JPS61184463A - 過酸化水素の新規定量法 - Google Patents
過酸化水素の新規定量法Info
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- JPS61184463A JPS61184463A JP2412285A JP2412285A JPS61184463A JP S61184463 A JPS61184463 A JP S61184463A JP 2412285 A JP2412285 A JP 2412285A JP 2412285 A JP2412285 A JP 2412285A JP S61184463 A JPS61184463 A JP S61184463A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の利用分野〕
本発明は、過酸化水素の新規な定量法に関するもので、
例えば、酵素反応により生成する過酸化水素ラベルオキ
シダーゼの存在下発色成分を用いてこれ全発色系に導き
、その呈色を比色定量することによりその定量を行う血
液、尿等の生体試料中の微量成分の定量法等に有効に利
用し得るものである。
例えば、酵素反応により生成する過酸化水素ラベルオキ
シダーゼの存在下発色成分を用いてこれ全発色系に導き
、その呈色を比色定量することによりその定量を行う血
液、尿等の生体試料中の微量成分の定量法等に有効に利
用し得るものである。
過酸化水素の検出、定量は化学実験上、工業上の重要性
だけでなく、特に臨床検査の分野に於ては酵素反応によ
り生成する過酸化水素を定量することにより生体成分の
定量を行う方法が広く普及しており極めて電番である。
だけでなく、特に臨床検査の分野に於ては酵素反応によ
り生成する過酸化水素を定量することにより生体成分の
定量を行う方法が広く普及しており極めて電番である。
例えば、血液中のコレスチロール、トリグリセライド、
グルコース。
グルコース。
尿酸、リン脂質、胆汁酸、コリンエステラーゼ。
モノアミンオキシダーゼ、グアナーゼなどを測定する方
法として、それぞれの系で最終的に生成する過酸化水素
全定量することにより目的物を測定する方法が開発され
ており、疾病の診断上役立っていることは周知の通りで
ある。
法として、それぞれの系で最終的に生成する過酸化水素
全定量することにより目的物を測定する方法が開発され
ており、疾病の診断上役立っていることは周知の通りで
ある。
過酸化水素の定量法として現在最も広く行われている方
法は、これをベルオキシダーゼ、及び発色成分である被
酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その呈色を比色
定量することにより間接的にその定量を行う方法である
。この方法に於て用いられる発色成分である被酸化性呈
色試薬の代表的なものとしては、４−アミノアンチピリ
ンと、フェノール系化合物又はＮ、・Ｎ−ジ置換アニリ
ン系化合物とを組合せた被酸化性呈色試薬１．３−メチ
ルベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリ
ン系化合物との組合せ試薬、２，２’−アジノヒス（３
−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴ
Ｓ ）、）リフェニルメタン系ロイコ色素、ベンジジン
誘導体、ジフェニルアミン誘導体、トリアリルイミダゾ
ール誘導体、ｏ−フ二二しンジアξン等が挙げられる。
法は、これをベルオキシダーゼ、及び発色成分である被
酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その呈色を比色
定量することにより間接的にその定量を行う方法である
。この方法に於て用いられる発色成分である被酸化性呈
色試薬の代表的なものとしては、４−アミノアンチピリ
ンと、フェノール系化合物又はＮ、・Ｎ−ジ置換アニリ
ン系化合物とを組合せた被酸化性呈色試薬１．３−メチ
ルベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリ
ン系化合物との組合せ試薬、２，２’−アジノヒス（３
−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴ
Ｓ ）、）リフェニルメタン系ロイコ色素、ベンジジン
誘導体、ジフェニルアミン誘導体、トリアリルイミダゾ
ール誘導体、ｏ−フ二二しンジアξン等が挙げられる。
しかしながら、これら被酸化性呈色試薬を用いて行う過
酸化水素定量法の従来技術はいずれも、被検試料中の過
酸化水素を全て酸化成績体に変換した後、その吸光度を
測定する方法である。従って、ここで用いられる被酸化
性呈色試薬はその酸化成績体が安定であることが必須条
件であり、呈色が不安定な酸化成績体は、これを安定化
させる特別な方法がない限シはかかる目的には使用が困
難であるとされていた。一方、上記した如き従来から用
いられている被酸化性呈色試薬は、ジフェニルアばン誘
導体を除いていずれもその呈色波長が７００ｎｍ以下で
ある為、例えば、血清、血漿等の体液成分の測定に於て
は、ビリルビン、ヘモグロビン等有色の共存物質の影響
を受は易い（尿中成分測定時には同様に尿中の色素体の
影響を受は易い）という問題点を有している。そこで、
よシ長波長側に呈色波長を有する被酸化性呈色試薬が種
々開発され、提案されているが、一般に、極大吸収波長
が７００ｎｍ以上にある被酸化性呈色試薬は呈色が不安
定であシ、そのままでは上記目的には使用し得ないこと
が多いというのが実状である。
酸化水素定量法の従来技術はいずれも、被検試料中の過
酸化水素を全て酸化成績体に変換した後、その吸光度を
測定する方法である。従って、ここで用いられる被酸化
性呈色試薬はその酸化成績体が安定であることが必須条
件であり、呈色が不安定な酸化成績体は、これを安定化
させる特別な方法がない限シはかかる目的には使用が困
難であるとされていた。一方、上記した如き従来から用
いられている被酸化性呈色試薬は、ジフェニルアばン誘
導体を除いていずれもその呈色波長が７００ｎｍ以下で
ある為、例えば、血清、血漿等の体液成分の測定に於て
は、ビリルビン、ヘモグロビン等有色の共存物質の影響
を受は易い（尿中成分測定時には同様に尿中の色素体の
影響を受は易い）という問題点を有している。そこで、
よシ長波長側に呈色波長を有する被酸化性呈色試薬が種
々開発され、提案されているが、一般に、極大吸収波長
が７００ｎｍ以上にある被酸化性呈色試薬は呈色が不安
定であシ、そのままでは上記目的には使用し得ないこと
が多いというのが実状である。
本発明の目的は、被検試料中の過酸化水素の全てが酸化
成績体に変換されるのを待たずに、反応の途中で、正確
且つ速かに、過酸化水素、又は反応して過酸化水素を生
成する物質の定量を行い得る方法を実現することと、酸
化成績体が不安定で、その吸光度が経時的に変化する被
酸化性呈色試薬を用いた、過酸化水素又は反応して過酸
化水素を生成する物質の定量法を実現することにあった
。
成績体に変換されるのを待たずに、反応の途中で、正確
且つ速かに、過酸化水素、又は反応して過酸化水素を生
成する物質の定量を行い得る方法を実現することと、酸
化成績体が不安定で、その吸光度が経時的に変化する被
酸化性呈色試薬を用いた、過酸化水素又は反応して過酸
化水素を生成する物質の定量法を実現することにあった
。
本発明は、ベルオキシダーゼの存在下発色成分を酸化発
色させ、その呈色を比色定量することにより行う過酸化
水素の定量法に於て、発色成分として、その酸化成績体
が不安定で吸光度が経時的に変化する被酸化性呈色試薬
を用いるか、或は、酸化成績体が安定な被酸化性呈色試
薬をこれが不安定となるような条件下で使用し、酸化成
績体の吸光度の時間的変化を測定してその最大吸光度を
求めることによりその定量を行うことを特徴とする過酸
化水素の定量法である。
色させ、その呈色を比色定量することにより行う過酸化
水素の定量法に於て、発色成分として、その酸化成績体
が不安定で吸光度が経時的に変化する被酸化性呈色試薬
を用いるか、或は、酸化成績体が安定な被酸化性呈色試
薬をこれが不安定となるような条件下で使用し、酸化成
績体の吸光度の時間的変化を測定してその最大吸光度を
求めることによりその定量を行うことを特徴とする過酸
化水素の定量法である。
即ち、本発明は、被検試料中の過酸化水素をベルオキシ
ダーゼの存在下発色成分である被酸化性呈色試薬と反応
させてこれを有色の酸化成績体とし、その呈色を比色定
量することにより該過酸化水素を定量せんとする過酸化
水素の定量法に於て、存在する過酸化水素の全量が酸化
成績体に変換し終るのを待たなくとも、その反応過程に
於ける最大吸光度を測定すれば反応の途中でも正確且つ
迅速にその定量を行い得ることを本発明者らが初めて見
出し完成した発明であシ、これにより、これまでかかる
用途には使用困難とされていた、酸化成績体が不安定で
吸光度が経時的に変化する被酸化性呈色試薬も、その呈
色波長が長波長側にあるという特性を生かして、同用途
に有効に使用し得るものとなった。このことは実に画期
的なことであシ、将に篤くべきことである。
ダーゼの存在下発色成分である被酸化性呈色試薬と反応
させてこれを有色の酸化成績体とし、その呈色を比色定
量することにより該過酸化水素を定量せんとする過酸化
水素の定量法に於て、存在する過酸化水素の全量が酸化
成績体に変換し終るのを待たなくとも、その反応過程に
於ける最大吸光度を測定すれば反応の途中でも正確且つ
迅速にその定量を行い得ることを本発明者らが初めて見
出し完成した発明であシ、これにより、これまでかかる
用途には使用困難とされていた、酸化成績体が不安定で
吸光度が経時的に変化する被酸化性呈色試薬も、その呈
色波長が長波長側にあるという特性を生かして、同用途
に有効に使用し得るものとなった。このことは実に画期
的なことであシ、将に篤くべきことである。
本発明の定量法は、過酸化水素と被酸化性呈色試薬との
反応過程に於ける酸化成績体の吸光度の時間的変化を測
定してその最大吸光度を求めることにより行うものであ
るから、これに用いる被酸化性呈色試薬はその酸化成績
体が不安定なものであるか、或いは酸化成績体が安定な
ものはそれが不安定となるような条件下でこれを用いる
必要がある。
反応過程に於ける酸化成績体の吸光度の時間的変化を測
定してその最大吸光度を求めることにより行うものであ
るから、これに用いる被酸化性呈色試薬はその酸化成績
体が不安定なものであるか、或いは酸化成績体が安定な
ものはそれが不安定となるような条件下でこれを用いる
必要がある。
本発明に於て用いられる酸化成績体が不安定な被酸化性
呈色試薬の例としては、例えば、ｏ−トリジン、０−ジ
アニシジン、３，３’−ジアミノベンジジン等のベンジ
ジン誘導体、ｐｐ′−ジエチルアミン−Ｎ ％ Ｎ’−
ジフェニルホルムアミジン及ヒソの類縁化合物、２，７
−ジアミツフルオレン、例えば２−（４−ジメチルアミ
ノフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェ
ニル）イミダゾール等のトリアリルイミダゾール誘導体
。
呈色試薬の例としては、例えば、ｏ−トリジン、０−ジ
アニシジン、３，３’−ジアミノベンジジン等のベンジ
ジン誘導体、ｐｐ′−ジエチルアミン−Ｎ ％ Ｎ’−
ジフェニルホルムアミジン及ヒソの類縁化合物、２，７
−ジアミツフルオレン、例えば２−（４−ジメチルアミ
ノフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェ
ニル）イミダゾール等のトリアリルイミダゾール誘導体
。
ＡＢＴＳ 、グアヤク脂等が挙げられるが、特にこれら
に限定されるものではなく、公知、未公知を問わず酸化
成績体が不安定となる被酸化性呈色試薬（組合せ試薬も
含む）ならば、その他の条件さえ適えば全て使用可能で
ある。
に限定されるものではなく、公知、未公知を問わず酸化
成績体が不安定となる被酸化性呈色試薬（組合せ試薬も
含む）ならば、その他の条件さえ適えば全て使用可能で
ある。
又、本来酸化成績体が安定な被酸化性呈色試薬（組合せ
試薬も含む）の場合には、これが不安定となるような条
件下、即ち、例えばｐＦＩや塩濃度等を調節するなどし
てこれを不安定化せしめ、使用に供せばよい。従って、
先に述べた如き、過酸化水素定量用の発色成分として従
来から用いられている、酸化成績体が安定な被酸化性呈
色試薬（組合せ試薬も含む）も、夫々その酸化成績体が
不安定となるような条件を設定することにより、いずれ
も本発明の定量方法に有効に使用し得る。
試薬も含む）の場合には、これが不安定となるような条
件下、即ち、例えばｐＦＩや塩濃度等を調節するなどし
てこれを不安定化せしめ、使用に供せばよい。従って、
先に述べた如き、過酸化水素定量用の発色成分として従
来から用いられている、酸化成績体が安定な被酸化性呈
色試薬（組合せ試薬も含む）も、夫々その酸化成績体が
不安定となるような条件を設定することにより、いずれ
も本発明の定量方法に有効に使用し得る。
本発明の方法では、過酸化水素を全量発色系に変換させ
る必要がないので、過酸化水素又は反応して過酸化水素
を生成する物質を極めて迅速に測定することができるが
、又、本発明の方法を臨床検査の分野で広く用いられて
いる自動分析装置に適用させた場合には、酸化成績体が
不安定でその呈色が短時間内に消失してしまう為、従来
からの問題であった呈色反応液中の色素が反応キュベツ
ト或すは反応チューブ等に残存、付着し次の測定に誤差
を与えるというような問題が全く解消できる。この結果
、これまで恋人りに行う必要のあったキュベツト、チュ
ーブ等の洗浄操作が簡略化でき、機械、動作の簡易化が
可能となった。又、反応して過酸化水素を生成する物質
を数種類測定する場合に、検体に被酸化性呈色試薬とベ
ルオキシダーゼからなる発色試薬を加えた後、この被検
液に目的とする物質に作用して過酸化水素を生成させる
酵素（酸化酵素）を順次加え、その都度、夫々の呈色の
最大吸光度を測定することにより、一つの被検液で多種
目の連続測定が可能となった。
る必要がないので、過酸化水素又は反応して過酸化水素
を生成する物質を極めて迅速に測定することができるが
、又、本発明の方法を臨床検査の分野で広く用いられて
いる自動分析装置に適用させた場合には、酸化成績体が
不安定でその呈色が短時間内に消失してしまう為、従来
からの問題であった呈色反応液中の色素が反応キュベツ
ト或すは反応チューブ等に残存、付着し次の測定に誤差
を与えるというような問題が全く解消できる。この結果
、これまで恋人りに行う必要のあったキュベツト、チュ
ーブ等の洗浄操作が簡略化でき、機械、動作の簡易化が
可能となった。又、反応して過酸化水素を生成する物質
を数種類測定する場合に、検体に被酸化性呈色試薬とベ
ルオキシダーゼからなる発色試薬を加えた後、この被検
液に目的とする物質に作用して過酸化水素を生成させる
酵素（酸化酵素）を順次加え、その都度、夫々の呈色の
最大吸光度を測定することにより、一つの被検液で多種
目の連続測定が可能となった。
更に、使用する酵素全キュベツト、ビーズ、チューブ等
に固定化し、これに検体を被酸化性呈色試薬とベルオキ
シダーゼからなる発色試薬と混合した被検液全フローシ
ステムで連続的に反応をさせることにより、数種類の項
目を連続的に迅速に測定することも可能となった。
に固定化し、これに検体を被酸化性呈色試薬とベルオキ
シダーゼからなる発色試薬と混合した被検液全フローシ
ステムで連続的に反応をさせることにより、数種類の項
目を連続的に迅速に測定することも可能となった。
又、先に述べた如く、例えば血清、血漿等の体液成分の
測定に於てはビリルビン、ヘモグロビン等有色の共存物
質の影響を受は易いので、より長波長側に呈色波長を有
する被酸化性呈色試薬の使用が望ましいが、一般に極大
吸収波長が７００ｎｍ以上にある被酸化性呈色試薬は呈
色が不安定なので、従来の過酸化水素の定量方法では使
用が困難であったが、本発明の方法により、これらの被
酸化性呈色試薬が有効に使用し得るものとなった。
測定に於てはビリルビン、ヘモグロビン等有色の共存物
質の影響を受は易いので、より長波長側に呈色波長を有
する被酸化性呈色試薬の使用が望ましいが、一般に極大
吸収波長が７００ｎｍ以上にある被酸化性呈色試薬は呈
色が不安定なので、従来の過酸化水素の定量方法では使
用が困難であったが、本発明の方法により、これらの被
酸化性呈色試薬が有効に使用し得るものとなった。
即ち、本発明の過酸化水素の定量法は、基質。
又は酵素反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ
生成する過酸化水素を定量することにより行う生体試料
中の基質又は酵素活性の定量法として特に効果的に使用
し得る。
生成する過酸化水素を定量することにより行う生体試料
中の基質又は酵素活性の定量法として特に効果的に使用
し得る。
本発明の方法により測定可能な生体試料中の微量成分と
しては、例えば、コレステロール、グルコース、グリセ
リン、トリグリセライド、遊離脂肪酸、尿酸、リン脂質
、胆汁酸、モノアミンオキシダーゼ、グアナーゼ、コリ
ンエステラーゼ等が挙けられるが、これらに限定される
ものではなく、酵素反応により生成する過酸化水素を定
量することによって測定が可能な生体成分は全て定量可
能である。
しては、例えば、コレステロール、グルコース、グリセ
リン、トリグリセライド、遊離脂肪酸、尿酸、リン脂質
、胆汁酸、モノアミンオキシダーゼ、グアナーゼ、コリ
ンエステラーゼ等が挙けられるが、これらに限定される
ものではなく、酵素反応により生成する過酸化水素を定
量することによって測定が可能な生体成分は全て定量可
能である。
本発明の方法による生体成分の定量に於て、過酸化水素
を生成させる酵素として用いられる酸化酵素（オキンダ
ーゼ）及びその他の目的で用いられる酵素類並びに酵素
反応に関与する基質及びその他の物質の種類及び使用量
は被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の生体成分の定量
法に準じて夫々測定対象となる物質に応じて適宜選択す
ればよい。又、本発明による過酸化水素の定量に於て用
いられるベルオキシダーゼとしては、その起源。
を生成させる酵素として用いられる酸化酵素（オキンダ
ーゼ）及びその他の目的で用いられる酵素類並びに酵素
反応に関与する基質及びその他の物質の種類及び使用量
は被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の生体成分の定量
法に準じて夫々測定対象となる物質に応じて適宜選択す
ればよい。又、本発明による過酸化水素の定量に於て用
いられるベルオキシダーゼとしては、その起源。
由来に特に限定はなく、植物、動物、微生物起源のベル
オキシダーゼ又はベルオキシダーゼ様物質が、一種若し
くは要すれば二種以上組合せて用いられる。又、その使
用量は目的に応じて適宜定められ、特に限定されない。
オキシダーゼ又はベルオキシダーゼ様物質が、一種若し
くは要すれば二種以上組合せて用いられる。又、その使
用量は目的に応じて適宜定められ、特に限定されない。
本発明の方法による生体成分の定量に於て用いられる緩
衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩。
衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩。
ホウ酸塩、炭酸塩、トリス緩衝液、グツド（Ｇｏｏｄ
’ｓ ）緩衝液などが挙げられるが、特にこれらに限定
されない。
’ｓ ）緩衝液などが挙げられるが、特にこれらに限定
されない。
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はこれら実施例にょシ何ら限定されるものではな
い。
本発明はこれら実施例にょシ何ら限定されるものではな
い。
実施例１
（１） 発色試液 ５０ ｍｍｏｔ／ｌリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）にペルオキシ−ダーゼＩ ＯＵ／ｌ、
ｐ ｐ’−ジメチルアｄノーＮ、Ｎ’−ジフェニルポ
ルムアだジン５０μｍｏｔ／Ｌの濃度になるように調製
した。
（ｐＨ７，０）にペルオキシ−ダーゼＩ ＯＵ／ｌ、
ｐ ｐ’−ジメチルアｄノーＮ、Ｎ’−ジフェニルポ
ルムアだジン５０μｍｏｔ／Ｌの濃度になるように調製
した。
（２）測定方法 過酸化水素濃度１．０ｍｍｏｔ／ｌの
試料５０μｔＫ発色試液２．０−を加え３７℃に加温下
、８８０ｎｍの吸光度を経時的に測定した。
試料５０μｔＫ発色試液２．０−を加え３７℃に加温下
、８８０ｎｍの吸光度を経時的に測定した。
第１図に本実施例に於ける吸光度の時間的変化を示す。
第１図よシ明らかな如く、過酸化水素濃度１．０ｍｍｏ
ｔ／Ｌの本実施例に於ては、反応開始約１４秒後に最大
吸光度約０１２６８を示している。
ｔ／Ｌの本実施例に於ては、反応開始約１４秒後に最大
吸光度約０１２６８を示している。
実施例２ 過酸化水素の定量
（１） 発色試液 ５０ ｍｍｏｔ／ｌリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）にベルオキシダーゼｌ ＯＵ／ｌ、、
ｐ、ｐ’−ジメチルアばノーＮＳＮ’−ジフェニルホル
ムアミジン５０μｍｏｔ／ｌの濃度になるように調製し
た。
（ｐＨ７，０）にベルオキシダーゼｌ ＯＵ／ｌ、、
ｐ、ｐ’−ジメチルアばノーＮＳＮ’−ジフェニルホル
ムアミジン５０μｍｏｔ／ｌの濃度になるように調製し
た。
（２）試 料 市販過酸化水素水を蒸留水で希釈し、０
．２ ＋ ０．５ ＋ １．０ ｍ ２．０ ｍｍｏｔ
／ ｌになるように調製した。
．２ ＋ ０．５ ＋ １．０ ｍ ２．０ ｍｍｏｔ
／ ｌになるように調製した。
（３）測定方法 各試料及び蒸留水各５０ ｔｔＬに夫
々発色試液２．０−を加え３７℃に加温下、８８０ｎｍ
の吸光度を経時的に測定して、夫々の場合の最大吸光度
を求めた。
々発色試液２．０−を加え３７℃に加温下、８８０ｎｍ
の吸光度を経時的に測定して、夫々の場合の最大吸光度
を求めた。
第２図に過酸化水素濃度と最大吸光度との関係を示す。
第２図より明らかな如く、各過酸化水素濃度に対してプ
ロットした最大吸光度を結ぶ検量線は原点を通る直線と
なシ、検量線は良好な定量性を示している。
ロットした最大吸光度を結ぶ検量線は原点を通る直線と
なシ、検量線は良好な定量性を示している。
実施例３ 尿酸の定量
（１） 発色試液 ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ 、 ＭＥＳ
（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸〕緩衝液
（ｐＨ６，５）にウリカーゼ１００Ｕ／ｌ、ベルオキシ
ダーゼ１０Ｕ／ｌ、ｐ、ｐ′−ジメチルアミン−Ｎ、Ｎ
’ −ジフェニルホルムアミジン５０μｍｏｔ７ｔの濃
度になるように調製した。
（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸〕緩衝液
（ｐＨ６，５）にウリカーゼ１００Ｕ／ｌ、ベルオキシ
ダーゼ１０Ｕ／ｌ、ｐ、ｐ′−ジメチルアミン−Ｎ、Ｎ
’ −ジフェニルホルムアミジン５０μｍｏｔ７ｔの濃
度になるように調製した。
（２）試 料 尿酸を蒸留水で希釈し０．２，０．５゜
１．０．２．０■／ｄｉになるように調製した。
１．０．２．０■／ｄｉになるように調製した。
（３） 測定操作 各試料液及び蒸留水各２０ ｐＬ
に夫々発色試液２．０−を加え、３７℃に加温下８８０
ｎｍの吸光度を経時的に測定して夫々の場合の最大吸光
度を求めた。
に夫々発色試液２．０−を加え、３７℃に加温下８８０
ｎｍの吸光度を経時的に測定して夫々の場合の最大吸光
度を求めた。
第３図に尿酸濃度と最大吸光度との関係を示す。
第３図よシ明らかな如く、各尿酸濃度に対してプロット
した最大吸光度を結ぶ検量線は原点を通る直線となり検
量線は良好な定量性を示している。
した最大吸光度を結ぶ検量線は原点を通る直線となり検
量線は良好な定量性を示している。
実施例４ 過酸化水素の定量
（１） 発色試液 ５０ ｍｍｏｔ／ｌリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０） ＶＣへｈオキシダーゼｌＯＵ／１ｘＯ
−トリジンｌ ｍ ｍｏｔ／ ｌの濃度になるように調
製した。
（ｐＨ７，０） ＶＣへｈオキシダーゼｌＯＵ／１ｘＯ
−トリジンｌ ｍ ｍｏｔ／ ｌの濃度になるように調
製した。
（２）試 料 市販過酸化水素水を蒸留水で希釈し、０
．２ 、０．５ 、１．０ 、２．０ｍｌ／ｌになるよ
うに調製した。
．２ 、０．５ 、１．０ 、２．０ｍｌ／ｌになるよ
うに調製した。
（３） 測定方法 各試料液及び蒸留水各５ｏμｔに
夫々発色試液２．０−を加え、３７℃に加温下６３５ｎ
ｍの吸光度を経時的に測定して夫々の場合の最大吸光度
金求めた。
夫々発色試液２．０−を加え、３７℃に加温下６３５ｎ
ｍの吸光度を経時的に測定して夫々の場合の最大吸光度
金求めた。
第４図に過酸化水素濃度と最大吸光度との関係を示す。
第４図より明らかな如く、各過酸化水素濃度に対してプ
ロットした最大吸光度を結ぶ検量線は原点を通る直線と
なシ、検量線は良好な定量性を示している。
ロットした最大吸光度を結ぶ検量線は原点を通る直線と
なシ、検量線は良好な定量性を示している。
実施例５
（１）第１試液 ５０ｍｍｏｔ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）Ｉｔにウリカーゼ５０Ｕ、ベルオキシダーゼ５
，０ＯＯＵ％ｐ、ｐ’−ジエチルアミノ−Ｎ、Ｎ−ジフ
ェニルホルムアミジン０．５ ｍｍｏｔｆ溶解して調製
した。
７，０）Ｉｔにウリカーゼ５０Ｕ、ベルオキシダーゼ５
，０ＯＯＵ％ｐ、ｐ’−ジエチルアミノ−Ｎ、Ｎ−ジフ
ェニルホルムアミジン０．５ ｍｍｏｔｆ溶解して調製
した。
（２）第２試液 ５０ｍｍｏｔ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０） １ ｔにコレステロールオキシダーゼ１５．
０ＯＯＵを溶解して調製した。
７，０） １ ｔにコレステロールオキシダーゼ１５．
０ＯＯＵを溶解して調製した。
（３）試 料 尿酸１０■／ｄｌの基準液、コレステロ
ール５０■／εの基準液、及び人血清５検体を試料とし
た。
ール５０■／εの基準液、及び人血清５検体を試料とし
た。
（４）測定方法 第１試液３、〇−に試料１０μｔを添
加し、３７℃での８８０ｎｍに於ける最大吸光度Ａ＋
ｋ測定した。試料添加１０分後にさらにこの液に第２試
液０．１−を添加し、３７℃での８８０ｎｍに於ける最
大吸光度Ａ２を測定した。次式に従い、尿酸値、遊離コ
レステロール値を夫々算出し念。
加し、３７℃での８８０ｎｍに於ける最大吸光度Ａ＋
ｋ測定した。試料添加１０分後にさらにこの液に第２試
液０．１−を添加し、３７℃での８８０ｎｍに於ける最
大吸光度Ａ２を測定した。次式に従い、尿酸値、遊離コ
レステロール値を夫々算出し念。
遊離コレステロール値
また、尿酸測定用の市販キット（尿酸−〇テストワコー
、和光純薬工業■製）及び遊離コレステロール測定用の
市販キット（遊離コレステロール−Ｃテストワコー、和
光紬薬工業■製）を用い、同一人血清を測定し水沫と比
較した。結果を表１に示す。
、和光純薬工業■製）及び遊離コレステロール測定用の
市販キット（遊離コレステロール−Ｃテストワコー、和
光紬薬工業■製）を用い、同一人血清を測定し水沫と比
較した。結果を表１に示す。
表 １
〔発明の効果〕
以上述べた如く、本発明の定量法は（１）過酸化水素の
全量が発色系に変換されるのを待たなくとも測定が行え
るので、測定時間が短縮できる点。（１１）酸化成績体
の呈色が短時間内に消失己てしまう為、臨床検査の分野
等自動分析装置を用いる測定に於て、反応液中の色素が
反応キュベツトや反応チューブ等に残存、付着し次の測
定に誤差を与えるという問題点が全く解消され、キュベ
ツト、チューブ等の洗浄操作が簡略化でき、機械、動作
の簡易化が可能となった点。（ｉｉｉ）同一被検液を用
い、同−検体中に存在する反応して過酸化水素を生成す
る物質数種類の連続測定を行うことが可能となった点。
全量が発色系に変換されるのを待たなくとも測定が行え
るので、測定時間が短縮できる点。（１１）酸化成績体
の呈色が短時間内に消失己てしまう為、臨床検査の分野
等自動分析装置を用いる測定に於て、反応液中の色素が
反応キュベツトや反応チューブ等に残存、付着し次の測
定に誤差を与えるという問題点が全く解消され、キュベ
ツト、チューブ等の洗浄操作が簡略化でき、機械、動作
の簡易化が可能となった点。（ｉｉｉ）同一被検液を用
い、同−検体中に存在する反応して過酸化水素を生成す
る物質数種類の連続測定を行うことが可能となった点。
Ｍ酸化呈色時の極大吸収波長が長波長側（例えば７００
ｎｍ以上）にあるが、酸化成績体が不安定でその吸光度
が経時的に変化する為、これまで過酸化水素の定量には
使用困難とされていた被酸化性呈色試薬を、その呈色波
長が長波長側にあるという特性音生かして、同用途に有
効に使用すること全可能ならしめた点。等に顕著な効果
を奏するものであり、斯業に貢献するところ甚だ大なる
ものである。
ｎｍ以上）にあるが、酸化成績体が不安定でその吸光度
が経時的に変化する為、これまで過酸化水素の定量には
使用困難とされていた被酸化性呈色試薬を、その呈色波
長が長波長側にあるという特性音生かして、同用途に有
効に使用すること全可能ならしめた点。等に顕著な効果
を奏するものであり、斯業に貢献するところ甚だ大なる
ものである。
第１図は、実施例１に於て得られた吸光度の時間的変化
を示したグラフであシ、横軸の各経過時間（秒）に於て
得られた吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだ
ものである。 第２図は、被酸化性呈色試薬としてｐ、ｐ’−ジメチル
アミン−Ｎ 、 Ｎ’−ジフェニルホルムアだジンを使
用した実施例２に於て得られた検量線を表わし、横軸の
各過酸化水素濃度（ｍｍｏｔ／ｌ）について得られた最
大吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだもので
ある。 第３図は、被酸化性呈色試薬としてＩ）５ｐ’−ジメチ
ルアミン−Ｎ、Ｎ’−ジフェニルホルムアばジンを使用
した実施例３に於て得られた検量線を表わし、横軸の各
尿酸濃度（η／ｄｉ）について得られた最大吸光度を縦
軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 第４図は、被酸化性呈色試薬として〇−トリジンを使用
した実施例４に於て得られた検量線を表わし、横軸の各
過酸化水素濃度（ｍｍｏｔ／ｌ）について得られた最大
吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものであ
る。 特許出願人 和光純薬工業株式会社 第 １ 図 ３８酸化７］（素環ｉ （”％ ） 手続補正書 昭和６１年 ５月 ６日 ！、事件の表示 昭和６０年特許願第０２４１２２号 λ 発明の名称 過酸化水素の新規定量法 １ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 連絡装置 ０３−２７０−１１５７１ ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄、図面の簡単な説明の欄
、及び図面。 ６ 補正の内容 （１）明細書１７頁１行目から１３行目にかげて記載の
表１のあとに以下の文章を挿入する。 「実施例６ （１）発色試液Ａ ０．１０ ｍｏｌ／ＩＩリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）ＩＡにＮ、Ｎ−ビス（ｐ−ジメチル
アミノフェニル）−Ｎ−（ｐ−）ルエンスルホニル）ウ
レア４５■、トリトンＸ−１００１，１，ベルオキシダ
ーゼ３３．０ＯＯＵ１ウリカーゼ３，３００Ｕを溶解し
て調製した。 （２）発色試液Ｂ 発色試液Ａ ５００ ＋ｎ／にＬ−
チアゾリジン−４−カルボン酸２５０■を溶解して調製
した。 （３） コレステロールオキシダーゼ溶液０．１０ｍ
ｏｌ／ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７，０） １０ｒｎｌに
コレステロールオキシダーゼ１，０ＯＯＵを溶解して調
製した。 （４） Ｘ料コントロール血清Ｃコントロール シー
ラム■ワコー（和光紬薬工業（株）製、ＬｏｔＡＣＤＦ
９４Ａ４ 、遊離コレステロール表示値２６ ｍ９７ｄ
ｉ 。 尿酸７．６■／ｄｌ ） ］及びこれを蒸留水で３／４
、２／４ 。 １／４に希釈したもの。 （５）測定方法 発色試液Ａ又はＢ ３． Ｏｒｎｌに
試料（２／４に希釈したもの）１０μノを加え３７℃に
加温下〜 ７３０ ｎｍでの吸光度変化を測定した。 又、発色試液Ｂ ３． Ｏｍｌに蒸留水及び各試料１０
μｌを夫々加え、３７℃に加温下７３０ ｎｍでの最大
吸光度（１）を求めた。さらに試料添加１０分後にコレ
ステロールオキシダーゼ溶液２０μｌを夫々添加し、３
７℃に加温下、７３０ ｎｍでの最大吸光度（２）を測
定した。 第５図に発色試液Ａ又はＢでの吸光度変化を示す。第５
図より明らかな如く、Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン
酸の添加により酸化成績体は不安定となる。又第６図に
発色試液Ｂを用いたときの尿酸濃度と最大吸光度（１）
との関係及び遊離コレステロール濃度と最大吸光度（２
）との関係を夫々示す。 第６図よシ明らかな如く、いずれも良好な検量関係が得
られた。」 （２）明細書１９頁１７行目に記載の「結んだものであ
る。」の後に改行して以下の文章を挿入する。 「第５図は、実施例６に於て得られた吸光度の時間的変
化を示したグラフであり、横軸の各経過時間（分）に於
て得られた吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結ん
だものである。ただし、曲線Ａは、発色試液Ａを使用し
たものであり、曲線Ｂは、発色試液Ｂを使用したもので
ある。 第６図は、被酸化性呈色試薬としてＮ、Ｎ−ビス（ｐ−
ジメチルアミノフェニル）−Ｎ−（ｐ−トルエンスルホ
ニル）ウレアを使用した実施例６に於て得られた検量線
を表わす。ただし、直線（１）は、横軸の各尿酸濃度（
希釈率）について得られた最大吸光度を縦軸に沿ってプ
ロットした点を結んだものであり、直線（２）は、横軸
の各遊離コレステロール濃度（希釈率）について得られ
た最大吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだも
のである。」 （３）第５図及び第６図を別紙のとおシ追加する。 以上 第Ｓ図 反応時間（分ン
を示したグラフであシ、横軸の各経過時間（秒）に於て
得られた吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだ
ものである。 第２図は、被酸化性呈色試薬としてｐ、ｐ’−ジメチル
アミン−Ｎ 、 Ｎ’−ジフェニルホルムアだジンを使
用した実施例２に於て得られた検量線を表わし、横軸の
各過酸化水素濃度（ｍｍｏｔ／ｌ）について得られた最
大吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだもので
ある。 第３図は、被酸化性呈色試薬としてＩ）５ｐ’−ジメチ
ルアミン−Ｎ、Ｎ’−ジフェニルホルムアばジンを使用
した実施例３に於て得られた検量線を表わし、横軸の各
尿酸濃度（η／ｄｉ）について得られた最大吸光度を縦
軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 第４図は、被酸化性呈色試薬として〇−トリジンを使用
した実施例４に於て得られた検量線を表わし、横軸の各
過酸化水素濃度（ｍｍｏｔ／ｌ）について得られた最大
吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものであ
る。 特許出願人 和光純薬工業株式会社 第 １ 図 ３８酸化７］（素環ｉ （”％ ） 手続補正書 昭和６１年 ５月 ６日 ！、事件の表示 昭和６０年特許願第０２４１２２号 λ 発明の名称 過酸化水素の新規定量法 １ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 連絡装置 ０３−２７０−１１５７１ ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄、図面の簡単な説明の欄
、及び図面。 ６ 補正の内容 （１）明細書１７頁１行目から１３行目にかげて記載の
表１のあとに以下の文章を挿入する。 「実施例６ （１）発色試液Ａ ０．１０ ｍｏｌ／ＩＩリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）ＩＡにＮ、Ｎ−ビス（ｐ−ジメチル
アミノフェニル）−Ｎ−（ｐ−）ルエンスルホニル）ウ
レア４５■、トリトンＸ−１００１，１，ベルオキシダ
ーゼ３３．０ＯＯＵ１ウリカーゼ３，３００Ｕを溶解し
て調製した。 （２）発色試液Ｂ 発色試液Ａ ５００ ＋ｎ／にＬ−
チアゾリジン−４−カルボン酸２５０■を溶解して調製
した。 （３） コレステロールオキシダーゼ溶液０．１０ｍ
ｏｌ／ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７，０） １０ｒｎｌに
コレステロールオキシダーゼ１，０ＯＯＵを溶解して調
製した。 （４） Ｘ料コントロール血清Ｃコントロール シー
ラム■ワコー（和光紬薬工業（株）製、ＬｏｔＡＣＤＦ
９４Ａ４ 、遊離コレステロール表示値２６ ｍ９７ｄ
ｉ 。 尿酸７．６■／ｄｌ ） ］及びこれを蒸留水で３／４
、２／４ 。 １／４に希釈したもの。 （５）測定方法 発色試液Ａ又はＢ ３． Ｏｒｎｌに
試料（２／４に希釈したもの）１０μノを加え３７℃に
加温下〜 ７３０ ｎｍでの吸光度変化を測定した。 又、発色試液Ｂ ３． Ｏｍｌに蒸留水及び各試料１０
μｌを夫々加え、３７℃に加温下７３０ ｎｍでの最大
吸光度（１）を求めた。さらに試料添加１０分後にコレ
ステロールオキシダーゼ溶液２０μｌを夫々添加し、３
７℃に加温下、７３０ ｎｍでの最大吸光度（２）を測
定した。 第５図に発色試液Ａ又はＢでの吸光度変化を示す。第５
図より明らかな如く、Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン
酸の添加により酸化成績体は不安定となる。又第６図に
発色試液Ｂを用いたときの尿酸濃度と最大吸光度（１）
との関係及び遊離コレステロール濃度と最大吸光度（２
）との関係を夫々示す。 第６図よシ明らかな如く、いずれも良好な検量関係が得
られた。」 （２）明細書１９頁１７行目に記載の「結んだものであ
る。」の後に改行して以下の文章を挿入する。 「第５図は、実施例６に於て得られた吸光度の時間的変
化を示したグラフであり、横軸の各経過時間（分）に於
て得られた吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結ん
だものである。ただし、曲線Ａは、発色試液Ａを使用し
たものであり、曲線Ｂは、発色試液Ｂを使用したもので
ある。 第６図は、被酸化性呈色試薬としてＮ、Ｎ−ビス（ｐ−
ジメチルアミノフェニル）−Ｎ−（ｐ−トルエンスルホ
ニル）ウレアを使用した実施例６に於て得られた検量線
を表わす。ただし、直線（１）は、横軸の各尿酸濃度（
希釈率）について得られた最大吸光度を縦軸に沿ってプ
ロットした点を結んだものであり、直線（２）は、横軸
の各遊離コレステロール濃度（希釈率）について得られ
た最大吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだも
のである。」 （３）第５図及び第６図を別紙のとおシ追加する。 以上 第Ｓ図 反応時間（分ン
Claims (4)
- （１）ベルオキシダーゼの存在下発色成分を酸化発色さ
せ、その呈色を比色定量することにより行う過酸化水素
の定量法に於て、発色成分として、その酸化成績体が不
安定で吸光度が経時的に変化する被酸化性呈色試薬を用
いるか、或は、酸化成績体が安定な被酸化性呈色試薬を
これが不安定となるような条件下で使用し、酸化成績体
の吸光度の時間的変化を測定してその最大吸光度を求め
ることによりその定量を行うことを特徴とする過酸化水
素の定量法。 - （２）過酸化水素が、酵素反応により生成する過酸化水
素である特許請求の範囲第１項記載の定量法。 - （３）過酸化水素が、生体試料中の微量成分の定量に於
て酵素反応により生成する過酸化水素である特許請求の
範囲第２項記載の定量法。 - （４）生体試料中の微量成分の定量が、基質、又は酵素
反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ生成する
過酸化水素を定量することにより行う生体試料中の基質
又は酵素活性の定量である特許請求の範囲第３項記載の
定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2412285A JPS61184463A (ja) | 1985-02-09 | 1985-02-09 | 過酸化水素の新規定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2412285A JPS61184463A (ja) | 1985-02-09 | 1985-02-09 | 過酸化水素の新規定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61184463A true JPS61184463A (ja) | 1986-08-18 |
Family
ID=12129502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2412285A Pending JPS61184463A (ja) | 1985-02-09 | 1985-02-09 | 過酸化水素の新規定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61184463A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9513227B2 (en) | 2013-04-26 | 2016-12-06 | Panasonic Intellectual Property Management Co., Ltd. | Method for quantitative determination of oxidant and apparatus for quantitative determination of oxidant |
-
1985
- 1985-02-09 JP JP2412285A patent/JPS61184463A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9513227B2 (en) | 2013-04-26 | 2016-12-06 | Panasonic Intellectual Property Management Co., Ltd. | Method for quantitative determination of oxidant and apparatus for quantitative determination of oxidant |
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