DE3827168A1 - Dna mit genetischer information von sarcosinoxidase - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Polydesoxyribonucleinsäure mit einer genetischen Information einer neuen Sarcosinoxidase.

Die Erfindung betrifft ferner einen Transformanten, der diese Polydesoxyribonucleinsäure aufweist, sowie die Sarcosinoxidase und ein Verfahren zur Herstellung derselben durch Expression mittels des Transformanten der genetischen Information der genannten Polydesoxyribonucleinsäure.

Sarcosinoxidase ist ein Enzym, welches eine enzymatische Reaktion katalysiert, bei der jeweils ein Mol Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid erzeugt werden aus jeweils einem Mol Sarcosin, Sauerstoff und Wasser gemäß dem folgenden Reaktionsschema:

Sarcosin + O₂ + H₂O → Glycin + Formaldehyd + H₂O₂.

Von Sarcosinoxidase ist es seit langem bekannt, daß sie natürlich vorkommt, speziell in tierischen Organen. Es wurde auch berichtet, daß diese Substanz in Mikroorganismen existiert, welche zur Gattung Penicillium [Frisell, W. R. & Mackenzie, C. G. (1970) Meth. Enzymol. 17A, 976-981], Pseudomonas (ibd.), Artherobactor (JP-OS 28 893/1979), Bacillus (JP-OSen 52 789/1979 und 1 62 174/1986), Cylindrocarpon (JP-OS 92 790/1981), Pseudomonas (JP-OS 43 379/1985) und dem Stamm von Streptomyscetaceae (JP-OS 2 80 271/1986) gehören.

Da es sich bei Sarcosinoxidase um eine Oxidase handelt, welche Sarcosin als ihr Substrat aufweist, kann sie für die quantitative Bestimmung des Sarcosins verwendet werden, welches in einer Körperflüssigkeit, wie im Serum, vorliegt. Zusätzlich ist das Enzym in einem Creatinin- oder Cholin-Metabolismus involviert. Speziell führt die Konjugationsreaktion von Sarcosinoxidase mit Creatininase oder Creatinase, die im Kreatinin-Metabolismussystem anwesend ist, zur Bildung von Formaldehyd und Wasserstoffperoxid und ermöglicht somit eine quantitative Bestimmung von Creatinin oder Creatin in spezifischer Weise mit großer Leichtigkeit. Mit Sarcosinoxidase wird somit ein biologisches Verfahren zur quantitativen Analyse eines Creatinins und/oder Creatins zur Verfügung gestellt. Die Substanz ist somit nicht nur bei Laborexperimenten von Bedeutung, sondern auch bei klinischen Diagnoseverfahren.

Sarcosinoxidase erzeugende Mikroorganismen, über die früher berichtet wurde, haben nur eine geringe Effizienz bei der Sarcosinoxidase-Erzeugung. Daher war die Verwendung einer Substanz, welche dazu beitragen kann, die Bildung von Sarcosinoxidase zu induzieren, wie Cholin, Sarcosin, Creatin oder dergl., unverzichtbar. Diese Maßnahme führt jedoch zu einer Kostensteigerung bei der Sarcosinoxidase- Erzeugung. Ferner gestaltet sich bei diesem Verfahren die Entfernung von anderen Enzymtypen, welche zusammen mit Sarcosinoxidase in dem kultivierten Gemisch vorliegen können, als äußerst schwierig. Es war somit ein kostenintensives Reinigungsverfahren erforderlich, um eine hochreine Sarcosinoxidase zu erhalten. Die Verwendung dieser Sarcosinoxidase erzeugenden Mikroorganismen hat sich somit nicht immer als effektiver und bequemer Weg zur Bereitstellung von Sarcosinoxidase als Reagens für den unbeschränkten Einsatz bei Laborexperimenten oder bei klinischen Diagnoseverfahren herausgestellt.

In einer kürzlich erschienen Literaturstelle wird berichtet, daß kontaminierende Enzyme, wie Catalase und Uricase, welche in einer thermisch resistenten Sarcosinoxidase vorliegen, welche von einem thermisch resistenten Mikroorganismus stammt, vollständig desaktiviert werden können durch eine Hitzebehandlung der Sarcosinoxidase (JP-OS 1 62 174/1986). Derartige kontaminierende Enzyme, wie Catalase und Uricase, die aus thermisch resistenten Mikroorganismen stammen, sind jedoch mehr oder weniger thermisch resistent, und es ist in der Tat äußerst schwierig, diese kontaminierenden Enzyme vollständig zu eliminieren.

Von den Erfindern wurden umfangreiche Studien mit dem Ziel durchgeführt, die Produktivität der Sarcosinoxidase zu verbessern, ein Verfahren zu finden, mit dem fremde, kontaminierende Enzyme eliminiert werden können, und die Produktionskosten zu reduzieren. Als Ergebnis dieser Untersuchungen ist es den Erfindern gelungen, ein neues Sarcosinoxidase-Gen aus einem Mikroorganismus zu erhalten und ferner dessen Primärstrukturanalyse aufzuklären. Darüber hinaus haben die Erfinder unter Anwendung von Genetic Engineering Techniken ein Verfahren entwickelt, mit dem die Sarcosinoxidase mit hoher Produktivität hergestellt werden kann, ohne daß die Verwendung einer induzierenden Substanz in dem Kulturmedium erforderlich ist.

Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Polydesoxyribonucleinsäure zu schaffen, die eine Basensequenz umfaßt, die für eine Aminosäuresequenz eines Polypeptids codiert, welches eine Sarcosinoxidase darstellt, die folgende physikochemische Eigenschaften aufweist:

• (a) Wirkung: katalysiert eine enzymatische Reaktion, bei der jeweils 1 Mol Glycin, Formaldehyd und Wasserstoff­ peroxid gebildet wird aus jeweils 1 Mol Sarcosin, Sauerstoff und Wasser gemäß dem folgenden Reaktionsschema: Sarcosin + O₂ + H₂O → Glycin + Formaldehyd + H₂O₂.
• (b) Substratspezifität: zeigt eine Substratspezifität gegenüber Sarcosin.
• (c) Optimaler pH: 8,0 bis 9,5.
• (d) Isoelektrischer Punkt: 4,7 ±0,1.
• (e) Molekulargewicht (bestimmt nach dem Gelfiltrations­ verfahren): 40 000 ±4000.
• (f) Thermische Stabilität: stabil bei Behandlung bei 40°C während 10 min.

Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Transformanten, dessen Wirts-Mikroorganismen die erwähnte, spezifische Polydesoxyribonucleinsäure besitzen.

Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, eine Sarcosinoxidase zu schaffen, die von diesem Transformanten gebildet wurde.

Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Sarcosinoxidase geschaffen, umfassend die Kultivierung des Transformanten unter Bewirkung des Transformanten, die genetische Information der erwähnten Polydesoxyribonucleinsäure weiterzugeben, und Sammlung des Polypeptids, welches einen Bestandteil der Sarcosinoxidase darstellt.

Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung deutlich. In den Figuren zeigt

Fig. 1 eine schematische Zeichnung, in der der Aufbau des pOXI101-Vektors dargestellt ist;

Fig. 2 eine ähnliche Zeichnung für den pOXI103-Vektor;

Fig. 3-1 und 3-2 die Basensequenz der Sarcosinoxi­ dase-Gen-DNA (von 5′ bis 3′) und

Fig. 4-1 und 4-2 die Aminosäuresequenz des daraus gebildeten Translationsprodukts.

Die Sarcosinoxidase der vorliegenden Erfindung besitzt als weitere enzymatische Aktivität eine Catalaseaktivität von unter 0,05 Einheiten, eine Creatinaseaktivität von unter 0,0004 Einheiten und einen N-Ethylglycinoxidaseaktivität von unter 0,03 Einheiten pro Einheit Aktivität der Sarcosinoxidase. Das Polypeptid, welches diese Sarcosinoxidase aufbaut, hat eine Aminosäuresequenz, welche, beginnend vom N-terminalen Ende, die folgende Formel (I) aufweist:

wobei A für einen Aminosäurerest oder ein Wasserstoffatom steht und B einen Aminosäurerest oder -OH bedeutet.

In dem Polypeptid der Formel (I) kann der Aminosäurerest, der durch A dargestellt wird, ein oder mehrere Aminosäurereste sein. Bevorzugte Beispiele für A sind ein Wasserstoffatom, ein Methionin oder ein Signal-Polypeptid. Die durch B repräsentierte Gruppe kann entweder ein Säureamid oder ein oder mehrere Aminosäurereste sein.

Eine Polydesoxyribonucleinsäure, die ein Sarcosinoxidase- Gen darstellt, das die oben erwähnten physikochemischen Eigenschaften aufweist, kann eine beliebige Polydesoxyribonucleinsäure sein, solange dieselbe nur das Sarcosinoxidase- Gen per se enthält, welches die oben erwähnten physikochemischen Charakteristika besitzt. Als Beispiel dieses Sarcoxinoxidase-Gens per se sei eine Polydesoxyribonucleinsäure erwähnt mit einer Basensequenz, die für die Aminosäuresequenz der folgenden Formel (II) codiert, beginnend von dem N-terminalen Ende:

Unter Berücksichtigung der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das die Sarcosinoxidase der Formel (II) aufbaut, kann es sich bei der Polydesoxyribonucleinsäure um eine beliebige Polydesoxyribonucleinsäure handeln, solange diese nur ein beliebiges Codon unter einer Serie von Codons besitzt, das der jeweiligen der Aminosäuren entspricht, welche die Aminosäuresequenz der Formel (II) darstellen. Es kann sich auch um eine Polydesoxyribonucleinsäure handeln, welche an ihrem 5′-Ende ein oder mehrere Codons mit Ausnahme eines Nonsenscodons und/oder an ihrem 3′-Ende ein oder mehrere Codons aufweist. Ein typisches Beispiel einer solchen Polydesoxyribonucleinsäure ist eine solche mit einer Basensequenz, welche, beginnend vom 5′-Ende, die folgende Formel (III) hat:

wobei X für ein Codon mit Ausnahme von TAA, TAG und TGA oder ein für ein Wasserstoffatom steht und Y ein Codon oder ein Wasserstoffatom darstellt.

Bei der Basensequenz der Formel (III) kann es sich bei dem durch X dargestellten Codon um ein beliebiges Codon handeln, solange dasselbe nur für eine Aminosäure codiert. Zusätzlich kann X an seinem 5′-Ende ein oder mehrere Codons besitzen, welche für Aminosäuren codieren. Bevorzugte Beispiele für X sind ATG oder eine Polydesoxyribonucleinsäure, welche einem Signal-Peptid entspricht.

Das durch Y dargestellte Codon kann ein beliebiges Codon sein, ausgewählt unter Translationsstopp-Codons und Codons, welche für eine Aminosäure codieren. Y kann an seinem 3′-Ende ein oder mehrere Codons besitzen, welche für Aminosäuren codieren, wobei es in diesem Fall wünschenswert ist, daß am 3′-Ende dieser Codons ein Translationsstopp- Codon vorgesehen ist.

Eine Polydesoxyribonucleinsäure mit einem Sarcosinoxidase- Gen als ihrem Bestandteil, eine Polydesoxyribonucleinsäure, welche ein Gen mit einer Basensequenz aufweist die für eine Aminosäuresequenz der Formel (II) codiert, oder eine Polydesoxyribonucleinsäure der Formel (III) kann man leicht herstellen mittels eines Mikroorganismus, welcher einen Donor des Sarcosinoxidase erzeugenden Gens darstellt. Speziell umfaßt dieses Verfahren die folgenden Verfahrensstufen. Eine DNA dieses Mikroorganismus wird zunächst abgetrennt und gereinigt. Anschließend erfolgt eine Behandlung mit Ultraschallwellen oder mit einer Restriktionsendonuclease. Diese DNA und eine lineare Expressionsvektor-DNA, welche in ähnlicher Weise verdaut wurde, z. B. durch eine Restriktionsendonuclease, werden mit einer DNA-Ligase oder dergl. verbunden (an den abgestumpften oder kohäsiven Enden der beiden DNA's), um einen geschlossenen Kreis zu bilden. Der auf diese Weise erhaltene, rekombinante DNA-Vektor wird in einen reproduzierbaren Wirts-Mikroorganismus eingeführt. Die Mikroorganismen, welche diesen rekombinanten DNA-Vektor aufweisen und die mittels eines Screening-Verfahrens unter Verwendung des Vektormarkers und der Sarcosinoxidase- Aktivität als Indikatoren gesammelt wurden, werden kultiviert. Der rekombinante DNA-Vektor wird dann von den kultivierten Mikroorganismen abgetrennt und gereinigt. Daraus wird die Sarcosinoxidase-Gen-Polydesoxyribonucleinsäure gesammelt.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung können beliebige Sarcosinoxidase erzeugende Mikroorganismen verwendet werden, welche in der Lage sind, Sarcosinoxidase mit den vorstehend erwähnten physikochemischen Eigenschaften zu erzeugen. Als Beispiel sei Bacillus sp. B-0618-Stamm genannt, der in JP-OS 28 893/1979 beschrieben wurde.

Ein transformierter Mikroorganismus, dem sie Sarcosinoxidase erzeugende Fähigkeit unter Verwendung von Genetic Engineering Techniken verliehen wurde, kann ebenfalls als ein Sarcosinoxidase-Gen-Donator-Mikroorganismus verwendet werden.

Das Verfahren der Sammlung einer DNA, welche durch den Gen-Donator-Mikroorganismus induziert wurde, wird im folgenden beispielhaft erläutert. Ein beliebiger der oben erwähnten Gen-Donator-Mikroorganismen wird zunächst in einem flüssigen Kulturmedium unter Belüftung 1 bis 3 Tage kultiviert. Die kultivierte Brühe wird zentrifugiert, um die Mikroorganismen zu sammeln. Diese werden dann zur Erzeugung einer Bacteriolyse lysiert, enthaltend ein Sarcosinoxidase- Gen. Für die Bacteriolyse wird eine Behandlung mit einem die Zellwand lysierenden Enzym, wie Lysozym oder β-Glucanase, durchgeführt. Gegebenenfalls erfolgt diese Behandlung in Kombination mit einem anderen Enzym, wie Protease, oder einem oberflächenaktiven Mittel, wie Natriumlaurylsulfat. Zusätzlich kann neben der Bacteriolyse eine physikalische Verdauung der Zellwände durchgeführt werden, z. B. durch Einfrieren-Auftauen oder mittels einer französischen Presse.

Herkömmliche Verfahren der Reinigung umfassen beispielsweise eine Deproteinbehandlung durch Phenolextraktion, Proteasebehandlung, Ribonucleasebehandlung, Präzipitation aus Alkohol und Zentrifugieren und können entweder unabhängig oder in Kombination angewandt werden, um eine Abtrennung und Reinigung der DNA aus der Bacteriolyse zu erreichen.

Die Verdauung der auf diese Weise abgetrennten und gereinigten DNA des Mikroorganismus kann beispielsweise durchgeführt werden mittels einer Behandlung mit Ultraschallwellen oder eine Restriktionsendonuclease. Um eine leichte Verbindung der DNA-Fragmente und der Vektor-DNA zu gewähr­ leisten, ist jedoch die Verwendung einer Restriktionsendonuclease bevorzugt, speziell einer solchen mit einer Aktivität für eine spezifische Nucleotidsequenz, wie EcoR I, Hind III, BamH I oder BamH II.

Geeignete Vektoren für den Einsatz bei der Erfindung sind solche, welche für die Verwendung als genetische, rekombinante DNA durch künstliche Behandlung eines Phagen oder einer Plasmid-DNA rekonstruiert wurden und in der Lage sind, autonom in Wirtsbakterienzellen zu wachsen.

Falls Escherichia coli als Wirts-Mikroorganismus verwendet wird, werden beispielsweise γ gt · γ C, γ gt · γ B oder dergl. als Phagen verwendet.

Als Plasmid werden pBR322, pBR325, pACYC184, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19 oder dergl. verwendet, falls Escherichia coli der Wirts-Mikroorganismus ist, und pUB110, pC194 oder dergl. werden verwendet, falls Bacillus subtilis der Wirts-Mikroorganismus ist. Zusätzlich kann man Suttlevektoren einsetzen, welche autonom in Wirtsbakterienzellen wachsen können, und zwar in grampositiven oder gramnegativen Mikroorganismen oder in beiden, z. B. bei Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae. Diese Vektoren werden vorteilhafterweise zu Vektorfragmenten verdaut unter Verwendung der gleichen Restriktionsendonuclease wie derjenigen, die zum Aufbrechen der oben erwähnten Sarcosinoxidase-Gen-Donator-Mikroorganismus-DNA verwendet wurde.

Herkömmliche Verfahren der Verwendung von DNA-Ligase können eingesetzt werden, um die bakterielle DNA und das Vektorfragment zu vereinigen. Beispielsweise kann das kohäsive Ende der bakteriellen DNA und das des Vektorfragments zunächst getempert (annealed) werden und nachfolgend kann eine rekombinante DNA aus dem bakteriellen DNA- Fragment und dem Vektorfragment durch die Wirkung einer geeigneten DNA-Ligase hergestellt werden. Falls erforderlich, kann das getemperte bakterielle DNA-Vektor-Fragment in den Wirts-Mikroorganismus eingeführt werden, um die rekombinante DNA mit Hilfe einer in vivo-DNA-Ligase zu erzeugen.

Als Wirtsbakterien kann man beliebige Mikroorganismen verwenden, welche ein autonomes und stabiles Wachstum der rekombinanten DNA erlauben und die Fähigkeit zur Expression des Charakters der fremden DNA besitzen. Beispiele derartiger Mikroorganismen umfassen Escherichia coli DH1, Escherichia coli HB101, Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600 und dergl., falls Escherichia coli als Wirtsbakterium verwendet wird.

Die Einführung der rekombinanten DNA in den Wirts- Mikroorganismus kann in Gegenwart von Calciumionen durchgeführt werden, wenn der Wirts-Mikroorganismus ein Bakterium der Gattung Escherichia ist. Falls man ein Bakterium der Gattung Bacillus als Wirts-Mikroorganismus einsetzt, so kann man entweder die kompetente Zellmethode, ein Verfahren zur elektrischen Einführung der Ribosom-Rekombinant-DNA in die Protoplast-Wirtsbakterienzellen oder die Mikroinjektionsmethode verwenden. Es wurde festgestellt, daß die auf diese Weise hergestellten Transformant-Bakterien bei Kultivierung in einem Nährmedium in stabiler Weise große Mengen Sarcosinoxidase erzeugen.

Die Einführung der zweckdienlichen DNA in den Wirts- Mikroorganismus kann verfolgt werden, indem man den Mikro­ organismus ermittelt, der zur Expression eines Drogenresistenz­ markers des Vektors, auf dem die zweckdienliche, rekombinante DNA gehalten wird, in der Lage ist sowie gleichzeitig zur Expression von Sarcosinoxidase. Man kann beispielsweise diejenigen Bakterien selektieren, welche in einem selektiven Kulturmedium des chemischen Toleranzmarkers wachsen und Sarcosinoxidase erzeugen.

Die rekombinante DNA, welche das Sarcosinoxidase-Gen besitzt und einmal auf diese Weise ausgewählt wurde, kann leicht von dem Transformant-Mikroorganismus extrahiert werden für die Einführung in ein weiteres Wirtsbakterium. Alternativ kann man die Sarcosinoxidase-Gen-DNA unter Verwendung einer Restriktionsendonuclease oder dergl. aus einer rekombinanten DNA, welche ein Sarcosinoxidase- Gen besitzt, verdauen und mit einem Ende eines anderen geöffneten Vektors vereinigen, der auf ähnliche Weise erhalten wurde. Die rekombinante DNA mit neuen Eigenschaften, welche auf diese Weise hergestellt wurde, wird anschließend in den Wirts-Mikroorganismus eingeführt.

Eine Sarcosinoxidase-Mutein-DNA, die eine wesentliche Sarcosinoxidase-Aktivität besitzt, ist eine Genvariante, die durch Genetic Engineering Techniken erfindungsgemäß aus einem Sarcosinoxidase-Gen erzeugt wurde. Dieses Mutein kann mittels verschiedener Genetic Engineering Techniken hergestellt werden, wie der ortsspezifischen Basen­ konversionsmethode, der Substitution eines spezifischen DNA-Fragments mit einem künstlichen Variant-Gen und dergl. Unter den so hergestellten Sarcosinoxidase-Mutein-DNA's werden diejenigen, welche besonders ausgezeichnete Eigenschaften aufweisen, schließlich in einen Vektor eingesetzt zur Erzeugung einer rekombinanten DNA, welche dann in den Wirts-Mikroorganismus eingeführt wird. Nachfolgend kann das Sarcosinoxidase-Mutein hergestellt werden.

Die Basensequenz des nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellten Sarcosinoxidase-Gens wurde mit der Desoxy- Methode entschlüsselt [Science, 214, 1205-1210 (1981)]. Die Aminosäuresequenz von Sarcosinoxidase wurde basierend auf der Basensequenz bestimmt.

Im folgenden wird die Methode erläutert, welche zur Bestimmung der Aminosäuresequenz des Abschnitts angewandt wurde, der das N-Ende des Sarcosinoxidase-Peptids darstellt. Der Sarcosinoxidase-Gen-Donator-Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Erzeugung von Sarcosinoxidase wird zunächst in einem Nährmedium kultiviert, um Sarcosinoxidase in den Bakterien zu bilden und anzureichern. Die kultivierten Bakterien werden von der Brühe durch Filtration, Zentrifugieren oder ähnliche Verfahren gesammelt. Die gesammelten Bakterien werden dann verdaut, und zwar entweder mechanisch oder enzymatisch unter Verwendung von Lysozym oder dergl., und zu den verdauten Bakterien gibt man EDTA und/oder ein geeignetes oberflächenaktives Mittel, sofern erforderlich, um Sarcosinoxidase zu solubilisieren. Diese wird anschließend als wäßrige Lösung abgetrennt. Diese wäßrige Lösung der Sarcosinoxidase wird eingeengt oder ohne Einengung der Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Gelfiltration, Adsorptionschromatographie oder Ionenaustausch-Chromatographie unterworfen, um hochreine Sarcosinoxidase zu erhalten. Die Aminosäuresequenz des des Abschnitts, welcher das N-Ende des Sarcosinoxidase- Peptids darstellt, wird an dieser hochreinen Sarcosinoxidase bestimmt unter Verwendung eines Flüssigphasen- Proteinsequenz-Analysegeräts (Beckman System 890ME, hergestellt von Beckman, Inc.). Auf diese Weise wird festgestellt, daß die Aminosäuresequenz dieses Abschnitts identisch ist mit der N-terminalen Aminosäure-Sequenz von der Sarcosinoxidase, die durch eine Genetic Engineering Technik erhalten wurde.

Die Kultivierung des Transformant-Wirts-Mikroorganismus wird unter geeigneten Bedingungen durchgeführt, wobei die Nährstoffcharakteristika und die physiologischen Charakteristika des Wirts-Mikroorganismus berücksichtigt werden. In den meisten Fällen wird eine Flüssigkultivierung durchgeführt. Bei einer Produktion im industriellen Maßstab hat sich jedoch eine Kultivierung unter tiefen aeroben Rührbedingungen als vorteilhafter erwiesen. Eine breite Vielfalt von Nährstoffen, wie sie herkömmlicherweise für die Kultivierung von Bakterien verwendet werden, kann für die Kultivierung des Wirts-Mikroorganismus verwendet werden. Speziell kann man beliebige Nährstoff- Kohlenstoffverbindungen als Kohlenstoffquellen einsetzen, einschließlich beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, Fructose, Melassen und dergl. Als Stickstoffquellen kann man beliebige, verfügbare Stickstoffverbindungen einsetzen, einschließlich Peptone, Fleischextrakte, Hefeextrakte, Caseinhydrolysate und dergl. Andere Bestandteile einschließlich Salze, wie Phosphate, Carbonate und Sulfate, sowie Salze von Magnesium, Calcium, Kalium, Eisen, Mangan, Zink und dergl. und bestimmte Typen von Aminosäuren oder Vitamine können verwendet werden, falls ihr Einsatz zweckmäßig ist. Bei dem Verfahren ist die Verwendung von Sarcosinoxidase-induzierenden Substanzen, wie Cholin, Sarcosin, Creatin und dergl., welche bei dem herkömmlichen Verfahren der Erzeugung von Sarcosinoxidase durch Sarcosinoxidase erzeugende Mikroorganismen erforderlich waren, nicht nötig.

Die Kultivierungstemperatur kann in einem Bereich variiert werden, in dem die Bakterien wachsen können und Sarcosinoxidase produzieren können. Der bevorzugte Temperaturbereich beträgt 20 bis 42°C für Escherichia coli. Die Kultivierungsdauer kann in einem gewissen Ausmaß in Abhängigkeit von den Kultivierungsbedingungen variiert werden. Grundsätzlich wird die Kultivierung zu einem Zeitpunkt beendet, wenn die Ausbeute an Sarcosinoxidase ein Maximum erreicht. Bei der gewöhnlichen Praxis dauert das etwa 12 bis 48 Stunden. Es ist möglich, den pH dieser Kulturmedia in einem Bereich zu ändern, in dem die Bakterien wachsen und Sarcosinoxidase erzeugen können. Der speziell bevorzugte pH-Bereich ist etwa 6 bis 8.

Sarcosinoxidase kann für die Verwendung in Form der Kulturbrühe mit einem Gehalt der Bakterien aufbewahrt werden. Im allgemeinen wird jedoch die in der Kulturbrühe enthaltene Sarcosinoxidase verwendet, nachdem man die Bakterien durch Filtration, Zentrifugieren oder ähnliche Verfahren abgetrennt hat. Falls Sarcosinoxidase in den Bakterienkörpern enthalten ist, werden die Bakterien zunächst mittels Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt. Die gesammelten Bakterien werden anschließend verdaut, und zwar entweder durch mechanische Mittel oder durch enzymatische Mittel unter Verwendung von Lysozym oder dergl. Zu den verdauten Bakterien wird ein Chelatisierungs­ mittel, wie EDTA und/oder ein geeignetes oberflächenaktives Mittel, sofern erforderlich, gegeben, um Sarcosinoxidase zu solubilisieren. Sarcosinoxidase wird dann als wäßrige Lösung gesammelt.

Die so erhaltenen, Sarcosinoxidase enthaltenden Lösungen werden anschließend durch Eindampfen im Vakuum oder unter Verwendung eines Filters eingeengt und einer Aus­ salzbehandlung mit Ammoniumsulfat, Natriumsulfat oder dergl. oder einer fraktionierten Fällung unter Verwendung eines hydrophilen, organischen Lösungsmittels, wie Methanol, Ethanol, Aceton oder dergl., unterworfen. Das Präzipitat wird in Wasser aufgelöst und die Lösung wird durch eine semipermeable Membran dialysiert, um nieder­ molekulargewichtige Verunreinigungen zu eliminieren. Als alternatives Verfahren kann man das Präzipitat mittels Gelfiltration, Adsorptionschromatographie, Ionenaustausch- Chromatographie oder dergl. unter Verwendung eines Adsorptions­ mittels oder eines Gelfiltrationsmittels, raffinieren. Gereinigte Sarcosinoxidase wird aus einer Sarcosinoxidase enthaltenden Lösung, welche unter Verwendung der verschiedenen Maßnahmen erhalten wurde, durch Verdampfung im Vakuum, Gefriergetrocknung oder dergl. hergestellt.

Die Aktivität der so hergestellten Sarcosinoxidase wird nach dem folgenden Verfahren gemessen.

Zunächst wird eine Reaktionsflüssigkeit der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

ml
0,2 Mol Tris-chlorwasserstoff-Puffer (pH 8,0)
0,5
15 mMol 4-Aminoantipyrin	0,5
0,2% (Gew./Vol.) Phenol	0,5
Peroxidase (0,5 E/ml)	0,5
0,1 Mol Sarcosin-wäßrige Lösung	1,0
Wasser	2,0

In ein Reagenzglas gibt man 0,5 ml der obigen Reaktions­ flüssigkeit. Die Flüssigkeit wird 3 min bei 37°C erhitzt und mit 10 µl einer Lösung mit einem Gehalt an Sarcosinoxidase (SOX) versetzt. Nachdem das Gemisch genau 5 min bei 37°C gehalten wurde, gibt man 2,5 ml Ethanol zu, um die Reaktion zu beenden. Das Gemisch wird dann einer colorimetrischen Analyse bei einer Wellenlänge von 480 nm unterworfen und der erhaltene Wert wird als A genommen. Wenn man die Fähigkeit der Substanz zur Erzeugung von 1 µMol Wasserstoffperoxid/min. als 1 Einheit (E) annimmt, errechnet sich der Wert für die Sarcosinoxidase-Aktivität (SOX-Aktivitätswert: E/ml) aus der folgenden Gleichung:

wobei A₀ den colorimetrischen Wert bezeichnet, der bei 480 nm erhalten wird, wenn die Pufferlösung ohne die Enzym­ lösung verwendet wird.

Die Aktivitäten der anderen Enzyme werden gemäß den folgenden Verfahren bestimmt.

(1) Messung der Catalase-Aktivität

In ein Reagenzglas gibt man 0,5 ml der mit 0,1 Mol Phosphatpuffer (pH 7,0) verdünnten Enzymlösung. Nach Erhitzen der Lösung während 5 min bei 30°C gibt man 0,5 ml 0,4%ige Wasserstoffperoxid-Lösung zu und hält das Ganze genau 5 min bei 30°C. Nach Beendigung der Reaktion durch Zugabe von 2,5 ml 0,1 Mol Perchlorsäurelösung wird das Gemisch einer colorimetrischen Analyse unterworfen. Der erhaltene Wert wird als B bezeichnet. Gesondert werden 0,5 ml der 0,4%igen Wasserstoffperoxidlösung in ein Reagenzglas gefüllt und 5 min bei 30°C erhitzt. Dazu gibt man 2,5 ml 0,1 Mol Perchlorsäurelösung und dann 0,5 ml der mit 0,1 Mol Phosphatpuffer (pH 7,0) verdünnten Enzymlösung. Das Gemisch wird bei 240 nm der colorimetrischen Analyse unterworfen und der erhaltene Wert wird als B₀ bezeichnet. Wenn man die Fähigkeit der Substanz zur Erzeugung von 1 µMol Wasserstoffperoxid/min als 1 Einheit (E) annimmt, errechnet sich der Wert für die Catalase- Aktivität (CL-Aktivitätswert: E/ml) aus der folgenden Gleichung:

(2) Messung der Creatinase-Aktivität

Es werden zunächst drei Lösungen hergestellt:

Erste Lösung
ml
0,2 Mol Phosphatpuffer (pH 7,5)
0,5
50 mMol Creatin-wäßrige Lösung	4,5
Zweite Lösung: @	0,2 Mol Tris-Chlorwasserstoffsäurepuffer (pH 8)	0,5
15 mMol 4-Aminoantipyrin-wäßrige Lösung	0,5
0,2% Phenol	0,5
Peroxidase (50 E/ml)	1,0
Sarcosinoxidase (30 E/ml)	0,5
0,5 mMol p-Chlorquecksilberbenzol	2,0
Dritte Lösung: @	0,5 mMol p-Chlorquecksilberbenzol	0,5

Die erste Lösung wird in ein Reagenzglas gefüllt und 3 min bei 37°C erhitzt. Dazu gibt man 10 µl einer Enzymlösung und hält das Ganze genau 5 min bei 37°C. Zu dem Gemisch gibt man 0,5 ml der dritten Lösung und danach 0,5 ml der zweiten Lösung. Nachdem dieses Gemisch weitere 20 min bei 37°C gehalten wurde, um die Reaktion zu bewirken, werden 1,5 ml destilliertes Wasser zugesetzt und die Lösung wird bei einer Wellenlänge von 500 nm der colorimetrischen Analyse unterworfen. Die Fähigkeit der Substanz zur Erzeugung von 1 µMol Wasserstoffperoxid in 1 min wird als die Aktivität von 1 Einheit (E) angenommen.

(3) Messung der N-Ethylglycinoxidase-Aktivität

Zunächst wird eine Reaktionsflüssigkeit der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

ml
0,2 Mol Tris-Chlorwasserstoff-Puffer (pH 8,0)
0,5
15 mMol 4-Aminoantipyrin	0,5
0,2% (Gew./Vol.) Phenol	0,5
Peroxidase (50 E/ml)	0,5
1,0 Mol N-Ethylglycin-wäßrige Lösung	1,0
Wasser	2,0

In ein Reagenzglas gibt man 0,5 ml der obigen Reaktions­ flüssigkeit. Die Flüssigkeit wird 3 min bei 37°C erhitzt und mit 10 µl einer das Enzym enthaltenden Lösung versetzt. Nachdem man das Gemisch genau 5 min bei 37°C gehalten hat, gibt man 2,5 ml Ethanol zur Beendigung der Reaktion zu. Das Gemisch wird dann der colorimetrischen Analyse bei einer Wellenlänge von 480 nm unterworfen, und der dabei erhaltene Wert wird als A bezeichnet. Die Fähigkeit der Substanz zur Erzeugung von 1 µMol Wasserstoffperoxid/min wird als die Einheit (E) der Aktivität des Enzyms angenommen.

Basierend auf den obigen Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität findet man bei der Sarcosinoxidase der vorliegenden Erfindung eine Catalase-Aktivität von unter 0,05 Einheiten, eine Creatinase-Aktivität von unter 0,0004 Einheiten und eine N-Ethylglycinoxidase-Aktivität von unter 0,03 Einheiten pro Einheit der Aktivität von Sarcosinoxidase. Es wird somit deutlich, daß die Sarcosinoxidase ein Enzym mit einer äußerst hohen Spezifität ist und als Reagens für klinische Diagnoseverfahren brauchbar ist.

Die auf diese Weise hergestellte Sarcosinoxidase besitzt die folgenden physikochemischen Eigenschaften.

• (a) Wirkung: Das Enzym katalysiert eine enzymatische Reaktion, bei der jeweils 1 Mol Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid aus jeweils 1 Mol Sarcosin, Sauerstoff und Wasser gemäß dem folgenden Reaktionsschema erzeugt wird: Sarcosin + O₂ + H₂O → Glycin + Formaldehyd + H₂O₂.
• (b) Substratspezifität: Die Sarcosinoxidase wird in einer Menge von 0,5 E zu 0,5 ml der Reaktionslösung gegeben, die 0,05 ml 0,2 M Tris-Chlorwasserstoffsäure- Puffer (pH 8,0), 0,05 ml 0,2%iges Phenol, 0,05 ml von 0,5 mg/ml Peroxidase, 0,2 ml destilliertes Wasser und 0,20 ml einer Substratlösung der folgenden Verbindung mit 0,5 Mol Konzentration umfaßt. Man läßt die Lösung 5 min bei 37°C reagieren. Anschließend werden 2,5 ml Ethanol zugesetzt, um die Reaktion zu beenden. Die resultierende Lösung wird bei 480 nm einer colorimetrischen Analyse unterzogen. Die Ergebnisse, ausgedrückt als relative Aktivität des jeweiligen Substrats, sind nachstehend angegeben:

  Substrat
  Relative Aktivität (%)
  Sarcosin
  100,0
  Cholin	0
  Serin	0
  Threonin	0
  Alanin	0
  Valin	0
  N-Methylethanolamin	0
  N-Dimethylethanolamin	0

• (c) Optimaler pH: Um den Einfluß des Enzyms auf das 4-Aminoantipyrin-Phenol-Peroxidase-Chromophorsystem zu vermeiden, wird das erzeugte Formaldehyd quantitativ bestimmt durch die Acetyl-Aceton-Methode. Dabei wurde fest­ gestellt, daß der optimale pH-Bereich der Sarcosinoxidase in der Nähe von 8,0 bis 9,5 liegt. Die verwendeten Puffer waren Dimethylglutarsäure-Puffer (pH 4 bis 7), Phosphatpuffer (pH 6 bis 8), Tris-chlorwasserstoffsäure- Puffer (pH 7,5 bis 9), Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 9 bis 10) und Natriumcarbonat-Natriumborat-Puffer (pH 10 bis 11).
• (d) Isoelektrischer Punkt: 4,7 ±0,1 (Elektrophorese unter Verwendung von Träger-Ampholin).
• (e) Molekulargewicht (bestimmt mit der Gelfiltrations­ methode): 40 000 ±4000.
• (f) Thermische Stabilität: 0,5 ml 10 mMol Tris- chlorwasserstoffsäure-Puffer (pH 8,0), enthaltend 20 µg/ml des enzymatischen Proteins, werden bei einer konstanten Temperatur stehengelassen. Dann wird die enzymatische Aktivität der Lösung gegenüber Sarcosin gemessen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren. Man stellt fest, daß die Lösung 100% Aktivität erhalten hat, selbst nach Behandlung bei 40°C.
• (g) Optimale Temperatur: Die enzymatische Aktivität gegenüber Sarcosin wurde bei verschiedenen Temperaturen gemäß der oben beschriebenen Methode zur Bestimmung der Sarcosinoxidase-Aktivität gemessen. Dabei findet man, daß die optimale Temperatur in der Nähe von 50°C liegt.
• (h) pH-Stabilität: Pufferlösungen des Enzyms mit unterschiedlichen pH-Werten werden hergestellt. Die ver­ wendeten Puffer sind Dimethylglutarsäure-Puffer (pH 4 bis 7), Phosphatpuffer (pH 6 bis 8), Tris-chlorwasserstoffsäure- Puffer (pH 7,5 bis 9), Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 9 bis 10), Natriumcarbonat-Natriumborat-Puffer (pH 10 bis 11). Zu 0,1 ml des jeweiligen Puffers gibt man 100 µl der Enzymlösung (die enzymatische Protein­ konzentration beträgt 100 µg/ml) und läßt die Mischung 60 min bei 37°C stehen. Dann setzt man 0,3 ml 1,0 mMol Tris-chlorwasserstoffsäure-Puffer (pH 8,0) zur Einstellung des pH-Wertes zu. 20 µl eines Aliquots dieser Lösung gibt man zu der Reaktionsflüssigkeit, um deren enzymatische Aktivität gegenüber Sarcosin nach der oben beschriebenen Methode zu bestimmen. Dabei stellt man fest, daß in der Nähe von 6,0 bis 10,0 pH-Stabilität vorliegt.

In der vorliegenden Beschreibung werden Aminosäuren, Peptide, Nucleinsäuren und Nucleinsäure-verwandte Verbindungen gemäß den herkömmlichen Standards auf diesem Gebiet abgekürzt. Einige Beispiele der Abkürzungen sind nachstehend angegeben. Ferner beziehen sich alle Bezeichnungen der Aminosäuren auf die L-Isomeren.

DNA
= Desoxyribonucleinsäure
RNA	= Ribonucleinsäure
A	= Adenin
T	= Thymin
G	= Guanin
C	= Cytosin
Ala	= Alanin
Arg	= Arginin
Asn	= Asparagin
Asp	= Aspartat
Cys	= Cystein
Gln	= Glutamin
Glu	= Glutamat
Gly	= Glycin
His	= Histidin
Ile	= Isoleucin
Leu	= Leucin
Lys	= Lysin
Met	= Methionin
Phe	= Phenylalanin
Pro	= Prolin
Ser	= Serin
Thr	= Theronin
Trp	= Tryptophan
Tyr	= Tyrosin
Val	= Valin.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiele Beispiel 1 (Herstellung von Chromosom-DNA)

Chromosom-DNA wird asu Bacillus sp. B-0618 (FERM BP-0750) nach dem folgenden Verfahren hergestellt. Der Stamm wird über Nacht in einem normalen Bouillon-Medium, enthaltend 0,5% Natriumthiosulfat, bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Die kultivierte Brühe wird 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert, um die Bakterien zu sammeln. Diese werden in 5 ml einer Lösung suspendiert, die 10% Saccharose, 50 mMol Tris-chlorwasserstoffsäure (pH 8,0) und 50 mMol EDTA enthält. Zu der Suspension gibt man 1 ml Lysozymlösung (10 mg/ml) und hält die Mischung 15 min bei 37°C. Anschließend erfolgt die Zugabe von 1 ml 10%igem SDS (Natriumdodecylsulfat). Ein gleiches Volumen einer Lösungs­ mittelmischung von Chloroform und Phenol (1 : 1) wird zu der Suspension gegeben und das Gemisch wird gerührt und 3 min bei 10 000 U/min zentrifugiert, um Wasser und Lösungsmittelschichten abzutrennen. Zu der zurückgewonnenen Wasserschicht gibt man vorsichtig das zweifache Volumen Ethanol und rührt das Gemisch langsam mit einem Glasstab, um zu bewirken, daß sich die DNA um den Stab wickelt. Die auf diese Weise abgetrennte DNA wird in 10 ml einer Lösung aufgelöst, die 10 mMol Tris-chlorwasserstoffsäure (ph 8,0) und 1 mMol EDTA enthält (eine derartige Lösung wird im folgenden als "TE" bezeichnet). Diese Lösung wird mit einem gleichen Volumen des Chloroform- Phenol (1 : 1)-Lösungsmittelgemisches behandelt und erneut zentrifugiert, um die Wasserschicht zu isolieren. Zu dieser gibt man das zweifache Volumen Ethanol, und die DNA wird wiederum auf die oben beschriebene Weise abgetrennt. Diese schließlich erhaltene DNA wird in 2 ml TE aufgelöst.

Beispiel 2 (Herstellung von pACYC 184-Plasmid-DNA)

Escherichia coli pM191, welches pACYC184 trägt [J. Bacteriol, 134, 1141 (1981); ATCC 37 033], wird in 1 l BHI-Medium (hergestellt von Difco Co.) unter Schütteln kultiviert. Wenn die Trübung der Brühe den Wert OD₆₆₀ = 1,0 erreicht hat, wird Spectinomycin zugesetzt, so daß eine Endkonzentration der Brühe 300 µg/ml beträgt. Das Schütteln der Brühe bei 37°C wird mindestens 16 h fortgesetzt. Nach Beendigung der Kultivierung wird die Brühe 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert, um Bakterienzellen zu sammeln. Daraus wird die Plasmid-DNA nach der Lysozym- SDS-Methode und der Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Methode [Maniatis et al., Molecular Cloning, 86-94, Cold Spring Harbor (1982)] hergestellt.

Beispiel 3 [Aufbau von Plasmid pOXI101 mit Sarcosinoxidase(SOX)-Gen]

(1) Es wird eine Mischung hergestellt aus 2 µl (etwa 0,5 µg) Bacillus sp. B-0618-chromosomaler DNA, hergestellt in Beispiel 1), 1 µm einer 10fachen Konzentration EcoRI- Verdauungspuffer [500 mMol Tris-chlorwasserstoffsäure (pH 7,5), 70 mMol MgCl₂, 1 Mol NaCl und 70 mMol Mercapto­ ethanol], 1 µm EcoRI (10 Einheiten/µl; hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und 6 µl Wasser. Die DNA wird 1 h bei 37°C verdaut. Gesondert wird Plasmid pACYC 184- DNA (etwa 0,3 µg) mit EcoRI auf ähnliche Weise verdaut. Dazu gibt man 0,6 Einheiten alkalische Phosphase (herge­ stellt von Takara Shuzo Co., Ltd.; im folgenden als "BAP" bezeichnet) und inkubiert das Gemisch 1h bei 65°C. Die beiden Lösungen der EcoRI-verdauten DNAs, die auf diese Weise hergestellt wurden, werden miteinander ver­ mischt und zu dem Gemisch gibt man 0,1 Vol. 3M Natrium­ acetat. Anschließend wird die Lösung mit einem gleichen Volumen einer Chloroform-Phenol-Lösungsmittelmischung be­ handelt und zentrifugiert, um die Wasserschicht zurück­ zugewinnen. Dazu gibt man das zweifache Volumen Ethanol. Die DNA wird durch Zentrifugieren gefällt und im Vakuum getrocknet. Die getrocknete DNA wird in 89 µl Wasser aufgelöst. Dazu gibt man 10 µl der 10fachen Konzentration Ligationspuffer [0,5 Mol Tris-chlorwasserstoffsäure (pH 7,6), 0,1 Mol MgCl₂, 0,1 Mol Dithiothreit, 10 mMol Spermidin, 10 mMol ATP) und 1 µl T4 DNA-Ligase (175 Ein­ heiten/µl; hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und vermischt das Ganze. Das Gemisch wird über Nacht bei 4°C stehengelassen. Diese DNA-Lösung wird mit einer Chloro­ form-Phenol-Mischung behandelt und die DNA wird durch Ethanol ausgefällt, im Vakuum getrocknet und in 10 µl TE aufgelöst.

(2) Escherichia coli DH1 (Stamm Nr. ME8569; zur Ver­ fügung gestellt von National Gene Research Institute) wird in 100 ml BHI-Medium (Brain Heart Infusion, herge­ stellt von Difco Co.) kultiviert, und die Zellen werden in der logarithmischen Wachstumsphase durch Zentrifugie­ ren (10 000 U/min. 2 min) gesammelt. Die Zellen werden in 40 ml einer eiskalten Lösung suspendiert, die 30 mMol Kaliumacetat, 100 mMol RbCl, 10 mMol CaCl₂, 50 mMol MnCl₂ und 15% Glycerin (pH 5,8) enthält. Nach 5minütigem Stehenlassen bei 0°C wird die Suspension zur Entfernung des Überstands zentrifugiert. Die Zellen werden in 4 ml einer eiskalten Lösung suspendiert, die 10 mMol MOPS- Puffer (hergestellt von Dotite Co.), 75 mMol CaCl₂, 10 mMol RbCl und 15% Glycerin (pH 6,5) enthält. Die Sus­ pension wird 15 min bei 0°C stehengelassen, um kompeten­ te Zellen zu erhalten.

(3) Zu 200 µl der obigen Escherichia coli-Suspension gibt man 10 µl der in der obigen Stufe (1) hergestellten DNA-Lösung. Die Mischung wird 30 min bei 0°C stehenge­ lassen und dann mit 1 ml BHI-Medium versetzt. Dieses Ge­ misch wird 90 min bei 37°C gehalten, 100 µl Aliquot der Mischung wird auf einer BHI-Agarplatte mit einem Gehalt an Tetracyclin (15 µg/ml) ausgebreitet und über Nacht bei 37°C kultiviert, um Transformanten zu erzeugen. Die­ se Transformanten werden auf einer SOX-Detektormedium- Platte repliziert (Zusammensetzung: 5 g Pepton, 2 g Fleischextrakt, 5 g Hefeextrakt, 1 g NaCl, 1 g K₂HPO₄, 0,5 g MgSO₄, 500 IE Peroxidase, 0,1 g Dianisidin, 9 g Sarcosin, 15 g Agar, 1 l destilliertes Wasser; pH 7,0), und es erfolgt eine weitere Kultivierung über Nacht bei 37°C.

Peripherien von vier Kolonien unter etwa 6000 Transforman­ ten hatten sich schwarz(charcoal)gefärbt. Einer der vier Stämme wurde als Escherichia coli DH1 pOXI101 bezeichnet. Nach Reinigung wird dieser Stamm in einem BHI-Medium über Nacht bei 37°C kultiviert und Plasmid-DNA wird auf glei­ che Weise wie in Beispiel 2 hergestellt. Das Plasmid, welches das Sarcosinoxidase-Gen und das pACYC 184-Gen enthält, wird als pOXI101 bezeichnet.

Beispiel 4 [Kartierung von pOXI101 und Subklonung]

Ein pOXI101-DNA-Spaltungsplan wird hergestellt unter Verwendung der Restriktionsendonucleasen ClaI, HpaI, SalI, SmaI und XhoI (alle von Takara Shuzo Co., Ltd.). Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt. Ein EcoRI-ClaI 5,3 kb-Fragment, enthaltend zwei XhoI-Stellen, das aus dem pOXI101 erhalten wurde, und ein EcoRI-ClaI 4,3 kb- Fragment, das aus pBR 322 erhalten wurde, werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(1) hergestellt. Es wur­ de eine Subklonung durchgeführt einschließlich Kohäsi­ on, Esch erichia coli DH1-Transformation und Screening nach Transformation, um einen Sarcosinoxidase erzeugen­ den Klon zu erhalten. Der Klon wird als Escherichia coli DHI pOXI103 (FERM P-9494) bezeichnet. Eine Plasmid-DNA wird aus diesem Stamm auf gleiche Weise wie in Beispiel 2 hergestellt und mit pOXI103 bezeichnet. Der Spal­ tungsplan wird an diesem Plasmid unter Verwendung der Re­ striktionsendonucleasen ClaI, HpaI, SalI, SmaI und XhoI (alle von Takara Shuzo Co., Ltd.) hergestellt. Dieser Plan ist in Fig. 2 dargestellt. Man stellt fest, daß gemäß diesem Plan ein Abschnitt von EcoRI durch die Nach barschaft von XhoI, enthaltend eine SmaI-Stelle, fehlt. Dieser Escherichia coli DHI pOXI103 wird über Nacht in einem BHI-Medium bei 37°C kultiviert und die Sarcosin­ oxidase-Produktivität wird gemäß der oben erwähnten Sarcosinoxidase-Aktivität-Meßverfahren bestimmt. Man stellt fest, daß der Stamm 2 E/ml Sarcosinoxidase er­ zeugt. Die Basensequenz der DNA mit einem Gehalt an Sar­ cosinoxidase wird gemäß der Didesoxy-Methode bestimmt un­ ter Verwendung des M13-Phagen [Science, 214, 1205-1210 (1981)]. Fig. 3 zeigt die Basensequenz des Sarcosinoxi­ dase-Gens und die Aminosäuresequenz der Sarcosinoxidase.

Beispiel 5 [Herstellung der Sarcosinoxidase]

Escherichia coli DHI pOXI103 wird 18 h in 20 ml BHI-Me­ dium unter Belüftung/Rühren bei 37°C unter Verwendung eines 30 l Tankfermenters kultiviert. Die kultivierten Bakterien werden durch 10minütiges Zentrifugieren bei 5000 U/min gesammelt. Die Sarcosinoxidase-Produktivität erreicht 4,6 E/ml. Die Bakterien werden mit 2 l physio­ logischer Salzlösung gewaschen und in 2 l 10 mMol Phos­ phatpuffer (pH 7,5) suspendiert. Zu der so hergestellten Suspension gibt man Lysozymchlorid und EDTA-2Na mit ei­ ner Endkonzentration von 0,1% bzw. 2 mMol. Nach 60minü­ tiger Inkubation bei 37°C unter Rühren wird das Gemisch 10 min bei 15 000 U/min zentrifugiert und 1,8 l des re­ sultierenden Überstands werden gesammelt.

Zu dem Überstand gibt man 1,8 l gesättigte Ammoniumsul­ fatlösung, um ein Präzipitat zu bilden. Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren bei 1200 U/min während 10 min gesammelt, in 300 ml 10 mMol Phosphatpuffer (pH 7,5) aufgelöst und dann auf eine Sephadex G-25(Warenbezeich­ nung)-Säule gegeben, die mit 10 mMol Phosphatpuffer (pH 7,5) äquilibriert wurde. Es wird eine Entsalzung durchgeführt. Anschließend wird die entsalzte Lösung einer DEAE-Cephallose CL-6B-Ionenaustauschchromatographie unterworfen, wobei die aktive Fraktion gesammelt wird. Diese Fraktion wird entsalzt und gefriergetrocknet. Man erhält 0,807 g eines pulverförmigen Produkts. Die Aus­ beute erreicht 36%, wobei die spezifische Aktivität des Produkts 41 E/mg beträgt.

Das Molekulargewicht der Sarcosinoxidase, die hergestellt wurde, wird durch die Gelfiltrationsmethode bestimmt. Da­ bei findet man ein Molekulargewicht von etwa 40 000. Die­ ses Molekulargewicht ist fast das gleiche wie das aus der Aminosäuresequenz der Substanz berechnete.

Mit der vorliegenden Erfindung wurde das Sarcosinoxidase- Gen aufgeklärt sowie die Basen- und die Aminosäure­ sequenz der Sarcoinoxidase. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein effizientes Verfahren zur Her­ stellung von Sarcosinoxidase zur Verfügung, und zwar unter Verwendung des Sarcosinoxidase-Gens und basierend auf verschiedenen Genetic Engineering Techniken.

Claims (14)

1. Eine Polydesoxyribonucleinsäure mit einer Basensequenz, welche eine Aminosäuresequenz eines Polypeptids codiert, welches eine Sarcosinoxidase darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß die Sarcosinoxidase die folgenden physikochemischen Eigenschaften aufweist:

• (a) Wirkung: katalysiert eine enzymatische Reaktion, bei der jeweils 1 Mol Glycin, Formaldehyd und Wasser­ stoffperoxid aus jeweils 1 Mol Sarcosin, Sauerstoff und Wasser gemäß dem folgenden Reaktionsschema gebildet wird: Sarcosin + O₂ + H₂O → Glycin + Formaldehyd + H₂O;
• (b) Substratspezifität: zeigt eine Substratspezifität gegenüber Sarcosin;
• (c) optimaler pH: 8,0 bis 9,5;
• (d) isoelektrischer Punkt: 4,7 ±0,1;
• (e) Molekulargewicht (bestimmt nach der Gelfiltrations- Methode): 40 000 ±4000;
• (f) thermische Stabilität: stabil nach Behandlung bei 40°C während 10 Minuten.

2. Polydesoxyribonucleinsäure gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polydesoxyribonucleinsäure eine Basensequenz umfaßt, welche für eine Polypeptid- Aminosäuresequenz der folgenden Formel, beginnend vom N-Ende, codiert: wobei A für einen Aminosäurerest oder ein Wasserstoffatom steht und B einen Aminosäurerest oder -OH bedeutet.

3. Polydesoxyribonucleinsäure gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polydesoxyribonucleinsäure eine Basensequenz der folgenden Formel, beginnend vom 5′-Ende, aufweist: wobei X für ein Codon mit Ausnahme von TAA, TAG oder TGA oder für ein Wasserstoffatom steht und Y ein Codon oder ein Wasserstoffatom bedeutet.

4. Ein Transformant, umfassend eine Polydesoxyribonucleinsäure, die bezüglich des Wirts-Mikroorganismus fremd ist und die in Anspruch 1 angegebene Definition hat.

5. Transformant gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polydesoxyribonucleinsäure die in Anspruch 2 definierte Polydesoxyribonucleinsäure ist.

6. Transformant gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Polydesoxyribonucleinsäure die in Anspruch 3 definierte Polydesoxyribonucleinsäure ist.

7. Transformant gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirts-Mikroorganismus ein Mikroorganismus ist, der zu Escherichia coli gehört.

8. Transformant gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Transformant Escherichia coli DHI pOXI103 ist (hinterlegt bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology; Hinter­ legungsnr. 1828, FERM BP-1828).

9. Eine Sarcosinoxidase, die eine Catalase-Aktivität von unter 0,05 Einheiten, eine Creatinase-Aktivität von unter 0,0004 Einheiten und eine N-Ethylglycinoxidase- Aktivität von unter 0,03 Einheiten pro Einheit Aktivität der Sarcosinoxidase aufweist.

10. Polypeptid mit einer Basensequenz, welche für eine Aminosäuresequenz der folgenden Formel, beginnend vom N-Ende, codiert: wobei A für einen Aminosäurerest oder ein Wasserstoffatom steht und B einen Aminosäurerest oder -OH bedeutet.

11. Verfahren zur Herstellung einer Sarcosinoxidase, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:
Einführung einer rekombinanten DNA, welche erzeugt wurde durch Einsetzen der in Anspruch 1 definierten Poly­ desoxyribonucleinsäure in einen Expressionsvektor, in einen Wirts-Mikroorganismus, um so einen Transformanten zu erzeugen,
Kultivierung des Transformanten, um zu bewirken, daß der Transformant die genetische Information der Polydesoxyribonucleinsäure weitergibt, und
Sammlung des Polypeptids, welches einen Bestandteil der Sarcosinoxidase darstellt;
wobei die Sarcosinoxidase folgende physikochemische Eigenschaften aufweist:

• (a) Wirkung: katalysiert eine enzymatische Reaktion, bei der jeweils 1 Mol Glycin, Formaldehyd und Wasser­ stoffperoxid aus jeweils 1 Mol Sarcosin, Sauerstoff und Wasser gemäß dem folgenden Reaktionsschema gebildet wird: Sarcosin + O₂ + H₂O → Glycin + Formaldehyd + H₂O₂;
• (b) Substratspezifität: zeigt eine Substratspezifität gegenüber Sarcosin;
• (c) optimaler pH: 8,0 bis 9,5;
• (d) isoelektrischer Punkt: 4,7 ±0,1;
• (e) Molekulargewicht (bestimmt nach der Gelfiltrations- Methode): 40 000 ±4000;
• (f) thermische Stabilität: stabil nach Behandlung bei 40°C während 10 Minuten.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Polydesoxyribonucleinsäure die in Anspruch 2 definierte Polydesoxyribonucleinsäure ist.

13. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polydesoxyribonucleinsäure die in Anspruch 3 definierte Polydesoxyribonucleinsäure ist.

14. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei der Tranformant Escherichia coli DHI pOXI103 ist (hinterlegt bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology; Hinterlegungsnr. 1828, FERM BP-1828).