウム、ベルリン酸塩、フェロセン化合物、ビリ
ルビンオキシダーゼ等を併用するとより良い結果を与え
る場合もあり、これらの併用も構わない。フェロシアン
化カリウム、フェロシアン化ナトリウム、ベルリン酸
塩、フェロセン化合物の濃度としては、従来これらを単
独で使用していた場合より低濃度である０．０００１〜
０．１ｍｇ／ｍｌがあげられる。
【００２７】また、試薬を２部に分けて反応を２段階と
し測定する方法、例えば、第１反応で検体中のアスコル
ビン酸や濁り等を消去あるいは可溶化し、第２反応で目
的物の酸化酵素を加えて呈色反応させる方法において
は、本発明に使用される化合物（Ｉ）は目的物の酸化酵
素による呈色反応時に系内に存在すれば良く、第１、第
２試薬のいずれに含まれていても効果を発揮するが、通
常は、第１試薬に含有されている方が効果的である。
【００２８】次に、実施例および参考例によって本発明
の態様を説明する。
【００２９】
【実施例】 実施例１ 尿酸の測定 （試薬１）：下記物質を含有するｐＨ＝７の溶液 ピペラジン-1,4- ビス(2- エタンスルホン酸) ７．６ｇ／ｌ 酢酸ナトリウム １５ｇ／ｌ ほう酸 ０．１ｇ／ｌ N-エチル-N-(3-メチルフェニル)- N'- サクシニルエチレンジアミン ０．２ｇ／ｌ パーオキシダーゼ ５ｋｕ／ｌ アスコルビン酸オキシダーゼ ３ｋｕ／ｌ （試薬１’）：試薬１に同仁化学研究所製ＣＨＡＰＳ（化合物１）を４ｇ／ｌ 添加し、ｐＨ＝７としたもの （試薬２）：下記物質を含有するｐＨ＝７の溶液 ピペラジン-1,4- ビス(2- エタンスルホン酸) ７．６ｇ／ｌ 酢酸ナトリウム １５ｇ／ｌ ほう酸 ０．１ｇ／ｌ パーオキシダーゼ １０ｋｕ／ｌ ウリカーゼ ０．７ｋｕ／ｌ ４−アミノアンチピリン ０．３５ｇ／ｌ フェロシアン化カリウム ０．０１ｇ／ｌ
【００３０】試験管を６本準備し、３本に試薬１を２．
２５ｍｌずつ入れとし、残り３本に試薬１’を
２．２５ｍｌずつ入れてと名づけた。まず、
にブランクとしてそれぞれ精製水０．０５ｍｌを添加、
にそれぞれ尿酸の１０ｍｇ／ｄｌ標準液を０．０５
ｍｌ添加、にそれぞれ尿酸の１０ｍｇ／ｄｌ標準液
にビリルビンを１００ｍｇ／ｄｌ溶解した液を０．０５
ｍｌ添加攪拌し、さらに全ての試験管に試薬２を０．７
５ｍｌ加えてよく攪拌し、３７℃の恒温槽中で加温し
た。１０分後にそれぞれの溶液の５５５ｎｍにおける吸
光度を測定したところ、０．０３６、０．２０４、
０．１９２、０．０３４、０．２０３、０．２
０２であった。ビリルビンの影響度を示す指標として、
ビリルビンが添加された場合に得られる吸光度と添加さ
れてない標準液の吸光度を比較した。試薬１はＣＨＡＰ
Ｓが無い例で（−）／（−）は０．９２であ
り、ＣＨＡＰＳを含む試薬１’では（−）／（−
）は０．９９であった（１に近い程ビリルビンの影響
は少ないことを示す）。ＣＨＡＰＳを含んだ系では影響
が軽減されていた。
【００３１】実施例２ 尿酸の測定 尿酸標準液の濃度を２ｍｇ／ｄｌ、４ｍｇ／ｄｌ、６ｍ
ｇ／ｄｌおよび８ｍｇ／ｄｌに変化させて実施例１と同
様に操作し、図１に示す検量線を作製した。
【００３２】 実施例３ クレアチニンの測定 （試薬１）：下記物質を含有するｐＨ＝７．７の溶液 ピペラジン-1,4- ビス(2- エタンスルホン酸) ７．６ｇ／ｌ N-エチル-N-(3-メチルフェニル)- N'- サクシニルエチレンジアミン ０．２ｇ／ｌ カタラーゼ ３００ｋｕ／ｌ アスコルビン酸オキシダーゼ ３ｋｕ／ｌ クレアチナーゼ ８０ｋｕ／ｌ ザルコシンオキシダーゼ ２０ｋｕ／ｌ アントヒール２４Ｂ（化合物１８） ０．３ ％ （試薬２）：下記物質を含有するｐＨ＝７．７の溶液 ピペラジン-1,4- ビス(2- エタンスルホン酸) ７．６ｇ／ｌ クレアチニナーゼ ３００ｋｕ／ｌ パーオキシダーゼ １０ｋｕ／ｌ ４−アミノアンチピリン ０．３５ｇ／ｌ アジ化ナトリウム ０．１ｇ／ｌ フェロセンカルボン酸 ０．０５ｇ／ｌ
【００３３】試験管４本に試薬１を２．２５ｍｌずつ入
れ、これに、ブランクとして精製水０．０５ｍｌ、
クレアチニンの５ｍｇ／ｄｌの標準液を０．０５ｍｌ、
３．５ｍｇ／ｄｌのクレアチニンを含む血清を０．０
５ｍｌ、の血清にビリルビンを２０ｍｇ／ｄｌの濃
度で添加した検体を０．０５ｍｌ添加して一旦攪拌し、
さらに試薬２を０．７５ｍｌ加えてよく攪拌後、３７℃
で１０分間加温した。５５５ｎｍにおける吸光度を測定
したところ、０．０２１、０．１４４、０．１０
６、０．１０６であった。より血清中のクレア
チニンは３．４６と計算され、またビリルビンの影響の
指標は１．０と計算され、影響がなかった。
【００３４】 実施例４ フリーコレステロールの測定 （試薬１）：下記物質を含有するｐＨ＝７の溶液 ピペラジン-1,4- ビス(2- エタンスルホン酸) ７．６ｇ／ｌ N-エチル-N-(3-メチルフェニル)- N'- サクシニルエチレンジアミン ０．３ｇ／ｌ トリトン Ｘ−１００ ３ｇ／ｌ パーオキシダーゼ ５ｋｕ／ｌ アスコルビン酸オキシダーゼ １ｋｕ／ｌ ベタインハイドロクロライド （化合物３・塩酸塩） ５ｇ／ｌ （試薬２）：下記物質を含有するｐＨ＝７の溶液 ピペラジン-1,4- ビス(2- エタンスルホン酸) ７．６ｇ／ｌ トリトン Ｘ−１００ ３ｇ／ｌ ４−アミノアンチピリン ０．５ｇ／ｌ パーオキシダーゼ ５ｋｕ／ｌ ベルリン酸 ０．０５ｇ／ｌ コレステロールオキシダーゼ ３ｋｕ／ｌ
【００３５】試験管４本に試薬１を２．２５ｍｌずつ入
れ、これに、ブランクとして精製水０．２０ｍｌ、
コレステロールの１００ｍｇ／ｄｌの標準液を０．０２
ｍｌ、２０ｍｇ／ｄｌのコレステロールを含む血清を
０．０２ｍｌ、の血清にビリルビンを２０ｍｇ／ｄ
ｌの濃度で添加した検体を０．０２ｍｌ添加して一旦攪
拌し、さらに試薬２を０．７５ｍｌ加えてよく攪拌後、
３７℃で１０分間加温した。５５５ｎｍにおける吸光度
を測定したところ、０．０１０、０．３２０、
０．０７２、０．０７２であり、ビリルビンの影響の
指標は１．０と計算された。ベタインハイドロクロライ
ドを添加しない場合の相当する値は０．０１５、
０．３２９、０．０７７、０．０６８で、ビリルビ
ン影響指標が０．８５であり、かなりのビリルビン影響
回避ができた。
【００３６】 実施例５ クレアチニンの測定（自動分析機） （試薬１）：下記物質を含有するｐＨ＝７．７の溶液 ピペラジン-1,4- ビス(2- エタンスルホン酸) ７．６ｇ／ｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １ｇ／ｌ N-エチル-N-(3-メチルフェニル)- N'- サクシニルエチレンジアミン ０．２ｇ／ｌ カタラーゼ ３００ｋｕ／ｌ アスコルビン酸オキシダーゼ ３ｋｕ／ｌ クレアチナーゼ ８０ｋｕ／ｌ ザルコシンオキシダーゼ １８ｋｕ／ｌ ＣＨＡＰＳ（化合物１） 表示量 （試薬２）：下記物質を含有するｐＨ＝７．７の溶液 ピペラジン-1,4- ビス(2- エタンスルホン酸) ７．６ｇ／ｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １ｇ／ｌ クレアチニナーゼ ３１０ｋｕ／ｌ パーオキシダーゼ ３０ｋｕ／ｌ ４−アミノアンチピリン ０．５ｇ／ｌ アジ化ナトリウム ０．１ｇ／ｌ フェロシアン化カリウム ０．０２ｇ／ｌ
【００３７】ＣＨＡＰＳの添加量は０，１，２，３，
４，５ｇ／ｌとし、上記試薬を調製し自動分析機でビリ
ルビン４０ｍｇ／ｄｌの影響を見た。 自動分析機パラメータ（日立７１５０型） 測定方法 ２ポイント ２４−５０ 測定主波長 ５４６ｎｍ 測定副波長 ７００ｎｍ サンプルボリューム ５μｌ
【００３８】サンプルの調製 ビリルビン無添加血清： ネスコールＸ，２ｍｌに生理
食塩水０．５ｍｌを加えた。 ビリルビン４０ｍｇ／ｄｌ添加血清： ネスコールＸ，
２ｍｌに２００ｍｇ／ｄｌのビリルビン０．５ｍｌを加
えた。
【００３９】結果を第２表に示す。
【００４０】
【表４】
【００４１】 実施例６ 尿酸の測定（自動分析機） （試薬１）：下記物質を含有するｐＨ＝７の溶液 ピペラジン-1,4- ビス(2- エタンスルホン酸) ７．６ｇ／ｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １ｇ／ｌ N-エチル-N-(3-メチルフェニル)- N'- サクシニルエチレンジアミン ０．２ｇ／ｌ パーオキシダーゼ ５ｋｕ／ｌ アスコルビン酸オキシダーゼ ３ｋｕ／ｌ 表示物質 ３ｇ／ｌ （試薬２）：下記物質を含有するｐＨ＝７の溶液 ピペラジン-1,4- ビス(2- エタンスルホン酸) ７．６ｇ／ｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １ｇ／ｌ ウリカーゼ ０．７ｋｕ／ｌ パーオキシダーゼ ３０ｋｕ／ｌ ４−アミノアンチピリン ０．５ｇ／ｌ アジ化ナトリウム ０．１ｇ／ｌ フェロセンカルボン酸 ０．０３ｇ／ｌ
【００４２】上記試薬にアンヒトール２０ＢＳ（化合物
１７）、アンヒトール２４Ｂ（化合物１８）、アンヒト
ール２０Ｎ（化合物２０）、アンヒトール２０Ｙ（化合
物２１）、ＣＨＡＰＳ（化合物１）およびベタインハイ
ドロクロライド（化合物３・塩酸塩）を表示量添加し、
自動分析機でビリルビン４０ｍｇ／ｄｌの影響を見た。
【００４３】自動分析機パラメータ（日立７１５０型） 測定方法 ２ポイント ２４−５０ 測定主波長 ５４６ｎｍ 測定副波長 ７００ｎｍ サンプルボリューム ５μｌ
【００４４】サンプルの調製 ビリルビン無添加血清： ネスコールＸ，２ｍｌに生理
食塩水０．５ｍｌを加えた。 ビリルビン４０ｍｇ／ｄｌ添加血清： ネスコールＸ，
２ｍｌに２００ｍｇ／ｄｌのビリルビン０．５ｍｌを加
えた。
【００４５】結果を第３表に示す。
【００４６】
【表５】
【００４７】参考例１：化合物４ トリメチルアミン塩酸塩９．５ｇを水１００ｍｌに溶解
し、これにクロロホルム１５０ｍｌを加え、さらに１２
Ｎ水酸化ナトリウム２０ｍｌを滴下した。激しく攪拌し
てクロロホルム層にトリメチルアミンを遊離させ、クロ
ロホルム層を分離した。このクロロホルム層５０ｍｌに
β−プロピオラクトン３．６ｍｌを添加し、４０℃で反
応させた。生成する結晶を濾取し、真空乾燥することに
より、化合物４，５．２ｇ（収率７９．４％）を得た。 Ｒｆ＝０．２５（クロロホルム／メタノール／酢酸＝６
０／４０／２）
【００４８】参考例２：化合物５ トリメチルアミン塩酸塩の代わりにジメチルアミン塩酸
塩８．２ｇを用いる以外は、参考例１と同様の操作を行
うことにより、化合物５，４．３ｇ（収率７４．３％）
を得た。 Ｒｆ＝０．２１（クロロホルム／メタノール／酢酸＝６
０／４０／２）
【００４９】参考例３：化合物６ トリメチルアミン塩酸塩の代わりにメチルアミン塩酸塩
６．７ｇを用いる以外は、参考例１と同様の操作を行う
ことにより、化合物６，２．２ｇ（収率４２．３％）を
得た。 Ｒｆ＝０．１７（クロロホルム／メタノール／酢酸＝６
０／４０／２）
【００５０】参考例４：化合物７ トリメチルアミン塩酸塩９．５ｇを水１００ｍｌに溶解
し、これにクロロホルム１５０ｍｌを加え、さらに１２
Ｎ水酸化ナトリウム２０ｍｌを滴下した。激しく攪拌し
てクロロホルム層にトリメチルアミンを遊離させ、クロ
ロホルム層を分離した。このクロロホルム層５０ｍｌに
１，３−プロパンサルトン６ｍｌを添加し、５０℃で反
応させた。生成する結晶を濾取し、真空乾燥することに
より、化合物７，８．８ｇ（収率９７．２％）を得た。 Ｒｆ＝０．１４（クロロホルム／メタノール／酢酸＝６
０／４０／２）
【００５１】参考例５：化合物８ トリメチルアミン塩酸塩の代わりにジメチルアミン塩酸
塩８．２ｇを用いる以外は、参考例４と同様の操作を行
うことにより、化合物８，５．１ｇ（収率６１．０％）
を得た。 Ｒｆ＝０．２６（クロロホルム／メタノール／酢酸＝６
０／４０／２）
【００５２】参考例６：化合物９ トリメチルアミン塩酸塩の代わりにメチルアミン塩酸塩
６．７ｇを用いる以外は、参考例４と同様の操作を行う
ことにより、化合物９，２．６ｇ（収率３４％）を得
た。 Ｒｆ＝０．２３（クロロホルム／メタノール／酢酸＝６
０／４０／２）
【００５３】参考例７：化合物１０ トリメチルアミン塩酸塩９．５ｇを水１００ｍｌに溶解
し、３−クロロ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナ
トリウム１９．７ｇを添加し、さらに水酸化ナトリウム
でｐＨを１０に調整した後、５０℃で反応させた。生成
する結晶を濾取し、真空乾燥することにより、化合物１
０，１．３ｇ（収率６．６％）を得た。 Ｒｆ＝０．１１（クロロホルム／メタノール／酢酸＝６
０／４０／２）
【００５４】参考例８：化合物１１ トリメチルアミン塩酸塩の代わりにジメチルアミン塩酸
塩８．２ｇを用いる以外は、参考例７と同様の操作を行
うことにより、化合物１１，４．６ｇ（収率２５．１
％）を得た。 Ｒｆ＝０．２２（クロロホルム／メタノール／酢酸＝６
０／４０／２）
【００５５】参考例９：化合物１２ トリメチルアミン塩酸塩の代わりにメチルアミン塩酸塩
６．７ｇを用いる以外は、参考例７と同様の操作を行う
ことにより、化合物１２，０．８ｇ（収率４．７％）を
得た。 Ｒｆ＝０．１６（クロロホルム／メタノール／酢酸＝６
０／４０／２）
【００５６】
【発明の効果】本発明により、検体中の物質を、酵素反
応を利用して過酸化水素に導き、これをパーオキシダー
ゼの存在下色素源と反応させ、呈色した反応液の可視部
における吸収を測定することにより比色定量する方法に
おいて、ビリルビンの影響をより軽減した測定法が提供
される。
【図面の簡単な説明】
【図１】測定物質として尿酸を用いたときの検量線であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ａ Ｂ Ｅ // Ｇ０１Ｎ 33/62 33/62 Ａ 33/70 33/70 33/92 33/92 Ｆターム(参考） 2G045 BA01 BB01 BB29 DA01 DA04 DA17 DA42 DA53 DA61 DA69 DA70 DA75 DA80 FA13 FB01 FB06 FB11 GC10 4B063 QA01 QQ01 QQ22 QQ89 QR01 QR02 QR07 QR12 QR57 QR66 QS36 QX02

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 検体中の物質を酵素反応を利用して化学
    量論量の過酸化水素に導く酵素、パーオキシダーゼ、色
    素源および一般式（Ｉ） 【化１】 ｛式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なって、水素また
    は置換もしくは非置換の低級アルキルを表し、Ｒ3は水
    素を表すか、あるいはＲ3とＲ1とが一緒になって−Ｒ3
    −Ｒ1−として−ＮＨ−（ＣＨ2）n−（式中、ｎは２〜
    ４の整数を表す）を表し、Ｒ4は単結合またはアルキレ
    ンを表し、Ｒ5はＯ-またはＲ6−Ｘ-（式中、Ｒ6は置換
    もしくは非置換のアルキレンを表し、ＸはＣＯＯ、ＳＯ
    2ＯまたはＯＰＯ2Ｏを表す）を表し、ＹはＲ7−ＮＨ−
    （式中、Ｒ7は置換数１〜３のヒドロキシで置換されて
    いてもよいコラノイル基を表す）を表す｝で表される化
    合物を含む自動分析機に使用するための検体中の物質の
    定量試薬。
  2. 【請求項２】 検体中の物質が、尿酸、クレアチニン、
    コレステロール、トリグリセライド、ポリアミン、胆汁
    酸、１，５−アンヒドログルシトール、ピルビン酸、乳
    酸、リン脂質または尿素である請求項１記載の物質の定
    量試薬。
  3. 【請求項３】 検体中の物質が、尿酸、クレアチニンま
    たはコレステロールである請求項１記載の物質の定量試
    薬。
  4. 【請求項４】 酵素反応に利用される酵素がウリカー
    ゼ、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ザルコシンオ
    キシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、リポプロテ
    インリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロール−
    ３−リン酸オキシダーゼ、ポリアミンアミドヒドロラー
    ゼ、ポリアミンオキシダーゼ、プトレスシンオキシダー
    ゼ、３−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、
    ジアホラーゼ、１，５−アンヒドログルシトールオキシ
    ダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダ
    ーゼ、乳酸オキシダーゼ、ホスホリパーゼＤ、コリンオ
    キシダーゼ、ウレアアミドリアーゼ、ピルベートキナー
    ゼまたはピルビン酸オキシダーゼである請求項１記載の
    物質の定量試薬。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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