JPS5816876B2 - コウガクカツセイアミノサンルイノセイゾウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は光学活性アミノ酸およびその光学対掌エステル
類の製造法に関する。

光学的に活性なアミノ酸およびそれらのエステルは光学
的特異性がその活性に関して重要である生理学的に活性
な化合物の合成に有用である。

特に合成セファロスポリン、合成ペニシリン系に属する
重要な抗生物質はそのような酸から誘導されたアシルア
ミド側鎖を有している。

すなわちＤ−α一置換−α−アミノ酢酸およびその誘導
体はセファレキシン、セファログリシン、アンピシリン
、アモキシシリンなどの合成に有利に使用することがで
きる。

従来、酵素の光学特異的（はとんどが５体特異的）加水
分解作用を利用して光学的に活性なアミノ酸を調製する
方法としては、例えば豚の腎臓から抽出した光学特異的
（５体特異的）加水分解作用を有するアシラーゼをラセ
ミＮ−クロロアセチル（またはアセチル）−α・−アミ
ノ酸に作用させて、対応するし−およびＤ−α−アミノ
酸を取得する方法などが知られている。

このアシラーゼを利用する光学分割法に関しては、さら
に同様の活性が微生物（例えばペニシリウム属、アスペ
ルギルス属など）にも存在することが知られているが、
比較的高価な試薬を用いてアミノ酸のＮ−アシル化を行
なう必要がある上、０体アミノ酸を取得せんとする場合
には加水分解されずに残る０体のＮ−アシルアミノ酸の
Ｎ−アシル基を除去する操作が必要である。

このような煩雑且つ高価な方法は工業的規模での実施に
は極めて不利と云わざるを得ない。

その他の例として例えば植物から抽出したパパインや動
物臓器から抽出したキモｌ−ＩＪプシン、トリプシン、
カルボキシペプチダーゼなどの種々の蛋白質加水分解酵
素（プロテアーゼ）の有する光学特異的アミド水解活性
やエステル氷解活性を利用する光学分割法が知られてい
るが、いずれも適用アミノ酸が天然アミノ酸に限定され
、しかも動植物酵素を利用するためその入手が限られる
ことなどから各種のアミノ酸の工業的生産には適さない
等の欠点を有している。

本発明者らは上に述べた既知の酵素的光学分割法の有す
る欠点を克服すべく鋭意研究の結果、既に本発明者らの
一部が自然界（微生物界）にはじめてその存在を明らか
にし、「α−アミノ酸エステルヒドロラーゼ」と命名報
告〔バイオケミカル・ジャーナル１３７巻、４９７−５
０３頁（１９７４年）〕シた新規なエステラーゼを生産
する微生物を利用することにより、光学活性アミノ酸お
よびその光学対掌エステル類をきわめて容易に得ること
に成功し、さらに広く生産微生物を探索して、ミコプラ
ナ属、プロタミノバクタ−属、アセトバクター属、シュ
ードモナス属、アエロモナス属、キサントモナス属およ
びバチルス属に属する微生物が上記の目的のために有利
に使用し得ることを見出し、ここに本発明を完成した。

すなわち本発明は、ミコプラナ属、プロタミノバクタ−
属、アセトバクター属、シュードモナス属、アエロモナ
ス属、キサントモナス属またはバチルス属に属し一般式 〔式中、Ｒは置換基を有してもよい飽和または不飽和の
六員環炭化水素残基を示し、Ｒ′はアルキル基またはア
ラルキル基を示す〕で表わされるラセミアミノ酸エステ
ル類を対応する光学活性アミノ酸に加水分解し得る微生
物の培養物またはその処理物を、ラセミアミノ酸エステ
ル類（Ｉ）に接触させることを特徴とする対応する光学
活性アミノ酸および（または）その光学対掌エステル類
の製造法である。

本発明の機構をさらに詳しく説明すれば、上記の微生物
の培養物またはその処理物をラセミアミノ酸エステル類
（Ｉ）に接触させることにより、該微生物の産生ずる光
学特異的エステル加水分解酵素（エステラーゼ）が該エ
ステルの一方の光学活性体を特異的に加水分解し分離の
容易な該光学活性アミノ酸類とその光学対掌エステル類
との混合物を得るものである。

本発明において使用される光学特異的エステラーゼを生
産する微生物としては、菌株保存センターに保存されて
いるタイプ力ルチュアの中から選ぶこともできるし、自
然界たとえば土壌、下水、海水、動植物体、空気中など
から分離することもできる。

以下に本発明において有利に使用されるタイプカルチュ
アの微生物株の数例を示すと、アセトバクター・バスツ
ーリアヌス（Ａｃｅ ｔｏｂａｃ ｔｅｒＰａｓｔｅｕ
ｒｉａｎｕｓ） ＩＦＯ３２２３、アセトバクター・ク
ービダンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｔｕｒｂｉｄ
ａｎｓ）ＩＦＯ３２２５，シュードモナス・メラノゲナ
ム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｍ
） ＩＦＯ１２０２０゜シュードモナス・マルトフイリ
ア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）
ＩＦＯ１２６９０、アエロモナス・ヒドロラーゼ（Ａ
ｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）ＩＦｏ
３８２０、キサントモナス・シトリ（Ｘａｎｔｈｏ−ｍ
ｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ） ＩＦＯ３８２９、キサントモ
ナス・オリゼ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｃ
）ＩＦＯ３９９５、バチルス・ズブチリス・パル・アテ
リムス（Ｂａ−ｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ｖａ
ｒ ａｔｅｒｒｉｍｕｓ） ＩＦＯ３２１４、バチルス
・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）
ＩＡＭ １２６０、バチルス・プレビス・（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＩＦｏ １２３７４などが
挙げられる。

また自然界から分離された微生物の例を示すと、ミコプ
ラナ・バラータ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａｂｕｌｌａｔａ）
ＦＥＲＭ−Ｐ、Ａ：８７０ ［ＡＴＣＣ２１７７９
］（特開昭４７−２５３８８）、プロタミノバクタ−・
アルボフラブス（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏ−ｂａｃｔｅｒ
ａｌｂｏｆｌａｖｕｓ）ＦＥＲＭ−Ｐ Ａ８６８ＣＡＴ
ＣＣ２１７５５）（特開昭４７−２５３８８）、ササン
トモナス・スピーシーズ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓ
ｐ、）Ｂ１９８−Ｉ ＦＥＲＭ−Ｐ扁２９４８ ［
ＡＴＣＣ２１７６４、ｌなどが挙げられる。

キサントモナス。スピーシーズ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ
ｓ ｓｐ、） Ｂ１９８−ＩＦＥＲＭ−Ｐ Ａ２９４８
（ＡＴＣＣ２１７６４）の菌学的性質は以下に列挙す
る通りである。

酸素要求性：好気性。

ダラム染色性：陰性。形と大きさ：短桿菌（０，８〜１
．０．Ｘｌ、５〜２．０ミクロン）。

運動性：あり（極単毛を有する）。

寒天培地上集落の特徴二円形（全綴）、光沢性、非拡散
性黄色色素を産生ずる。

寒天斜面上の生育の特徴：糸状、光沢性、明黄色を呈す
。

液体培地中での生育の特徴：厚膜状菌膜を形成し、わず
かに濁る程度に生育する。

ゲラチンの液化：除々におこる。リドマスミルク：はと
んど生育せず、リドマスは変化しない。

バレイショ斜面上の生育：光沢性、明黄色を呈す。

カゼインの分解：陰性。デンプンの分解：陽性。

セルロースの分解：陰性。硝酸塩環元性：陰性。

インドール生成：陰性。糖の資化性ニゲルコース、ショ
糖、乳糖を資化し弱酸性を呈するが、ガスの発生は認め
られない。

カタラーゼ活性：陽性。

生育温度：５−４０℃（至適温度：２４−２７℃）。

これらの菌学的諸性質をもとに、バーシーズ・マニュア
ル・オブ・デイターミネイテブ・バクテリオロジー（Ｂ
ｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒ −
ｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第７版
（１９５７年）に従って該菌株をキサントモナス・スピ
ーシーズ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ、）と固定
した。

これらの微生物の光学特異的エステラーゼを用いて所望
の光学活性アミノ酸およびそのエステル類を製造するた
めには必ずしも該エステラーゼを単離する必要はなく、
通常まずこれらの微生物を培養して得られる培養物また
はその処理物とラセミアミノ酸エステル類（Ｉ）とを適
当な条件下で接触させればよい。

培養物を得るための培養方法としては通気撹拌培養、し
んとう培養、静置培養のいずれも利用できるが、通常好
気的培養が望ましい。

培地組成としては通常使用される天然物の一種または二
種以上の組合せに必要に応じて糖類、有機酸類、ノルマ
ルパラフィンなどの炭化水素化合物や、アミノ態窒素、
硝酸態窒素を含む各種無機あるいは有機含窒素化合物や
、金属塩類等を適宜加え、ｐＨを６〜８に調整して使用
する。

培養温度は２０〜４０℃が適しており特に２４−３７℃
が望ましい。

培養時間は菌株の種類や培養条件などによって変るが、
エステラーゼ活性の最大になる時点に培養を。

終了するのがよく、通常８〜３０時間が適当である。

こうして得られた微生物の培養物またはその処理物が光
学特異的エステル加水分解反応に使用されるが、ここで
いう培養物の処理物とは、培養物１に適当な処理を加え
てアミノ酸および（または）その光学対掌エステル類の
製造に有利な形にしたすべてのものを指し、例えば該活
性が菌体内に存在する場合は、■培養物から分取洗滌さ
れた菌体、■菌体から既知の方法を適用して得られる無
細胞抽出液、■無細胞抽出液から既知の方法で得られる
部分精製あるいは精製されたエステラーゼ標品、■物理
的あるいは化学的手段によって水不溶性高分子物質に結
合あるいは包括されたエステラーゼ標品などを指し、ま
た該活性が菌体外に存在する場合は、■培養物から除菌
後得られる上澄液、■上澄液に既知の酵素精製法を適用
して得られる部分精製または精製されたエステラーゼ標
品、■物理的あるいは化学的手段によって水不溶性高分
子物質に結合あるいは包括されたエステラーゼ標品など
を指す。

これらの微生物の培養物またはその処理物をラセミアミ
ノ酸エステル類（Ｉ）に作用させる反応は通常水性溶媒
中で行なわれるが、有機溶媒を添加してもよい。

反応液のｐＨは４〜９、特に５〜８に調整するのが望ま
しい。

エステラーゼ標品が水に可溶性の場合、上記光学特異的
エステル加水分解反応は溶液中で行なわれるが、それら
が水に不溶性の場合は上記反応は回分法あるいはカラム
法の形で実施される。

これらの反応においては、エステル加水分解反応の進行
に伴なって遊離するカルボキシル基のために反応液のｐ
Ｈが低下するが、これは水酸化ナトリウムなどのアルカ
リ溶液を少しずつ滴下するか緩衝液を用いることによっ
て防止される。

反応時間は基質濃度、ニス・チル加水分解活性の強さ、
反応温度などにより決定されるが、通常０．５〜２４時
間である。

実際には反応液のｐＨ低下が認められなくなったとき、
即ちカルボキシル基の遊離はもはや認められなくなった
ときか、あるいは常法に従い反応液の一部をとり、たと
えば薄層クロマトグラフィーによりアミノ酸エステルと
遊離のアミノ酸の存在比が５０ ： ５０になったと認
められたときをもって反応を終了する。

反応温度は０−５０℃の間で選ばれる。

基質濃度は主としてその溶解度とエステラーゼ活性の強
さとの関係で選ばれるが、通常０．１−１０％の範囲で
ある。

一般式（１）中、Ｒで示される飽和または不飽和の六員
環炭化水素残基としては、フェニル、シクロヘキシル、
シクロへキセニル（例、１−シクロへキセニル、２−シ
クロへキセニル、３−シクロへキセニル）、シクロへキ
サジェニル（例、１゜３−シクロへキサジェニル、１，
４−シクロヘキサジエニル、１，５−シクロ・＼キサジ
ェニル、２゜５−シクロへキサジェニル）などが挙げら
れる。

またこれらの環状基が有し得る置換基としては、例えば
−ＯＨ，−８Ｈ，−Ｃｏ２Ｈ，−８Ｏ３Ｈ，−ＮＨ２Ｎ
Ｏ２、Ｃｌ ｔ Ｂｒ 、 ＣＨｓ 、 ＯＣ２
Ｈ５などが挙げられる。

なおこれらの原料となるアミノ酸類には新規なものもあ
るが、それらは例えば対応するＲ基を有するアルデヒド
からストレッカー反応によって合成し得る。

Ｒ′で示されるアルキル基としては、好ましくは炭素数
６以下の低級アルキル基、例えばメチル、エチル、プロ
ピル、ブチルなどが挙げられ、アラルキル基としては、
例えばベンジルなどが挙げられる。

Ｒ′で示されるこれらアルキルまたはアラルキル基の導
入は、通常のエステル化反応により行なわれる。

即ち塩酸または硫酸などの鉱酸あるいはチオニルクロラ
イドなどを含む所望のアルキルまたはアラルキルアルコ
ール中に所望のアミノ酸類を混じ撹拌するだけで極めて
高収率に達成される。

エステル化反応終了後、所望のアミノ酸エステル類（Ｉ
）は使用したアルコールを溜去するだけで、例えば塩酸
塩などの塩として高収率で取得し得る。

本発明において使用される微生物がエステル加水分解反
応において示す光学特異性にはＤ休符選的な場合もまた
Ｌ休符異的な場合もある。

また、同一微生物でも使用するアミノ酸エステル類（Ｉ
）によりその光学特異性が逆転することもある。

従って目的に応じて任意の微生物またはその処理物と任
意のラセミアミノ酸エステル類（１）とを組み合せるこ
とによって、所望の光学活性アミノ酸類および（または
）その光学対掌エステル類を得ることができる。

特に５体アミノ酸エステル類を特異的に加水分解し得る
微生物を、ラセミアミノ酸エステル類（１）に作用させ
た場合、０体アミノ酸エステル類を反応液中に残すので
、例えばＤ−α一置換−α−アミノ酸エステル類を原料
として使用するセファロスポリン類の微生物合成法〔ジ
ャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエテ
ィー９４巻、４０３５〜４０３７頁（１９７２年）〕に
おいて該り体エステル類を遊離アミノ酸に戻すことなく
そのまま使用し得るために極めて有利である。

こうしてラセミアミノ酸エステル類（Ｉ）に上述の光学
特異的エステラーゼを作用させることによっていずれか
一方の光学活性を有する。

即ち０体またはＬ体のアミノ酸エステル類とその逆の光
学活性を有する、即ちＬ体または０体のアミノ酸類との
混合物が得られるが、これらのそれぞれ相反する光学活
性体は、それらの化学的性質が極めて相異なるため既知
の方法、例えば溶媒抽出法やクロマトグラフィー法など
によって極めて容易に単一の光学活性体としてそれぞれ
分離・精製される。

そのようにして得られる所望の光学活性体とは逆のもう
一方の光学活性体は、アミノ酸エステルの場合もあり得
るしあるいはアミノ酸の場合もあり得るが、いずれの場
合にも既知の任意の方法を適用することによって、例え
ば水に溶解後加熱することによって容易にラセミ化する
から再び上述の反応の原料として使用することができる
。

以上述べてきた本発明は、たとえば ■ 微生物を利用する方法なので動植物酵素を利用する
方法に比較して工業的生産に適している。

■ 原料として使用するエステル類は容易かつ安価に製
造できるので、例えばＮ−アシルアミノ酸類を原料とす
るアシラーゼ法と比較して極めて有利である。

■ 種々の合成原料として有用な非天然アミノ酸類にも
適用することができる。

■ 合成ペニシリン、合成セファロスポリン類の原料と
して重要なり体のアミノ酸またはそのエステル類を容易
に製造することができる。

などの利点を有する。

以下参考例および実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。

参考例および実施例中で使用される二種類の培地組成を
次に記す。

〔Ａ培地〕

肉エキス １．０％ ペプトン １．０％ 食塩 ０．５％ 水道水 ｐＨ７，０ 〔Ｂ培地〕 す゛ルタミン酸モノナトリウム ０．２％酵母エキス
０．２％ 、ブト７ ｏ、５％リン酸二
カリウム ０．２％ 塩化マグネシウム６水塩 ０．１％ 硫酸第一鉄７水塩 ０．０１％ ショ糖 ２．０％ 水道水 ｐＨ７、０ 参考例 １ キサントモナス・スピーシーズ Ｂ１９８−ＩＦＥＲＭ
Ｐ Ａ２９４８の種培養液１．５ｔを０．００５％の
アンチフロスＦ１０２（第−製薬工業製）を含む３００
を醗酵槽中のＢ培地１５０ｔに接種し、通気量５０％、
撹拌１７０ ｒ、 ｐ、ｍ、、温度２８℃の条件下に２
４時間通気撹拌培養した。

培養終了後、シャープレス遠心機を用いて培養液から湿
菌体を分離した（収量８５にり）。

このようにして得られた湿菌体の４．５ｋｇを１０４の
０，１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に再懸濁し
、Ｅ ＤＴＡ−Ｎａ２５６ ｆと卵白リゾチーム１．５
Ｓ’を加えて５℃に１６時間放置し溶菌した。

この溶菌液に硫酸マグネシウム・７水塩３７２とデオキ
シリボヌクレアーゼＩ（生膜）７．５■を加えて５℃で
撹拌しながら２４時間放置したあと、酢酸カルシウム２
６４グを１ｔの水に溶解したものと、リン札酸二カリウ
ム２６１グを５００ｍ１の水に溶解したものをこの順に
加え、溶液中でリン酸カルシウムゲルを形成させその遠
心上清を得た（リン酸カルシウム処理粗抽出液）。

この粗抽出液を１００ｔの水に１５時間、続いて１００
ｔのＧ、０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に２１時間
透析したあと、予め０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６ｙ
Ｏ）で平衡化したＣＭ−セルロースカラム（床容積２．
５ ｔ ）に吸着させ、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６，０）３ｔでカラムを洗滌後、０．１５Ｍ塩化カリウ
ムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）５ｔで
溶出した。

フラクションコレクターを使用して分画した活性画分（
ＣＭ−セルロースカラム溶出画分）に硫酸アンモニウム
６７０ｆ（７０％飽和）を加えて生じる沈澱物を遠心分
離法で集め、少量の０．０１ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６
、’Ｏ）に溶かしたあと、８０ｔの水に対して４０時間
透析した。

この透析内液を凍結乾燥し、１．８６ｆの粗エステラー
ゼ乾燥粉末を得た。

表１に部分精製の結果をまとめて示す。※酵素単位：ｐ
Ｈ６，０，２７℃の条件下で１分間アタリフェニルグリ
シンメチルエステル１マイクロモルを加水分解する酵素
量を１単位と定める。

参考例 ２ Ｌ−２−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンの５％水溶液
に塩酸あるいは水酸化ナトＩＪウムを加えてｐＨ２から
１０の間に修正したあと、１２０℃に１時間または２時
間加熱したところ表２に示すようにｐｔ（６，１以上で
は１０′θ％う′セミ化した。

実施例 １ ミコプラナ・バラータＦＥＲＭ ＰＡ８７０、プロタ
ミノバクタ−・アルボフラブスＦＥＲＭ−ＰＡ８６８、
アセトバクター・バスツーリアヌスＩＦ０３２２３、ア
セトバクター・タービダンスＩＦＯ３２２５、シュード
モナス・メラノゲヌムＩＦＯ１２０２０、シュードモナ
ス・マルトフイリアＩＦＯ１２６９０、アエロモナス・
ヒドロフイラ ＩＦｏ ３８２０、バチルス・ズブチリ
ス・パル・アテリムス ＩＦＯ３２１４、バチルス・ズ
ブチリス Ｉ入Ｍ１２６０、バチルス・プレビスＩＦＯ
１２３７４の３日斜面培養１白金耳を２００ｍ１容三角
フラスコの中のＡ培地５０ｍ１に接種し、２８℃で２０
時間種培養したものを、２を容坂ロフラスコ中のＡ培地
５００ｍ１に接種し２８℃で２０時間培養した後遠心分
離して菌体を集め、蛤０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６
，０）２００ｍｌで１回洗滌した後同緩衝液５０ｍ１に
懸濁した。

得られた懸濁液５０ｍ１に、１グのＤＬ−２−Ｐ−１：
：ドロキシフェニルグリシンメチルエステル塩酸塩を含
む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）５０７ＸＪを加
え、３０℃でエステルと遊離のアミノ酸との存在比が約
５０ ： ５０になる迄反応させた。

反応液を遠心分離により除菌し上清液のｐＨを７．５に
修正（水酸化ナトリウム溶液）後、Ｄ−２−ｐ−ヒドロ
キシフェニルグリシンを等容のエーテルで３回抽出し、
エーテル層を無水硫酸すＩ−ＩＪウムで脱水した後減圧
下に濃縮乾固し、た。

濃縮残渣に少量の塩酸飽和メタノールを加え、さらに微
量のエーテルを添加して５℃に暫時放置して析出するＤ
−２−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンメチルエステル
塩酸塩結晶を戸数した。

その結果を表３に示す。実施例 ２ キサントモナス・スピーシーズ Ｂ１９８−ＩＦＥＲＭ
Ｐ Ａ２９４３、キサントモナス・シトリ ＩＦ
Ｏ３８２９、キサントモナス・オリゼ ＩＦＯ３９９５
の３日斜面培養１白金耳を２００ｍ１容三角フラスコ中
のＢ培地５０ｍ１に接種し２８℃で２０時間種培養した
ものを、２を容坂ロフラスコ中のＢ培地５００７７２１
に接種し２８℃で２０時間しんとう培養した後遠心分離
で菌体を集め、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）
２００７２１で１回洗滌した後同緩衝液５０ｍ１に懸濁
した。

懸濁液５０１１１１に１ｆのＤＬ−２−ｐ−ヒドロキシ
フェニルグリシンメチルエステル塩酸塩ヲ含ｔｒ ０．
２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０） ５ ｏｍｚを加えて
３０℃で反応させた。

薄層クロマトグラフィー法を用いてエステルと遊離のア
ミノ酸との存在比が約５０：５０になったことを確認し
た後、遠心分離により除菌しその上清のｐＨを７．５に
修正（水酸化ナトリウム溶液）し等容の酢酸エチルで３
回抽出した。

酢酸エチル部分を無水硫酸ナトリウムで脱水した後減圧
下に濃縮乾固し、濃縮残渣に少量の塩酸飽和メタノール
を加えさらに微量のエーテルヲ添加してＤ−２−ｐ−ヒ
ドロキシフェニルグリシンメチルエステル塩酸塩結晶を
析出させ戸数した。

その結果を表４に示す。実施例 ３ バチルス・ズブチリス・パル・アテリムスＩＦＯ３２１
４をＡ培地を用いて２８℃で２０時間しんとう培養した
培養液５ｍｌにＤ−２−フェニルグリシンまたはＬ−２
−フェニルグリシンの各種エステル誘導体を終濃度５．
０ ｍｌｉ／１１１１になるように添加；し、２８℃で
２４時間振盪しながら反応した。

反応後、反応液中に残存するＤ−またはＬ−フェニルグ
リシンエステル濃度をシリカゲル薄層クロマトグラフィ
ー（展開溶媒、ｎ−ブタノール：酢酸：水−４：１：５
）法により定量した。

その結果を表５に示す。

実施例 ４ キサントモナス・シトリ ＩＦＯ３８２９をＢ培地を用
いて２８℃で２４時間しんとう培養した培養液４０００
ｍ１を遠心分離して菌体を集め、蒸留水４０００７７２
１で１回洗滌した後５ｏｏｍｇの蒸留水に再懸濁したも
のに、２％ＤＬ−２−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン
メチルエステル塩酸塩水溶液５００ｍ１を加え、２５℃
、ｐＨ６，０に保ちながら９０分間反応させた。

反応液を遠心分離により除菌しその上清のｐＨを７．２
に修正し酢酸エチル各１ｔで３回抽出後、酢酸エチル層
を脱水、濃縮乾固し、３．２５ｆのＤ−２−ｐ−ヒドロ
キシフェニルグリシンメチルエステル結晶が得うレタ５ （収率７４％）。

［α］ −１２８° （Ｃ０，５゜Ｏ，５Ｎ−ＨＣ
Ｉ） 実施例 ５ キサントモナス・シトリ ＩＦＯ３８２９をＢ培地を用
いて２８℃で２４時間しんとう培養した培養液５００ｍ
ｌを遠心分離して菌体を集め、蒸留水５００ｍ１で１回
洗滌した後５００７７２１の蒸留水に再懸濁したものに
、５ｖのＤＬ−２−フェニルグリシンメヂルエステル塩
酸塩を加え撹拌しなから２３℃で１時間保温した。

反応中はｐＨスタットを用いてｐＨ６，０に保った。

（ＩＮ−水酸化ナトリウム）。

反応終了後反応液を遠心分離して得られる上清のｐＨを
８．０に修正しエーテル各５００グで５回抽出し、抽出
液を無水硫酸すｌ−ＩＪウムにより脱水してエーテルを
溜去した。

残渣に塩酸飽和メタノール５０７１１２と微量のエーテ
ルとを加えて５℃に１６時間放置し析出するＬ−２−フ
ェニルグリシンメチルエステル塩酸塩結晶を戸数した（
収量２．０１、収率８０％）。

〔α、１２５＋１１６゜（Ｃ０，５，０，ＩＮ−ＨＣＩ
） Ｄ実施例 ６ バルチス・プレビス ＩＦＯ１２３７４をＡ培地を用い
て２８℃で２４時間しんとう培養した培養液２０００７
７２Ａ！を遠心分離して菌体を集め、蒸留水ｉｏｏｏｍ
ｇで１回洗滌した後１０１００Ｏの蒸留水に再懸濁した
ものに、１０グのＤＬ−２−（１′−シクロへキセニル
）グリシンメチルエステル塩酸塩を加え、撹拌しながら
３０℃、Ｉ）Ｈ７，０に保ち１０時間反応させた。

反応後遠心分離により除菌しその上清のｐＨを８．０に
修正し、エーテル各１．３ｔで５回抽出しエーテル層を
無水硫酸ナトリウムにより脱水後エーテルを溜去した。

残渣の油状物に塩酸飽和メタノールを少量加えて溶解し
たあと極く少量のエーテルを添加冷却し析出するＤ−２
−（１’−シクロ・＼キセニル）グリシンメチルエステ
ル塩酸塩結晶を戸数した（収量３．６ｇ、収率７２％）
。

〔α）’、’−１１３°（Ｃ０，５゜０、ＩＮ−ＨＣＩ
） 実施例 ７ バチルス・ズブチリス ＩＡＭ １２６０をＡ培地を
用いて２８℃で２４時間しんとう培養した培養液２００
０７７２Ａ’を遠心分離して菌体を集め、２０００７７
２１の蒸留水で１回洗滌した後２０００７７２１の蒸留
水に再懸濁したものに、１０ｖのＤＬ−２−フェニルグ
リシンエチルエステル塩酸塩ヲ含ム０、１ Ｍ ＩＪ
７酸緩衝液（ｐＨ７，０） ２０００ｍｌを加えて撹拌
しながら２４時間反応させた。

反応液を遠心分離しその上清のｐＨを８．０に修正した
あと酢酸エチル各２ｔで３回抽出し、酢酸エチル層を集
め、酢酸エチルを減圧下に溜去した。

残渣に少量の塩酸飽和エタノールを加えて溶解し極少量
のエーテルを加え、５℃に一夜放置するとＤ−２−フェ
ニルグリシンエチルエステル塩酸塩結晶が析出した。

収量３．５ ｆ （収率７０％） 〔α〕付−９１°
（Ｃ０，５、０，Ｉ Ｎ−ＨＣ１）実施例 ８ 参考例１の方法により部分精製したキサントモナス・ス
ピーシーズ Ｂ１９８−Ｉ ＦＥＲＭ−ＰＡ２９４８
の粗エステラーゼ乾燥粉末を用いて特願昭４９−１３６
４７８の方法に従い不溶化酵素を調製した。

即ち該粗エステラーゼ乾燥粉末１．２１を２ｔの０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解した溶液に、ブロ
ムシアンで活性化したβ−１゜３−グルカン（カードラ
ン型多糖類）１００ｆの懸濁液を加え、５℃、ｐＨ８，
０の条件下１６時間撹拌したところ全活性の８４％がβ
−１，３−グルカンに固定化された。

この固定化酵素標品をガラス製カラム（６Ｘｉ８ｃｍ）
に詰め（床容積５００ｍ１）、５℃において０５％のＤ
Ｌ−２−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンメチルエステ
ル塩酸塩ヲ含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）を
流速１００ｍ１／ ｈ ｒで通過させた。

適宜通過液を集めて約１１５容になる迄濃縮しくロータ
リーエバポレター、温度４０℃以下）、ＩＮ−水酸化す
ｌ−ＩＪウムを用いてｐＨ７，２に修正後当容の酢酸エ
チルで３回抽出した。

酢酸エチル層を無水硫酸すＩ−ＩＪウムで脱水後酢酸エ
チルを溜去するとＤ−２−ｐ−ヒドロキシフェニルグリ
シンメチルエステル結晶カ得られた。

表６にこのようにして得られた標品の収率と比旋光度の
例を示す。

この方法により２ケ月間の連続反応を行なったが、収率
、標品の比旋光度のいずれにも全く低下は見られなかっ
た。

比旋光度は、ＣＯ，２、０，５Ｎ−ＨＣ１の条件下で測
定した。

実施例 ９ シュードモナス・メラノゲナムＩＦＯ１２０２０をＡ培
地を用いて２８℃で２４時間しんとう培養した培養液１
０１００Ｏを遠心分離して菌体を集め、蒸留水１０１０
０Ｏで１回洗滌したあと１００７７２１の蒸留水に再懸
濁したものに、２％ＤＩ、−２−ｐ −ヒドロキシフェ
ニルグリシンメチルエステル塩酸塩水溶液１００７７２
６を加え、２５℃、ｐＨ６，５に保ちながら１８０分間
反応させた。

反応液を遠心分離して菌体を除き、その十清のｐＨを７
．２に修正したのち各２００１１１１の酢酸エチルで３
回抽出した。

酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水後濃縮乾固す
ると０．６６ｆのＤ−２−ｐ−ヒドロキシフェニルグリ
シンメチルエステルが得られた〔〔α、：］］２５−１
２９°ＣＣ０，５０，５Ｎ −ＨＣ１） ）。

また氷霜のｐＨを４．０に修正したあとアンバーライト
ＩＲ−１２０（Ｈ） カラム（床容積２００７ｆｌｌ）
に通し、４００ｍ１の０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐｉ（４，
０）ヲ用いて洗滌後５００ｍ１の２Ｎアンモニア水で溶
出される画分を濃縮しｐＨ５，３に調整するとＬ−２−
ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンが析出した〔収量０．
７５ｆ、〔α〕２つ５＋１５５°（Ｃ１，０゜０．５Ｎ
−ＨＣＩ）〕。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ミコプラナ属、ブロクミノバクター属、アセトバク
   ター属、シュードモナス属、アエロモナス属キサントモ
   ナス属またはバチルス属に属し一般式 〔式中、Ｒは置換基を有してもよい飽和または不飽和の
   六員環炭化水素残基を示し、Ｒ′はアルキル基またはア
   ラルキル基を示す〕で表わされるラセミアミノ酸エステ
   ル類を対応する光学活性アミノ酸に加水分解し得る微生
   物の培養物またはその処理物を、ラセミアミノ酸エステ
   ル類（Ｉ）に接触させることを特徴とする対応する光学
   活性アミノ酸および（または）その光学対掌エステル類
   の製造法。