FR2619395A1 - Acide desoxyribonucleique portant l'information genetique d'une sarcosine oxydase et procede de preparation de sarcosine oxydase a l'aide de cet acide - Google Patents

Abstract

On décrit un nouvel acide polydésoxyribonucléique possédant une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés d'un polypeptide qui constitue une sarcosine oxydase. Celle-ci est une enzyme ayant les caractéristiques physico-chimiques suivantes : elle catalyse une réaction enzymatique dans laquelle 1 mole de glycine, 1 mole de formaldéhyde et 1 mole de peroxyde d'hydrogène sont obtenues à partir de 1 mole de sarcosine, 1 mole d'oxygène et 1 mole d'eau; elle présente une spécificité de substrat vis-à-vis de la sarcosine; pH optimal : 8,0 - 9,5; Point isoélectrique : 4,7 +- 0,1; Masse moléculaire (déterminée par la méthode de filtration sur gel) : 40 000 +- 4 000; elle est stable lors d'un traitement à 40 degre(s)C pendant 10 minutes. La sarcosine oxydase fournit une méthode biologique pour l'analyse quantitative de la créatinine et/ou créatine, et constitue un élément majeur pour l'utilisation non seulement dans les expériences au laboratoire mais également dans le diagnostic clinique.

Description

ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE PORTANT L'ItFORMATION GNETIQUE D'UNE

SAROOSINE OXYDASE ET PROCEDE DE PREPARATION DE SARCOSINE OXYDASE

A L'AIDE DE CET ACIDE.

La présente invention concerne un acide polydésoxyribonucléique portant l'information génétique

d'une nouvelle sarcosine oxydase.

L'invention se rapporte également & un transformant présentant ledit acide polydésoxyribonuc-léique, et à la sarcosine oxydase, ainsi qu'à un procédé de préparation de cette dernière par l'expression, par le transformant, de l'information génétique dudit acide polydésoxyribonucléique. La sarcosine oxydase est une enzyme qui catalyse une réaction enzymatique dans laquelle une mole de glycine, une mole de formaldéhyde et une mole de peroxyde d'hydrogène sont obtenues.& partir d'une mole de sarcosine, d'une mole d'oxygène et d'une mole d'eau, conformément au schéma réactionnel suivant: Sarcosine + 02 + H20 b Glycine + Formaldéhyde + H202 La sarcosine oxydase est connue depuis longtemps comme existant dans la nature, en particulier dans des organes d'animaux. Il a également été rapporté que cette substance existe dans des microorganismes appartenant aux genres PenicIllum [Frisell, W.R. & Mackenzie, C.G. (1970) Meth. Enzymol. 17A, 976-981], Pseudomonas (idem), Artherobactor (Demande de Brevet Japonais Mise à la Disposition du Public n' 28893/1979), Bacillus (Demandes de Brevet Japonals Mises à la Disposition du Public n' 52789/1979 et 162174/1986), Cylindrocarpon (Demande de Brevet Japonais Mise à la Disposition du Public n' 92790/1981) , Pseudomonas (Demande de Brevet Japonais Mise à la Disposition du Public n' 43379/1985), et la souche de Streptomyscetaceae (Demande de Brevet Japonais Mise à la

Disposition du Public n' 280271/1986).

Etant donné que la sarcosine oxydase est une oxydase ayant la sarcosine comme substrat, elle peut être utilisée pour le titrage de la sarcosine existant dans les fluides corporels, tels que le sérum. De plus, l'enzyme est impliquée dans le métabolisme de la créatinine et de la choline. En particulier, la réaction de conjugaison de la sarcosine oxydase avec la créatininase ou la créatinase, qui sont présentes dans le système du métabolisme de la créatinine, donne du formaldéhyde et du peroxyde d'hydrogène, rendant ainsi possible de titrer la créatinine ou la créatine de façon spécifique et sans difficulté. La sarcosine oxydase fournit ainsi une méthode biologique pour l'analyse quantitative de la créatinine et/ou de la créatine, et elle constitue un élément majeur pour l'utilisation, non seulement dans les expériences au

laboratoire, mais également dans le diagnostic clinique.

Les microorganismes producteurs de sarcosine oxydase, qui ont été décrits Jusqu'à présent, ne fournissent qu'un rendement médiocre en sarcosine oxydase, si bien que l'utilisation d'une substance qui peut aider à induire la production de sarcosine oxydase, telle que la choline, la

sarcosine, la créatine, ou similaires, était indispensable.

Ceci rend élevé le coût de production de la sarcosine oxydase. De plus, conformément à cette méthode, l'élimination d'autres types d'enzymes, qui peuvent être présentes conjointement avec la sarcosine oxydase dans le milieu de culture, était très difficile. Ceci pose le problème du coût élevé de la purification pour obtenir une sarcosine oxydase de pureté élevée. Ainsi, l'utilisation de ces microorganismes producteurs de sarcosine oxydase n'a pas toujours été une voie efficace et commode pour fournir de la sarcosine oxydase comme réactif, en vue d'une large utilisation dans les expériences au laboratoire ou dans le

diagnostic clinique.

Il a été décrit récemment dans la littérature que des enzymes contaminantes, telles que la catalase et l'uricase, qui sont présentes dans une sarcosine oxydase résistante à la chaleur, issue d'un microorganisme résistant à la chaleur, peuvent être complètement désactivées par un traitement par la chaleur de la sarcosine oxydase (Demande de Brevet Japonais Mise à la Disposition du Public n' 162174/1986). Ces enzymes contaminantes, telles que la catalase et l'uricase, issues de microorganismes résistants à la chaleur sont cependant plus ou moins résistantes à la chaleur, et il est en fait très difficile d'éliminer

complètement ces enzymes contaminantes.

Les présents inventeurs ont entrepris des études approfondies pour améliorer le rendement en sarcosine oxydase, pour trouver une méthode pour éliminer les enzymes contaminantes, étrangères, et pour réduire les coûts de production. Comme résultat, les inventeurs ont réussi à obtenir une nouveau gène de la sarcosine oxydase à partir d'un microorganisme et, en outre, à élucider l'analyse de sa structure primaire. En outre, par l'application d'une technique de génie génétique, les inventeurs ont mis au point un procédé pour préparer la sarcosine oxydase, avec un rendement élevé et sans l'utilisation d'une substance

inductrice dans le milieu de culture.

En conséquence, la présente invention a pour but de proposer un acide polydésoxyribonucléique comprenant une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés

d'un polypeptide qui constitue une sarcosine oxydase.

La présente invention a comme but plus spécifique de proposer l'acide polydésoxyribonucléique, dans lequel ladite sarcosine oxydase possède les caractéristiques physico-chimiques suivantes: (a) Action: catalyse une réaction enzymatique dans laquelle une mole de glycine, une mole de formaldéhyde et une mole de peroxyde d'hydrogène sont obtenues à partir d'une mole de sarcosine, d'une mole d'oxygène et d'une mole d'eau, conformément au schéma réactionnel suivant:

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Sarcosine + 02 + H20 ---* Glycine + Formaldéhyde + H202 (b) Spécificité de substrat: présente une spécificité de substrat vis-à-vis de la sarcosine <c) pH optimal:

8,0 - 9,5

(d> Point isoélectrique:

4,7 0,1

(e) Masse moléculaire (déterminée par la méthode de filtration sur gel)

40 000 4 000

(f) Stabilité thermique:

stable lors d'un traitement à 40'C pendant 10 minutes.

Cette invention a pour autre but de proposer un transformant dont le microorganisme hôte possède ledit acide

polydésoxyribonucléique spécifique.

Encore un autre but de cette invention est de proposer une sarcosine oxydase produite par ledit

transformant.

La présente invention propose également un procédé de préparation d'une sarcosine oxydase, consistant à cultiver ledit transformant pour amener le transformant à

exprimer l'information génétique dudit acide polydésoxy-

ribonucléique, et & recueillir le polypeptide qui est un

constituant de ladite sarcosine oxydase.

D'autres buts, caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront plus clairement ci-après à

la lecture de la description suivante.

- La Figure 1 est une représentation schématique montrant la configuration du vecteur pOXIlO1; - La Figure 2 est une représentation analogue pour le vecteur pOXI103; - les Figures 3-1 et 3-2 représentent la séquence de bases de l'ADN du gène de la sarcosine oxydase (de 5' vers 3'); et - les Figures 4-1 et 4-2 représentent la séquence d'acides aminés du produit de translation obtenu à

partir de celui-ci.

La sarcosine oxydase de cette invention possède, comme autre activité enzymatique, une activité de catalase inférieure à 0,05 unité, une activité de créatinase inférieure à 0,0004 unité, et une activité de Néthylglycine oxydase inférieure à 0,03 unité par unité d'activité de sarcosine oxydase, et le polypeptide constituant cette sarcosine oxydase a une séquence d'acides aminés, partant de l'extrémité N-terminale, représentée par la formule (I)> suivante: A-Ser Thr Bis Phe Asp Val lie Val Val

10

Gly Ala Gly Ser Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Gin Leu Ala Lys Gin Gly Val Lys Thr Leu Leu Val Asp Ala Phe Asp Pro Pro His

40

Thr Asn Gly Ser Bis Ris Gly ksp Thr Ar& lie lie Ara Bis Ala Tyr Gly Glu Gly Ar& Glu Tyr Val Pro Leu Ala Leu Art Ser Gin Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Thr Ris His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly Pro Lys Gly Glu Ser Ala Phe Val Ala Glu Thr Het Glu Ala Ala Lys Glu Ris Ser Leu Thr Val Asp Leu Leu Glu Gly Asp Glu Ile Asn Lys Ars Trp Pro Gly 1o 130 Ile Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu Pro Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Ars Ala Tyr Arg Glu Leu

160

Ala Glu Ala Arg Gly Ala Lys Val Leu Thr His Thr Arg Val Glu Asp Phe Asp lie Ser Pro Asp Ser Val Lys Ile Glu Thr Ala Asn

190

Gly Ser Tyr Thr Ala Asp Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Leu Asp Ile Pro Leu Gin

220

Pro Tyr Arg Gin Val Val Gly Phe Phe Glu Ser Asp Glu Ser Lys Tyr Ser Asn Asp Ile Asp Phe Pro Gly Phe Met Val Glu Val Pro

250

Asn Gly Ile Tyr Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Leu Gly Tyr His Thr Phe Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr

280

lie Asn Arg Glu Phe Gly Val Tyr Pro Glu Asp Glu Ser Asn Leu Arg Ala Phe Leu Glu Glu Tyr Met Pro GIy Ala ASn Gly Glu Leu Lys Arg Gly Ala Val Cys Met Tyr Thr Lys Thr Leu Asp Glu Bis Phe lie Ile Asp Leu Bis Pro Glu gis Ser Asn Val Val lie Ala Ala Gly Phe Ser Gly Bis Gly Phe Lys Phe Ser Ser Gly VaI Gly Glu Val Leu Ser Gin Leu Ala Leu Thr Gly Lys Thr Glu Dis Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys Glu Ser Leu Gin Lys Thr Thr Ile

-B (I)

o: - A représente un reste d'acide aminé ou un atome r d'hydrogène; et

- B représente un reste d'acide aminé ou -OH.

Dans le-polypeptide de formule (I), le reste d'acide aminé représenté par A peut consister en un ou plusieurs restes d'acides aminés. Des exemples préférés de A sont un atome d'hydrogène, la méthionine, ou un polypeptide signal. Le groupe représenté par B peut être, soit un amide d'acide, soit un ou plusieurs restes d'acides aminés. Un acide polydésoxyribonucléique qui est un gène

de sarcosine oxydase possédant les caractéristiques physico-

chimiques mentionnées ci-dessus peut être tout acide polydésoxyribonucléique pour autant qu'il contienne le gène de sarcosine oxydase lui-même possèdant les caractéristiques physico-chimiques mentionnées ci-dessus. On donne comme exemples dudit gène de la sarcosine oxydase lui-même, l'acide polydésoxyribonucléique ayant une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés représentée par la formule (II)> suivante, partant de l'extrémité N terminale: Ser Thr Bis Phie Asp Val lie Val Val Gly Ala Gly Ser Met Gly Het Ala Ala Gly Tyr Gin Leu Ala Lys Gin Gly Val Lys Thr Leu Leu Val. Asp Ala Phe Asp Pro Pro Mis Thr Asn Gly Ser Bis His Gly Asp Thr Arg le Ile Arg Bis Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr Val Pro Leu Ala Leu Arg Ser Gin Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Thr Dis Bis Lys lie Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly Pro Lys Gly Glu Ser Ala Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys Glu Bis Ser Leu Thr Val Asp Leu Leu Glu Gly Asp Glu Ile Asn Lys Arg Trp Pro Gly lile Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala lle Phe Glu Pro Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg Glu Leu Ala Glu Ala Arg Gly Ala Lys Val Leu Thr 8is Thr Arg Val Glu Asp Phe Asp lie Ser Pro Asp Ser Val Lys Ilié Glu Thr Ala Asn Gly Ser Tyr Thr Ala Asp Lys Leu lie Val Ser Het Gly Ala Trp Asa Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Leu Asp lie Pro Leu Gin Pro Tyr Arg Gin Val Val Gly Phe Phe Glu 0 230 Ser Asp Glu Ser Lys Tyr Ser Ash Asp Ile Asp Phe Pro Gly Phe Met Val Glu Val Pro Asn Gly lie Tyr Tyr Gly'Phe Pro Ser Phe

260

Gly Gly Cys Gly Leu Lys Leu Gly Tyr His Thr 1he Gly Gln Lys le Asp Pro Asp Thr lie Asn Arg Glu Phe Gly Val Tyr Pro Glu

290

Asp Glu Ser Asn Leu Arg Ala Phe Leu Glu Glu Tyr Met Pro Gly Ala Asn Gly Glu Leu Lys Arg Gly Ala Val Cys Met Tyr Thr Lys

320

Thr Leu Asp Glu Ris Phe Ile Ile Asp Leu His Pro Glu His Ser Asn Val Val Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly Ris GIy Phe Lys Phe

350

Ser Ser Gly Val Gly Glu Val Leu Ser Glu Leu Ala Leu Thr Gly Lys Thr Glu His Asp le Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala

380

Leu Lys Glu Ser Leu Gin Lys Thr Thr Ile En ce qui concerne la séquence d'acides aminés du polypeptide constituant la sarcosine oxydase de formule (II), l'acide polydésoxyribonucléique peut être tout acide polydésoxyribonucléique pour autant qu'il possède n'importe lequel parmi une série de codons correspondant à chacun des acides aminés constituant la séquences d'acides aminés de la formule (II). Ce peut être également un acide polydésoxyribonucléique possédant, à son extrémité 5'

terminale, un ou plusieurs codons autres qu'un codon non-

sens et/ou à son extrémité 3' terminale, un ou plusieurs

codons. Un exemple typique d'un tel acide polydésoxy-

ribonucléique est celui possédant une séquence de bases, représentée, partant de l'extrémité 5' terminale, par la formule (III):

X -AGC ACA CAT TTT GAT GTC ATC GTT GTT

GGA GCT GGA TCA ATG GGA ATG GCG GCA GGT

TAT CAA TTA GCA AAG CAA GGA GTC AAA ACA

90

TTA TTA GTG GAT GCA TTT GAT CCG CCG CAT

ACA AAC GGA AGC CAT CAC GGT GAT ACT CGT

ATC ATC CGC CAT GCT TAC GGT GAG GGA AGA

180

GAA TAT GTT CCT CTT GCA TTA AGA TCA CAA

GAG TTA TGG TAT GAA CTA GAA AAA GAA ACA

CAC CAT AAA ATA TTC ACG AAA ACG GGC GTA

270

CTC GTA TIT GGT CCT AAA GGT GAA TCG GCT

TTC GT? GCA GAA ACG ATG GAA GCG GCA AAG

GAA CAT TCA TTG ACT GTT GAT TTA CTG GAA

360

GGT GAT GAA ATA AAT AAG CGT TGG CCG GGT

ATA ACG GTT CCG CAA AAC TAC AAT GCT ATT

TTC GAA CCG AAC TCA GGT GTA TTA TTC AGT

GAA AAT TGT ATT CGT GCC TAC CGC GAG TA

GCT GAA GCG CGA GGT GCT AAA GTT CTA ACA

CAT ACA CGC GTT GAG GAC TTT GAC ATT TCA

540

CCG GAC TCA GTC AAA ATC GAA ACA GCA AAT

GGA TCA TAC ACA GCT GAT AAA TTA ATT GTT

AGC ATG GGA' GCT TGG AAT AGC AAA CTA CTT

- 630

TCA AAA CTA AA? CTT GAC AC CCA TTA CAG

CCA TAT CGT CAA GTG GTA GGT TTC TTT GAA

TCC GAT GAA TCA AAG TAT AGC AAT GAT ATT

720

GAT TTC CCA GGA TTC ATG GTT GAA GTG CCA

AAT GGT ATT TAT TAC GGA TTC CCA AGC TTC

GGC GGC TGT GGA TTG AAA CTA GGA TAT CAT

810

ACG TTC GGG CAG AAA ATT GAC CCT GAT ACA

ATT AA? CGC,GAA TTT GGC GTT TAT CCA GAA

GAT GAA AGT AAT CTT CGC GCT TTC TTG GAA

900

GAA TAT AlTG CCA GGA GCA AAT GGA GAG TTA

AAA AGA GGG GCA GTC TGC ATG TAC ACG AAA

ACA TTA GAT GAA CAT TTC ATT ATA GAC TTA

990

CAT CCT GAA CAT TCC AAC GTA GTC ATC GCT

GCC GGC TTC TCT GGC CAT GGA TTT AAG TTT

TCC AGT GGA GTT GGT GAA GTG CTA AGT CAA

TTA GCT TTA ACT GGT AAA ACA GAG CAC GAT

ATT TCA ATC TTC TCC ATT AAC CGT CCT GCT

TTG AAA GAA TCG TTA CAA AAA ACA ACT ATC

-Y (t) o: - X représente un codon autre que TAA, TAG et TGA, ou un atome d'hydrogène; et

- Y désigne un codon ou un atome d'hydrogène.

Concernant la séquence de bases de formule (III), le codon représenté par X peut être tout codon pour autant qu'il code pour un acide aminé. De plus, X peut posséder à son extrémité 5' terminale, un ou plusieurs codons codant pour des acides aminés. Des exemples préférés de X sont ATG ou un acide polydésoxyribonucléique correspondant à un

peptide signal.

Le codon représenté par Y peut être tout codon choisi parmi les codons de terminaison de translation et les codons codant pour un acide aminé. Y peut posséder, à son extrémité 3' terminale, un ou plusieurs codons codant pour des acides aminés, étant entendu que, dans ce cas, il est souhaitable qu'un codon de terminaison de translation soit

prévu à l'extrémité 3' terminale de ces codons.

Un acide polydésoxyribonucléique ayant un gène de

sarcosine oxydase comme constituant, un acide polydésoxy-

ribonucléique qui est un gène ayant une séquence de bases codant pour la séquence d'acides aminés de formule (II), ou un acide polydésoxyribonucléique représenté par la formule (III), peuvent être préparés aisément par un microorganisme qui est un donneur du gène producteur de sarcosine oxydase. De façon spécifique, le procédé comprend les étapes suivantes. Un ADN de ce microorganisme est tout d'abord séparé et purifié, et l'on fait-suivre par un traitement par ultrasons ou par une endonucléase de restriction. Cet ADN et un ADN vecteur d'expression linéaire qui est, de la même façon, digéré par une endonucléase de restriction, par exemple, sont réunis avec une ADN ligase, ou similaire (aux extrémités épointées ou cohésives des deux ADN), pour former un cercle fermé. Le vecteur d'ADN recombinant ainsi obtenu est introduit dans un microorganisme hôte reproductible. On cultive des 1c0 microorganismes possédant ledit vecteur d'ADN recombinant recueilli, au moyen d'un criblage, à l'aide d'un marqueur du vecteur et de l'activité sarcosine oxydase en tant qu'indicateurs. Ledit vecteur d'ADN recombinant est ensuite séparé des microorganismes cultivés et il est purifié, à partir duquel on recueille l'acide polydésoxyribonucléique

du gène de sarcosine oxydase.

Tout microorganisme producteur de sarcosine oxydase peut être utilisé comme microorganisme donneur du gène de sarcosine oxydase aux fins de cette invention. Des exemples sont les microorganismes producteurs de sarcosine oxydase décrits dans les Demandes de Brevets Japonais Mises à la Disposition du Public n' 28893/1979, 52789/1979, 92790/1981, 43379/1985, 162174/1986, 280271/1986, et similaires. De façon spécifique, ils sont choisis parmi les microorganismes producteurs de sarcosine oxydase appartenant au genre Bacillus, tels que la souche Bacillus sp B- 0618, la souche Bacillus sp NS-129, et similaires, au genre Arthrobacter, tel qu'Arthrobacter ureafashiense IFO 12140 et similaires, au genre Cylindrocarpon, tel que Cylindrocarpon didymum (Harting) Wollen weber M-1 et similiares, au genre Pseudomonas, tel que Pseudomonas maltophilia BMTU 254, Pseudomonas maltophilia BMTU 288, et similaires, et à l'espèce Streptomyces, telle que Chainia purpurogena DSM 43156, Chainia ochraceae DSM 43155, Streptomyces flocculus DSM 40327, Streptoverticillium sp DSM 40237, Kitasatoa purpurea DSM 43362, et similaires. Des

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microorganismes producteurs de sarcosine oxydase souhaitables sont la souche Bacillus sp B-0618, et similaires. Un microorganisme transformé, auquel l'aptitude à la production de sarcosine oxydase a été fournie par l'utilisation d'une technique de génie génétique, peut également être employé comme microorganisme donneur du gène

de sarcosine oxydase.

La méthode pour recueillir un ADN induit par le microorganisme donneur du gène est maintenant illustrée à titre d'exemple. On-cultive tout d'abord n'importe lequel

parmi les microorganismes donneurs du gène mentionnés ci-

dessus, dans un milieu de culture liquide, sous aération, pendant 1 à 3 Jours. Le bouillon ainsi cultivé est soumis à une centrifugation pour recueillir le microorganisme, lequel est ensuite lysé pour produire une bactériolyse contenant un gène de sarcosine oxydase. Le traitement par une enzyme lysant la paroi cellulaire, telle que le lysozyme ou la glucanase, est utilisé pour la bactériolyse, en combinaison, si nécessaire, avec une autre enzyme, telle qu'une protéase ou un agent tensio-actif, tel que le laurylsulfate de sodium. De plus, la digestion physique des parois cellulaires au moyen de la congélation-décongélation ou de la presse de French, par exemple, peut être employée

conjointement avec la bactériolyse.

Des méthodes classiques de purification, comprenant, par exemple, un traitement d'enlèvement d'une protéine par une extraction au phénol, un traitement par protéase, un traitement par ribonucléase, une précipitation dans un alcool, et une centrifugation, peuvent être appliquées, soit indépendamment de, soit en combinaison avec, la séparation et la purification de l'ADN provenant de

la bactériolyse.

La digestion de l'ADN du microorganisme ainsi séparé et purifié peut être effectuée à l'aide d'un traitement par ultrasons ou par une endonucléase de restriction, par exemple. Cependant, afin d'assurer une Jonction aisée des fragments d'ADN et de l'ADN vecteur, l'utilisation d'une endonucléase de restriction est préférable, en particulier, celles présentant une activité sur les séquences nucléotidiques spécifiques, telles que EcoR I, Hind III, BamH I, ou BamH II. Des vecteurs souhaitables employés sont ceux restructurés pour être utilisés comme ADN recombinant génétique par un traitement artificiel d'un phage ou d'ADN plasmide qui est capable de se développer de façon autonome

dans des cellules bactériennes hôtes.

Dans le cas o Escherichia coli est utilisé comme microorganisme hôte, par exemple, Xgt. XC, Xgt. B, ou

similaires, sont utilisés comme phages.

Comme plasmides, pBR322, pBR325, pACYC184, pUC12, pUC13, pUC18, pUCl9, ou similaires, sont utilisés lorsque Escherichia co2i est le microorganisme hôte, et pUB110, pC194, ou similaires, sont utilisés lorsque Bacillus subtillis est le microorganisme hôte. De plus, des vecteurs navettes peuvent être employés, qui peuvent se développer de façon autonome dans des cellules bactériennes hôtes de microorganismes gram-positifs ou de microorganismes gram-négatifs, ou des deux, par exemple, dans Escherichie coli ou Saccharomyces cerevisiae ou les deux. Ces vecteurs sont, de façon souhaitable, digérés en fragments de vecteurs à l'aide de la même endonucléase de restriction que celle utilisée dans la rupture de l'ADN du microorganisme donneur

de gêne de sarcosine oxydase mentionné ci-dessus.

Une méthode classique d'utilisation de l'ADN ligase peut être employée pour relier l'ADN bactérien et le fragment de vecteur. Par exemple, l'extrémité cohésive de 1' ADN bactérien et celledu fragment de vecteur sont tout d'abord mises sos foer biote-aire d'abrd, puis un ADN recombinant du fragment d' ADN bactérien et du fragment de vecteur peut être préparé par l'action d'une ADN ligase appropriée. Si nécessaire, l'ADN bactérien - fragment de vecteur,'sous forme bicaténaire, est introduit dans le microorganisme hôte pour produire l'ADN recombinant

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à l'aide d'ADN ligase in vivo.

On peut utiliser, comme bactéries hôtes, tous microorganismes qui permettent une croissance autonome et stable de l'ADN recombinant et qui sont capables d'exprimer le caractère de l'ADN étranger. Des exemples de ces microorganismes comprennent Escherichia coli DH1, Escherichia coll HB101, Escherichia coli W3110, Escherichia coll C600, et similaires, lorsque Escherichia coli est

utilisé comme bactérie hôte.

L'introduction de l'ADN recombinant dans le microorganisme hôte peut être effectuée en présence de l'ion calcium, lorsque le microorganisme hôte est une bactérie appartenant au genre Escherichia. Lorsqu'une bactérie appartenant au genre Bacillus est utilisée comme microorganisme hôte, on peut utiliser soit la méthode des cellules compétentes, une méthode introduisant électriquement l'ADN recombinant ribosomial dans les cellules bactériennes de l'hôte protoplaste, soit la méthode par micro- injection. On a découvert que la bactérie ú0 transformante ainsi obtenue, lorsqu'elle est cultivée dans un milieu nutritif, produit de façon stable une quantité

importante de sarcosine oxydase.

L' introduction de 1' ADN ayant la fonction désirée, le microorganisme hôte peut être retrouvée au moyen de la détection du microorganisme qui peut exprimer un marqueur de résistance aux médicaments du vecteur sur lequel l'ADN recombinant ayant la fonction désirée est maintenu, ainsi que la sarcosine oxydase en même temps. Par exemple, on peut choisir des bactéries qui se développent dans un milieu de culture sélectif du marqueur de tolérance chimique et qui

produisent de sarcosine oxydase.

L'ADN recombinant possédant ledit gène de sarcosine oxydase, une fois choisi de cette manière, peut être facilement extrait du microrganisme transformant pour être introduit dans une autre bactérie hôte. En variante, l'ADN du gène de sarcosine oxydase peut être digéré à l'aide d'une endonucléase de restriction ou similaire, à partir d'un ADN recombinant possédant un gène de sarcosine oxydase, et il est réuni avec une terminaison d'un autre vecteur ouvert obtenu d'une manière similaire. L'ADN recombinant ayant les nouvelles caractéristiques, qui est ainsi préparé,

est ensuite introduit dans le microorganisme hôte.

Un ADN de sarcosine oxydase mutéine, qui possède une activité sarcosine oxydase substantielle, est un gène variant produit par une technique de génie génétique, conformément à la présente invention, & partir d'un gène de sarcosine oxydase. Cette mutéine peut être préparée à l'aide de diverses techniques de génie génétique, telles que la méthode de conversion des bases spécifiques du site, la substitution d'un fragment d'ADN spécifique par un gène variant artificiel, et similaires. Parmi les ADN de sarcosine oxydase mutéine ainsi préparés, ceux ayant des caractéristiques particulièrement excellentes sont finalement insérés dans un vecteur pour produire un ADN recombinant, lequel est ensuite introduit dans-le microorganisme hôte. On peut produire ensuite la sarcosine

oxydase mutéine.

La séquence de bases du gène de sarcosine oxydase préparé par la méthode décrite ci-dessus a été décodée par la méthode désoxy [Science, 214, 1205 - 1210 (1981)]. La *2,5 séquence d'acides aminés de la sarcosine oxydase a été

déterminée à partir de la séquence de bases.

La méthode employée pour la détermination de la séquence d'acides aminés de la fraction constituant l'extrémité N terminale du peptide sarcosine oxydase va maintenant être discutée. Les microorganismes donneurs du gène de sarcosine oxydase, capables de produire la sarcosine oxydase, ont tout d'abord été cultivés dans un milieu nutritif, afin de produire et d'accumuler de la sarcosine oxydase dans les bactéries. Les bactéries cultivées ont été recueillies à partir du bouillon, par filtration, centrifugation, ou moyens similaires. Les bactéries recueillies ont ensuite été digérées, soit par des moyens mécaniques, soit par des moyens enzymatiques, à l'aide de lysozyme ou similaire, et, aux bactéries digérées, on a aJouté de l'EDTA et/ou un agent tensio-actif approprié, si nécessaire, pour solubiliser la sarcosine oxydase, laquelle

a été ensuite séparée sous la forme d'une solution aqueuse.

Cette solution aqueuse de sarcosine oxydase a été condensée ou, sans être condensée, soumise à un fractionnement au sulfate d'ammonium, une filtration sur gel, une chromatographie d'adsorption, ou une chromatographie d'échange d'ions, afin d'obtenir une sarcosine oxydase de pureté élevée. La séquence d'acides aminés de la fraction constituant l'extrémité N terminale du peptide sarcosine oxydase a été déterminée sur cette sarcosine oxydase de pureté élevée, à l'aide d'un séquenceur de protéines en phase liquide (Beckman System 890ME, fabriqué par Beckman, Inc. >. De cette manière, il a été confirmé que la séquence d'acides aminés de ladite fraction est identique à la séquence d'acides aminés de l'extrémité N terminale de la sarcosine oxydase obtenue par une technique de génie génétique. La culture du microorganisme hôte du transformant est conduite dans les conditions déterminées en prenant en considération les caractéristiques physiologiques et nutritives du microorganisme hôte. Dans la plupart des cas, on emploie une culture liquide. Cependant, dans une production à l'échelle industrielle, la culture aérobie sous forteagitation est plus avantageuse. Une grande variété de milieux nutritifs habituellement utilisés pour la culture des bactéries peut être utilisée pour cultiver le microorganisme hôte. D'une manière spécifique, tous composés carbonés nutritifs peuvent être utilisés comme sources de carbone, comprenant, par exemple, le glucose, le sucrose, le lactose, le maltose, le fructose, les mélasses et similaires. Comme sources d'azote, tous composés azotés disponibles peuvent être employés, y compris les peptones, les extraits de viande, les extraits de levure, les hydrolysats de caséine et similaires. D'autres ingrédients, y compris des sels, tels que phosphates, carbonates et sulfates, de même que les sels de magnésium, de calcium, de potassium, de fer, de manganèse, de zinc, et similaires, et certains types d'acides aminés ou de vitamines, peuvent être utilisés s'ils conviennent. Le procédé ne nécessite pas l'utilisation de substances inductrices de sarcosine oxydase, telles que la choline, la sarcosine, la créatine, et similaires, qui sont nécessaires dans le procédé classique de production de sarcosine oxydase par des

microorganismes producteurs de sarcosine oxydase.

On peut faire varier la température de la culture dans une plage dans laquelle les bactéries peuvent se développer et produire de la sarcosine oxydase. La plage des températures que l'on préfère est 20 - 42'C pour Escherichia coli. On peut faire varier le temps de la culture à un certain degré dépendant des conditions de la culture. En principe, la culture est terminée au moment o le rendement de sarcosine oxydase atteint un maximum. Dans

la pratique habituelle, cela prend environ 12 - 48 heures.

Il est possible de faire varier le pH des milieux de culture à l'intérieur de la plage dans laquelle les bactéries peuvent se développer et produire la sarcosine oxydase. La

plage des pH particulièrement préférée est d'environ 6 - 8.

La sarcosine oxydase-peut être présentée en vue de l'utilisation sous la forme de bouillon de culture comme il contient des bactéries. Cependant, la sarcosine oxydase contenue dans le bouillon de culture est généralement utilisée après que l'on en ait séparé les bactéries par filtration, centrifugation, ou moyens similaires. Au cas o de la sarcosine oxydase soit contenue dans la pâte bactérienne, les bactéries sont tout d'abord séparées par filtration ou par centrifugation. Les bactéries recueillies sont ensuite digérées, soit par des moyens mécaniques, soit par des moyens enzymatiques, à l'aide de lysozyme ou similaire, et aux bactéries digérées, on ajoute un agent chélatant, tel que EDTA et/ou un agent tensio-actif approprié, si nécessaire, pour solubiliser la sarcosine oxydase, ce qui permet ainsi de recueillir la sarcosine

oxydase sous forme de solution aqueuse.

Les solutions contenant la sarcosine oxydase, que l'on obtient ainsi, sont ensuite condensées par évaporation sous vide ou par l'utilisation d'un filtre, et elles sont soumises à un traitement de relargage par du sulfate 1O d'ammonium, du sulfate de sodium, ou similaires, ou à une précipitation fractionnée & l'aide d'un solvant organique hydrophile, tel que le méthanol, l'éthanol, l'acétone, ou similaires. Le précipité est dissous dans l'eau, et la solution est dialysée à travers une membrane semi-perméable,

afin d'éliminer les impuretés de faible masse moléculaire.

En variante, le précipité est purifié par filtration sur gel, chromatographie d'adsorption, chromatographie d'échange d'ions, ou similaires, à l'aide d'un adsorbant ou d'un agent de filtration sur gel. La sarcosine oxydase purifiée est produite à partir de la solution contenant la sarcosine oxydase, qui est obtenue par l'utilisation de ces divers moyens par évaporation sous vide, lyophilisation, ou similaires. L'activité de la sarcosine oxydase ainsi préparée est mesurée conformément à la méthode suivante: On a tout d'abord préparé un fluide réactionnel

ayant la composition suivante.

Tampon Tris chlorure d'hydrogène 0,2M (pH 8, 0>. 0,5 ml Amino-4 antipyrine 15 mM....................... 0,5 ml Phénol 0,2% (p/v)..........

.................. 0,5 ml Peroxydase (0,5 U/ml)................ 0,5 ml Solution aqueuse de sarcosine O,1 M......... 1,0 ml Eau.... ................DTD: ........................ 2,0 ml 3F. Dans un tube à essai, on a introduit 0,5 ml du fluide réactionnel ci-dessus. Le fluide a été chauffé à 37'C pendant 3 minutes, et on y a ajouté 10 1i d'une solution contenant de la sarcosine oxydase (SOX). Après avoir maintenu le mélange à 37'C pendant exactement minutes, on lui a ajouté 2,5 ml d'éthanol pour terminer la réaction. Le mélange a été ensuite soumis à une analyse colorimétrique à une longueur d'onde de 480 nm, et la valeur obtenue a été prise en tant que A. En prenant l'aptitude de la substance à produire 1 gmole de peroxyde d'hydrogène par minute comme 1 unité (U), la valeur de l'activité sarcosine oxydase (Valeur de l'Activité SOX: U/ml) est déterminée à partir de l'équation suivante: (A-A0) x 3,01 x 1..DTD: Activité SOX =----------------

17,14 x 0,5 x 0,01 X 5 o A0 désigne la valeur colorimétrique obtenue à 480 nm lorsque la solution tampon a été utilisée à la place de la

solution d'enzyme.

Les activités des autres enzymes ont été déterminées conformément aux méthodes suivantes: (1) Mesure de l'Activité.Catalase Dans un tube à essai, on a introduit 0,5 ml de la solution d'enzyme diluée avec un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0). Après chauffage de la solution à 30'C pendant minutes, on y a ajouté 0,5 ml d'une solution de peroxyde d'hydrogène à 0,4%, laquelle a été maintenue à 30'C pendant exactement 5 minutes. Après achèvement de la réaction par l'addition de 2,5 ml de soluton d'acide perchlorique 0,1 M, le mélange a été soumis à une analyse colorimétrique, et la valeur obtenue a été prise en tant que B. De façon séparée, 0,5 ml d'une solution de peroxyde d'hydrogène à 0,4% a été introduit dans un tube à essai et chauffé à 30'C pendant minutes. On y a ajouté 2,5 ml d'une solution d'acide perchlorique 0, 1 M, puis 0,5 ml de la solution d'enzyme diluée avec du tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0). Le mélange a été soumis à l'analyse colorimétrique à 240 nm, et la valeur obtenue a été prise en tant que BO' En prenant l'aptitude de la substance à produire 1 imole de peroxyde d'hydrogène par minute comme 1 unité (U), la valeur de l'activité catalase (Valeur de l'Activité CL: U/ml) est déterminée à partir de l'équation suivante: (B-B0) x 3,50 x 1

Activité CL = -------------------

0,04 x 0,5 x 5 (2) Mesure de l'Activité Créatinase On a d'abord préparé trois solutions: Première solution: Tampon phosphate 0,2 M (pH 7,5).......

....... 0,5 ml Solution aqueuse de créatine 50 mM............. 4,5 ml Seconde solution: Tampon Tris acide chlorhydrique 0,2 M (pH 8,0). 0,5 ml Solution aqueuse d'amino-4 antipyrine 15 mM.... 0,5 ml Phénol à 0,2%........DTD: .......................... 0,5 ml Peroxydase (50 U/ml)....................DTD: ...... 1,0 ml Sarcosine oxydase (30 u/ml).................... 0,5 ml Benzène p-chloromercurique 0,5 mM.............. 2,0 ml Troisième solution: Benzène p-chloromercurique 0,5 mM.............. 0,5 ml La première solution a été introduite dans un tube à essai et chauffée & 37'C, pendant 3 minutes. A cette solution, 10 1l d'une solution d'enzyme ont été aJoutés et maintenus à 37'C pendant précisément 5 minutes. Au mélange, on a aJouté 0,5 ml de la troisième solution, puis 0,5 ml de la seconde solution. Après avoir maintenu ce mélange à 37'C pendant encore 20 minutes pour effectuer la réaction, on a ajouté 1,5 ml d'eau distillée, et la solution a été soumise à une analyse colorimétrique à une longueur d'onde de 500 nm. L'aptitude de la substance à produire 1 imole de peroxyde d'hydrogène en 1 minute a été prise comme activité..DTD: d' 1 unité (U).

(3) Mesure de l'Activité N-Ethylglycine Oxydase On a d'abord préparé un fluide réactionnel ayant

la composition suivante.

Tampon Tris chlorure d'hydrogène 0,2M <pH 8,0). 0,5 ml Amino-4 antipyrine 15 mM....................... 0,5 ml Phénol 0,2% (p/v).....................

....... 0,5 ml Peroxydase <50 U/ml)........................... 0,5 ml Solution aqueuse de N-éthylglycine 1,0 M....... 1,0 ml Eau..................DTD: ........................ 2,0 ml Dans un tube à essai, on a introduit 0, 5 ml du fluide réactionnel ci-dessus. Le fluide a été chauffé à 37'C pendant 3 minutes, et lui a aJouté 10 11 d'une solution contenant l'enzyme. Apres avoir maintenu le mélange à 37'C pendant exactement 5 minutes, on a lui ajouté 2,5 ml d'éthanol pour terminer la réaction. Le mélange a ensuite été soumis & une analyse colorimétrique à une longueur d'onde de 480 nm, et la valeur obtenue a été prise en tant que A. L'aptitude de la substance à produire 1 jmole de..DTD: peroxyde d'hydrogène par minute a été prise comme activité-

d'l unité (U) de l'enzyme.

Sur la base des méthodes ci-dessus pour déterminer les activités enzymatiques, il a été trouvé que la sarcosine oxydase de cette invention possède une activité catalase inférieure à 0,05 unité, une activité créatinase inférieure à 0,0004 unité,. et une activité N-éthylglycine oxydase inférieure à 0,03 unité par unité d'activité sarcosine oxydase. Ainsi, il a été mis en évidence que la sarcosine oxydase était une enzyme présentant une spécificité très élevée, qui est utile comme réactif pour le diagnostic clinique. La sarcosine oxydase ainsi préparée possède les caractéristiques physico-chimiques suivantes: (a) Action: L'enzyme catalyse une réaction enzymatique dans laquelle une mole de glycine, une mole de formaldéhyde et une mole de peroxyde d'hydrogène sont obtenues à partir d'une mole de sarcosine, d'une mole d'oxygène et d'une mole d'eau, conformément au schéma réactionnel suivant: Sarcosine + 02 + H20 - Glycine + Formaldéhyde + H202 (b) Spécificité de substrat: On a ajouté la sarcosine oxydase en une quantité de 0,5 U, & 0,5 ml de la solution réactionnelle comprenant 0,05 ml de tampon Tris acide chlorhydrique 0,2 M (pH 8,0), 0,05 ml de phénol à 0,2%, 0,05 ml de 0,5 mg/ml de peroxydase, 0, 2 ml d'eau distillée, et 0,20 ml d'une solution de substrat constitué par le composé suivant avec une concentration de 0,5 MK On a laissé réagir la solution à 37 C pendant 5 minutes, sur quoi on y a aJouté 2,5 ml d'éthanol pour terminer la réaction. La solution résultante a été soumise à une analyse colorimétrique à 480 nm. Les résultats, en termes de l'activité relative de chaque

substrat, sont énumérés ci-après.

Substrat Activité Relative (%) Sarcosine 100,0 Choline 0 Sérine O Thréonine O Alanine O Valine 0 N-méthyléthanolamine O Ndiméthyléthanolamine O

26 1 9395

(c) pH optimal: Afin d'éviter l'influence de l'enzyme sur le système chromophore amino-4 antipyrine-phénol-peroxydase, le

formaldéhyde produit a été titré par la méthode à l'acétyl-

acétone. Comme résultat, il a été trouvé que la plage de pH optimale de la sarcosine oxydase se situait au voisinage de 8,0 - 9,5. Les tampons utilisés étaient le tampon acide diméthylglutarique (pH: 4 - 7), le tampon phosphate (pH: 6 - 8), le tampon Tris acide chlorhydrique <pH: 7,5 - 9), le tampon glycine-hydroxyde de sodium (pH: 9 - 10), le tampon carbonate de sodium-borate de

sodium (pH: 10 - 11).

(d) Point isoélectrique: 4,7 0,1 (Electrophorèse utilisant l'ampholine comme support) (e) Masse moléculaire (déterminée par la méthode de filtration sur gel)

40 000 4 000

(f) Stabilité thermique: On a laissé reposer à une température constante 0,5 ml de tampon Tris acide chlorhydrique 10 mM (pH 8,0) contenant 20 ig/ml de la protéine enzymatique. Puis l'activité enzymatique de la solution vis-à-vis de la sarcosine a été mesurée conformément à la méthode décrite ci-dessus, pour trouver que la solution a conservé

l'activité de 100% même après un traitement à 40'C.

(g) Température optimale: L'activité enzymatique vis-à-vis de la sarcosine a été mesurée à diverses températures conformément à la méthode mentionnée ci-dessus pour la détermination de l'activité sarcosine oxydase, pour trouver que la

température optimale se situe au voisinage de 50'C.

(h) Stabilité au pH: On a préparé des solutions tampons de l'enzyme à divers pH. Les tampons utilisés étaient le tampon acide diméthylglutarique (pH: 4 - 7), le tampon phosphate (pH: 6 - 8), le tampon Tris acide chlorhydrique (pH: 7,5 - 9), le tampon glycine- hydroxyde de sodium (pH: 9 - 10), le tampon carbonate de sodium-borate de sodium (pH: 10 - 11). -A O, 1 ml de chaque tampon, on a ajouté 100;.l de la solution d'enzyme (concentration de la protéine enzymatique: 100 pg/ml> , et on a laissé reposer le mélange à 37'C pendant 60 minutes. Puis, on a aJouté 0,3 ml de tampon Tris acide chlorhydrique 1,0 mM (pH: 8,0), afin d'ajuster le pH. 20 gl d'une fraction aliquote de la solution ont été ajoutés au fluide réactionnel pour déterminer son activité enzymatique vis-à-vis de la

sarcosine conformément à la méthode mentionnée ci-dessus.

Comme résultat, il a été trouvé que la stabilité au pH se

situait au voisinage de 6,0 - 10,0.

Dans la description de ce mémoire, les acides

aminés, peptides, acides nucléiques, et composés apparentés aux acides nucléiques sont indiqués de manière abrégée selon la nomenclature en vigueur dans la technique. Quelques

exemples des abréviations sont énumérés ci-dessous.

Egalement, toutes les désignations des acides aminés se rapportent aux isomères L. ADN: Acide désoxyribonucléique ARN: Acide ribonucléique A: Adénine T: Thymine G: Guanine C: Cytosine Ala: Alanine Arg: Arginine Asn: Asparagine Asp: Aspartate Cys: Cystéine Gln Glutamine Glu: Glutamate Gly: Glycine * His: Histidine Ile: Isoleucine Leu: Leucine Lys: Lysine Met: Méthionine Phe: Phénylalanine Pro: Proline Ser: Sérine Thr: Thréonine Trp: Tryptophane Tyr: Tyrosine Val: Valine D'autres caractéristiques de la présente invention

ressortiront au cours de la description suivante des modes

de réalisation qui sont donnés à titre d'exemples pour illustrer l'invention et qui ne sont pas destinés à en

limiter la portée.

EXEMPLES

Exemple 1 [Préparation d'un ADN chromosomique] On a préparé un ADN chromosomique à partir de

Bacillus sp B-0618 (FERM BP-0750) par la méthode suivante.

La souche a été soumise à une culture avec secousses dans ml d'un milieu de bouillon normal, contenant 0,5% de thiosulfate de sodium, à 37'C, pendant toute une nuit. Le bouillon cultivé a été centrifugé à 3 000 tpm pendant 10 minutes, afin de recueillir les cellules bactériennes, qui ont été mises en suspension dans 5 ml d'une solution contenant 10% de sucrose, 50 mM de Tris acide chlorhydrique (pH 8,0) et 50 mM d'EDTA. A la suspension, on a ajouté 1 ml de solution de lysozyme (10 mg/ml), et on a maintenu le mélange, à 37'C, pendant 15 minutes, en faisant suivre par

l'addition de i ml de SDS (dodécylsulfate de sodium) à 10%.

On a ajouté à la suspension un volume égal d'un solvant mixte de chloroforme et de phénol (1:1), et le mélange a été agité et centrifugé à 10 000 tpm, pendant 3 minutes, pour séparer les couches aqueuse et de solvant. A la couche aqueuse récupérée, on a ajouté doucement 2 fois son volume d'éthanol, et on a agité lentement le mélange avec une tige de verre, afin d'amener 1'ADN à s'enrouler autour de la tige. L'ADN séparé de cette manière a été dissous dans ml d'une solution contenant 10 mM de Tris acide chlorhydrique (pH 8,0) et 1 mM d'EDTA (cette solution étant désignée ci-après par l'abréviation "TE))). Cette solution a

été traitée par un volume égal de solvant mixte chloroforme-

phénol (1: 1), et elle a été à nouveau centrifugée afin de récupérer la couche aqueuse. On y a encore ajouté 2 fois son volume d'éthanol, et l'ADN a été à nouveau séparé du mélange de la même manière que celle décrite ci-dessus. Cet

ADN obtenu finalement a été dissous dans 2 ml de TE.

Exemple 2 [Préparation d'un ADN plasmide pACYC 1841 Escherichia col pM191. portant pACYC 184 [J. Bacteriol. 134, 1141 (1981); ATCC 37033] a été soumis à une culture avec secousses dans 1 litre de milieu BHI (produit par Difco Co.). Lorsque la turbidité du bouillon a atteint DO660 = 1,0, on lui a aJouté de la spectinomycine à une concentration finale daslebaillcn égale à 300 ig/ml. Le secouage du bouillon à 37'C a été poursuivi pendant au moins 16 heures. Après achèvement de la culture, le bouillon a été centrifugé à 3 000 tpm, pendant 10 minutes, afin de recueillir les cellules bactériennes, à partir desquelles l'ADN plasmide a été préparé conformément à la méthode au lysozyme-SDS et à la méthode au chlorure de césium-bromure d'éthidium [Maniatis et al, Molecular Cloning, 86 - 94,

Cold Spring Harbor (1982>].

Exemple 3 [Construction du Plasmide pOXI101 possédant le gène de la Sarcosine Oxydase (SOX)] (1) On a préparé un mélange à partir de 2 pl (environ 0,5 Wg) de l'ADN chromosomique de Bacillus sp B-0618 préparé à l'Exemple 1, 1 i1 de tampon de digestion de EcoRI [Tris acide chlorhydrique 500 mM (pH 7,5), MgC12 70 mM, NaCl 1 K et mercapto éthanol 70 mM], concentré 10 fois, 1 pil de EcoRi (10 unités/il; produit par Takara Shuzo Co., Ltd.), et o 6 l d'eau, et l'ADN a été digéré à 37'C pendant 1 heure. De façon séparée, l'ADN plasmide pACYC 184 (environ 0,3 gg> a été digéré avec EcoRI d'une manière analogue. A celui-ci, on a ajouté 0,6 unité de phosphatase alcaline <produite par Takara Shuzo Co., Ltd.; ci-après désignée par l'abréviation "BAP"), et le mélange a été incubé à 65'C pendant 1 heure. Les deux solutions d'ADN digérées par EcoRI que l'on a ainsi préparées ont été mélangées ensemble, et 0,1 volume

d'acétate de sodium 3M a été aJouté au mélange.

Ensuite, la solution a été traitée par un volume é&al d'un solvant mixte chloroforme-phénol, et centrifugée pour séparer la couche aqueuse. A celle-ci, on a ajouté 2 fois son volume d'éthanol, et on a fait précipiter l'ADN par centrifugation et on l'a séché sous vide. L'ADN séché a été dissous dans 89 g1 d'eau, et à celui-ci, 10 1l de tampon de coordination ftris acide chlorhydrique 0,5 M (pH 7,6), MgCl2 0,14 dithiothréitol 0,1 M spermidine mM, ATP 10 mM) concentré 10 fois et 1j pl d'ADN ligase T4 (175 unités/ l; produit par Takara Shuzo Co., Ltd.) ont été ajoutés et mélangés, et on-a laissé reposer le mélange à 4'C pendant toute une nuit. Cette solution d'ADN a été traitée par un mélange chloroforme-phénol, et l'ADN a été précipité par l'éthanol, séché sous

vide, et dissous dans 10.l de TE.

* (2) On a cultivé Escherichia coli DH 1 (Stock n' ME8569; fourni par National Gene Research Institute) dans 100 ml de milieu BHI (Infusion de Cervelle et de Coeur, produite par Difco Co.), et les cellules ont été recueillies à la phase de croissance logarithmique par centrifugation (10 000 tpm, 2 minutes), et ont été mises en suspension dans 40 ml d'une solution refroidie par de la glace, contenant mM d'acétate de potassium, 100 mM de RbCl, 10 mM de

CaC12, 50 mM de MnCl2, et 15% de glycérine (pH 5,8).

Après avoir laissé reposer la suspension à O'C pendant minutes, celle-ci a été centrifugée afin d'éliminer le surnageant. Les cellules ont été mises en suspension dans 4 ml d'une solution refroidie par de la glace contenant 10 mM de tampon MOPS (produit par Dotite Co.), 75 mM de CaC12, 10 mM de RbCl et 15% de glycérine (pH 6,5), et on a laissé la suspension à O'C pendant 5 minutes, afin d'obtenir des cellules compétentes. (3) A 200 il de la suspension de Escherichia coli susindiquée, on a ajouté 10 Fl de la solution d'ADN préparée selon (1) ci-dessus. Après avoir laissé reposer le mélange à O'C pendant 30 minutes, on lui a ajouté 1 ml de milieu BHI. Ce mélange a été maintenu à 37'C pendant 90 minutes, 100 il de fraction aliquote dudit mélange ont été étalés sur une plaque d'agar BHI contenant de la tétracycline <15.g/ml), et cultivés pendant toute une nuit à 37'C, pour produire des transformants. Ces transformants ont été répliqués sur une plaque de milieu de détection de SOX (composition: peptone.............. 5 g - extrait de viande.... 2 g - extrait de levure.

. 5 g - NaCl................. 1 g - K2HPO4............... 1 g 2- MS O4....DTD: ......... 0,5g - MgsO4........O,S5g..DTD: peroxydase.......... 500 UI-

- dianisidine........ O, g -sarcosine...........9 g - agar................ . 15 g - eau distillée........ 1 litre; pH 7,0>, et il a été cultivé encore pendant toute une

nuit à 37'C.

Les périphéries de 4 colonies parmi environ 6 000 transformants ont été colorées dans le charbon actif. L'une des 4 souches a été appelée Escherichia coli DH1 pOXIlOl. Apres purification, cette souche a été cultivée dans un milieu BHI, pendant toute une nuit, à 37'C, et 1'ADN plasmide a été préparé de la même manière qu'à l'Exemple 2. Le plasmide contenant le gène de la sarcosine oxydase et le gène pACYC 184 a

été nommé pOXI101.

Exemple 4 [Cartographie de pOXI101 et Sous-clonage] Une carte de clivage de i'ADN de pOXI101 a été préparée à l'aide des endonucléases de restriction ClaI, HpaI, SalI, SmaI et XhoI (toutes produites par Takara Shuzo Co. Ltd.). Les résultats sont présentés sur la Figure 1. Un fragment EcoRI-ClaI 5,3 kb, contenant deux sites XhoI, obtenu à partir de pOXIlOl, et un fragment EcoRI-ClaI 4,3 kb, obtenu à partir de pBR 322, ont été préparés dela même manière que celle décrite à l'Exemple 3 (1). Le sous-clonage a été effectué, incluant la cohésion, la transformation de Escherichia coli DH1 et le criblage après transformation, afin d'obtenir un clone producteur de sarcosine oxydase. Le clone a été appelé Escherichia coli DH1 pOXI103, déposé le 24 juillet 1987 auprès de "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology" - numéro de dépôt 1828, FERM BP-1828 (issu du dépôt FERM P9494 du 24 juillet 1987). Un ADN plasmide a été préparé à partir de cette souche de la même manière qu'à

l'Exemple 2, et il a été appelé pOXI103. La carte de clivage a été prépa-

rée sur ce plasmide à l'aide des endonucléases de restriction ClaI, HpaI, 3 SalI, SmaI, et Xhol (toutes produites par Takara Shuzo Co., Ltd.).La carte est représentée sur la Figure 2. Selon cette carte, il a été trouvé que le clone était dépourvu d'une partie provenant de EcoRI vers le voisinage de XhoI contenant un site SmaI. Ce Escherichia coli DH1 pOXI103 a été cultivé dans un milieu BHI à 37'C, pendant toute une nuit, et le rendement en sarcosine oxydase a été déterminé conformément à la méthode mentionnée ci-dessus pour la mesure de l'activité sarcosine oxydase. Comme résultat, la souche a produit 2 u/ml de sarcosine oxydase. La séquence de bases de l'ADN contenant le gène de sarcosine oxydase a été déterminée par la Méthode Didésoxy à l'aide du phage M13 [Science, 214, 1205 - 1Z10 (1981)]. La Figure 3 représente la séquence de bases du gène de la sarcosine oxydase et la séquence d'acides aminés

de la sarcosine oxydase.

Exemple 5 [Préparation de la Sarcosine Oxydase] On a cultivé Escherichia coli DH1 pOXI103 dans litres de milieu BHI sous aération-agitation à 37'C, pendant 18 heures, à l'aide d'un fermenteur vibrant de 30 litres. Les bactéries cultivées ont été recueillies par centrifugation à 5 000 tpm pendant 10 minutes. Le rendement

en sarcosine oxydase qui a été obtenu était de 4,6 u/ml.

Les bactéries ont été lavées avec 2 litres de sérum physiologique et mises en suspension dans 2 litres de tampon phosphate 10 mM (pH 7,5). A la suspension ainsi préparée, on a ajouté du chlorure de lysozyme et EDTA2Na à une concentration finale de respectivement 0, 1% et 2 mM. Après incubation à 37'C pendant 60 minutes avec agitation, le mélange a été centrifugé à 15 000 tpm pendant 10 minutes et

on a recueilli 1,8 litre du surnageant résultant.

Au surnageant, on a aJouté 1,8 litre d'une solution saturée de sulfate d'ammonium pour obtenir un précipité. Le précipité a été recueilli par centrifugation à 1 200 tpm pendant 10 minutes, dissous dans 300 ml de tampon phosphate 10 mM (pH 7,5), puis il a été appliqué sur une colonne Sephadex G-25 (Marque de Fabrique) qui a été équilibrée avec un tampon phosphate 10 mM (pH 7,5) pour dessalage. Ensuite, la solution dessalée a été soumise à une chromatographie d'échange d'ions sur DEAE-Cephallose CLBE, pour recueillir la fraction active. Cette fraction a été dessalée et lyophilisée, pour donner 0,807 g d'un produit pulvérulent. Le rendement obtenu était de 36%,

l'activité spécifique du produit étant de 41 U/mg.

La masse moléculaire de la sarcosine oxydase

préparée a été mesurée par la méthode de filtration sur gel.

Comme résultat, il a été trouvé que la sarcosine oxydase a une masse moléculaire d'approximativement 40 000, laquelle est presque la même que celle calculée à partir de la

séquence d'acides aminés de la substance.

Cette invention a permis d'élucider la structure du gène de la sarcosine oxydase, de même que la séquence de bases et d'acides aminés de la sarcosine oxydase. De plus, cette invention a fourni un procédé efficace pour la préparation de la sarcosine oxydase à l'aide du gène de la sarcosine oxydase et sur la base de diverses techniques de

génie génétique.

Il va de soi que de nombreuses modifications et variantes de la présente invention sont possibles à la lumière des enseignements ci-dessus. Il doit par conséquent être entendu que le domaine de protection ne doit en aucune manière être limité aux modes de réalisation décrits ici d'une manière spécifique, et que l'invention peut être mise en oeuvre autrement qu'avec ces modes de réalisation

spécifiquement décrits.

Claims (13)

REVENDICATIONS

1 - Acide polydésoxyribonucléique, caractérisé par le fait qu'il comprend une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés d'un polypeptide qui constitue une sarcosine oxydase. 2 - Acide polydésoxyribonucléique selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ladite sarcosine oxydase est une enzyme ayant les caractéristiques physico-chimiques suivantes: (a) Action: catalyse une réaction enzymatique dans laquelle une mole de glycine, une mole de formaldéhyde et une mole de peroxyde d'hydrogène sont obtenues & partir d'une mole de sarcosine, d'une mole d'oxygène et d'une mole d'eau, conformément au schéma réactionnel suivant Sarcosine + 02 + H20 - Glycine + Formaldéhyde + H202 (b) Spécificité de substrat: I20 présente une spécificité de substrat vis-à-vis de la sarcosine (c) pH optimal:

8,0 - 9,5

(d) Point isoélectrique:

4,7 0,1

(e>) Masse moléculaire (déterminée par la méthode de filtration sur gel)

000 4 000

(f> Stabilité thermique:

stable lors d'un traitement & 40'C pendant 10 minutes.

3 - Acide polydésoxyribonucléique selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comprend une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés de polypeptide, représentée par la formule suivante, partant de l'extrémité N terminale: A -Ser Thr Bis Phe Asp Val lie Val Val Gly Ala Gly Ser Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Gin Leu Ala Lys Gin Gly Val Lys Thr Leu Leu Val Asp Ala Phe Asp Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His Bis Gly Asp Thr Arl Ile lie Ar8 Bis Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr Val Pro Leu Ala Leu Arg Ser Gin Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Thr Ris Ris Lys lie Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly Pro Lys Gly Glu Ser Ala Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys Glu Ris Ser Leu Thr Val Asp Leu Leu Glu Gly Asp Glu lie Asn Lys Arg Trp Pro Gly Ile Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu Pro Asn Ser Gly Val-Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg Glu Leu Ala Glu Ala Arg GIy Ala Lys Val Leu Thr Bis Thr Arg Val Glu Asp Phe Asp lle Ser Pro Asp Ser Val Lys Ile Glu Thr Ala Asn Gly Ser Tyr Thr Ala Asp Lys Leu lie Val F1 Ser Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Leu Asp le Pro Leu Gin Pro Tyr Arg Gin Val Val Gly Phe Phe Glu Ser Asp Glu Ser Lys Tyr Ser Asn Asp lie Asp Phe Pro Gly Phe Met Val Glu Val Pro Asn Gly lie Tyr Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Leu Gly Tyr Ris Thr Phe Gly Gin Lys Ile Asp Pro Asp Thr lie Asn Arg Glu Phe Gly Val Tyr Pro Glu Asp Glu Ser Asn Leu Ar8 Ala Phe Leu Glu Glu Tyr Met Pro Gly Ala Asn Gly Glu Leu Lys Ar8 Gly Ala Val Cys Met Tyr Thr Lys Thr Leu Asp Glu Bis Phe lie lie Asp Leu Ris Pro Glu Bis Ser Asn Val Val lie Ala Ala Gly Phe Ser Gly Ris Gly Phe Lys Phe Ser Ser Gly Val Gly Glu Val Leu Ser Gin Leu Ala Leu Thr Gly Lys Thr Glu Ris Asp Ile Ser Ile Phe Ser lie Asn Arg Pro Ala Leu Lys Glu Ser Leu Gln Lys Thr Thr lIle -B o - A représente un reste d'acide aminé ou un atome d'hydrogène; et

- B représente un reste d'acide aminé ou -OH.

4 - Acide polydésoxyribonucléique selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il a la séquence de bases suivante, partant de l'extrémité 5' terminale:

X-AGC ACA CAT TTT GAT GTC ATC GTT GTT

GGA GCT GGA TCA ATG GGA ATG GCG GCA GGT

TAT CAA TTA GCA AAG CAA GGA GTC AAA ACA

TTA TTA GTG GAT GCA TTT GAT CCG CCG CAT

ACA AAC GGA AGC CAT CAC GGT GAT ACT CGT

ATC ATC CGC CAT GCT TAC GGT GAG GGA AGA

GAA TAT GTT CCT CTT GCA TTA AGA TCA CAA

GAG TTA TGG TAT GAA CTA GAA AAA GAA ACA

CAC CAT AAA ATA TTC ACG AAA ACG GGC GTA

CTC GTA TTT GGT CCT AAA GGT GAA TCG GCT

TTC GTT GCA GAA ACG ATG GAA GCG GCA AAG

GAA CAT TCA TTG ACT GTT GAT TTA CTG GAA

GGT GAT GAA ATA AAT AAG CGT TGG CCG GGT

ATA ACG GTT CCG GAA AAC TAC AAT GCT ATT

TTC GAA CCG AAC TCA GGT GTA TTA TTC AGT

GAA AAT TGT ATT CGT GCC TAC CGC GAG TTA

GCT GAA GCG CGA GGT GCT AAA GTT CTA ACA

31V 13V VDV VVV VV ViL D31 VVYS VVV 511 133 153 DVV i1V 331 ail DIV V31 lIV IVS DV3 DVys V3V VVV 15 i3V Vil 135 Vil Oú VVD 15V vi3 515 VVS 159 115 VSS 1VY Do1 Zg IZi SVV li Vos IV3 355 131 Di1 3Do 33D DIV Dis VIS 3VV 331 1Va VVS 1i3 iV3 vIl 3MV VIV liV 311 IZV VVO LVS Vil V3V

VVV DV DVI DIV 3D51 315 VDS D55 Y9V VVV

VIl DUD VDS IYV VDO V15 V3 D9V IVI VVS oz VYY D11 IL 135 3D3 o 13 I VV 15V VuS IV0 VVS YD3 IVI 119 355 111 VIS 353 IVY liV VYV IV9 133 3VB lIV VVV M3 D599 311 D3V OT I1 IYI VYs V13 VMI 911 vus 191 359 035 311 35Y Y33 311 V99 Dvi IVI lIV 155 LIY

V33 515 IVS 115 91V 311 155 133 311 115

LIV l S v IVY 3DV iYI DV 31 VY1 IV DO31 vvs 111 311 19 ViLs Di5 VY3 193 iVI V3OD DV VIl vi3 DIV 3VS 113 YVV V11 VVV v31 113 V13 VMI DoV IVY 591 139 V55 oIV 3OV IIV Vil vvv IVS 13is V3V DVI vo1 V1 IVY VODS 1V VS DIiV YVY 315 Vol 31V D53 V1 IIYV YO Iii DVS DVO 115 33DO-V3V IVa

S6ú6L9Z

o: - X représente un codon autre que TAA, TAG ou TGA, ou un atome d'hydrogène; et

- Y représente un codon ou un atome d'hydrogène.

5 - Transformant, caractérisé par le fait qu'il comprend un acide polydésoxyribonucléique qui est étranger par rapport au microorganisme hôte et a une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés d'un

polypeptide qui constitue une sarcosine oxydase.

6 - Transformant selon la revendication 5,

caractérisé par le fait que ledit acide polydésoxy-

ribonucléique est l'acide polydésoxyribonucléique tel que

défini à la revendication 2.

7 - Transformant selon la revendication 5,

caractérisé par le fait que ledit acide polydésoxy-

ribonucléique est l'acide polydésoxyribonucléique tel que

défini à la revendication 3.

8 - Transformant selon la revendication 5, caractérisé par le fait que ledit microorganisme hôte est un

microorganisme appartenant à l'espèce Escherichia coli.

9 - Transformant selon la revendication 5, caractérisé par le fait qu'il est Escherichia colt DH1 pOXI103 (Déposé auprès de (Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology - Japon"

n' de Dépôt 1828, FERM BP-1828).

- Sarcosine oxydase, caractérisée par le fait qu'elle possède une activité de catalase inférieure à 0,05 unité, une activité de créatinase inférieure à 0,0004 unité, et une activité de N-éthylglycine oxydase inférieure à 0,03

unité par unité d'activité de sarcosine oxydase.

11 - Polypeptide, caractérisé par le fait qu'il a une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés de polypeptide, représentée par la formule suivante, partent de l'extrémité N terminale A-Ser Thr Ris Phe Asp Val lile Val Val Gly Ala Gly Ser Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Gin Leu Ala Lys Gin Gly Val Lys Thr Leu Leu Val Asp Ala Phe Asp Pro Pro His Thr Asn Gly Ser Ris Ris Gly Asp Thr Arg Ile l1e Art Ris Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr Val Pro Leu Ala Leu Arg Ser Gin i5 Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys Glu Thr Ris Bis Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly Pro Lys Gly Glu Ser Ala Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys Glu His Ser Leu Thr Val Asp Leu Leu Glu Gly Asp Glu Ile Asn Lys Ars Trp Pro Gly lie Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu Pro Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Art Ala Tyr Ars Glu Leu Ala Glu Ala Ar8 Gly Ala Lys Val Leu Thr lis Thr Arg Val Glu Asp Phe Asp lie Ser Pro Asp Ser Val Lys lie Glu Thr Ala Asn Gly Ser Tyr Thr Ala Asp Lys Leu le Val Ser Met Gly Ala Trp Asn Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Leu Asp lie Pro Leu Gin Pro Tyr Arg Gin Val VaI Gly Phe Phe Glu Ser Asp GIu Ser Lys Tyr Ser Asn Asp Ile Asp Phe Pro Gily Phe Mét Val Glu Val Pro Asn Gly Ile Tyr Tyr Gly Phe Pro Ser Phe GIy Gly Cys Gly Leu Lys Leu Gly Tyr His Thr Phe Gly Gin Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly Val Tyr Pro Glu Asp Glu Ser Asn Leu Arc Ala Phe Leu Glu Glu Tyr Met Pro Gly Ala Asn Gly Glu Leu Lys Arg Gly Ala Val Cys Met Tyr Thr Lys Thr Leu Asp Glu Ris Phe Ile Ile Asp Leu Ris Pro Glu Ris Ser Asn Val Val Ile Ala zs Ala Gly Phe Ser Gly Ris Gly Phe Lys Phe Ser Ser Gly Val Gly Glu Val Leu Ser Gln Leu Ala Leu Thr Gly Lys Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Ar8 Pro Ala Leu Lys Glu Ser Leu Gln Lys Thr Thr Ile -B o - A représente un reste d'acide aminé ou un atome d'hydrogène;et

- B représente un reste d'acide aminé ou -OH.

12 - Procédé de préparation d'une sarcosine oxydase, caractérisé par le fait qu'il consiste à: - introduire un ADN recombinant, qui est produit par insertion de l'acide polydésoxyribonucléique tel que F défini à la revendication 1 dans un vecteur d'expression, dans un microorganisme hôte, afin de produire un transformant; - cultiver ledit transformant, pour amener le transformant à exprimer l'information génétique dudit acide polydésoxyribonucléique; et - recueillir le polypeptide qui est un constituant de

ladite sarcosine oxydase.

13 - Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que ladite sarcosine oxydase est une enzyme ayant les caractéristiques physico-chimiques suivantes: (a) Action: catalyse une réaction enzymatique dans laquelle une mole de glycine, une mole de formaldéhyde et une mole de peroxyde d'hydrogène sont obtenues à partir d'une mole de sarcosine, d'une mole d'oxygène et d'une mole d'eau, conformément au schéma réactionnel suivant: Sarcosine + 02 + H20 - Glycine + Formaldéhyde + H202 (b) Spécificté de substrat: présente une spécificité de substrat vis-à-vis de la sarcosine (c) pH optimal:

8,0 - 9,5

(d) Point isoélectrique:

4,7 0,1

(e> Masse moléculaire (déterminée par la méthode de filtration sur gel)

000 4 000

(f) Stabilité thermique:

stable lors d'un traitement à 40'C pendant 10 minutes.

14 - Procédé selon la revendication 12,

caractérisé par le fait que ledit acide polydésoxy-

ribonucléique est l'acide polydésoxyribonucléique tel que

défini à la revendication 2.

- Procédé selon la revendication 12,

caractérisé par le fait que ledit acide polydésoxy-

ribonucléique est l'acide polydésoxyribonucléique tel que

défini à la revendication 3.

16 - Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que le transformant est Escherichla coli DH1 pOXI103 (Déposé auprès de "Fermentation Research

Institute, Agency of Industrial Science and Technology -

Japon)"; n' de Dépôt 1828, FERM BP-1828).