JPS5816876B2 - コウガクカツセイアミノサンルイノセイゾウホウ - Google Patents

コウガクカツセイアミノサンルイノセイゾウホウ

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JPS5816876B2
JPS5816876B2 JP5185175A JP5185175A JPS5816876B2 JP S5816876 B2 JPS5816876 B2 JP S5816876B2 JP 5185175 A JP5185175 A JP 5185175A JP 5185175 A JP5185175 A JP 5185175A JP S5816876 B2 JPS5816876 B2 JP S5816876B2
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河原賢治
五十嵐政二
高橋健
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Takeda Chemical Industries Ltd
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は光学活性アミノ酸およびその光学対掌エステル
類の製造法に関する。
光学的に活性なアミノ酸およびそれらのエステルは光学
的特異性がその活性に関して重要である生理学的に活性
な化合物の合成に有用である。
特に合成セファロスポリン、合成ペニシリン系に属する
重要な抗生物質はそのような酸から誘導されたアシルア
ミド側鎖を有している。
すなわちD−α一置換−α−アミノ酢酸およびその誘導
体はセファレキシン、セファログリシン、アンピシリン
、アモキシシリンなどの合成に有利に使用することがで
きる。
従来、酵素の光学特異的(はとんどが5体特異的)加水
分解作用を利用して光学的に活性なアミノ酸を調製する
方法としては、例えば豚の腎臓から抽出した光学特異的
(5体特異的)加水分解作用を有するアシラーゼをラセ
ミN−クロロアセチル(またはアセチル)−α・−アミ
ノ酸に作用させて、対応するし−およびD−α−アミノ
酸を取得する方法などが知られている。
このアシラーゼを利用する光学分割法に関しては、さら
に同様の活性が微生物(例えばペニシリウム属、アスペ
ルギルス属など)にも存在することが知られているが、
比較的高価な試薬を用いてアミノ酸のN−アシル化を行
なう必要がある上、0体アミノ酸を取得せんとする場合
には加水分解されずに残る0体のN−アシルアミノ酸の
N−アシル基を除去する操作が必要である。
このような煩雑且つ高価な方法は工業的規模での実施に
は極めて不利と云わざるを得ない。
その他の例として例えば植物から抽出したパパインや動
物臓器から抽出したキモl−IJプシン、トリプシン、
カルボキシペプチダーゼなどの種々の蛋白質加水分解酵
素(プロテアーゼ)の有する光学特異的アミド水解活性
やエステル氷解活性を利用する光学分割法が知られてい
るが、いずれも適用アミノ酸が天然アミノ酸に限定され
、しかも動植物酵素を利用するためその入手が限られる
ことなどから各種のアミノ酸の工業的生産には適さない
等の欠点を有している。
本発明者らは上に述べた既知の酵素的光学分割法の有す
る欠点を克服すべく鋭意研究の結果、既に本発明者らの
一部が自然界(微生物界)にはじめてその存在を明らか
にし、「α−アミノ酸エステルヒドロラーゼ」と命名報
告〔バイオケミカル・ジャーナル137巻、497−5
03頁(1974年)〕シた新規なエステラーゼを生産
する微生物を利用することにより、光学活性アミノ酸お
よびその光学対掌エステル類をきわめて容易に得ること
に成功し、さらに広く生産微生物を探索して、ミコプラ
ナ属、プロタミノバクタ−属、アセトバクター属、シュ
ードモナス属、アエロモナス属、キサントモナス属およ
びバチルス属に属する微生物が上記の目的のために有利
に使用し得ることを見出し、ここに本発明を完成した。
すなわち本発明は、ミコプラナ属、プロタミノバクタ−
属、アセトバクター属、シュードモナス属、アエロモナ
ス属、キサントモナス属またはバチルス属に属し一般式 〔式中、Rは置換基を有してもよい飽和または不飽和の
六員環炭化水素残基を示し、R′はアルキル基またはア
ラルキル基を示す〕で表わされるラセミアミノ酸エステ
ル類を対応する光学活性アミノ酸に加水分解し得る微生
物の培養物またはその処理物を、ラセミアミノ酸エステ
ル類(I)に接触させることを特徴とする対応する光学
活性アミノ酸および(または)その光学対掌エステル類
の製造法である。
本発明の機構をさらに詳しく説明すれば、上記の微生物
の培養物またはその処理物をラセミアミノ酸エステル類
(I)に接触させることにより、該微生物の産生ずる光
学特異的エステル加水分解酵素(エステラーゼ)が該エ
ステルの一方の光学活性体を特異的に加水分解し分離の
容易な該光学活性アミノ酸類とその光学対掌エステル類
との混合物を得るものである。
本発明において使用される光学特異的エステラーゼを生
産する微生物としては、菌株保存センターに保存されて
いるタイプ力ルチュアの中から選ぶこともできるし、自
然界たとえば土壌、下水、海水、動植物体、空気中など
から分離することもできる。
以下に本発明において有利に使用されるタイプカルチュ
アの微生物株の数例を示すと、アセトバクター・バスツ
ーリアヌス(Ace tobac terPasteu
rianus) IFO3223、アセトバクター・ク
ービダンス(Acetobacter turbid
ans)IFO3225,シュードモナス・メラノゲナ
ム(Pseudomonas melanogenum
) IFO12020゜シュードモナス・マルトフイリ
ア(Pseudomonasmaltophilia)
IFO12690、アエロモナス・ヒドロラーゼ(A
eromonas hydrophila)IFo
3820、キサントモナス・シトリ(Xantho−m
onas citri) IFO3829、キサントモ
ナス・オリゼ(Xanthomonas oryzac
)IFO3995、バチルス・ズブチリス・パル・アテ
リムス(Ba−cillus 5ubtilis va
r aterrimus) IFO3214、バチルス
・ズブチリス(Bacillussubtillis)
IAM 1260、バチルス・プレビス・(Baci
llus brevis)IFo 12374などが
挙げられる。
また自然界から分離された微生物の例を示すと、ミコプ
ラナ・バラータ(Mycoplanabullata)
FERM−P、A:870 [ATCC21779
](特開昭47−25388)、プロタミノバクタ−・
アルボフラブス(Protamino−bacter
alboflavus)FERM−P A868CAT
CC21755)(特開昭47−25388)、ササン
トモナス・スピーシーズ(Xanthomonas s
p、)B198−I FERM−P扁2948 [
ATCC21764、lなどが挙げられる。
キサントモナス。スピーシーズ(Xanthomona
s sp、) B198−IFERM−P A2948
(ATCC21764)の菌学的性質は以下に列挙す
る通りである。
酸素要求性:好気性。
ダラム染色性:陰性。形と大きさ:短桿菌(0,8〜1
.0.Xl、5〜2.0ミクロン)。
運動性:あり(極単毛を有する)。
寒天培地上集落の特徴二円形(全綴)、光沢性、非拡散
性黄色色素を産生ずる。
寒天斜面上の生育の特徴:糸状、光沢性、明黄色を呈す
液体培地中での生育の特徴:厚膜状菌膜を形成し、わず
かに濁る程度に生育する。
ゲラチンの液化:除々におこる。リドマスミルク:はと
んど生育せず、リドマスは変化しない。
バレイショ斜面上の生育:光沢性、明黄色を呈す。
カゼインの分解:陰性。デンプンの分解:陽性。
セルロースの分解:陰性。硝酸塩環元性:陰性。
インドール生成:陰性。糖の資化性ニゲルコース、ショ
糖、乳糖を資化し弱酸性を呈するが、ガスの発生は認め
られない。
カタラーゼ活性:陽性。
生育温度:5−40℃(至適温度:24−27℃)。
これらの菌学的諸性質をもとに、バーシーズ・マニュア
ル・オブ・デイターミネイテブ・バクテリオロジー(B
ergey’s Manual of Deter −
minative Bacteriology)第7版
(1957年)に従って該菌株をキサントモナス・スピ
ーシーズ(Xanthomonas sp、)と固定
した。
これらの微生物の光学特異的エステラーゼを用いて所望
の光学活性アミノ酸およびそのエステル類を製造するた
めには必ずしも該エステラーゼを単離する必要はなく、
通常まずこれらの微生物を培養して得られる培養物また
はその処理物とラセミアミノ酸エステル類(I)とを適
当な条件下で接触させればよい。
培養物を得るための培養方法としては通気撹拌培養、し
んとう培養、静置培養のいずれも利用できるが、通常好
気的培養が望ましい。
培地組成としては通常使用される天然物の一種または二
種以上の組合せに必要に応じて糖類、有機酸類、ノルマ
ルパラフィンなどの炭化水素化合物や、アミノ態窒素、
硝酸態窒素を含む各種無機あるいは有機含窒素化合物や
、金属塩類等を適宜加え、pHを6〜8に調整して使用
する。
培養温度は20〜40℃が適しており特に24−37℃
が望ましい。
培養時間は菌株の種類や培養条件などによって変るが、
エステラーゼ活性の最大になる時点に培養を。
終了するのがよく、通常8〜30時間が適当である。
こうして得られた微生物の培養物またはその処理物が光
学特異的エステル加水分解反応に使用されるが、ここで
いう培養物の処理物とは、培養物1に適当な処理を加え
てアミノ酸および(または)その光学対掌エステル類の
製造に有利な形にしたすべてのものを指し、例えば該活
性が菌体内に存在する場合は、■培養物から分取洗滌さ
れた菌体、■菌体から既知の方法を適用して得られる無
細胞抽出液、■無細胞抽出液から既知の方法で得られる
部分精製あるいは精製されたエステラーゼ標品、■物理
的あるいは化学的手段によって水不溶性高分子物質に結
合あるいは包括されたエステラーゼ標品などを指し、ま
た該活性が菌体外に存在する場合は、■培養物から除菌
後得られる上澄液、■上澄液に既知の酵素精製法を適用
して得られる部分精製または精製されたエステラーゼ標
品、■物理的あるいは化学的手段によって水不溶性高分
子物質に結合あるいは包括されたエステラーゼ標品など
を指す。
これらの微生物の培養物またはその処理物をラセミアミ
ノ酸エステル類(I)に作用させる反応は通常水性溶媒
中で行なわれるが、有機溶媒を添加してもよい。
反応液のpHは4〜9、特に5〜8に調整するのが望ま
しい。
エステラーゼ標品が水に可溶性の場合、上記光学特異的
エステル加水分解反応は溶液中で行なわれるが、それら
が水に不溶性の場合は上記反応は回分法あるいはカラム
法の形で実施される。
これらの反応においては、エステル加水分解反応の進行
に伴なって遊離するカルボキシル基のために反応液のp
Hが低下するが、これは水酸化ナトリウムなどのアルカ
リ溶液を少しずつ滴下するか緩衝液を用いることによっ
て防止される。
反応時間は基質濃度、ニス・チル加水分解活性の強さ、
反応温度などにより決定されるが、通常0.5〜24時
間である。
実際には反応液のpH低下が認められなくなったとき、
即ちカルボキシル基の遊離はもはや認められなくなった
ときか、あるいは常法に従い反応液の一部をとり、たと
えば薄層クロマトグラフィーによりアミノ酸エステルと
遊離のアミノ酸の存在比が50 : 50になったと認
められたときをもって反応を終了する。
反応温度は0−50℃の間で選ばれる。
基質濃度は主としてその溶解度とエステラーゼ活性の強
さとの関係で選ばれるが、通常0.1−10%の範囲で
ある。
一般式(1)中、Rで示される飽和または不飽和の六員
環炭化水素残基としては、フェニル、シクロヘキシル、
シクロへキセニル(例、1−シクロへキセニル、2−シ
クロへキセニル、3−シクロへキセニル)、シクロへキ
サジェニル(例、1゜3−シクロへキサジェニル、1,
4−シクロヘキサジエニル、1,5−シクロ・\キサジ
ェニル、2゜5−シクロへキサジェニル)などが挙げら
れる。
またこれらの環状基が有し得る置換基としては、例えば
−OH,−8H,−Co2H,−8O3H,−NH2N
O2、Cl t Br 、 CHs 、 OC2
H5などが挙げられる。
なおこれらの原料となるアミノ酸類には新規なものもあ
るが、それらは例えば対応するR基を有するアルデヒド
からストレッカー反応によって合成し得る。
R′で示されるアルキル基としては、好ましくは炭素数
6以下の低級アルキル基、例えばメチル、エチル、プロ
ピル、ブチルなどが挙げられ、アラルキル基としては、
例えばベンジルなどが挙げられる。
R′で示されるこれらアルキルまたはアラルキル基の導
入は、通常のエステル化反応により行なわれる。
即ち塩酸または硫酸などの鉱酸あるいはチオニルクロラ
イドなどを含む所望のアルキルまたはアラルキルアルコ
ール中に所望のアミノ酸類を混じ撹拌するだけで極めて
高収率に達成される。
エステル化反応終了後、所望のアミノ酸エステル類(I
)は使用したアルコールを溜去するだけで、例えば塩酸
塩などの塩として高収率で取得し得る。
本発明において使用される微生物がエステル加水分解反
応において示す光学特異性にはD休符選的な場合もまた
L休符異的な場合もある。
また、同一微生物でも使用するアミノ酸エステル類(I
)によりその光学特異性が逆転することもある。
従って目的に応じて任意の微生物またはその処理物と任
意のラセミアミノ酸エステル類(1)とを組み合せるこ
とによって、所望の光学活性アミノ酸類および(または
)その光学対掌エステル類を得ることができる。
特に5体アミノ酸エステル類を特異的に加水分解し得る
微生物を、ラセミアミノ酸エステル類(1)に作用させ
た場合、0体アミノ酸エステル類を反応液中に残すので
、例えばD−α一置換−α−アミノ酸エステル類を原料
として使用するセファロスポリン類の微生物合成法〔ジ
ャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエテ
ィー94巻、4035〜4037頁(1972年)〕に
おいて該り体エステル類を遊離アミノ酸に戻すことなく
そのまま使用し得るために極めて有利である。
こうしてラセミアミノ酸エステル類(I)に上述の光学
特異的エステラーゼを作用させることによっていずれか
一方の光学活性を有する。
即ち0体またはL体のアミノ酸エステル類とその逆の光
学活性を有する、即ちL体または0体のアミノ酸類との
混合物が得られるが、これらのそれぞれ相反する光学活
性体は、それらの化学的性質が極めて相異なるため既知
の方法、例えば溶媒抽出法やクロマトグラフィー法など
によって極めて容易に単一の光学活性体としてそれぞれ
分離・精製される。
そのようにして得られる所望の光学活性体とは逆のもう
一方の光学活性体は、アミノ酸エステルの場合もあり得
るしあるいはアミノ酸の場合もあり得るが、いずれの場
合にも既知の任意の方法を適用することによって、例え
ば水に溶解後加熱することによって容易にラセミ化する
から再び上述の反応の原料として使用することができる
以上述べてきた本発明は、たとえば ■ 微生物を利用する方法なので動植物酵素を利用する
方法に比較して工業的生産に適している。
■ 原料として使用するエステル類は容易かつ安価に製
造できるので、例えばN−アシルアミノ酸類を原料とす
るアシラーゼ法と比較して極めて有利である。
■ 種々の合成原料として有用な非天然アミノ酸類にも
適用することができる。
■ 合成ペニシリン、合成セファロスポリン類の原料と
して重要なり体のアミノ酸またはそのエステル類を容易
に製造することができる。
などの利点を有する。
以下参考例および実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。
参考例および実施例中で使用される二種類の培地組成を
次に記す。
〔A培地〕
肉エキス 1.0% ペプトン 1.0% 食塩 0.5% 水道水 pH7,0 〔B培地〕 す゛ルタミン酸モノナトリウム 0.2%酵母エキス
0.2% 、ブト7 o、5%リン酸二
カリウム 0.2% 塩化マグネシウム6水塩 0.1% 硫酸第一鉄7水塩 0.01% ショ糖 2.0% 水道水 pH7、0 参考例 1 キサントモナス・スピーシーズ B198−IFERM
P A2948の種培養液1.5tを0.005%の
アンチフロスF102(第−製薬工業製)を含む300
を醗酵槽中のB培地150tに接種し、通気量50%、
撹拌170 r、 p、m、、温度28℃の条件下に2
4時間通気撹拌培養した。
培養終了後、シャープレス遠心機を用いて培養液から湿
菌体を分離した(収量85にり)。
このようにして得られた湿菌体の4.5kgを104の
0,1Mトリス−塩酸緩衝液(pH8,0)に再懸濁し
、E DTA−Na256 fと卵白リゾチーム1.5
S’を加えて5℃に16時間放置し溶菌した。
この溶菌液に硫酸マグネシウム・7水塩372とデオキ
シリボヌクレアーゼI(生膜)7.5■を加えて5℃で
撹拌しながら24時間放置したあと、酢酸カルシウム2
64グを1tの水に溶解したものと、リン札酸二カリウ
ム261グを500m1の水に溶解したものをこの順に
加え、溶液中でリン酸カルシウムゲルを形成させその遠
心上清を得た(リン酸カルシウム処理粗抽出液)。
この粗抽出液を100tの水に15時間、続いて100
tのG、01Mリン酸緩衝液(pH6,0)に21時間
透析したあと、予め0.01Mリン酸緩衝液(pH6y
O)で平衡化したCM−セルロースカラム(床容積2.
5 t )に吸着させ、0.01Mリン酸緩衝液(pH
6,0)3tでカラムを洗滌後、0.15M塩化カリウ
ムを含む0.01Mリン酸緩衝液(pH6,0)5tで
溶出した。
フラクションコレクターを使用して分画した活性画分(
CM−セルロースカラム溶出画分)に硫酸アンモニウム
670f(70%飽和)を加えて生じる沈澱物を遠心分
離法で集め、少量の0.01MIJン酸緩衝液(pH6
、’O)に溶かしたあと、80tの水に対して40時間
透析した。
この透析内液を凍結乾燥し、1.86fの粗エステラー
ゼ乾燥粉末を得た。
表1に部分精製の結果をまとめて示す。※酵素単位:p
H6,0,27℃の条件下で1分間アタリフェニルグリ
シンメチルエステル1マイクロモルを加水分解する酵素
量を1単位と定める。
参考例 2 L−2−p−ヒドロキシフェニルグリシンの5%水溶液
に塩酸あるいは水酸化ナトIJウムを加えてpH2から
10の間に修正したあと、120℃に1時間または2時
間加熱したところ表2に示すようにpt(6,1以上で
は10′θ%う′セミ化した。
実施例 1 ミコプラナ・バラータFERM PA870、プロタ
ミノバクタ−・アルボフラブスFERM−PA868、
アセトバクター・バスツーリアヌスIF03223、ア
セトバクター・タービダンスIFO3225、シュード
モナス・メラノゲヌムIFO12020、シュードモナ
ス・マルトフイリアIFO12690、アエロモナス・
ヒドロフイラ IFo 3820、バチルス・ズブチリ
ス・パル・アテリムス IFO3214、バチルス・ズ
ブチリス I入M1260、バチルス・プレビスIFO
12374の3日斜面培養1白金耳を200m1容三角
フラスコの中のA培地50m1に接種し、28℃で20
時間種培養したものを、2を容坂ロフラスコ中のA培地
500m1に接種し28℃で20時間培養した後遠心分
離して菌体を集め、蛤0.05Mリン酸緩衝液(pH6
,0)200mlで1回洗滌した後同緩衝液50m1に
懸濁した。
得られた懸濁液50m1に、1グのDL−2−P−1:
:ドロキシフェニルグリシンメチルエステル塩酸塩を含
む0.2Mリン酸緩衝液(pH6,0)507XJを加
え、30℃でエステルと遊離のアミノ酸との存在比が約
50 : 50になる迄反応させた。
反応液を遠心分離により除菌し上清液のpHを7.5に
修正(水酸化ナトリウム溶液)後、D−2−p−ヒドロ
キシフェニルグリシンを等容のエーテルで3回抽出し、
エーテル層を無水硫酸すI−IJウムで脱水した後減圧
下に濃縮乾固し、た。
濃縮残渣に少量の塩酸飽和メタノールを加え、さらに微
量のエーテルを添加して5℃に暫時放置して析出するD
−2−p−ヒドロキシフェニルグリシンメチルエステル
塩酸塩結晶を戸数した。
その結果を表3に示す。実施例 2 キサントモナス・スピーシーズ B198−IFERM
P A2943、キサントモナス・シトリ IF
O3829、キサントモナス・オリゼ IFO3995
の3日斜面培養1白金耳を200m1容三角フラスコ中
のB培地50m1に接種し28℃で20時間種培養した
ものを、2を容坂ロフラスコ中のB培地5007721
に接種し28℃で20時間しんとう培養した後遠心分離
で菌体を集め、0.05Mリン酸緩衝液(pH6,0)
200721で1回洗滌した後同緩衝液50m1に懸濁
した。
懸濁液501111に1fのDL−2−p−ヒドロキシ
フェニルグリシンメチルエステル塩酸塩ヲ含tr 0.
2Mリン酸緩衝液(pH6,0) 5 omzを加えて
30℃で反応させた。
薄層クロマトグラフィー法を用いてエステルと遊離のア
ミノ酸との存在比が約50:50になったことを確認し
た後、遠心分離により除菌しその上清のpHを7.5に
修正(水酸化ナトリウム溶液)し等容の酢酸エチルで3
回抽出した。
酢酸エチル部分を無水硫酸ナトリウムで脱水した後減圧
下に濃縮乾固し、濃縮残渣に少量の塩酸飽和メタノール
を加えさらに微量のエーテルヲ添加してD−2−p−ヒ
ドロキシフェニルグリシンメチルエステル塩酸塩結晶を
析出させ戸数した。
その結果を表4に示す。実施例 3 バチルス・ズブチリス・パル・アテリムスIFO321
4をA培地を用いて28℃で20時間しんとう培養した
培養液5mlにD−2−フェニルグリシンまたはL−2
−フェニルグリシンの各種エステル誘導体を終濃度5.
0 mli/1111になるように添加;し、28℃で
24時間振盪しながら反応した。
反応後、反応液中に残存するD−またはL−フェニルグ
リシンエステル濃度をシリカゲル薄層クロマトグラフィ
ー(展開溶媒、n−ブタノール:酢酸:水−4:1:5
)法により定量した。
その結果を表5に示す。
実施例 4 キサントモナス・シトリ IFO3829をB培地を用
いて28℃で24時間しんとう培養した培養液4000
m1を遠心分離して菌体を集め、蒸留水4000772
1で1回洗滌した後5oomgの蒸留水に再懸濁したも
のに、2%DL−2−p−ヒドロキシフェニルグリシン
メチルエステル塩酸塩水溶液500m1を加え、25℃
、pH6,0に保ちながら90分間反応させた。
反応液を遠心分離により除菌しその上清のpHを7.2
に修正し酢酸エチル各1tで3回抽出後、酢酸エチル層
を脱水、濃縮乾固し、3.25fのD−2−p−ヒドロ
キシフェニルグリシンメチルエステル結晶が得うレタ5 (収率74%)。
[α] −128° (C0,5゜O,5N−HC
I) 実施例 5 キサントモナス・シトリ IFO3829をB培地を用
いて28℃で24時間しんとう培養した培養液500m
lを遠心分離して菌体を集め、蒸留水500m1で1回
洗滌した後5007721の蒸留水に再懸濁したものに
、5vのDL−2−フェニルグリシンメヂルエステル塩
酸塩を加え撹拌しなから23℃で1時間保温した。
反応中はpHスタットを用いてpH6,0に保った。
(IN−水酸化ナトリウム)。
反応終了後反応液を遠心分離して得られる上清のpHを
8.0に修正しエーテル各500グで5回抽出し、抽出
液を無水硫酸すl−IJウムにより脱水してエーテルを
溜去した。
残渣に塩酸飽和メタノール507112と微量のエーテ
ルとを加えて5℃に16時間放置し析出するL−2−フ
ェニルグリシンメチルエステル塩酸塩結晶を戸数した(
収量2.01、収率80%)。
〔α、125+116゜(C0,5,0,IN−HCI
) D実施例 6 バルチス・プレビス IFO12374をA培地を用い
て28℃で24時間しんとう培養した培養液20007
72A!を遠心分離して菌体を集め、蒸留水iooom
gで1回洗滌した後10100Oの蒸留水に再懸濁した
ものに、10グのDL−2−(1′−シクロへキセニル
)グリシンメチルエステル塩酸塩を加え、撹拌しながら
30℃、I)H7,0に保ち10時間反応させた。
反応後遠心分離により除菌しその上清のpHを8.0に
修正し、エーテル各1.3tで5回抽出しエーテル層を
無水硫酸ナトリウムにより脱水後エーテルを溜去した。
残渣の油状物に塩酸飽和メタノールを少量加えて溶解し
たあと極く少量のエーテルを添加冷却し析出するD−2
−(1’−シクロ・\キセニル)グリシンメチルエステ
ル塩酸塩結晶を戸数した(収量3.6g、収率72%)
〔α)’、’−113°(C0,5゜0、IN−HCI
) 実施例 7 バチルス・ズブチリス IAM 1260をA培地を
用いて28℃で24時間しんとう培養した培養液200
0772A’を遠心分離して菌体を集め、200077
21の蒸留水で1回洗滌した後20007721の蒸留
水に再懸濁したものに、10vのDL−2−フェニルグ
リシンエチルエステル塩酸塩ヲ含ム0、1 M IJ
7酸緩衝液(pH7,0) 2000mlを加えて撹拌
しながら24時間反応させた。
反応液を遠心分離しその上清のpHを8.0に修正した
あと酢酸エチル各2tで3回抽出し、酢酸エチル層を集
め、酢酸エチルを減圧下に溜去した。
残渣に少量の塩酸飽和エタノールを加えて溶解し極少量
のエーテルを加え、5℃に一夜放置するとD−2−フェ
ニルグリシンエチルエステル塩酸塩結晶が析出した。
収量3.5 f (収率70%) 〔α〕付−91°
(C0,5、0,I N−HC1)実施例 8 参考例1の方法により部分精製したキサントモナス・ス
ピーシーズ B198−I FERM−PA2948
の粗エステラーゼ乾燥粉末を用いて特願昭49−136
478の方法に従い不溶化酵素を調製した。
即ち該粗エステラーゼ乾燥粉末1.21を2tの0.1
Mリン酸緩衝液(pH8,0)に溶解した溶液に、ブロ
ムシアンで活性化したβ−1゜3−グルカン(カードラ
ン型多糖類)100fの懸濁液を加え、5℃、pH8,
0の条件下16時間撹拌したところ全活性の84%がβ
−1,3−グルカンに固定化された。
この固定化酵素標品をガラス製カラム(6Xi8cm)
に詰め(床容積500m1)、5℃において05%のD
L−2−p−ヒドロキシフェニルグリシンメチルエステ
ル塩酸塩ヲ含む0.1Mリン酸緩衝液(pH6,0)を
流速100m1/ h rで通過させた。
適宜通過液を集めて約115容になる迄濃縮しくロータ
リーエバポレター、温度40℃以下)、IN−水酸化す
l−IJウムを用いてpH7,2に修正後当容の酢酸エ
チルで3回抽出した。
酢酸エチル層を無水硫酸すI−IJウムで脱水後酢酸エ
チルを溜去するとD−2−p−ヒドロキシフェニルグリ
シンメチルエステル結晶カ得られた。
表6にこのようにして得られた標品の収率と比旋光度の
例を示す。
この方法により2ケ月間の連続反応を行なったが、収率
、標品の比旋光度のいずれにも全く低下は見られなかっ
た。
比旋光度は、CO,2、0,5N−HC1の条件下で測
定した。
実施例 9 シュードモナス・メラノゲナムIFO12020をA培
地を用いて28℃で24時間しんとう培養した培養液1
0100Oを遠心分離して菌体を集め、蒸留水1010
0Oで1回洗滌したあと1007721の蒸留水に再懸
濁したものに、2%DI、−2−p −ヒドロキシフェ
ニルグリシンメチルエステル塩酸塩水溶液100772
6を加え、25℃、pH6,5に保ちながら180分間
反応させた。
反応液を遠心分離して菌体を除き、その十清のpHを7
.2に修正したのち各2001111の酢酸エチルで3
回抽出した。
酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水後濃縮乾固す
ると0.66fのD−2−p−ヒドロキシフェニルグリ
シンメチルエステルが得られた〔〔α、:]]25−1
29°CC0,50,5N −HC1) )。
また氷霜のpHを4.0に修正したあとアンバーライト
IR−120(H) カラム(床容積2007fll)
に通し、400m1の0.2M酢酸緩衝液(pi(4,
0)ヲ用いて洗滌後500m1の2Nアンモニア水で溶
出される画分を濃縮しpH5,3に調整するとL−2−
p−ヒドロキシフェニルグリシンが析出した〔収量0.
75f、〔α〕2つ5+155°(C1,0゜0.5N
−HCI)〕。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 ミコプラナ属、ブロクミノバクター属、アセトバク
    ター属、シュードモナス属、アエロモナス属キサントモ
    ナス属またはバチルス属に属し一般式 〔式中、Rは置換基を有してもよい飽和または不飽和の
    六員環炭化水素残基を示し、R′はアルキル基またはア
    ラルキル基を示す〕で表わされるラセミアミノ酸エステ
    ル類を対応する光学活性アミノ酸に加水分解し得る微生
    物の培養物またはその処理物を、ラセミアミノ酸エステ
    ル類(I)に接触させることを特徴とする対応する光学
    活性アミノ酸および(または)その光学対掌エステル類
    の製造法。
JP5185175A 1975-04-28 1975-04-28 コウガクカツセイアミノサンルイノセイゾウホウ Expired JPS5816876B2 (ja)

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