JPH09121855A - 新規アルカリプロテアーゼおよびその製造法 - Google Patents
新規アルカリプロテアーゼおよびその製造法Info
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- JPH09121855A JPH09121855A JP7322535A JP32253595A JPH09121855A JP H09121855 A JPH09121855 A JP H09121855A JP 7322535 A JP7322535 A JP 7322535A JP 32253595 A JP32253595 A JP 32253595A JP H09121855 A JPH09121855 A JP H09121855A
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- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 可溶性タンパク質のみならず、ケラチンなど
の不溶性タンパク質に対しても強力な活性を有する新規
アルカリプロテアーゼを提供する。 【構成】 下記の理化学的性質を有するアルカリプロテ
アーゼ。 （ａ） 作用および基質特異性：カゼイン、ゼラチン、
グルテン、ヘモグロビン、インシュリンなどの各種タン
パク質に作用し、そのペプチド結合をエンド的に加水分
解してオリゴペプチドおよびアミノ酸を生成する。特
に、従来の酵素では作用し難かったケラチン等の不溶性
タンパク質に対しても、強力に加水分解する。 （ｂ） 最適ｐＨ： 最適ｐＨはカゼインを基質とした
場合、１１．０〜１１．５である。 （ｃ） 比活性：カゼインに対しては２１４，０００
（Ｕ／ｍｇタンパク）、ケラチンに対しては５２，７０
０（Ｕ／ｍｇタンパク）である。
の不溶性タンパク質に対しても強力な活性を有する新規
アルカリプロテアーゼを提供する。 【構成】 下記の理化学的性質を有するアルカリプロテ
アーゼ。 （ａ） 作用および基質特異性：カゼイン、ゼラチン、
グルテン、ヘモグロビン、インシュリンなどの各種タン
パク質に作用し、そのペプチド結合をエンド的に加水分
解してオリゴペプチドおよびアミノ酸を生成する。特
に、従来の酵素では作用し難かったケラチン等の不溶性
タンパク質に対しても、強力に加水分解する。 （ｂ） 最適ｐＨ： 最適ｐＨはカゼインを基質とした
場合、１１．０〜１１．５である。 （ｃ） 比活性：カゼインに対しては２１４，０００
（Ｕ／ｍｇタンパク）、ケラチンに対しては５２，７０
０（Ｕ／ｍｇタンパク）である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なアルカリプ
ロテアーゼおよびその製造法ならびに該アルカリプロテ
アーゼ産生能を有する新規好アルカリ性放線菌に関す
る。
ロテアーゼおよびその製造法ならびに該アルカリプロテ
アーゼ産生能を有する新規好アルカリ性放線菌に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】アルカリプロテアーゼはタンパク質のペ
プチド結合をアルカリ領域において特異的に加水分解す
る酵素であり、食品、繊維、皮革、洗剤等の工業におい
て広く利用されている。このようなアルカリプロテアー
ゼは糸状菌、酵母、細菌等の微生物により広く生産され
ることが知られており、またいわゆる好アルカリ性微生
物と呼ばれる一群の微生物によっても生産される。
プチド結合をアルカリ領域において特異的に加水分解す
る酵素であり、食品、繊維、皮革、洗剤等の工業におい
て広く利用されている。このようなアルカリプロテアー
ゼは糸状菌、酵母、細菌等の微生物により広く生産され
ることが知られており、またいわゆる好アルカリ性微生
物と呼ばれる一群の微生物によっても生産される。
【０００３】前述された好アルカリ性微生物から生産さ
れるアルカリプロテアーゼとしては、いわゆる好アルカ
リ性バチルス属菌から得られる酵素（例えば、特公平７
−６３３６６、特公平７−６３３６７、特公平７−６３
３６８等）が多数既に知られており、主に洗剤用として
開発が進められている。また、同様な好アルカリ性バチ
ルス属菌から得られる耐熱性酵素として、ＡＨ−１０１
株の生産するアルカリプロテアーゼ（特開平２−２５５
０８７）およびＢ１８−１株の生産するアルカリプロテ
アーゼ（特公平７−６３３６８）等が知られている。し
かしながら、同じ好アルカリ性微生物である好アルカリ
性放線菌の産生するプロテアーゼについてはあまり知ら
れておらず、わずかに好アルカリ性ストレプトミセス属
菌由来の酵素（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３８
（１）３７−４４，１９７４）ならびに好アルカリ性サ
ーモアクチノミセス属ＨＳ６８２株のアルカリプロテア
ーゼ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，５６（２），２４６−２５０，１９９２）等が報
告されているにすぎない。
れるアルカリプロテアーゼとしては、いわゆる好アルカ
リ性バチルス属菌から得られる酵素（例えば、特公平７
−６３３６６、特公平７−６３３６７、特公平７−６３
３６８等）が多数既に知られており、主に洗剤用として
開発が進められている。また、同様な好アルカリ性バチ
ルス属菌から得られる耐熱性酵素として、ＡＨ−１０１
株の生産するアルカリプロテアーゼ（特開平２−２５５
０８７）およびＢ１８−１株の生産するアルカリプロテ
アーゼ（特公平７−６３３６８）等が知られている。し
かしながら、同じ好アルカリ性微生物である好アルカリ
性放線菌の産生するプロテアーゼについてはあまり知ら
れておらず、わずかに好アルカリ性ストレプトミセス属
菌由来の酵素（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３８
（１）３７−４４，１９７４）ならびに好アルカリ性サ
ーモアクチノミセス属ＨＳ６８２株のアルカリプロテア
ーゼ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，５６（２），２４６−２５０，１９９２）等が報
告されているにすぎない。
【０００４】一方、洗剤用にプロテアーゼを応用する場
合、ケラチン等の不溶性タンパク質に対しても良好に作
用する酵素が望ましいことが指摘されている（皆川基：
繊消誌、第２６巻，３２２頁，（１９８５））。もちろ
ん、この場合においてもカゼイン等の可溶性タンパク質
を強力に分解できなければならないことは当然である。
また、プロテアーゼを浴槽や浴床排水溝あるいは洗面化
粧台ドレインの洗浄剤に応用する場合では、４０℃前後
の中温で充分な活性を保持し、かつ毛髪、垢などのケラ
チンを強力に分解する能力が要求される。現状の洗剤お
よび洗浄剤は、配合組成の関係からそのｐＨがアルカリ
領域にあることから、配合する酵素はアルカリプロテア
ーゼが最適である。
合、ケラチン等の不溶性タンパク質に対しても良好に作
用する酵素が望ましいことが指摘されている（皆川基：
繊消誌、第２６巻，３２２頁，（１９８５））。もちろ
ん、この場合においてもカゼイン等の可溶性タンパク質
を強力に分解できなければならないことは当然である。
また、プロテアーゼを浴槽や浴床排水溝あるいは洗面化
粧台ドレインの洗浄剤に応用する場合では、４０℃前後
の中温で充分な活性を保持し、かつ毛髪、垢などのケラ
チンを強力に分解する能力が要求される。現状の洗剤お
よび洗浄剤は、配合組成の関係からそのｐＨがアルカリ
領域にあることから、配合する酵素はアルカリプロテア
ーゼが最適である。
【０００５】さらに、ケラチンを主要タンパク質とする
毛髪、羽毛等は化学合成が不可能なアミノ酸であるシス
テインの製造原料として重要である。現状では毛髪等を
酸加水分解処理し、化学的反応によりシステインを製造
している。しかしながら、過激な反応条件のため著量の
システインが分解されてしまい、収量が極めて悪いた
め、プロテアーゼ処理等の温和な加水分解方法が望まれ
ていた。この場合においても、ケラチンが高アルカリ領
域において膨潤し酵素の作用を受けやすくなるという性
質から、加水分解剤としての酵素はアルカリプロテアー
ゼが最適である。
毛髪、羽毛等は化学合成が不可能なアミノ酸であるシス
テインの製造原料として重要である。現状では毛髪等を
酸加水分解処理し、化学的反応によりシステインを製造
している。しかしながら、過激な反応条件のため著量の
システインが分解されてしまい、収量が極めて悪いた
め、プロテアーゼ処理等の温和な加水分解方法が望まれ
ていた。この場合においても、ケラチンが高アルカリ領
域において膨潤し酵素の作用を受けやすくなるという性
質から、加水分解剤としての酵素はアルカリプロテアー
ゼが最適である。
【０００６】このような用途に対して、先述のＡＨ−１
０１株および好アルカリ性ストレプトミセス属菌由来の
アルカリプロテアーゼの有用性が提案されている。しか
しながら、特にケラチンの分解力において両酵素ともそ
の実用化に対しては不充分であり、さらに強力なケラチ
ン分解力を有する新規なアルカリプロテアーゼの開発が
望まれていた。
０１株および好アルカリ性ストレプトミセス属菌由来の
アルカリプロテアーゼの有用性が提案されている。しか
しながら、特にケラチンの分解力において両酵素ともそ
の実用化に対しては不充分であり、さらに強力なケラチ
ン分解力を有する新規なアルカリプロテアーゼの開発が
望まれていた。
【０００７】上記のような観点から、発明者らは強力な
ケラチン分解力を有するアルカリプロテアーゼを生産す
る微生物を主に好アルカリ性放線菌を中心として検索し
た結果、好アルカリ性のストレプトミセス属に属する放
線菌１株が、好気的培養により目的とする新規アルカリ
プロテアーゼを効率良く生産することを見い出し、本発
明を完成するに至った。
ケラチン分解力を有するアルカリプロテアーゼを生産す
る微生物を主に好アルカリ性放線菌を中心として検索し
た結果、好アルカリ性のストレプトミセス属に属する放
線菌１株が、好気的培養により目的とする新規アルカリ
プロテアーゼを効率良く生産することを見い出し、本発
明を完成するに至った。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】したがって本発明は、
特にケラチンのような不溶性タンパク質をも強力に加水
分解できる、新規なアルカリプロテアーゼを提供するこ
とを目的としている。
特にケラチンのような不溶性タンパク質をも強力に加水
分解できる、新規なアルカリプロテアーゼを提供するこ
とを目的としている。
【０００９】また本発明は、上記アルカリプロテアーゼ
を生産する新規微生物およびその微生物を利用した上記
アルカリプロテアーゼの製造法を提供することを目的と
している。
を生産する新規微生物およびその微生物を利用した上記
アルカリプロテアーゼの製造法を提供することを目的と
している。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明による新規アルカ
リプロテアーゼは、以下のような理化学的性質を有する
もの、である。
リプロテアーゼは、以下のような理化学的性質を有する
もの、である。
【００１１】（ａ）作用および基質特異性：各種タンパ
ク質およびペプチドに特異的に作用し、そのペプチド結
合をエンド型の機作により切断して、低分子量のオリゴ
ペプチドおよびアミノ酸を生成する。また特に従来のプ
ロテアーゼでは分解が困難であったケラチンなどの不溶
性タンパク質についても高い活性を示す。 （ｂ）最適ｐＨ：最適ｐＨはカゼインを基質とした場
合、１１．０〜１１．５である。 （ｃ）安定ｐＨ：３０℃、２４時間の処理条件におい
て、ｐＨ１．５〜１２．０で安定である。 （ｄ）最適温度：最適作用温度は７０〜７５℃である。 （ｅ）安定温度：ｐＨ７．０、１０分間の処理条件にお
いて、カルシウム無添加の場合は５５℃、カルシウムを
添加した場合は６０℃まで安定である。 （ｆ）分子量：約５６，０００（ＳＤＳ電気泳動法）で
ある。 （ｇ）等電点：約１０〜１０．５（等電点電気泳動法）
である。 （ｈ）比活性：カゼインを基質とした場合は２１４，０
００（Ｕ／ｍｇタンパク）、ケラチンを基質とした場合
は５２，７００（Ｕ／ｍｇタンパク）である。 （ｉ）阻害：ＰＣＭＢ（パラクロロマーリュリーベンゾ
エイト）、ヨード酢酸、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四
酢酸）では活性は阻害されないが、ＤＦＰ（ジイソプロ
ピルフルオロホスフェート）、ＰＭＳＦ（フェニルメタ
ンスルフォニルフルオライド）では阻害される。
ク質およびペプチドに特異的に作用し、そのペプチド結
合をエンド型の機作により切断して、低分子量のオリゴ
ペプチドおよびアミノ酸を生成する。また特に従来のプ
ロテアーゼでは分解が困難であったケラチンなどの不溶
性タンパク質についても高い活性を示す。 （ｂ）最適ｐＨ：最適ｐＨはカゼインを基質とした場
合、１１．０〜１１．５である。 （ｃ）安定ｐＨ：３０℃、２４時間の処理条件におい
て、ｐＨ１．５〜１２．０で安定である。 （ｄ）最適温度：最適作用温度は７０〜７５℃である。 （ｅ）安定温度：ｐＨ７．０、１０分間の処理条件にお
いて、カルシウム無添加の場合は５５℃、カルシウムを
添加した場合は６０℃まで安定である。 （ｆ）分子量：約５６，０００（ＳＤＳ電気泳動法）で
ある。 （ｇ）等電点：約１０〜１０．５（等電点電気泳動法）
である。 （ｈ）比活性：カゼインを基質とした場合は２１４，０
００（Ｕ／ｍｇタンパク）、ケラチンを基質とした場合
は５２，７００（Ｕ／ｍｇタンパク）である。 （ｉ）阻害：ＰＣＭＢ（パラクロロマーリュリーベンゾ
エイト）、ヨード酢酸、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四
酢酸）では活性は阻害されないが、ＤＦＰ（ジイソプロ
ピルフルオロホスフェート）、ＰＭＳＦ（フェニルメタ
ンスルフォニルフルオライド）では阻害される。
【００１２】また、本発明による上記新規アルカリプロ
テアーゼの製造法は、好アルカリ性ストレプトミセス属
に属し、上記アルカリプロテアーゼ産生能を有する微生
物を培養する工程と、該工程で得られる培養物より該新
規アルカリプロテアーゼを分離する工程を含んでなるも
の、である。さらにまた、本発明による上記新規アルカ
リプロテアーゼ産生能を有する新規菌株は、ストレプト
ミセス エスピー ＴＯＴＯ−９３０５株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３６４０）である。
テアーゼの製造法は、好アルカリ性ストレプトミセス属
に属し、上記アルカリプロテアーゼ産生能を有する微生
物を培養する工程と、該工程で得られる培養物より該新
規アルカリプロテアーゼを分離する工程を含んでなるも
の、である。さらにまた、本発明による上記新規アルカ
リプロテアーゼ産生能を有する新規菌株は、ストレプト
ミセス エスピー ＴＯＴＯ−９３０５株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３６４０）である。
【００１３】本発明によるアルカリプロテアーゼは比活
性が極めて高く、特に従来のプロテアーゼでは分解され
にくかったケラチン等の不溶性タンパク質をも、強力に
加水分解する。したがって、衣料用洗剤や柔軟剤に洗浄
効果を高める目的で配合されたり、浴槽、浴室排水溝、
洗面化粧台ドレインなどの閉塞除去剤に添加されれば、
極めて効果的である。さらに、ケラチンを主要タンパク
質とする毛髪、羽毛等からのシステインなどのアミノ酸
製造にも応用が可能であり、広範囲の工業分野で利用さ
れ得る。また、本発明による菌株は、上記アルカリプロ
テアーゼを効率良く菌体外に分泌するので、簡便な工程
で高効率にその生産を行うことができる点で有利であ
る。
性が極めて高く、特に従来のプロテアーゼでは分解され
にくかったケラチン等の不溶性タンパク質をも、強力に
加水分解する。したがって、衣料用洗剤や柔軟剤に洗浄
効果を高める目的で配合されたり、浴槽、浴室排水溝、
洗面化粧台ドレインなどの閉塞除去剤に添加されれば、
極めて効果的である。さらに、ケラチンを主要タンパク
質とする毛髪、羽毛等からのシステインなどのアミノ酸
製造にも応用が可能であり、広範囲の工業分野で利用さ
れ得る。また、本発明による菌株は、上記アルカリプロ
テアーゼを効率良く菌体外に分泌するので、簡便な工程
で高効率にその生産を行うことができる点で有利であ
る。
【００１４】新規アルカリプロテアーゼ産生菌株 本発明による新規アルカリプロテアーゼは、微生物を用
いて生産することができる。特に好ましくは、本発明に
よるアルカリプロテアーゼは、好アルカリ性ストレプト
ミセス属、特にストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＴＯＴＯ−９３０５株によ
り生産される。この菌株は発明者らにより、北九州市の
一般家屋浴室のタイル目地上より分離されたものであ
る。この菌株は好アルカリ性放線菌であり、次の表１及
び表２に示す菌学的性質を有する。なお、本菌株は好ア
ルカリ微生物であり、通常の中性培地では生育しない
か、あるいは生育が極めて不良であるため、表１及び表
２の菌学的性質の検討に際しては０．５％Ｎａ２ＣＯ３
添加のアルカリ性培地を用いた。
いて生産することができる。特に好ましくは、本発明に
よるアルカリプロテアーゼは、好アルカリ性ストレプト
ミセス属、特にストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＴＯＴＯ−９３０５株によ
り生産される。この菌株は発明者らにより、北九州市の
一般家屋浴室のタイル目地上より分離されたものであ
る。この菌株は好アルカリ性放線菌であり、次の表１及
び表２に示す菌学的性質を有する。なお、本菌株は好ア
ルカリ微生物であり、通常の中性培地では生育しない
か、あるいは生育が極めて不良であるため、表１及び表
２の菌学的性質の検討に際しては０．５％Ｎａ２ＣＯ３
添加のアルカリ性培地を用いた。
【００１５】
【表１】
【表２】
【００１６】本菌株ＴＯＴＯ−９３０５株は表１の結果
より、形態学的に放線菌、ストレプトミセス属の特徴を
有する。また、細胞壁にＬ−Ｌ−ジアミノピメリン酸を
含有する等のことから、本菌株はストレプトミセス属に
属する一菌種と分類される。
より、形態学的に放線菌、ストレプトミセス属の特徴を
有する。また、細胞壁にＬ−Ｌ−ジアミノピメリン酸を
含有する等のことから、本菌株はストレプトミセス属に
属する一菌種と分類される。
【００１７】ＴＯＴＯ−９３０５株は、各種寒天培地上
での気菌糸の色調から白色シリーズに属すること、胞子
表面は平滑であること、胞子の連鎖はおおむね直状であ
ること、メラニン色素は生成しないこと等の性質を有す
る。これらの性質と各種炭素源の同化性試験の結果をも
とに、既知菌種の中から本菌株の類似種をバージェーズ
マニュアル第８版（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｃｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ ８ｔｈ Ｅｄ．）に従って検索を行った。
その結果、特に各種炭素源の同化性において本菌株と類
似の既知菌種は見いだせないことから、本菌株はストレ
プトミセス属に属する新菌種である。
での気菌糸の色調から白色シリーズに属すること、胞子
表面は平滑であること、胞子の連鎖はおおむね直状であ
ること、メラニン色素は生成しないこと等の性質を有す
る。これらの性質と各種炭素源の同化性試験の結果をも
とに、既知菌種の中から本菌株の類似種をバージェーズ
マニュアル第８版（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｃｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ ８ｔｈ Ｅｄ．）に従って検索を行った。
その結果、特に各種炭素源の同化性において本菌株と類
似の既知菌種は見いだせないことから、本菌株はストレ
プトミセス属に属する新菌種である。
【００１８】なお、本菌株は工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託番号第１３６４０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１
３６４０）のもと寄託されている。
術研究所に寄託番号第１３６４０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１
３６４０）のもと寄託されている。
【００１９】培養条件 上記菌株は好アルカリ性放線菌であるため、その培養は
アルカリ領域で行う必要がある。培地をアルカリ性にす
るための方法としては格別である必要はなく、通常の培
地中に例えば炭酸ナトリウムあるいは炭酸水素ナトリウ
ムを添加するだけで良い。炭素源としてはグルコース、
可溶性デンプン、セルロース等の単糖、多糖などを用い
ることができる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウ
ム塩などの無機物をはじめ、尿素、ペプトン、乾燥酵
母、酵母エキス、ダイズ粉、コーンスチープリカー、カ
ゼイン、肉エキス、アミノ酸などが用いられる。これら
の炭素源や窒素源の他に各種無機塩、例えばマグネシウ
ム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩などを必要
に応じて添加しても良い。培地に加えるアルカリ源とし
ては、０．５〜２．０％程度の炭酸ナトリウム、炭酸水
素ナトリウム等の炭酸塩あるいは水酸化ナトリウム、ア
ンモニアなどが使用でき、培地のｐＨは８．０〜１１．
０程度が望ましい。
アルカリ領域で行う必要がある。培地をアルカリ性にす
るための方法としては格別である必要はなく、通常の培
地中に例えば炭酸ナトリウムあるいは炭酸水素ナトリウ
ムを添加するだけで良い。炭素源としてはグルコース、
可溶性デンプン、セルロース等の単糖、多糖などを用い
ることができる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウ
ム塩などの無機物をはじめ、尿素、ペプトン、乾燥酵
母、酵母エキス、ダイズ粉、コーンスチープリカー、カ
ゼイン、肉エキス、アミノ酸などが用いられる。これら
の炭素源や窒素源の他に各種無機塩、例えばマグネシウ
ム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩などを必要
に応じて添加しても良い。培地に加えるアルカリ源とし
ては、０．５〜２．０％程度の炭酸ナトリウム、炭酸水
素ナトリウム等の炭酸塩あるいは水酸化ナトリウム、ア
ンモニアなどが使用でき、培地のｐＨは８．０〜１１．
０程度が望ましい。
【００２０】培養は、このような培地中で培養温度２０
〜４０℃、好ましくは２７〜３８℃で２日〜５日間好気
的に撹袢または振とうしながら行う。
〜４０℃、好ましくは２７〜３８℃で２日〜５日間好気
的に撹袢または振とうしながら行う。
【００２１】本発明による新規なアルカリプロテアーゼ
は、上記のような培養条件のもとで、主として培養液中
に分泌され、蓄積される。
は、上記のような培養条件のもとで、主として培養液中
に分泌され、蓄積される。
【００２２】酵素の採取 上記培養液から本発明による酵素を採取、精製するため
には、既知の精製法を単独もしくは併用して利用するこ
とができる。本酵素は主として菌体外（培養液中）に分
泌されるため、例えば濾過あるいは遠心分離で菌体を除
去することにより容易に粗酵素液を得ることができる。
この粗酵素は、さらに既知の精製法、例えば硫安などに
よる塩析；メタノール、エタノール、アセトンなどの有
機溶媒による沈殿法；ケラチン等による吸着法；限外濾
過；ゲル濾過クロマトグラフィー；イオン交換クロマト
グラフィー；疎水クロマトグラフィー、その他の各種ク
ロマトグラフィーを、単独もしくは併用して、精製する
ことができる。
には、既知の精製法を単独もしくは併用して利用するこ
とができる。本酵素は主として菌体外（培養液中）に分
泌されるため、例えば濾過あるいは遠心分離で菌体を除
去することにより容易に粗酵素液を得ることができる。
この粗酵素は、さらに既知の精製法、例えば硫安などに
よる塩析；メタノール、エタノール、アセトンなどの有
機溶媒による沈殿法；ケラチン等による吸着法；限外濾
過；ゲル濾過クロマトグラフィー；イオン交換クロマト
グラフィー；疎水クロマトグラフィー、その他の各種ク
ロマトグラフィーを、単独もしくは併用して、精製する
ことができる。
【００２３】好ましい精製法を示せば以下の通りであ
る。まず、培養濾液に８０％飽和硫安を添加して塩析を
行い、得られた沈殿を緩衝液に溶解する。次いでＣＭ−
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（東ソー社製）、ＤＥＡ
Ｅ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（同社製）によるイ
オン交換クロマトグラフィーを行うことにより、ＳＤＳ
電気泳動的に均一な精製酵素を得ることができる。
る。まず、培養濾液に８０％飽和硫安を添加して塩析を
行い、得られた沈殿を緩衝液に溶解する。次いでＣＭ−
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（東ソー社製）、ＤＥＡ
Ｅ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（同社製）によるイ
オン交換クロマトグラフィーを行うことにより、ＳＤＳ
電気泳動的に均一な精製酵素を得ることができる。
【００２４】酵素の性質 本発明によるアルカリプロテアーゼの性質は以下に示さ
れる通りである。なお、以下において活性測定法とは次
の方法をいうものとする。
れる通りである。なお、以下において活性測定法とは次
の方法をいうものとする。
【００２５】（活性測定法）カゼイン０．６％またはケ
ラチン２％を含む５０ｍＭグリシンＮａＣｌ／ＮａＯＨ
緩衝液（ｐＨ１０．５）０．５ｍｌを０．１ｍｌの酵素
溶液と混合し、３０℃、１０分間（ケラチンを基質とし
た場合は振とうしながら２０分間）反応させた後、２．
５ｍｌのトリクロロ酢酸混合液（０．１１Ｍトリクロロ
酢酸、０．２２Ｍ酢酸ナトリウム、０．３３Ｍ酢酸）を
加えて３０℃で３０分間静置した後、アドバンテック社
製濾紙Ｎｏ．５Ｃで濾過する。次いで、この濾液の０．
５ｍｌを２．５ｍｌの０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液に加
え、さらに３倍希釈したフェノール試薬を０．５ｍｌ添
加撹袢後、さらに室温にて３０分間放置し、６６０ｎｍ
の吸光度を測定する。上記の測定条件下で１分間に１マ
イクログラムのチロシンに相当する吸光度を増加させる
酵素量を、酵素活性１単位（１Ｕ）と定義する。
ラチン２％を含む５０ｍＭグリシンＮａＣｌ／ＮａＯＨ
緩衝液（ｐＨ１０．５）０．５ｍｌを０．１ｍｌの酵素
溶液と混合し、３０℃、１０分間（ケラチンを基質とし
た場合は振とうしながら２０分間）反応させた後、２．
５ｍｌのトリクロロ酢酸混合液（０．１１Ｍトリクロロ
酢酸、０．２２Ｍ酢酸ナトリウム、０．３３Ｍ酢酸）を
加えて３０℃で３０分間静置した後、アドバンテック社
製濾紙Ｎｏ．５Ｃで濾過する。次いで、この濾液の０．
５ｍｌを２．５ｍｌの０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液に加
え、さらに３倍希釈したフェノール試薬を０．５ｍｌ添
加撹袢後、さらに室温にて３０分間放置し、６６０ｎｍ
の吸光度を測定する。上記の測定条件下で１分間に１マ
イクログラムのチロシンに相当する吸光度を増加させる
酵素量を、酵素活性１単位（１Ｕ）と定義する。
【００２６】（１）作用および基質特異性 カゼイン、ゼラチン、グルテン、ヘモグロビン、インシ
ュリンなどのタンパク質に作用し、そのペプチド結合を
エンド的に加水分解することによりオリゴペプチドおよ
びアミノ酸を生成する。また、特に従来の酵素では分解
の困難であったケラチンなどの不溶性タンパク質をも強
力に加水分解する。
ュリンなどのタンパク質に作用し、そのペプチド結合を
エンド的に加水分解することによりオリゴペプチドおよ
びアミノ酸を生成する。また、特に従来の酵素では分解
の困難であったケラチンなどの不溶性タンパク質をも強
力に加水分解する。
【００２７】（２）最適ｐＨおよび安定ｐＨ 上記の活性測定法にもとづき、本酵素に及ぼすｐＨの影
響を調べた。なお、緩衝液としてＫＣｌ／ＨＣｌ（ｐＨ
１．０−１．５）、グリシンＮａＣｌ／ＨＣｌ（ｐＨ
２．０−３．５）、酢酸（ｐＨ４．０−５．５）、リン
酸（ｐＨ６．０−７．０）、トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．
５−８．５）、グリシンＮａＣｌ／ＮａＯＨ（ｐＨ９．
０−１１．５）、ＫＣｌ／ＮａＯＨ（ｐＨ１２．０−１
３．０）を使用した。第１図に活性の最大値を１００と
した場合の各ｐＨにおける相対活性を示した。第１図に
より本酵素の最適ｐＨは３０℃において１１．０−１
１．５であることが分かる。
響を調べた。なお、緩衝液としてＫＣｌ／ＨＣｌ（ｐＨ
１．０−１．５）、グリシンＮａＣｌ／ＨＣｌ（ｐＨ
２．０−３．５）、酢酸（ｐＨ４．０−５．５）、リン
酸（ｐＨ６．０−７．０）、トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．
５−８．５）、グリシンＮａＣｌ／ＮａＯＨ（ｐＨ９．
０−１１．５）、ＫＣｌ／ＮａＯＨ（ｐＨ１２．０−１
３．０）を使用した。第１図に活性の最大値を１００と
した場合の各ｐＨにおける相対活性を示した。第１図に
より本酵素の最適ｐＨは３０℃において１１．０−１
１．５であることが分かる。
【００２８】同様に本酵素のｐＨ安定性について第２図
に示した。本酵素を各ｐＨの緩衝液中に３０℃で２４時
間保持した後、その残存活性を未処理の酵素活性を１０
０とした相対活性として示した。第２図から、本酵素は
上記処理条件下においてｐＨ１．５−１２．０までの極
めて広範囲のｐＨ域で安定であることが分かる。
に示した。本酵素を各ｐＨの緩衝液中に３０℃で２４時
間保持した後、その残存活性を未処理の酵素活性を１０
０とした相対活性として示した。第２図から、本酵素は
上記処理条件下においてｐＨ１．５−１２．０までの極
めて広範囲のｐＨ域で安定であることが分かる。
【００２９】（３）最適温度および安定温度 上記活性測定法に準じて、本酵素に及ぼす温度の影響を
調べた。第３図に最大活性を１００とした場合の各温度
における相対活性を示した。第３図から、本酵素の最適
温度は７０〜７５℃であることが分かる。
調べた。第３図に最大活性を１００とした場合の各温度
における相対活性を示した。第３図から、本酵素の最適
温度は７０〜７５℃であることが分かる。
【００３０】また、本酵素を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に添加し、４０〜８０℃の範囲の各条件
下で１０分間保持した後、その残存活性を測定した。測
定は５ｍＭの塩化カルシウムを添加した場合としない場
合の二通りについて行った。その結果を第４図に示し
た。第４図により、カルシウム無添加の場合は５５℃ま
で、カルシウムを添加した場合は６０℃まで安定である
ことがわかる。この結果より、本酵素はカルシウムの添
加により熱安定性が増加することが判明した。
（ｐＨ７．０）に添加し、４０〜８０℃の範囲の各条件
下で１０分間保持した後、その残存活性を測定した。測
定は５ｍＭの塩化カルシウムを添加した場合としない場
合の二通りについて行った。その結果を第４図に示し
た。第４図により、カルシウム無添加の場合は５５℃ま
で、カルシウムを添加した場合は６０℃まで安定である
ことがわかる。この結果より、本酵素はカルシウムの添
加により熱安定性が増加することが判明した。
【００３１】（４）分子量 本酵素の分子量をＳＤＳ電気泳動法により測定したとこ
ろ、分子量は約５６，０００であった。
ろ、分子量は約５６，０００であった。
【００３２】（５）等電点 本酵素の等電点を等電点電気泳動法により測定したとこ
ろ、等電点は約１０〜１０．５であった。
ろ、等電点は約１０〜１０．５であった。
【００３３】（６）比活性 本酵素の比活性を活性測定法に準じて測定した。なお、
タンパク質濃度はバイオラッド社製のプロテインアッセ
イキットを使用して測定し、酵素は電気泳動的に均一な
精製標品を使用した。その結果、本酵素の比活性は、カ
ゼインを基質とした場合は２１４，０００（Ｕ／ｍｇタ
ンパク）、ケラチンに対しては５２，７００（Ｕ／ｍｇ
タンパク）であり、本酵素は極めて強力な加水分解活性
を有することが判明した。
タンパク質濃度はバイオラッド社製のプロテインアッセ
イキットを使用して測定し、酵素は電気泳動的に均一な
精製標品を使用した。その結果、本酵素の比活性は、カ
ゼインを基質とした場合は２１４，０００（Ｕ／ｍｇタ
ンパク）、ケラチンに対しては５２，７００（Ｕ／ｍｇ
タンパク）であり、本酵素は極めて強力な加水分解活性
を有することが判明した。
【００３４】（７）阻害 一般的な酵素阻害剤であるＤＦＰ（ジイソプロピルフル
オロホスフェート）、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフ
ォニルフルオライド）、ＰＣＭＢ（パラクロロマーキュ
リーベンゾエイト）、ヨード酢酸、ＥＤＴＡ（エチレン
ジアミン四酢酸）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）
について、これらが本酵素の活性に及ぼす影響を調べ
た。各阻害剤を所定濃度となるように５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、本酵素を添加後３０
℃で３０分間処理を行った。次いで処理溶液より一定量
を分取して活性測定法に準じて、その残存活性を測定し
た。残存活性は阻害剤無添加で同様に処理した対照を１
００とした相対値で示した。この結果を表３に示した。
オロホスフェート）、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフ
ォニルフルオライド）、ＰＣＭＢ（パラクロロマーキュ
リーベンゾエイト）、ヨード酢酸、ＥＤＴＡ（エチレン
ジアミン四酢酸）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）
について、これらが本酵素の活性に及ぼす影響を調べ
た。各阻害剤を所定濃度となるように５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、本酵素を添加後３０
℃で３０分間処理を行った。次いで処理溶液より一定量
を分取して活性測定法に準じて、その残存活性を測定し
た。残存活性は阻害剤無添加で同様に処理した対照を１
００とした相対値で示した。この結果を表３に示した。
【００３５】
【表３】
【００３６】表３の結果から、本酵素はＤＦＰおよびＰ
ＭＳＦにより阻害され、その他の阻害剤による阻害を受
けなかったことより、本アルカリプロテアーゼはセリン
プロテアーゼであることがわかる。また、本酵素は界面
活性剤であるＳＤＳに対しても若干の阻害をうけたもの
の、まだ十分な活性を保持しており洗剤用として有望で
ある。
ＭＳＦにより阻害され、その他の阻害剤による阻害を受
けなかったことより、本アルカリプロテアーゼはセリン
プロテアーゼであることがわかる。また、本酵素は界面
活性剤であるＳＤＳに対しても若干の阻害をうけたもの
の、まだ十分な活性を保持しており洗剤用として有望で
ある。
【００３７】上記各特性を示す本酵素と、従来公知の細
菌、放線菌由来のアルカリプロテアーゼとの比較を表４
に示した。
菌、放線菌由来のアルカリプロテアーゼとの比較を表４
に示した。
【００３８】
【表４】
【００３９】表４に示した諸性質の比較より、本酵素が
極めて高い比活性を有する新規なアルカリプロテアーゼ
であることが分かる。
極めて高い比活性を有する新規なアルカリプロテアーゼ
であることが分かる。
【００４０】
【発明の実施の態様】次に本発明を以下の実施例により
更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。
更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。
【００４１】実施例１ 粗酵素粉末の調製 ストレプトミセス エスピー ＴＯＴＯ−９３０５株の
前培養液５０ｍｌ（３５℃、４日間振とう培養）を、可
溶性デンプン１．５％、スキムミルク１．５％、Ｋ２Ｈ
ＣＯ４ ０．３％、酵母エキス０．１％、ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ０．０５％および、別殺菌して添加したＮａＨ
ＣＯ３ １．０％を含有する培地（ｐＨ９．０）４５０
０ｍｌを入れた小型ジャーファーメンターに植菌し、３
５℃で４日間、通気量１ｖ／ｖ／ｍｉｎ、回転数２００
ｒｐｍで培養を行った。培養終了後、培養液を８０００
ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を除去した。得られ
た上清液を凍結乾燥して、４０Ｕ／ｍｇの粗酵素粉末９
ｇを得た。
前培養液５０ｍｌ（３５℃、４日間振とう培養）を、可
溶性デンプン１．５％、スキムミルク１．５％、Ｋ２Ｈ
ＣＯ４ ０．３％、酵母エキス０．１％、ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ０．０５％および、別殺菌して添加したＮａＨ
ＣＯ３ １．０％を含有する培地（ｐＨ９．０）４５０
０ｍｌを入れた小型ジャーファーメンターに植菌し、３
５℃で４日間、通気量１ｖ／ｖ／ｍｉｎ、回転数２００
ｒｐｍで培養を行った。培養終了後、培養液を８０００
ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を除去した。得られ
た上清液を凍結乾燥して、４０Ｕ／ｍｇの粗酵素粉末９
ｇを得た。
【００４２】実施例２ 精製酵素の調製 実施例１と同様の培地４５００ｍｌを入れた小型ジャー
ファーメンターに、ストレプトミセス エスピー ＴＯ
ＴＯ−９３０５株の前培養液５０ｍｌを植菌した。これ
を実施例１と同様に培養した後、遠心分離により培養上
清３８００ｍｌを得た。この上清液のｐＨ１０．５にお
けるプロテアーゼ活性は９４．５Ｕ／ｍｇであった。
ファーメンターに、ストレプトミセス エスピー ＴＯ
ＴＯ−９３０５株の前培養液５０ｍｌを植菌した。これ
を実施例１と同様に培養した後、遠心分離により培養上
清３８００ｍｌを得た。この上清液のｐＨ１０．５にお
けるプロテアーゼ活性は９４．５Ｕ／ｍｇであった。
【００４３】次いで、この上清液に硫安粉末を８０％飽
和になるまで加え、１昼夜５℃で暗所に静置後８０００
ｒｐｍで遠心分離を行い、沈殿を回収した。この沈殿を
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、セルロ
ースチューブを用いて同緩衝液に対し透析を行った。透
析後、その透析内液を１ｍＭＣａＣｌ添加の１０ｍＭＭ
ＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＣＭ−Ｔｏｙ
ｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラムに通じて酵素を吸着さ
せ、０〜０．５Ｍ のＮａＣｌ濃度勾配で溶出させた。
活性画分を透析後、１ｍＭＣａＣｌを含む１０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔ
ｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラムに通じて活性画分を
通過させ、不純タンパク質を吸着させた。上記一連の精
製により、１９２０Ｕ／ｍｌのアルカリプロテアーゼを
３４ｍｌ得た。本画分はＳＤＳ電気泳動的にもゲル濾過
的にもそれぞれ単一バンドおよび単一ピークを示し、酵
素タンパク質として均一であることが確認された。
和になるまで加え、１昼夜５℃で暗所に静置後８０００
ｒｐｍで遠心分離を行い、沈殿を回収した。この沈殿を
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、セルロ
ースチューブを用いて同緩衝液に対し透析を行った。透
析後、その透析内液を１ｍＭＣａＣｌ添加の１０ｍＭＭ
ＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＣＭ−Ｔｏｙ
ｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラムに通じて酵素を吸着さ
せ、０〜０．５Ｍ のＮａＣｌ濃度勾配で溶出させた。
活性画分を透析後、１ｍＭＣａＣｌを含む１０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔ
ｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラムに通じて活性画分を
通過させ、不純タンパク質を吸着させた。上記一連の精
製により、１９２０Ｕ／ｍｌのアルカリプロテアーゼを
３４ｍｌ得た。本画分はＳＤＳ電気泳動的にもゲル濾過
的にもそれぞれ単一バンドおよび単一ピークを示し、酵
素タンパク質として均一であることが確認された。
【図１】図１は、本発明によるアルカリプロテアーゼの
最適ｐＨを示すグラフである。
最適ｐＨを示すグラフである。
【図２】図２は、本発明によるアルカリプロテアーゼの
安定ｐＨを示すグラフである。
安定ｐＨを示すグラフである。
【図３】図３は、本発明によるアルカリプロテアーゼの
最適温度を示すグラフである。
最適温度を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明によるアルカリプロテアーゼの
安定温度を示すグラフである。
安定温度を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 村野 仁美 福岡県北九州市小倉北区中島二丁目１番１ 号 東陶機器株式会社内 (72)発明者 大崎 有美 福岡県北九州市小倉北区中島二丁目１番１ 号 東陶機器株式会社内
Claims (7)
- 【請求項１】下記の理化学的性質を有するアルカリプロ
テアーゼ （ａ）作用および基質特異性：各種タンパク質およびペ
プチドに特異的に作用し、そのペプチド結合をエンド型
の機作により切断して、低分子量のオリゴペプチドおよ
びアミノ酸を生成する。また特に従来のプロテアーゼで
は分解が困難であったケラチンなどの不溶性タンパク質
についても高い活性を示す。 （ｂ）最適ｐＨ：最適ｐＨはカゼインを基質とした場
合、１１．０〜１１．５である。 （ｃ）安定ｐＨ：３０℃、２４時間の処理条件におい
て、ｐＨ１．５〜１２．０で安定である。 （ｄ）最適温度：最適作用温度は７０〜７５℃である。 （ｅ）安定温度：ｐＨ７．０、１０分間の処理条件にお
いて、カルシウム無添加の場合は５５℃、カルシウムを
添加した場合は６０℃まで安定である。 （ｆ）分子量：約５６，０００（ＳＤＳ電気泳動法）で
ある。 （ｇ）等電点：約１０〜１０．５（等電点電気泳動法）
である。 （ｈ）比活性：カゼインを基質とした場合は２１４，０
００（Ｕ／ｍｇタンパク）、ケラチンを基質とした場合
は５２，７００（Ｕ／ｍｇタンパク）である。 （ｉ）阻害：ＰＣＭＢ（パラクロロマーキュリーベンゾ
エイト）、ヨード酢酸、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四
酢酸）では活性は阻害されないが、ＤＦＰ（ジイソプロ
ピルフルオロホスフェート）、ＰＭＳＦ（フェニルメタ
ンスルフォニルフルオライド）では阻害される。 - 【請求項２】好アルカリ性放線菌ストレプトミセス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属菌から得られる、請求項１
記載のプロテアーゼ。 - 【請求項３】ストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＴＯＴＯ−９３０５株から得
られる、請求項１記載のプロテアーゼ。 - 【請求項４】好アルカリ性ストレプトミセス属に属し、
請求項１記載のアルカリプロテアーゼ産生能を有する微
生物を培養する工程と、該工程で得られた培養物より該
アルカリプロテアーゼを分離する工程とを含んでなる、
アルカリプロテアーゼの製造法。 - 【請求項５】前期微生物の培養がｐＨ８．０〜１３．０
のアルカリ性で行われる、請求項４記載の製造法。 - 【請求項６】前記微生物がストレプトミセス エスピー
ＴＯＴＯ−９３０５株である請求項４記載のプロテア
ーゼ製造法。 - 【請求項７】ストレプトミセス エスピー ＴＯＴＯ−
９３０５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６４０）。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32253595A JP3601043B2 (ja) | 1995-11-02 | 1995-11-02 | 新規アルカリプロテアーゼおよびその製造法、新規アルカリプロテアーゼからなる製品。 |
| US09/076,842 US6156557A (en) | 1995-11-02 | 1998-05-13 | Alkaline protease from streptomyces sp. and method for preparing the same |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32253595A JP3601043B2 (ja) | 1995-11-02 | 1995-11-02 | 新規アルカリプロテアーゼおよびその製造法、新規アルカリプロテアーゼからなる製品。 |
| US09/076,842 US6156557A (en) | 1995-11-02 | 1998-05-13 | Alkaline protease from streptomyces sp. and method for preparing the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09121855A true JPH09121855A (ja) | 1997-05-13 |
| JP3601043B2 JP3601043B2 (ja) | 2004-12-15 |
Family
ID=26570850
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32253595A Expired - Fee Related JP3601043B2 (ja) | 1995-11-02 | 1995-11-02 | 新規アルカリプロテアーゼおよびその製造法、新規アルカリプロテアーゼからなる製品。 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6156557A (ja) |
| JP (1) | JP3601043B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999018218A1 (fr) * | 1997-10-07 | 1999-04-15 | Kao Corporation | Protease alcaline |
| US6803222B2 (en) | 2000-11-22 | 2004-10-12 | Kao Corporation | Alkaline proteases |
| US8153413B2 (en) | 2004-11-18 | 2012-04-10 | Japan Agency For Marine-Earth Science And Technology | High alkaline protease and use thereof |
| WO2019142774A1 (ja) * | 2018-01-16 | 2019-07-25 | 花王株式会社 | 角質汚れ洗浄剤、及び角質汚れ分解能の評価方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001164300A (ja) * | 1999-12-06 | 2001-06-19 | Daiwa Kasei Kk | 皮革鞣製における酵素脱毛剤及び酵素脱毛法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3439286B2 (ja) * | 1995-07-05 | 2003-08-25 | 日機装株式会社 | 電子スピン共鳴用試料加熱方法および装置 |
-
1995
- 1995-11-02 JP JP32253595A patent/JP3601043B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-05-13 US US09/076,842 patent/US6156557A/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999018218A1 (fr) * | 1997-10-07 | 1999-04-15 | Kao Corporation | Protease alcaline |
| US6759228B2 (en) | 1997-10-07 | 2004-07-06 | Kao Corporation | Alkaline protease |
| US7297528B2 (en) | 1997-10-07 | 2007-11-20 | Kao Corporation | Alkaline protease |
| US6803222B2 (en) | 2000-11-22 | 2004-10-12 | Kao Corporation | Alkaline proteases |
| US7371839B2 (en) | 2000-11-22 | 2008-05-13 | Kao Corporation | Alkaline proteases |
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