MXPA03005127A - Hidrolizados proteicos enriquecidos en peptidos que tienen un residuo carboxiterminal de prolina. - Google Patents

Hidrolizados proteicos enriquecidos en peptidos que tienen un residuo carboxiterminal de prolina.

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Abstract

Se describe un metodo para producir por via enzimatica un hidrolizado proteico a partir de un sustrato proteico, donde se usa una endoproteasa especifica para prolina, o una composicion que contiene una endoproteasa especifica para prolina, y, opcionalmente, subtilisina o una metaloendoproteasa, y otras enzimas, tales como carboxlpeptidasas, para producir un hidrolizado proteico enriquecido en fragmentos peptidicos que tienen un residuo carboxiterminal de prolina. Dichos hidrolizados proteicos pueden usarse como tales o para reducir el sabor amargo de alimentos con suplementos nutricionales de hidrolizados proteicos, asi como para producir alimentos que contienen hidrolizados que tienen baja antigenicidad.

Description

HIDROLIZADOS PROTEICOS ENRIQUECIDOS EN PÉPTIDOS QUE TIENEN UN RESIDUO CARBOXITERMINAL DE PROLINA Campo de la invención La presente invención se relaciona con hidrolizados con un método para producir los hidrolizadoa y con el uso de estos hidrolizados Antecedentes de la invención Los hidrolizados enzimáticos de leche o de fracciones de leche tienen solamente una aplicación limitada en la industria Aún estos hidrolizados ocupan nichos interesantes en el como lo evidencia el gran volumen de literatura que describe y reivindica procesos optimizados para obtener dichos La leche o las fracciones de leche se someten a enzimas que tienen actividad para producir los hidrolizados y principalmente minimizar la alergenicidad del y facilitar la ingesta al ofrecer un producto fácilmente asimilable durante la digestión y estabilizar las proteínas en los productos ácidos contra la precipitación durante períodos de almacenamiento Aunque la reducción del peso molecular de las proteínas de la leche es una práctica comúnmente aceptada para producir estos efectos la hidrólisis enzimática de las proteínas de la leche tiene Los aspectos negativos de la incubación de la leche con enzimas incluyen la digestión proteolítica un sabor cada vez más amargo cuanto más se reduce la longitud de los fragmentos menores rendimientos de productos finales debidos a los pasos de purificación y cambios de sabor poco causados por altos niveles de aminoácidos Es comúnmente difícil obtener la degradación uniforme y completa de todas las fracciones de leche a través de una incubación con endoproteasas Por se sabe que la es resistente a y la digestión parcial de esta molécula puede conducir a reacciones inesperadamente fuertes contra fórmulas así como a una precipitación visible de en productos tales como bebidas ácidas para Para garantizar la ausencia de proteínas digeridas en forma inadecuada en un hidrolizado se requiere generalmente de un paso de ultrafiltración para la remoción de los grandes fragmentos peptídicos restantes en el Este paso indispensable para eliminar estos fragmentos proteicos parcialmente digeridos del hidrolizado disminuye inevitablemente el rendimiento del producto de la digestión incrementando así los costos de Puede superarse la antigenicidad de las proteínas digiriéndolas en péptidos que tienen solamente residuos de pero los péptidos creados mediante una digestión proteolítica tan extensa pueden resultar muy La explicación general de este fenómeno es que los péptidos más con un mayor contenido de aminoácidos hidrofóbicos promueven sabores La naturaleza del material proteico inicial el tipo de enzimas usadas para la digestión y la longitud de los péptidos obtenidos determina en gran medida cuán amargo es el sabor asociado con el hidrolizado Por se sabe que la que contiene muchos aminoácidos genera hidrolizados mucho más amargos que las proteínas del En operaciones se elimina el amargor de los hidrolizados proteicos por medio de la eliminación selectiva de péptidos usando carbón activado o absorción en una resina La reducción concomitante en el rendimiento durante dichos pasos de eliminación incrementa el costo del producto Más este proceso tiene un impacto negativo sobre el valor nutricional del producto ya que pueden perderse varios aminoácidos indispensables desde el punto de vista nutricional debido a su naturaleza incluyendo fenilalanina e Por la remoción del amargor por estos medios tiende a producir hidrolizados deficientes en estos aminoácidos de importancia Puede lograrse también la remoción del amargor sometiendo los hidrolizados a exopeptidasas En este se liberan aminoácidos aminoterminales y carboxiterminales de los con el fin de reducir su hidrofobicidad La exposición de los péptidoa a exoproteasas no selectivas en la liberación de cantidades incontrolables de aminoácidos libres del hidrolizado El calentamiento subsiguiente de dichos hidrolizados que contienen aminoácidos se lo requiere para la esteriliazción o el secado por comúnmente genera sabores desagradables en la mezcla a través de reacciones de Más los altos niveles de aminoácidos libres creados por las exoproteasas pueden incrementar el valor osmótico del hidrolizado final hasta niveles que causan diarrea la producción de hidrolizados proteicos representa un compromiso entre los pros y las contras de la digestión proteolítica La práctica común es optimizar la digestión enzimática de sustratos proteicos para los requerimientos particulares de una categoría de Por los hidrolizados proteicos dirigidos a niños verdaderamente alérgicos requieren de una digestión proteolítica seguida por la remoción rigurosa de cualquier fragmento proteico de gran peso molecular En los productos diseñados para que raramente muestran alergias a la leche contienen típicamente hidrolizados donde se incrementa la longitud peptídica promedio para minimizar la posibilidad de aparición de sabores desagradables y maximizar el rendimiento máximo del Se considera que proteínas más importantes de la tales como la la y la así como las fracciones de proteínas vegetales por de aislados de proteínas de arroz y gluten de son compuestos Por se considera que la digestión de estas proteínas de la leche y los hasta lograr pesos moleculares de menos de 3000 es importante para minimizar la alergenicidad Se cree que especialmente la fracción de es un alérgeno ya que esta proteína no está presente en la leche humana y la digestión proteolítica de la ha probado ser Las fórmulas infantiles que contienen hidrolizados proteicos que se han hidrolizado en forma exhaustiva contienen típicamente grandes niveles de aminoácidos que indican un sabor y alta Las evaluaciones recientes de productos de fórmulas infantiles comercializados en la actualidad han demostrado que la mayor parte de ellos aún contiene materiales inmunogénicos basados en Esta observación indica que aún subsiste la demanda de nuevas mezclas que conduzcan a mejores hidrolizados a menor Los hidrolizados proteicos en productos destinados para consumidores con necesidades no por atletas o gente en dieta para deben adecuarse para proveer buenas características de Bajo estas un buen así como un buen aspecto tal como solubilidad bajo condiciones es de gran Los productos en esta incluyendo los jugos fortificados de frutas y las bebidas para se entre en suplementos de glutamina y arginina para mejorar la salud del Las bebidas para por sirven para mejorar la resistencia física y la recuperación de un atleta después de un ejercicio prolongado de alta Se han considerado fuentes de cereales ricos en tales como el gluten de o fuentes proteicas ricas en como las proteínas de arroz y los aislados de como alternativas a las proteínas de la para satisfacer las necesidades de suplementos de productos ácidos relacionados con la Sin duchas proteínas de particularmente el gluten de muestran solubilidades muy pobres a valores de pH más es aquellos superiores a lo que significa que es difícil obtener hidrolizados de gluten completamente solubles Debido a la influencia negativa sobre el costo del producto y la calidad asociada con la hidrólisis de se han descripto en publicaciones previas varias mezclas enzimáticas dirigidas al mejoramiento de las características de los hidrolizados y la disminución de los costos de Los ejemplos incluyen EP 321 que se refiere al uso de endoproteasas derivadas de como la la quimiotripsina y la y EP 325 986 y que favorecen el uso de endoproteasas obtenidas de especies de Bacillus o Se han descripto varias exoproteasas como capaces de remover el amargor de mezclas de Mientras por EP 0223 560 se refiere al uso de una endoproteasa específica para WO 96113174 se refiere a una mezcla de aminopeptidasas y carboxipeptidasas para este Se describen en una cantidad de publicaciones los efectos beneficiosos de las endoproteasas específicas para en comparación con varias exopep para producir hidrolizados proteicos que tienen perfiles de sabor amargo relativamente Por la patente japonesa JP02039896 se refiere al uso de una endoproteasa específica para prolina combinada con una para generar preparaciones de péptidos de bajo peso Se describe la degradación de oligopéptidos ricos en prolina por tres hidrolasas específicas para prolina esencial para acelerar la maduración del sin que aparezca sabor amargo of Dairy 77 más se describe la remoción del efecto del amargor de endoproteasas específicas para en combinación con una en JP5015314 describe una preparación enzimática cruda obtenida de Aspergillus oryzae que aparte de una actividad proteolítica no especifica pequeñas cantidades de una endoproteasa específica para prolina y actividad de De acuerdo con los residuos de prolina presentes en los extremos carboxilo de las proteínas causan sabores amargos y son La incubación de proteínas de soja con una mezcla de enzimas endoproteasas y carboxipeptidasas dio como resultado un hidrolizado que fue significativamente menos amargo que un hidrolizado de soja obtenido con una preparación de proteasa que carecía de la combinación de endoproteasa y carboxipeptidasa específica para el estado de la técnica sugiere fuertemente que la liberación mediada por exopeptidasas de residuos de aminoácidos hidrofóbicos del extremo es esencial para remover significativamente el amargor de los hidrolizados Del mismo las referencias que se refieren específicamente a endoproteasas específicas para prolina para la remoción del amargor establecen que la función de esta actividad es exponer los residuos hidrofóbicos de para permitir su remoción subsiguiente por medio de una carboxipeptidasa La implicación de esta hipótesis es que la actividad de remoción del amargor de las endoproteasas específicas para prolina está relacionada con la remoción eficiente de los residuos carboxiterminales de en vez de con la creación de péptidos que poseen dichos residuos carboxiterminales de Resumen de la invención La presente invención provee un hidrolizado proteico que comprende donde la fracción molar de péptidos que posee una prolina carboxiterminal es más del doble de la fracción molar de prolina en el sustrato proteico usado para generar el La presente invención provee un hidrolizado de suero que comprende donde la fracción molar de péptidos que tienen una prolina carboxiterminal es de al menos preferiblemente al menos más preferiblemente entre 30 y un hidrolizado de caseína que comprende donde la fracción molar de péptidos que tienen una prolina carboxiterminal es de al menos preferiblemente al menos y más preferiblemente menos de un hidrolizado de soja que comprende donde la fracción molar de péptidos que tienen una prolina carboxiterminal es de al menos preferiblemente entre 30 y un hidrolizado de gluten que comprende donde la fracción molar de péptidos que tienen una prolina carboxiterminal es de al menos preferiblemente al menos ventajosamente menos de y un hidrolizado de cebada que comprende donde la fracción molar de péptidos que tienen una prolina carboxiterminal es de al menos preferiblemente al menos ventajosamente menos de La presente invención provee además una endoproteasa específica para prolina que se selecciona del grupo que consiste un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 1 a 526 de SEQ ID 2 o un fragmento de la un polipéptido que está codificado por un polinucleótido que hibridiza bajo condiciones de baja severidad con la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID o un fragmento de la que al menos o idéntico en preferiblemente en 100 más preferiblemente al menos idéntico en 200 o una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID y una molécula de que codifica la endopeptidasa La presente invención provee el uso de un hidrolizado proteico de la invención en un alimento o el uso de una endoproteasa específica para prolina de acuerdo con la un método para producir por medios enzimáticos un hidrolizado proteico a partir de un sustrato donde el sustrato proteico se incuba con una endoproteasa específica para prolina para producir un hidrolizado proteico enriquecido en péptidos que tienen una prolina carboxiterminal una composición enzimática que comprende una endoproteasa específica para prolina de la composición que es capaz de producir un hidrolizado proteico que comprende donde la fracción molar de péptidos que tienen una prolina carboxiterminal es al menos el doble de la fracción molar de prolina en la proteína o en un hidrolizado de la y un alimento que comprende un hidrolizado proteico de la invención o que puede obtenerse empleando un método de la Descripción detallada de la invención Se ha demostrado que una alta incidencia de residuos de prolina en el extremo carboxiterminal de los péptidos puede correlacionarse con un sabor poco Más se ha demostrado que la alta incidencia deseada de residuos carboxiterminales de prolina puede lograrse solamente con altas concentraciones de una endoproteasa específica para es concentraciones que exceden la actividad especificada en JP5015314 por varios órdenes de y aún más en ausencia de una carboxipeptidasa Desde un punto de vista la implicación de esta observación es que existe la necesidad clara de un medio mejorado para producir endoproteasas específicas para prolina en grandes cantidades y en forma relativamente Una forma preferida de llevar esto a cabo es a través de la sobreproducción de dicha endoproteasa específica para usando técnicas de ADN recombinante Como muchos productos alimenticios son ácidos y las incubaciones enzimáticas a largo plazo bajo circunstancias no requieren de condiciones de incubación ácida para evitar la contaminación una forma más preferida de realizar esto es por medio de la sobreproducción de una endoproteasa específica para prolina estable ante usando técnicas de ADN Una forma de realizar esto particularmente preferible es a través de la sobreproducción de una endoproteasa específica para prolina derivada de y una forma de realizar esto más preferida es mediante la sobreproducción de una endopeptidasa específica para prolina de Aspergillus Para permitir esta última se requiere de información sobre una endoproteasa específica para prolina derivada de Aspergillus Más debe estar disponible la secuencia de nucleótidos completa de la secuencia codificante del Una vez que se ha hecho disponible la nueva enzima en una forma relativamente se contemplan otras aplicaciones nuevas y sorprendentes que tienen ventajas técnicas y Una nueva aplicación sería la creación de hidrolizados no amargos de sustratos proteicos con composiciones inusuales de Dichas composiciones inusuales de aminoácidos pueden ofrecer serios beneficios en determinadas aplicaciones Los ejemplos son la caseína o el gluten de o los aislados de proteínas de maíz con altos niveles de residuos de aminoácidos hidrofóbicos Hasta estos sustratos no tenían un uso debido a los sabores amargos generados por la hidrólisis requerida por los métodos Usando el método de hidrólisis de acuerdo con la pueden prepararse nuevos hidrolizados no que pueden usarse en la nutrición de niños o pacientes en dietas así como en dietas para el consumidor y en la nutrición de los Aparte de dichos hidrolizados se contemplan también aplicaciones que aprovechan el efecto de reducción del amargor de una endoproteasa ácida específica para prolinas como Por la incorporación de la en productos alimenticios tales como queso o que involucra un paso de es útil para suprimir el amargor que puede desarrollarse al pasar el en productos alimenticios proteicos que requieren de un tratamiento con tales como la producción de quesos modificados por o la producción de hidrolizados proteicos para la industria de los saborizantes la incorporación de la enzima de acuerdo con la invención ayudará a suprimir el sabor Más se investigan también beneficios no relacionados directamente con la supresión del sabor Una de dichas aplicaciones nuevas es la incubación de la enzima con proteínas alimenticias para reducir su Varias proteínas alimenticias contienen subfracciones altamente tales como el gluten de que contiene con secuencias peptídicas ricas en Estas proteínas pueden someterse a nuevas enzimas para aliviar su Otra nueva aplicación es la incorporación de la enzima en todas las clases de ya que se ha observado que ésta demora la formación de sabor rancio en los panes Otra aplicación nueva es el uso de la endoproteasa específica para prolina con el fin de generar péptidos ricos en Dichos péptidos ricos en prolina son adiciones deseables para varios productos alimenticios o nutracéticos ya que se los ha implicado en la acción en efectos fibrinolíticos antitrombóticos y antihipertensívos en la protección de la mucosa así como en la prevención de la artritis Otra aplicación sorprendente es la adición de la nueva enzima a un alimento para para mejorar el uso de las Por la adición de la enzima conduce a una digestibilidad mejorada de las secuencias ricas en prolina difíciles de presentes en el alimento así como a velocidades de conversión mejoradas para proteínas vegetales poco costosas que contienen altos niveles de En aún otra se usa la enzima en la fabricación de Las proteínas de la cebada son ricas en secuencias con alto contenido de y sus proteínas de cereales no son extremadamente difíciles de degradar en los aminoácidos libres requeridos para crear un mosto de fermentación se ha demostrado que la incorporación de la nueva enzima en el proceso de molienda estimula la liberación de aminoácidos de la cebada pero no de modo que se obtiene un mosto más De forma puede mejorarse la fermentación de cerveza a partir de sustratos molidos que contienen una mayor proporción de otros cereales poco costosos y disponibles en forma tales por el En la mayor parte de estas aplicaciones la endoproteasa específica para prolina debería mostrar preferiblemente un espectro de actividad con un pH óptimo Para superar los problemas antes la invención demuestra que la actividad de una endopeptidasa específica para prolina aislada y es sin la actividad sustancial concomitante o subsiguiente de una enzima es suficiente para remover el amargor en forma significativa de un hidrolizado la endoproteasa específica para prolina puede comprender al menos 5 unidades por gramo de proteína de la preparación enzimática de la preferiblemente 10 más preferiblemente 25 y aún más preferiblemente 50 Más los estudios realizados de acuerdo con la invención demuestran que la actividad de la endoproteasa específica para prolina aislada y es sin la actividad sustancial concomitante o subsiguiente de una enzima es suficiente para disminuir significativamente el nivel de inmunogenicidad total de los hidrolizados así como para incrementar significativamente su solubilidad total bajo condiciones ácidas Los hidrolizados producidos de acuerdo con la invención están enriquecidos en péptidos que tienen un residuo carboxiterminal de Una realización de la presente invención provee una mezcla enzimática que comprende una endoproteasa específica para prolina aislada y para la producción de alto rendimiento de hidrolizados proteicos que tienen un sabor sustancialmente poco amargo y escasas propiedades sin la producción concomitante de niveles sustanciales de aminoácidos Esta mezcla enzimática es adecuada para preparar hidrolizados de varias fracciones En puede incubarse un sustrato tal como una proteína de la con una endoproteasa específica para prolina aislada y y una para producir un hidrolizado proteico enriquecido en fragmentos peptídicos que tienen una prolina carboxiterminal El término significa que al menos de los fragmentos peptídicos en el producto hidrolizado de la separación enzimática poseen un residuo carboxiterminal de La presente invención provee un hidrolizado proteico obtenido por medio de la hidrólisis de una proteína que comprende donde la fracción molar de péptidos que tiene una prolina es al menos el doble de la fracción molar de prolina en el sustrato proteico usado para producir el La longitud promedio de los péptidos en los hidrolizados en de entre 3 y 9 Los hidrolizados preferidos de acuerdo con la invención un hidrolizado de suero que comprende donde la fracción molar de péptidos que tienen una prolina es de al menos preferiblemente al menos más preferiblemente entre 30 y un hidrolizado de caseína que comprende donde la fracción molar de péptidos que tienen una prolina carboxiterminal es de al menos preferiblemente entre 30 y y un hidrolizado de soja que comprende donde la fracción molar de péptidos que tienen una prolina carboxiterminal es de al menos pre eriblemente entre 30 y Por péptidos o fragmentos peptídicos se entienden péptidos con masas moleculares de entre 400 y 2000 Estos péptidos pueden analizarse de acuerdo con el análisis de que se describe en la sección de y En en la producción de los hidrolizados proteicos de la el sustrato proteico se hidroliza en forma al menos en un al menos del sustrato proteico se convierte en péptidos que tienen masas moleculares de entre 400 y 2000 Más entre 20 y y aún más entre 30 y del sustrato proteico se convierte en dichos En otra realización de la puede incubarse un sustrato proteico con una mezcla enzimática que comprende una endoproteasa específica para prolina aislada y una endoproteasa de serina o una metalo y una para producir un hidrolizado proteico enriquecido en fragmentos peptídicos que tienen una prolina carboxiterminal La mezcla enzimática de la invención es particularmente adecuada para usar en la producción de hidrolizados proteicos diseñados para mejorar el sabor y la composición nutritiva de bebidas para deportistas y bebidas basadas en ya que la mezcla de péptidos hidrolizados resultantes combina un perfil de amargor muy bajo con una solubilidad excelente bajo las condiciones ácidas prevalentes en dichas La mezcla enzimática de la invención se caracteriza porque contiene al menos una por una proteasa de serina o una metalo en combinación con una endoproteasa específica para prolina para obtener un hidrolizado Más la invención se relaciona con una endoproteasa específica para prolina aislada y y una mezcla enzimática de proteasa de serina o metalo capaz de producir un hidrolizado proteico que comprende fragmentos donde al menos preferiblemente al menos más preferiblemente entre 30 y de dichos fragmentos peptídicos tiene una a prolina Otra realización de la invención es un hidrolizado proteico enriquecido con un contenido relativamente alto de péptidos que tienen prolina como residuo aminoacídico Dichos hidrolizados enriquecidos pueden comprender al menos preferiblemente al menos más preferiblemente entre 30 y de fragmentos peptídicos que tienen un residuo carboxiterminal de Como las preparaciones enzimáticas usadas típicamente en la génesis de hidrolizados proteicos no pueden generar péptidos que poseen residuos de prolina en el extremo los hidrolizados proteicos que son relativamente ricos en dichos péptidos son Los sustratos para la hidrólisis con una mezcla de la invención incluyen leche leche caseína caseína de productos de suero ácido o productos de suero de la Endoproteasa específica para prolina derivada de Aspergillus no corta solamente en el sector carboxiterminal de los residuos de sino que también lo hace en el sector carboxiterminal de los residuos de lo que convierte a otras proteínas animales basadas en tales como la así como loa huesos o las espinas que contienen carne en sustratos interesantes para la Más los sustratos como el gluten de la cebada molida y las fracciones proteicas por de arroz o son sustratos Los hidrolizados proteicos de leche producidos de acuerdo con la invención pueden con y sin pasos adicionales de filtración o en varios alimentos tales como los hidrolizados hipoalergénicos de nutrición los hidrolizados básicos para nutrición entérica y así como los concentrados proteicos para varias formas de alimentos Por los hidrolizados proteicos de la invención pueden usarse para producir alimentos que tienen poca tales como fórmulas las preparaciones enzimáticas de acuerdo con la invención pueden usarse para reducir el amargor en alimentos saborizados con al menos un hidrolizado aún cuando el hidrolizado proteico está presente en grandes Por los alimentos pueden comprender entre y de un hidrolizado y aún tener un sabor amargo reducido por medio del uso de una preparación de la La presente invención provee una endoproteasa específica para prolina aislada y con un pH óptimo sola o en una composición que comprende una o más enzimas para la preparación de un hidrolizado proteico que puede usarse en varias aplicaciones Se define dicha endoproteasa específica para prolina aislada y purificada como poseedora de al menos 10 unidades de actividad de endoproteasa específica para prolina por gramo de material Estas unidades deberían medirse usando el péptido sintético a 37 grados C y pH 5 en el caso de que el pH óptimo de la endoproteasa específica para prolina sea menor que pH por en el caso de la endoproteasa específica para midiéndose las unidades a pH como se especifica en la sección de Materiales y Esta enzima aislada y sola o en una mezcla supera una cantidad de desventajas de las mezclas enzimáticas conocidas previamente en la Más destecablemente la endoproteasa específica para prolina aislada y purificada de la invención es clave para la producción de hidrolizados que combinan un potencial alergénico un alto rendimiento y un bajo perfil de Más los hidrolizados producidos con la endoproteasa específica para prolina aislada y o con una mezcla enzimática que comprende esta endoproteasa específica para son estables en ambiente ácido y contienen niveles muy bajos de aminoácidos de modo tal que se genera un mínimo de sabores amargos durante los pasos de tales como el secado por rocío o la esterilización del Los hidrolizados de acuerdo con la invención contendrán menos de 900 micromoles de aminoácidos libres por gramo de polvo preferiblemente menos de 300 micromoles de aminoácidos libres por gramo de polvo más preferiblemente menos de 150 micromoles de aminoácidos libres por gramo de polvo y aún más preferiblemente menos de 50 micromoles por gramo de polvo La mezcla de acuerdo con la invención se caracteriza porque comprende otra tal como una proteasa de serina o una metalo en combinación con una endoproteasa específica para prolina aislada y purificada que trabajan juntas para proveer un hidrolizado proteico Las proteasas de serina representan una clase bien conocida de endoproteasas y algunos de sus representantes más tales como la subtilisina y la prefieren cortar la cadena peptídica en el sector carboxiterminal de aminoácidos hidrofóbleos tales como Phe y La mezcla enzimática de la invención puede contener quimiotripsina La subtilisina es producida por una especie de tiene una especificidad de sustrato particularmente y un pH óptimo La enzima es óptimamente activa entre y La enzima es poco está disponible como un producto comercial regular y es útil para la por de varios hidrolizados de La quimiotripsina puede obtenerse de páncreas de tiene una especificidad de sustrato algo más a valores de pH ligeramente más alcalinos que la y es activa debajo de los 50 grados La clase de metalo endoproteasas está ampliamente distribuida en hongos y organismos Pueden dividirse entre metaloproteasas neutras y De estas dos solamente las proteasas neutras muestran la preferencia de corte es cortan la cadena peptídica en el sector de residuos de la cadena tales Phe y Los representantes bien conocidos de la categoría de metalo proteasas neutras son al baciliolisina y la termolisina y cualquiera de o puede estar presente en la mezcla de la Ambas enzimas se obtienen de especies de Bacillus y muestran una actividad máxima bajo condiciones neutras o levemente Se han obtenido representantes menos conocidos de estas metalo endoproteasas neutras de especies de En los casos donde no se usa la endoproteasa específica para prolina debido a sus efectos de remoción del sino para contribuir en la hidrólisis de secuencias proteicas ricas en pueden ser ventajosas las combinaciones con metaloproteasas de tipo por deuterolisinas Una endoproteasa específica para prolina es una endoproteasa capaz de cortar péptidos o polipéptidos en el extremo carboxiterminal de los residuos de Dichas enzimas se hallan ampliamente en animales y pero su presencia en microorganismos parece ser Hasta se han identificado endoproteasas específicas para prolina en especies de Aspergillus 0 522 0 967 Aero onas Xanthomonas y Bacteroides Aunque las enzimas específicas para prolina de la mayor parte de estos organismos son activas a aproximadamente pH la enzima de Aspergillus es óptimamente activa a aproximadamente pH De acuerdo con una realización se usa una endoproteasa específica para prolina que tiene un pH óptimo menor que preferiblemente tiene un pH óptimo de entre y debido a las ventajas técnicas y económicas de dichas La endoproteasa específica para prolina de la invención puede aislarse de una de las especies microbianas antes particularmente de una especie de Aspergillus la endoproteasa específica para prolina se aisla de una cepa de Aspergillus Más la endoproteasa específica para prolina se aisla de un Aspergillis niger huésped modificado para sobreexpresar un gen que codifica una endoproteasa específica para aunque pueden usarse otros tales como como vectores de expresión Por la clonación y sobreproducción de endoproteasas específicas para prolina de entre en ha provisto varias endoproteasas específicas para prolina en forma Se provee un ejemplo de dicha construcción de sobreproducción en World Journal of Microbiology Volumen páginas Se usa preferiblemente un Aspergillus niger huésped para producir una no utilizando promotores de niger para dirigir la expresión de un gen que codifica una endoproteasa específica para prolina de La mayor parte de las publicaciones científicas referentes a la clonación y la producción de endoproteasas específicas para prolina se centran en la función de esta enzima en la síntesis y la regulación de proteínas activas en el ámbito Las publicaciones que implican esta enzima en la producción de hidrolizados proteicos útiles son escasas y se refieren al uso de la enzima en combinación con una Varias publicaciones japonesas se refieren a la presencia de actividad endoproteolítica específica para prolina en mezclas enzimáticas crudas y capaces de producir hidrolizados con perfiles bajos de sabor pero las mezclas enzimáticas usadas siempre contenían exoproteasas No se sugiere en la técnica una relación directa entre la remoción del sabor amargo y la actividad endoproteolítica específica para prolina en ausencia de exoproteasas como carboxipeptidasas o aminopeptidasas Más no se han descripto previamente relaciones entre los hidrolizados producidos usando una actividad endoproteolítica específica para prolina y una respuesta inmunogénica disminuida o una solubilidad ácida Un polipéptido de la invención que tiene actividad de endoproteasa específica para prolina puede estar en una forma Como se lo define en la presente un polipéptido aislado es un polipéptido producido en forma endógena o recombinante que está esencialmente libre de otros polipéptidos distintos de la endoproteasa específica para y está típicamente en una pureza de al menos aproximadamente preferiblemente al menos aproximadamente más preferiblemente al menos aproximadamente aún más preferiblemente al menos aproximadamente aún más preferiblemente con de y más preferiblemente con aproximadamente de determinada por El polipéptido puede aislarse por centrifugación y métodos cromatográficos o empleando cualquier otro procedimiento conocido en la técnica para obtener proteínas puras a partir de soluciones Se comprenderá que el polipéptido puede combinarse con vehículos o diluyentes que no interfieran con el propósito deseado para el por lo el polipéptido en esta forma aún se considerará El polipéptido estará generalmente en una preparación donde más de por más de o en peso las proteínas en la preparación sean un polipéptido de la el polipéptido de la invención se obtiene de un microorganismo que posee un gen que codifica una enzima con actividad de endoproteasa específica para Más el microorganismo es un y óptimamente es un hongo Por los organismos preferidos son del género tales como aquellos de la especie Aspergillus En una primera la presente invención provee un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 1 a 526 de SEQ ID 2 el de al menos aproximadamente preferiblemente al menos aproximadamente preferiblemente al menos aproximadamen e pre eriblemente al menos aproximadamente preferiblemente al menos aproximadamente más preferiblemente al menos aproximadamente aún más preferiblemente al menos aproximadamente aún más preferiblemente al menos aproximadamente y más preferiblemente al menos aproximadamente y que tiene actividad de endoproteasa específica para Para los propósitos de la presente el grado de identidad entre dos o más secuencias de aminoácidos se determina empleando el programa de búsqueda en bases de datos BLAST P para proteínas et Nucleic Acids Research con la matriz 62 y un umbral esperado de Un polipéptido de la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID una secuencia sustancialmente homóloga o un fragmento de cualquiera de las secuencias que tiene actividad de endoproteasa específica para En se prefiere la secuencia de aminoácidos de ocurrencia natural que se indica en SEQ ID El polipéptido de la invención puede comprender también una variante o una especie homóloga de ocurrencia natural del polipéptido de SEQ ID Una variante es un polipéptido que aparece en forma por en levaduras o células donde la variante tiene actividad de endoproteasa específica para prolina y una secuencia sustancialmente a la proteína de SEQ ID 2 El término se refiere a polipéptidos que tienen las mismas características esenciales o la misma funcionalidad biológica que la endoproteasa específica para prolina de SEQ ID e incluye variantes El carácter esencial de la endoproteasa específica para prolina de SEQ ID 2 es que es una enzima capaz de cortar el aminoácido aminoterminal de una proteína o un éptido un polipéptido variante tiene al menos el mismo nivel de actividad de endoproteasa específica para prolina que el polipéptido de SEQ ID Las variantes incluyen variantes alélicas de la misma cepa que el polipéptido de SEQ ID 2 o de una cepa diferente del mismo género o De forma una especie homóloga a la proteína de la invención es una proteína equivalente con una secuencia que es una endoproteasa específica para prolina y ocurre naturalmente en otra especie de Aspergillus Las variantes y las especies homólogas pueden aislarse usando los procedimientos que se describen en la presente que se usaron para aislar el polipéptido de SEQ ID y realizando procedimientos como los en una superficie celular por una una un hongo o una célula vegetal También es posible usar una sonda de la invención para rastrear bibliotecas preparadas a partir de células de hongos o para obtener clones que expresan las variantes o especies homólogas del polipéptido de SEQ ID Estos clones pueden manipularse empleando técnicas convencionales para generar un polipéptido de la que puede producirse subsiguientemente por medio de procedimientos o sintéticos conocidos per La secuencia del polipéptido de SEQ ID y de las variantes y las especies pueden modificarse también para proveer los polipéptidos de la Pueden realizarse sustituciones de por entre 2 ó y 20 ó 30 Puede efectuarse también la misma cantidad de deleciones e cambios pueden realizarse sin afectar las regiones críticas para la función del de modo que dicho polipéptido retenga su actividad de endoproteasa específica para Los polipéptidos de la invención incluyen fragmentos de los polipéptidos completos antes mencionados y de variantes de los incluyendo fragmentos de la secuencia indicada en SEQ ID Dichos fragmentos retendrán típicamente su actividad de endoproteasa específica para Los fragmentos pueden ser de al menos 100 ó 200 aminoácidos de o pueden tener esta cantidad de aminoácidos sustraídos de la secuencia completa que se indica en SEQ ID De ser pueden producirse los polipéptidos de la invención empleando medios aunque comúnmente se los preparará en forma como se describirá más Los polipéptidos sintéticos pueden por por medio de la adición de residuos de histidina o de una marca T7 para ayudar a identificarlos o o por medio de la adición de una secuencia para promover su secreción de la célula Por las secuencias variantes pueden comprender aquellas derivadas de cepas de Aspergillus distintas de la cepa de la que se aisló el polipéptido de SEQ ID Pueden identificarse las variantes de otras cepas de Aspergillus observando la actividad de endoproteasa específica para prolina y usando procedimientos de clonación y como se describe en la presente Las variantes pueden incluir la la modificación o la adición de aminoácidos individuales o grupos de aminoácidos dentro de la secuencia siempre y cuando el péptido mantenga la funcionalidad biológica básica de la endoproteasa específica para prolina de SEQ ID Pueden realizarse sustituciones de por entre 2 ó y 20 ó 30 El polipéptido modificado generalmente retendrá actividad de endoproteasa específica para Pueden realizarse sustituciones conserva dichas sustituciones son bien conocidas en la las sustituciones no afectan el plegamiento o la actividad del Las secuencias polipeptídicas más cortas están dentro del alcance de la Por se considera que un péptido de al menos 50 aminoácidos o hasta 150 ó 200 aminoácidos de largo está dentro del alcance de la siempre y cuando demuestre la funcionalidad biológica básica que la endoproteasa específica para prolina de SEQ ID En pero no este aspecto de la invención abarca la situación en la que la proteína es un fragmento de la secuencia de la proteína En una segunda la presente invención provee un polipéptido aislado que tiene actividad de endoproteasa específica para prolina y está codificado por polinucleótidos que hibridizan o pueden hibridizar bajo condiciones de baja más preferiblemente bajo condiciones de severidad moderada y más bajo condiciones de gran con la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID 1 un fragmento de ácido nucleico que comprende al menos la porción de SEQ ID pero que tiene menos que la totalidad de o que tiene bases que difieren de aquellas de SEQ ID o con una cadena de ácido nucleico complementaria con SEQ ID El término de significa que el polinucleótido de la invención puede hibridizar con el ácido nucleico usado como sonda la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID l o un fragmento de la o el complemento de SEQ ID a un nivel significativamente superior al basal La invención incluye también los polinucleó que codifican la endoproteasa específica para prolina de la así como secuencias de nucleótidos que son complementarias con la La secuencia de nucleótidos puede ser de ARN o incluyendo ADN ADN sintético o ADNc la secuencia de nucleótidos es ADN más una secuencia de ADN un polinucleótido de la invención comprende una secuencia de nucleótidos contiguos que es capaz de hibridizar bajo condiciones selectivas con la secuencia codificante de SEQ ID o con el complemento de la Dichos nucleótidos pueden sintetizarse de acuerdo con métodos bien conocidos en la Un polinucleótido de la invención puede hibridizar con la secuencia codificante de SEQ ID o con el complemento de la a un nivel significativamente superior al La hibridización basal puede por debido a la presencia de otros ADNc en una biblioteca de El nivel de señal generado por la interacción entre un polinucleótido de la invención y secuencia codificante de SEQ ID o con el complemento de la es típicamente al menos 10 preferiblemente al menos 20 más preferiblemente al menos 50 veces y aún más preferiblemente al menos 100 más intenso que las interacciones entre otros polinucleótidos y la secuencia codificante de SEQ ID La intensidad de la interacción puede por marcando la sonda con por ejemplo con Puede lograrse típicamente la hbridización selectiva usando condiciones de baja severidad de sodio M y citrato de sodio a aproximadamente severidad moderada cloruro de sodio M y citrato de sodio M a aproximadamente o gran severidad cloruro de sodio M y citrato de sodio a aproximadamente 60 Modificaciones Los polinucleótidos de la invención pueden comprender ADN o Pueden ser de cadena simple o También pueden ser polinucleótidos que incluyen nucleótidos sintéticos o incluyendo ácidos nucleicos Existe una cantidad de tipos diferentes de modificaciones para polinucleótidos que son conocidas en la Éstas incluyen esqueletos de metilfosfonato y y la adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos de la Para los propósitos de la presente debe interpretarse que los polinucleótidos que se describen en la presente documentación pueden modificarse usando cualquier método disponible en la Aquellos entrenados en la técnica deben comprender usando procedimientos de pueden prepararse sustituciones de nucleótidos que no afectan la secuencia del polipéptido codificado por los de la para reflejar el uso de codones de cualquier organismo huésped particular en el que vayan a expresarse los polipéptídos de la La secuencia codificante de SEQ ID 1 puede modificarse llevando a cabo sustituciones de por entre 2 ó y 50 ó 100 El polinucleótido de SEQ ID 1 puede como alternativa o adicionalmente realizando una o más inserciones mediante la extensión en uno o ambos El polinucleótido modificado codifica generalmente un polipéptido que tiene actividad de endoproteasa específica para Pueden realizarse sustituciones degeneradas sustituciones que puedan resultar en una sustitución conservativa de aminoácidos cuando se traduzca la secuencia por como se describirá más adelante con referencia a los Homólogos Se incluye en la invención una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridizar selectivamente con el complemento de la secuencia de ADN codificante de SEQ ID y generalmente tendrá al menos ó al menos al menos al menos al menos al menos o al menos de identidad de secuencia con la secuencia codificante de SEQ ID a lo largo de una región de al menos preferiblemente al menos más preferiblemente al menos 200 nucleótidos o más preferiblemente a lo largo de la secuencia completa de SEQ ID Del mismo la invención abarca también un nucleótido que codifica una endoproteasa específica para prolina activa y que es capaz de selectivamente con un fragmento de un complemento de la secuencia de ADN codificante de SEQ ID La invención abarca un fragmento de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID 1 que es al menos o a lo largo de preferiblemente a lo largo de 100 más preferiblemente al menos idéntico a lo largo de 200 nucleótidos Puede usarse cualquier combinación de los grados de identidad y los tamaños mínimos antes mencionados para definir los polinucleótidos de la las combinaciones más estrictas con mayor identidad a lo largo de secuencias más Por por un polinucleótido que es al menos o idéntico a lo largo de preferiblemente a lo largo de 100 forma un aspecto de la como lo hace un polinucleótido que es al menos idéntico a lo largo de 200 El paquete UWGCG provee el programa que puede usarse para calcular la identidad usado con sus parámetros por Pueden usarse también los algoritmos PILEUP y BLAST N para calcular la identidad de secuencia o alinear secuencias como identificar secuencias equivalentes o por con sus parámetros por El software para realizar los análisis BLAST está disponible para el público en el Centro Nacional de Información de Biotecnología Este algoritmo comprende identificar primero un par de secuencias con alta puntuación identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de que coinciden o satisfacen un valor positivo umbral cuando se alinean con una palabra de la misma longitud de una secuencia en una base de T se conoce como el umbral de puntuación de palabra Estos aciertos iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para iniciar búsquedas para hallar HSP que las Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada en tanta distancia como pueda incrementarse el valor de alineación Las extensiones para los aciertos de palabras en cada dirección se detienen cuando la puntuación de la alineación acumulada con el tiempo cae debajo de una cantidad respecto de su valor la puntuación acumulativa baja a cero o menos debido a la acumulación de una o más alineaciones de puntuación negativa o se alcanza el final de cualquiera de las Los parámetros del algoritmo T y determinan la sensibilidad y la velocidad de la El programa BLAST usa como parámetros por omisión una longitud de palabra de alineaciones de matriz de puntuación BLOSUM62 de una expectativa de M N y una comparación de ambas El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos Una medida de similitud provista por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma menor que provee una indicación de la probabilidad por la cual ocurriría por azar una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o Por se considera que una secuencia es similar a otra secuencia si la probabilidad de suma en una comparación de la primera secuencia con la segunda es de menos de aproximadamente preferiblemente menos de aproximadamente más preferiblemente menos de aproximadamente y más preferiblemente de menos de aproximadamente Sondas y cebadores Los polinucleótidos de la invención incluyen y pueden usarse como por como cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa como cebadores para reacciones alternativas de amplificación o como por marcadas con una marca usando medios con marcas radiactivas o no o pueden clonarse los polinucleótidos en Dichos sondas y otros fragmentos tendrán al menos por al menos 30 ó 40 nucleótidos de Tendrán típicamente hasta 200 ó 300 nucleótidos de o aún serán hasta unos pocos nucleótidos como 5 ó 10 más cortos que la secuencia codificante de SEQ ID En se producirán los cebadores por medios sintéticos que comprendan la fabricación por pasos de la secuencia de ácidos nucleicos de a un nucleótido por vez Los procedimientos para lograr esto usando protocolos automatizados están disponibles en la Se producirán polinucleótidos más largos usando medios recombinantes por técnicas de clonación por Éstas abarcarán preparar un par de cebadores de aproximadamente para amplificar la región deseada de la endoprateasa específica para prolina a poner los cebadores en contacto con o ADM genómico obtenido de una una una célula un procariota o una célula preferiblemente de una cepa de realizar una reacción en cadena de la bajo condiciones adecuadas para la amplificación de la región aislar el fragmento amplificado purificando la mezcla de reacción en un gel de y recuperando el ADN Pueden diseñarse los cebadores para que contengan sitios adecuados de reconocimiento por enzimas de de modo que pueda clonarse el ADN amplificado en un vector de clonación Pueden usarse dichos procedimientos para obtener todos o parte de los polinucleótidos que codifican las secuencias de endoproteasa específica para prolina descriptas en la presente Los los promotores y las secuencias subsiguientes están dentro del alcance de la y pueden obtenerse también de una forma análoga por medios PC o técnicas de comenzando con el ADN genómico de una célula de vegetal o Los polinucleótidos o cebadores pueden poseer una marca de Las marcas adecuadas incluyen isótopos tales como o marcas enzimáticas u otras marcas tales como Dichas marcas pueden agregarse a los polinucleótidos o cebadores de la y pueden detectarse usando procedimientos conocidos por aquellos entrenados en la Los polinucleótidos o cebadores los fragmentos de los marcados y sin pueden usarse en pruebas basadas en ácidos para detectar o secuenciar una endoproteasa específica para o una variante de la en una muestra Dichas pruebas de detección comprenderán generalmente poner en contacto una muestra fúngica sospechada de contener el ADN de con una sonda que comprenda un polinucleótido o un cebador de la bajo condiciones de y detectar cualquier doblete formado entre la sonda y el ácido nucleico en la Puede lograrse la detección usando procedimientos tales como PCR o inmovilizando la sonda en un soporte eliminando cualquier ácido nucleico de la muestra que no hibridice con la y luego detectando cualquier ácido nucleico que hibridice con la Como puede inmovilizarse la muestra de ácido nucleico en un soporte luego puede hacérselo hibridizar con la y puede detectarse la cantidad de sonda unida a dicho soporte después de la remoción de sondas no Las sondas de la invención pueden envasarse convenientemente bajo la forma de un equipo de en un recipiente En dichos la sonda puede estar unida a un soporte donde el formato del ensayo para el que está diseñado el equipo requiere de dicha El equipo puede contener también reactivos adecuados para tratar la muestra a sondear e hibridizar la sonda con el ácido nucleico en la reactivos de y La sondas y los polinucleótidos de la invención pueden usarse también en un microensayo el polinucleótido de la invención se obtiene del mismo organismo que el tal como un en particular un hongo del género Aspergillus Los polinucleótidos de la invención incluyen también variantes de la secuencia de SEQ ID 1 que codifican un polipéptido que tiene actividad de endoproteasa específica para Las variantes pueden formarse mediante sustituciones deleciones Por dichas variantes de la secuencia codificante de SEQ ID 1 pueden codificar polipéptidos que tienen la capacidad de digerir una cadena polipeptídica en el sector carboxiterminal de Producción de polinucleótidos Los polinucleótidos que no tienen de identidad con SEQ ID pero que están dentro del alcance de la pueden obtenerse de una cantidad de Por las variantes de la secuencia de endoproteasa específica para prolina descripta en la presente documentación pueden por rastreando bibliotecas de ADN genómico preparadas a partir de un rango de tales como aquellos como fuentes de los polipéptidos de la pueden obtenerse otros homólogos vegetales o procariotas de endoproteasas específicas para y dichos homólogos y fragmentos de los mismos en hibridizar con SEQ ID Dichas secuencias pueden obtenerse sondeando bibliotecas de ADNc o bibliotecas de ADN genómico de otras y analizando dichas bibliotecas con sondas que comprenden toda o parte de SEQ ID 1 bajo condiciones de severidad moderada o alta se describió Las sondas de ácidos nucleicos que comprenden toda o parte de SEQ ID 1 pueden usarse para sondear bibliotecas de ADNC o genómicas de otras tales como aquellas descriptas como fuentes de los polipéptidos de la Pueden obtenerse también especies homólogaa usando PCR que emplea cebadores diseñados para secuencias blanco dentro de las variantes y homólogos que codifican secuencias de aminoácidos Los cebadores pueden contener una o más posiciones y se usarán bajo condiciones de severidad menos estrictas que aquellas usadas para clonar secuencias con cebadores de secuencias individuales contra secuencias Como dichos polinucleótidos pueden obtenerse por dirigida a sitios específicos de secuencias de endoproteasas específicas para o variantes de las Esto puede ser por cuando se requiere de cambios de codones silenciosos en las para optimizar las preferencias de codones para una célula huésped particular en la que deseen expresarse las secuencias de polinucleótidos Pueden llevarse a cabo otros cambios de secuencias con el fin de introducir sitios de reconocimiento para enzimas de o para alterar las propiedades o las funciones de los polipéptidos codificados por los La invención incluye polinucleótidos de cadena doble que comprenden un de la invención y su complemento La presente invención también provee polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención descriptos con Como dichos polinucleótidos serán útiles como secuencias para la producción recombinante de los polipéptidos de la no es necesario que ellos sean capaces de hibridizar con la secuencia de SEQ ID aunque esto será generalmente Por otro si se lo dichos polinucleótidos pueden usarse y prepararse como se describió Polinucleótidos recombinantes La invención también provee vectores que comprenden un polinucleótido de la incluyendo vectores de clonación y en otro métodos de transformación o transfección de dichos vectores a una célula huésped por bajo condiciones en las que se desea la expresión de un polipéptido a partir de una secuencia de la o de un polipéptido codificado por Se proveen también células huésped que comprenden un polinucleótido o un vector de la donde el polinucleótido es heterólogo respecto del de la célula El término comúnmente respecto de la célula significa que el polinucleótido no aparece naturalmente en el genoma de la célula o que el polipéptido no es producido en forma natural por la la célula huésped una célula de por una célula de levadura del género Kluyveromyces o o una célula por del género Aspergillus Los polinucleótidos de la invención pueden incorporarse en un vector de replicación por un vector de clonación o El vector puede usarse para replicar un ácido nucleico en una célula huésped Por en otra la invención provee un método para preparar los polinucleótidos de la invención que comprende introducir un polinucleótido de la invención en un vector introducir el vector en una célula huésped y cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la replicación del Puede recuperarse el vector de la célula Se describen a continuación células huésped en conexión con los vectores de El vector en el cual se inserta el cassette de expresión de la invención puede ser cualquier vector que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y la elección del vector dependerá comúnmente de la célula huésped en la que vaya a Por el vector puede ser un vector de replicación es un vector que existe como entidad cuya replicación es independiente de la replicación tal como un Como el vector puede ser uno cuando se lo introduce en una célula se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con los cromosomas con los cuales se ha cuando el polinucleótido de la invención en un está unido a una secuencia reguladora que es capaz de proveer la expresión de la secuencia codificante en la célula es el vector es un vector de El término operativamente se refiere a una donde los componentes descriptos están en una relación que permite que funcionen de la manera Una secuencia tal como un un potenciador u otra señal de regulación de la expresión a una secuencia codificante se coloca de modo tal que se logra la expresión de la secuencia codificante bajo condiciones compatibles con las secuencias de Los por en el caso de un un un virus o vetcores pueden proveerse con un origen de opcionalmente un promotor para la expresión del y opcionalmente un potenciador un regulador del Puede haber presente una secuencia de como puede serlo una secuencia de poliadenilación Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores de por un gen de resistencia a en el caso de un plásmido o un gen de resistencia a para un vector de Los vectores pueden usarse in por para la producción de o pueden usarse para transfectar o transformar una célula La secuencia de ADN que codifica el polipéptido se introduce preferiblemente en un huésped como parte de una construcción de expresión en la que la secuencia de ADN está unida a señales de que son capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ADN en las células Para la transformación de un huésped adecuado con la construcción de existen procedimientos disponibles que son bien conocidos por aquellos entrenados en la Puede usarse la construcción de expresión para transformar el como parte de un vector que contiene un marcador de o puede ransíormarse la construcción de expresión como una molécula junto con el vector que tiene el marcador de Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores de Los marcadores de selección preferidos sin aquellos que complementan un defecto en la célula o que confieren resistencia a una por genes marcadores versátiles que pueden usarse para transformar la mayor parte de los hongos filamentosos y las tales como genes o ADNc de acetamidasas genes o ADNc de facA de nidulans o o genes que proveen resistencia a antibióticos como kanamicina o o resistencia a Como pueden usarse marcadores específicos de selección como marcadores auxotrópicos que requieren de las correspondientes cepas huéspedes por URA3 o genes análogos de otras pyre o pyrñ nidulans o nidulans o o En una realización el marcador de selección se elimina de la célula huésped transformada después de introducir la construcción de de modo de obtener células huésped transformadas capaces de producir el que están libres de los genes marcadores de Otros marcadores incluyen la subunidad de la ATP eintetasa la el gen de resistencia bacteriana 6418 en pero no en hongos el gen de resistencia a ampicilina el gen de resistencia a y el gen uidA de que codifica glucuronidasa Loa vectores pueden usarse in por para producir ARN o transfectar o transformar una célula Para la mayor parte de los hongos filamentosos y las la construcción de expresión se integra preferiblemente en el de la célula con el fin de obtener transformantes Sin para algunas también hay disponibles sistemas de vectores episo ales donde puede incorporarse la construcción de expresión para obtener un nivel de expresión elevado y Los ejemplos de éstos incluyen vectores derivados de los plásmidos 2 CEN y pKDl de y o vectores que contienen una secuencia AMA AMA1 de Cuando se integran las construcciones de expresión en los genomas de las células se integran las construcciones en loci al azar en el o en un locus blanco usando recombinación en cuyo caso el locus blanco comprende preferiblemente un gen de alta Un gen de alta expresión es un gen cuyo ARNm compone al menos del ARNm celular por bajo condiciones como un gen cuyo producto génico compone al menos de las proteínas celulares en el caso de un producto genético puede secretarse a niveles de al menos Una construcción de expresión para una célula huésped dada contendrá comúnmente los siguientes unidos operativamente entre sí desde el extremo hacia el extremo respecto de la cadena codificante de la secuencia que codifica el polipéptido del primer una secuencia promotora capaz de dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido en una célula huésped una región 5 no traducida una secuencia señal capaz de dirigir la secreción del polipéptido de la célula huésped mencionada hacia el medio de la secuencia de ADN que codifica una forma madura y pref riblemente activa del y preferiblemente también una región de terminación de la transcripción capaz de terminar la río abajo de la secuencia de ADN que codifica el Río abajo de la secuencia de ADN que codifica el la construcción de expresión preferiblemente contiene una región no traducida que contiene uno o más sitios de también conocida como El origen del terminador es menos El terminador por ser nativo respecto de la secuencia de ADN que codifica el Sin se usa preferiblemente un terminador de levadura en células huésped de y se usa un terminador de hongo filamentoso en células huésped Más el terminador es endógeno respecto de la célula huésped en la que se expresa la secuencia de ADN que codifica el Puede lograrse también la expresión mejorada del polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención mediante la selección de regiones reguladoras por secuencias señales y regiones de que sirven para incrementar la expresión si se lo los niveles de secreción de la proteína de interés del huésped de expresión para proveer el control inducible de la expresión del polipéptido de la Aparte del promotor nativo del gen que codifica el polipéptido de la pueden usarse otros promotores para dirigir la expresión del polipéptido de la El promotor puede seleccionarse por su eficiencia en el direccionamiento de la expresión del polipéptido de la invención en el huésped de expresión Los y las otras señales de expresión pueden seleccionarse para que sean compatibles con la célula huésped para la cual se diseña el vector de Por pueden usarse promotores en aquellos adecuados para usar en cepas de Cuando se lleva a cabo la expresión de los polipéptidos de la invención en células de pueden usarse promotores de Pueden usarse también promotores específicos para por promotores específicos para células Pueden usarse también promotores por la repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney el promotor LTR del virus del sarcoma rous el promotor el promotor IE del citomegalovirus humano los promotores del virus de herpes simplex o promotores de Los promotores adecuados para levaduras incluyen los promotores y de y los promotores nmtl y adh de Los promotores de mamíferos incluyen el promotor de la que puede introducirse en respuesta a metales tales como el Pueden usarse también promotores tales como el promotor grande SV40 del antígeno T o los promotores de Todos estos promotores están disponibles fácilmente en la Pueden usarse promotores de tales como el promotor de la Se prefieren especialmente los promotores específicos para en promotores específicos para células endoteliales o neuronales los promotores DDAHI y También pueden usarse promotores por la repetición terminal larga del virus de la leucemia de Moloney el del virus del sarcoma rous el promotor el promotor IE del citomegalovirus humano promotores de HSV como los promotores HSV o promotores particularmente la región reguladora río arriba Los promotores virales están disponibles fácilmente en la Puede usarse una variedad de promotores que son capaces de dirigir la transcripción en las células huésped de la la secuencia promotora es dirigida por un gen de alta como se describió Los ejemplos de genes de alta expresión preferidos de los cuales derivan preferiblemente los que están abarcados en blanco predeterminados para la integración de las construcciones de sin genes que codifican enzimas glucolíticas tales como las fosfato las deshidrogenasas las fosfoglicerato quinasas las piruvato quinasas las alcohol deshidrogenasas así como genes que codifican celobiohidrolasas galactosidasas alcohol factores de elongación y proteínas ribosomales Los ejemplos específicos de genes adecuados de alta expresión por el gen LAC4 de Kluyverornycea los genes de metanol oxidasa y de Hansenula y los genes de glucoamilasa de niger y awa el gen de de el gen gpdA de nidulans y los genes de celobiohidrolasa de Los ejemplos de promotores fuertes constitutivos inducibles que se prefieren para usar en la expresión en huéspedes fúngicos son aquellos que se obtienen de genes fúngicos de promotores de xilanasa subunidad 9 de triosa fosfato isomerasa alcohol deshidrogenasa amilasa amiloglucosidasa gen acetamidasa y deshidrogenasa Los ejemplos de promotores fuertes que pueden usarse en levadura incluyen aquellos que pueden obtenerse de los genes de alcohol 3 guinasa y triosafosf to Los ejemplos de promotores fuertes que pueden usarse en bacterias incluyen los promotores de la amilasa y así como promotores de genes de proteasas Los promotores fuertes que pueden usarse en células vegetales incluyen los promotores de la nopalina sintetasa la octopina sintetasa la manopina sintetasa la subunidad menor de la ribulosa la la actina de la el virus en mosaico de la coliflor 35S y y el circovirus El vector puede incluir además secuencias que rodean el que dan lugar a ARN que comprende secuencias homólogas a aquellas secuencias genómicas preferiblemente secuencias genómicas de o secuencias genómicas Esto permitirá introducir los polinucleótidos de la invención en el de las células eucariotas o virus por recombinación En puede usarse un vector que comprende el cassette de flanqueado por secuencias para preparar un vector viral adecuado para administrar los polinucleótidos de la invención a una célula de Otros ejemplos de vectores virales adecuados incluyen los vectores virales de herpes simplex y incluyendo virus asociados y virus HPV como o Los procedimientos de transferencia genética que emplean estos virus son conocidos por aquellos entrenados en la Pueden por vectores retrovirales para integrar en forma estable el polinucleótido que da lugar al ARN antisentido en el genoma del En los vectores de adenovirus con replicación deficiente permanecen episomales por permiten una expresión transitoria El vector puede contener un polinucleótido de la invención orientado en una dirección para proveer la producción de ARN Éstos pueden usarse para si es los niveles de expresión del Células huésped y expresión En otro la invención provee un proceso para preparar un polipéptido de la que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de como se describió bajo condiciones adecuadas para la expresión por el vector de una secuencia codificante que codifica el y recuperar el polipéptido Los polinucleótidos de la invención pueden incorporarse en una vector de replicación recombinante tal como un vector de El vector puede usarse para replicar el ácido nucleico en una célula huésped Por en otra la invención provee un método para preparar un polinucleótido de la que comprende introducir un polinucleótido de la invención en un vector introducir el vector en una célula huésped y cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la replicación del El vector puede recuperarse de la célula Las células huésped adecuadas incluyen bacterias tales como lineas de células de mamíferos y otras líneas de células por células de tales como células Sf9 y células fúngicas el polipéptido se produce como una proteína en cuyo caso la secuencia de que codifica una forma madura del polipéptido en la construcción de está unida operativamente a una secuencia de ADN que codifica una secuencia En el caso en que el gen que codifica la proteína secretada en la cepa tipo una secuencia preferiblemente la secuencia señal usada será nativa respecto de la secuencia de ADN que codifica el Como la secuencia señal es ajena a la secuencia de ADN que codifica el en cuyo caso la secuencia señal es preferiblemente endógena respecto de la célula huésped en la cual se expresa la secuencia de Los ejemplos de secuencias señales adecuadas para células huésped de levadura son las secuencias señales de genes de levadura MFalpha De forma una secuencia señal adecuada para células huésped de hongos filamentosos por una secuencia señal derivada de un gen de a iloglucosidasa de hongo por el gen glaA de Esta secuencia señal puede usarse en combinación con el promotor de la misma amiloglucosidasa llamada así como en combinación con otros Pueden usarse también secuencias señales híbridas en el contexto de la presente Las secuencias directrices heterólogas de secreción son aquellas que se originan del gen de la amiloglucosidasa fúngica versiones de 18 y 24 por de el gen MFalpha por Saccharomyces y o el gen de la Los vectores pueden transformarse o transfectarse en una célula huésped como se describió para obtener la expresión de un polipéptido de la Este proceso puede comprender cultivar una célula transformada con un vector de como se describió bajo condiciones adecuadas para la expresión del y opcionalmente recuperar el polipéptido Por otro aspecto de la invención provee células huésped transformadas o transfectadas o que comprenden un polinucleótido o vector de la el polinucleótido es transportado en un vector que permite la replicación y expresión del Las células pueden seleccionarse de modo que sean compatibles con dicho vector y por ser células procariotas o de levaduras o La invención abarca procesos para la producción de un polipéptido de la invención por medio de la expresión recombinante de una secuencia de ADN que codifica el Para este puede usarse la secuencia de ADN de la invención para la amplificación genética el intercambio de señales de tales como promotores o secuencias señales de con el fin de permitir la expresión económica del polipéptido en una célula huésped homóloga o Se define en la presente documentación una célula huésped homóloga como una célula huésped que es de la misma especie o que es una variante de la misma especie que aquella de la que deriva la secuencia de Las células huésped adecuadas son preferiblemente microorganismos tales como más organismos por tales como levaduras hongos o células En se prefieren las células de levadura sobre las células de hongos ya que son más fáciles de Sin algunas proteínas son secretadas pobremente en en algunos no son procesadas de forma apropiada por hiperglicosilación en En estos debería seleccionarse un hongo filamentoso como organismo Las bacterias del género Bacillus son muy adecuadas como huéspedes debido a su capacidad de secretar proteínas al medio de Otras bacterias adecuadas como huéspedes son aquellas de los géneros Streptomyces y Pseudo Una célula huésped preferida para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido es una del género Yarrowia o Más se selecciona una célula huésped de levadura del grupo que consiste en las especies Saccharomyces Kluyveromyces lactis conocida como Kluyveromyces marxianus Hansenula poli Pichia Yarrowia lipolifica y Schizosaccharomyces Sin son más preferidas para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido las células huésped de hongos Las células huésped de hongos filamentosos preferidas se seleccionan del grupo que consiste en los géneros Acremoniu Thielavia y Talaromyces Más la célula huésped de hongo filamentoso es de las especies Aspergillus Aspergillus sojae o Aspergillus o es de una especie del grupo de Aspergillus niger por y The Genus The Williams páginas Éstas sin Aspergillus Aspergillus awa Aspergillus Aspergillus Aspergtllus Aspergillus Aspergillus Aspergillus oryzae ? Aspergillus y también aquellas de las especies Fusariuiu Acremoníum Neurospora Mycetíophtora Sporotrichum dimorphosporum y Thielavia terrestris Los ejemplos huéspedes de preferidos dentro del alcance de la presente invención son tales como las especies de Aspergillus aquellas que se describen en y y las especies de bacterias tales como especies de Bacillus aquellas descriptas en 134048 y especialmente Bacillus subiilis Bacillus lchenifor Bacillus especies de y tales como especies de aquellas descriptas en tales como Kluyveromyces lactis y en y especies de tales como Saccharomyces cerevisiae Las células huésped de acuerdo con la invención incluyen células y la invención se extiende entonces a organismos transgénicos tales como plantas y partes de las que contienen una o más células de la Las células pueden expresar en forma heteróloga el polipéptido de la o pueden contener en forma heteróloga uno o más de los polinucleótidos de la Por lo la planta transgénica modificada puede tener insertada en forma en su genoma una secuencia que codifica los polipéptidos de la La de las células vegetales puede realizarse usando procedimientos por usando un plásmido Ti o Ri de Por el plásmido puede contener secuencias necesarias para infectar una y pueden emplearse derivados de los plásmidos Ti Ri La célula huésped puede el y los procedimientos para diseñar la sobreexpresión son bien conocidos y pueden usarse en la presente Por lo el huésped puede tener dos o más copias del Como puede efectuarse la infección directa de una parte de la tal como una la raíz o el En esta puede lesionarse la parte de la planta a por cortando la planta con una pinchando la planta con una aguja o frotando la planta con un La lesión se inocula luego con La planta o la parte de la planta puede cultivarse luego en un medio estable y puede dejarse que se desarrolle hasta dar una planta La regeneración de células transformadas en plantas modificadas genéticamente puede lograrse usando procedimientos por seleccionando brotes transformados usando un antibiótico y los brotes en un medio que contienen los nutrientes hormonas vegetales y Cultivo de células huésped y producción recombinante La invención también incluye células que han sido modificadas para expresar la endoproteasa específica para prolina o una variante de la Dichas células incluyen líneas de células eucariotas superiores modificadas en forma o preferiblemente tales como células de mamíferos o células de células eucariotas tales como células de levaduras o células o células tales como células bacterianas También es posible expresar los polípéptidos de la invención en forma transitoria en una línea celular o en una tal por en un sistema de expresión en Dichos que están adaptados para expresar las proteínas de acuerdo con la también están incluidos dentro del alcance de la presente De acuerdo con la presente puede efectuarse la producción del polipéptido de la invención cultivando loes huéspedes de expresión que han sido transformados con uno o más polinucleótidoa de la presente en un medio de fermentación nutritivo convencional Las células huésped de acuerdo con la invención pueden cultivarse usando procedimientos conocidos en la Para cada combinación de un promotor y una célula existen condiciones de cultivo disponibles que conducen a la expresión de la secuencia de ADN que codifica el Después de alcanzar la densidad celular o la titulación de polipéptido se detiene el cultivo y se recupera el polipéptido usando procedimientos El medio de fermentación puede comprender un medio de cultivo conocido que contiene una fuente de carbono una fuente de nitrógeno sulfato de nitrato de cloruro de una fuente de nitrógeno orgánico un extracto de un extracto de una y fuentes de nutrientes inorgánicos Opcionalmente puede incluirse o agregarse subsiguientemente un inductor de la construcción de expresión La selección del medio apropiado puede basarse en la selección del huésped de puede basarse en los requerimientos de regulación de la construcción de Los medios adecuados son bien conocidos por aquellos entrenados en la El medio si se lo contener componentes adicionales que favorezcan a los huéspedes de expresión sobre otros microorganismos potencialmente La fermentación puede realizarse durante un período de La fermentación puede ser un proceso por continuo o por suministro por a una temperatura en el rango de entre y por a un pH de entre 2 y Las condiciones preferidas de fermentación incluyen una temperatura en el rango de entre y un a pH de entre 3 y Las condiciones apropiadas se seleccionan comúnmente sobre la base de la elección del huésped de expresión y la proteína a Después de la si resulta pueden retirarse las células del caldo de mediante centrifugación o Después de detener la fermentación o retirar las puede recuperarse el polipéptido de la si se lo puede purificárselo o aislárselo por medios La endoproteasa específica para prolina de la invención puede purificarse a partir de micelio fúngico o a partir del caldo de cultivo en el que las células fúngicas liberaron la endoproteasa específica para En una realización se obtiene el polipéptido a partir de un más preferiblemente de un más preferiblemente de Aspergillus Modificaciones Los poiipéptidos de la invención pueden modificarse en forma por pueden modificarse en forma Por puede glicosilárselos o más o pueden comprender residuos de aminoácidos También puede modificárselos agregando residuos de histidina para contribuir a la purificación o por medio de la adición de una secuencia para promover la secreción de la El polipéptido puede tener extensiones amino o tales como un residuo de aminoterminal un péptido conector pequeño de hasta aproximadamente o una pequeña extensión que facilite la tal como un tracto de un epitope antigénico o un dominio de Puede marcarse un polipéptido de la invención con una marca de La marca de revelado puede ser una marca adecuada que permita la detección del Las marcas adecuadas incluyen por polinucleótidos y conectores tales como Pueden modificarse los poiipéptidos para que incluyan aminoácidos de ocurrencia no o para incrementar la estabilidad del Cuando se producen las proteínas o los péptidos por medios pueden introducirse dichos aminoácidos durante la Las proteínas o los péptidos pueden modificarse también después de su producción sintética o recombinante Los polipéptidos de la invención pueden producirse también usando En dichos los aminoácidos se conectan en secuencia en orientación de C a Esto es convencional en la técnica para producir dichas proteínas o Existe una cantidad de modificaciones de cadena lateral conocidas en la y puede efectuárselas sobre las cadenas laterales de las proteínas o los péptidos de la presente Dichas modificaciones por modificaciones de aminoácidos por alquilación por medio de una reacción con un seguida por una reducción con una amidación con metilacetimidato o una acilación con anhídrido Las secuencias provistas por la presente invención también pueden usarse como materiales iniciales para la construcción de enzimas de Las proteasas específicas para prolina de son proteasas específicas para prolina alteradas mediante técnicas de mutagénesis mutagénesis dirigida a sitios que tiene propiedades que difieren de aquellas de las proteasas específicas para prolina de tipo salvaje o de las proteasas específicas para prolina recombinantes tales como aquellas producidas por la presente Por puede alterarse su temperatura o su actividad su afinidad de sustrato o su termoestab de modo de adecuarlas mejor para usarlas en un proceso Pueden identificarse los aminoácidos esenciales para la actividad de la proteasa específica para prolina de la para luego someterlos a de acuerdo con procedimientos conocidos en la tales como mutagénesis dirigida a sitios específicos o mutagénesis de rastreo de En los procedimientos más se introducen mutaciones en cada residuo de la y se evalúa la actividad biológica en las moléculas imitantes resultantes actividad de endoproteasa específica para para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la Los sitios de interacción pueden determinarse también por medio del análisis de la estructura que puede determinarse empleando técnicas tales como resonancia magnética cristalografía o marcación de fotoafinidad Se espera que el uso de células huésped de levaduras y hongos filamentosos permita realizar dichas modificaciones procesamiento truncado y fosforilación con o según sean para conferir una actividad biológica óptima sobre loa productos de expresión recombinante de la Preparaciones Los polipéptidos de la invención pueden tomar una forma Se comprenderá que el polipéptido puede mezclarse con vehículos o diluyentes que no interfieran con el propósito deseado para el y aún considerarse como El polipéptido de la invención puede tomar también una forma sustancialmente en cuyo caso el polipéptido estará generalmente en una preparación donde más de por más de o de las proteínas en la preparación sean un polipéptido de la Los polipéptidos de la invención pueden proveerse en una forma tal que estén fuera de su ambiente celular Por pueden estar sustancialmente aislados o como se describió o en una célula que no aparezca en la por una célula de otras especies de plantas o Remoción o reducción de la actividad de endoproteasa específica para prolina La presente invención también se relaciona con métodos para producir una célula mutante a partir de una célula que comprende alterar o eliminar las secuencias de ácidos nucleicos endógenas que codifican el o las secuencias de control del lo que resulta en una célula mutante que produce menos polipéptido que la célula La construcción de cepas que tienen una menor actividad de endoproteasa específica para prolina puede lograrse convenientemente por medio de la modificación o la inactivación de la secuencia de ácidos nucleicos necesaria para la expresión de la endoproteasa específica para prolina en la La secuencia de ácidos nucleicos a modificar o inactivar puede por una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el o una parte del mismo esencial para presentar actividad de endoproteasa específica para o la secuencia de ácidos nucleicos puede tener una función de regulación requerida para la expresión del polipéptido a partir de la secuencia codificante de la secuencia de ácidos Un ejemplo de dicha secuencia reguladora o de control puede ser una secuencia promotora o una parte funcional de la es una parte que es suficiente para afectar la expresión del Otras secuencias de control para posibles modificaciones sin una secuencia una secuencia de una secuencia de una secuencia señal y una secuencia de La modificación o la inactivación de la secuencia de ácido nucleico puede realizarse sometiendo la célula a mutagénesis y seleccionando las células en las que se haya reducido o eliminado la capacidad de producir endoproteasas específicas para La que puede ser específica o al puede por por medio del uso de un agente mutagéníco físico o mediante el uso de un oligonucleótido o sometiendo la secuencia de ADN a mutagénesis por la mutagénesis puede realizarse usando cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes Los ejemplos de agentes mutagenizantes físicos o químicos adecuados para este propósito incluyen irradiación ultravioleta ácido sulfonato de etil metano bisulfito de ácido fórmico y análogos de Cuando se usan dichos se realiza típicamente la mutagénesis en presencia del agente mutagenizante bajo condiciones y se seleccionan las células que muestran una expresión reducida o nula de actividad de endoproteasa específica para La modificación o al inactivación de la producción de un polipéptido de la presente invención puede lograrse a través de la la sustitución o la remoción de uno o más nucleótidos en la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido o de un elemento de regulación requerido para la transcripción o la traducción del Por pueden insertarse o eliminarse de modo de introducir un codón de puede eliminarse el codón o puede cambiarse el marco abierto de Dicha modificación o inactivación puede lograrse por mutagénesis dirigida a sitios específicos o mutagénesis por de acuerdo con métodos conocidos en la en la modificación puede realizarse in es directamente sobre la célula que expresa la secuencia de ácidos nucleicos a es preferible que la modificación se lleve a cabo in como se más Un ejemplo de una forma conveniente para inactivar o reducir la producción de la endoproteasa específica para prolina por una célula huésped seleccionada se basa en técnicas de reemplazo de genes o interrupción de Por en el método de interrupción de se mutageniza una secuencia de ácidos nucleicos que corresponde al gen endógeno o el fragmento de gen de interés in para producir una secuencia de ácidos nucleicos que se transforma en la célula huésped para producir un gen Por recombinación la secuencia de ácidos nucleicos defectuosa reemplaza al gen endógeno o al fragmento de el gen defectuoso o el fragmento de gen también codifica un marcador que puede usarse para seleccionar los transformantes en los que se haya modificado o destruido el gen que codifica el Como puede lograrse la modificación o la inactivación de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la presente invención por medio de procedimientos antisentido usando una secuencia de nucleótidos complementaria con la secuencia codificante del Más puede reducirse o eliminarse la producción del polipéptido en una célula introduciendo una secuencia de nucleótidos complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el El polinucleótido antisentido se transcribirá típicamente en la célula y será capaz de hibridizar con el ARNm que codifica la endoproteasa específica para Bajo condiciones que permitan que la secuencia antisentido complementaria con la secuencia de nucleótidos con el se reducirá o eliminará la cantidad de endoproteasa específica para prolina producida en la Se prefiere que la célula modificada de acuerdo con los métodos de la presente invención sea de origen por una cepa fúngica que sea adecuada para la producción de productos proteicos ya sea homóloga o heteróloga respecto de la La presente invención se relaciona además con una célula imitante de una célula que comprende una alteración o una deleción de la secuencia de ácidos nucleicos endógena que codifica el o una secuencia de control del lo que resulta en una célula mutante que produce menos polipéptido que la célula Las células mutantes deficientes en polipéptido creadas de este modo son particularmente útiles para la expresión de polipéptidos homólogos heterólogos la presente invención se relaciona además con métodos para producir un polipéptido homólogo o heterólogo que comprenden cultivar la célula imitante bajo condiciones que conducen a la producción del y recuperar el En el presente el término se define en la presente documentación como polipéptidos que no son nativos respecto de la célula una proteína nativa en la que se han realizado modificaciones para alterar la secuencia o una proteína nativa cuya expresión está alterada en forma como resultado de una manipulación de la célula huésped por técnicas de ADN recombinante En aún otro la presente invención provee un método para preparar una producto proteico esencialmente libre de actividad de endoproteasa específica para que comprende la fermentación de una célula que produce un polipéptido de endoproteasa específica para prolina de la presente así como el producto proteico de El método comprende agregar una cantidad efectiva de un agente capaz de inhibir la actividad de endoproteasa específica para prolina al caldo de fermen durante o después de completada la recuperar el producto de interés del caldo de y someter opcionalmente el producto recuperado para realizar purificaciones Como después del el caldo de cultivo resultante puede someterse a un tratamiento de alteración del pH o la de modo de reducir la actividad de endoproteasa específica para prolina en forma y permitir la recuperación del producto del caldo de El tratamiento combinado sobre el pH o la temperatura puede realizarse sobre una preparación proteica recuperada del caldo de Los métodos de la presente invención para preparar un producto esencialmente libre de endoproteasas específicas para prolina son de particular interés para la producción de polipéptidos en en la producción de proteínas tales como Las células deficientes en endoproteasa específica para prolina pueden usarse también para expresar proteínas heterólogas de interés para la industria alimenticia o la industria f Las fuentes preferidas de endoproteasa específica para prolina se obtienen por medio de la clonación de un gen microbiano que codifica una endoproteasa específica para prolina en un organismo huésped Las fuentes más preferidas de endoproteasa específica para prolina se obtienen mediante la clonación de un gen derivado de que codifica una endoproteasa específica para prolina en un huésped que pertenece a un género de Aspergillus capaz de sobreexpresar el gen de endoproteasa específica para En la categoría de productos que contienen hidrolizados proteicos dirigidos a consumidores sin necesidades está creciendo el nicho del mercado que abarca el uso de hidrolizados proteicos en productos para En esta categoría de la alergenicidad del producto final no es un En su aspectos como el el valor nutricional y la presencia de aminoácidos específicos para beneficiar la resistencia y estimular la recuperación fisiológica después del ejercicio son parámetros importantes en dichos particularmente cuando se los usa en bebidas para Por se ha implicado la glutamina en el combate del estrés pero puede suplírsela solamente en pequeños ya que el aminoácido libre no es estable en Los hidrolizados proteicos producidos de acuerdo con la invención son muy adecuados para usar en productos dirigidos a debido a su solubilidad elevada bajo las condiciones prevalentes de pH por en bebidas para Una implicación importante de este criterio es que pueden incluirse altos niveles de hidrolizados producidos de acuerdo con la invención en productos nutricionales para sin la desventaja de la precipitación de proteínas al esterilizar y durante el almacenamiento Por puede extenderse la duración de almacenamiento de los productos para deportistas agregando un hidrolizado proteico de la La mezcla enzimática de acuerdo con la invención puede usarse para hidrolizar materiales proteicos de origen tales como leche leche proteínas de suero o mezclas de caseína y proteínas de Dichas mezclas de caseína y proteínas de suero pueden por en relaciones similares a aquellas halladas en la leche las formas de proteínas animales basadas en colágeno forman un debido a la posibilidad de degradar estas proteínas en moléculas más eliminando así el sabor amargo de extractos de carnes o eliminando la asimilación de residuos de prolina e hidroxiprolina en las articulaciones de los La mezcla enzimática de acuerdo con la invención puede usarse también para hidrolizar materiales de origen tales por gluten de cebada malteada o sin u otros cereales usados para preparar leche de concentrados o aislados de la concentrados de proteínas de maíz y aislados de la y proteínas del La invención se ilustrará adicionalmente en los siguientes Ejemplos no Materiales y métodos Se obtuvo de leche vacuna esencialmente un polvo libre de con un mínimo de de de Se obtuvo también el colágeno insoluble de tendón de Aquiles de Se obtuvo el caseinato de sodio de MD Foods Se obtuvo el concentrado de suero no de de de Borculo Domo Países Se obtuvo un hidrolizado de suero con poco sabor 800 así como proteínas de suero enriquecidas en de Arraor Proteines Se obtuvieron otros hidrolizados comerciales del productor o se los adquirió en Se obtuvo el aislado de aoja como 90 de Lucas Se obtuvo la subtilisina de licheniformis 560000 DU por de DSM Food Specialities Se obtuvo el LP 75000 de Shin Se obtuvo el 100OL de NOVO Se obtuvo la termolisina una estable ante el calor de Bacillus thermoproteolyticus con una actividad de 14000 como producto de Se ai3ló la endoproteasa específica para prolina de Flavobacterium y se la clonó en coli usando construcciones conocidas y métodos de purificación enzimática Diefenthal y World Journal of Microbiology Biotechnology Se evaluó la actividad en en amortiguador fosfato pH a Se usó pH en esta prueba porque el pH óptimo de esta enzima es superior a pH Se monitoreó el producto por espectrofotoraetría a 410 Se definió una unidad como la cantidad de enzima que provoca la liberación de 1 Nmol de por minuto bajo estas Se midieron las endoproteasas específicas para prolina de Aspergillua de acuerdo con el método descripto en la patente japonesa con modificaciones se evalúa la actividad enzimática en a 37 grados en un amortiguador de fosfato de a pH Se eligió pH en esta el pH óptimo de la enzima es menor que pH Se monitoreó también el producto de reacción espectrofotometría a 410 Electroforesie bidemensional en el Electroforesis bidemensional en gel y secuenciación parcial de aminoácidos de una endopeptidasa específica para prolina de Aspergillus Se produjo y aisló la endoproteasa específica para prolina de niger como se detalla en el Ejemplo Se realizó la purificación completa usando una electroforeáis bidemensional en Con este se retiró la sal del material activo aislado de la columna Superdex 75 por medio de una dilución 20 en amortiguador 10 pH y luego se concentró con un miniconcentrador Centricon 30kD se realizó la electroforesis bidemensional en gel como se describe en electrophoresis using immobilized pH Principies and Methods Amersham Pharrracia Biotech ev La primera dimensión se realizó en iPGphor usando una cinta de 11 con un rango de pH de La muestra sin concentrada 3 se diluyó en urea 8 M 6 y tiourea 2 Ésta se mezcló con 5 microlitros de amortiguador concentrado de rehidratación 10 que contenía urea 6 tiourea 2 de y de amortiguador con un rango de pH de Se usó el total para rehidratar la cinta Se realizó el enfoque durante usando el protocolo descripto en el folleto Biorad suministrado con las cintas a modo de La segunda dimensión se realizó en un dispositivo Criterion Mini Vertical Cell usando un gel moldeado previamente al adquirido de Se incubó primero la cinta IPG en un amortiguador de equilibrio SDS que contenía DTT y una segunda vez en un amortiguador que contenía iodoacetamida Ambas incubaciones fueron por 15 minutos a 20 El amortiguador de equilibrio SDS consistió en 50 pH urea 6 de de SDS y una traza de azul bromofenol Después de la la cinta IPG se recortó para que cupiera en el tipo de gel y se evaluó con amortiguador TGS diluido lOx Después del se coloreó el gel con Sypro Ruby Países por y se lavó con agua Milli Q por 2 Se realizó la formación de imágenes en The Imager La mancha más grande se se lavó varias veces con 50 de bicarbonato de se incubó durante la noche a 37 grados C con tripsina con grado de secuenciación Boehringer Se extrajeron los péptidos del trozo de gel varias veces con ácido fórmico que contenía se secaron las muestras usando una centrífuga al vacío Brunswick Países y se almacenó a hasta el análisis Análisis de Se usó una HPLC líquida de alto con un espectrómetro de masa Qtof 2 Reino para separar los péptidos formados durante la digestión con Se colocaron 5 microlitros de la solución de péptido en una LC Países usando agua Q que contenía de ácido a una velocidad de flujo de 20 Los péptidos se eluyeron de la precolumna usando un gradiente rápido de de ácido fórmico en agua Milli Q Solución y de ácido fórmico en acetonitrilo El gradiente comenzó con de solución A y aumentó a de solución B en 20 y se mantuvo en este último valor por otros 5 La velocidad de flujo usada durante la elución de los péptidos fue de 200 Usando un análisis de pudieron determinarse las secuencias parciales de aminoácidos de la endopeptidasa específica para prolina de secuenciando de novo los péptidos Se usó una HPLC con un espectrómetro de masa de trampa de iones Países unido a una bomba P4000 Países para caracterizar los hidrolizados de proteínas enzimáticas producidos con la mezcla enzimática de la Los péptidos formados se separaron usando una columna PEP AP C18 300A LC Países Ba en combinación con un gradiente de de ácido fórmico en agua Milli Q Solución y de ácido fórmico en acetonitrilo para la El gradiente comenzó con de solución A y aumentó hasta de solución B en 45 y se mantuvo en este último valor por otros 5 minutos El volumen de inyección usado fue de SO la velocidad de flujo fue de 50 microlitros por y se mantuvo la temperatura de la columna a 30 La concentración de proteínas en la muestra inyectada fue de aproximadamente 50 Se obtuvo información detallada sobre los péptidos individuales usando el algoritmo del de que es un algoritmo característico para un espectrómetro de masa de trampa de iones Los análisis completos fueron seguidos por análisis detallados para determinar el estado de cambio del ión más intenso en el rango de masa del análisis El análisis subsiguiente de de este última ión resultó en la obtención de información parcial sobre la secuencia del que pudo usarse para una búsqueda en bases de datos usando la aplicación SEQVEST de Xcallbur Bioworks Países Los bancos de datos usados se extrajeron del banco de datos disponible en el NCBI Nacional de Informática de que contiene las proteínas de interés para la aplicación En estos donde se evaluaron sustratos proteicos bien tales como proteínas de suero o se incrementó la precisión de la técnica de análisis omitiendo aquellos espectros con un ajuste de secuencia de menos de Solamente los péptidos con una masa entre aproximadamente 400 y 2000 Daltons se consideraron adecuados para análisis adicionales por secuenciación de MS Se usó angiotensina para sintonizar la sensibilidad óptima en modo MS y la f agmentación en modo realizando una infusión constante de 60 lo que resultó en especies con cargas principales dobles y triples en modo y en una energía de colisión óptima de aproximadamente en modo Análisis de de fórmulas infantiles e hidrolizados proteicos comerciales Antes de la tuvo que retirarse el material graso de las fórmulas Con este se extrajeron las muestras nutritivas completas g de polvo en 100 mi de agua 3 veces con 30 mi de hexano Se agregaron pequeñas cantidades de NaCl para mejorar la separación de las capas de se obtuvieron 5 mi de la capa de agua y se los secó por Antes del se disolvió la muestra nuevamente en 25 mi de agua se centrifugó 2 veces 13000 y se filtró a través de un tamiz de De las muestras de hidrolizados se disolvieron 400 mg en 100 mi de agua se centrifugó 2 veces 13000 y se filtró a través de un tamiz de Para caracterizar los péptidos presentes en los hidrolizados proteicos se siguió la misma estrategia que se describió previamente para los hidrolizados enzimáticos formados por la mezcla de la es se aplicó el hidrolizado filtrado a la columna de y se caracterizaron completamente los péptidos individuales con masas moleculares de entre 400 y 2000 daltons mediante un análisis de Sin el banco de datos usado para obtener la información sobre la secuencia del péptido de hidrolizados derivados de suero o caseína consistía solamente en secuencias de proteínas de leche Determinación de la fracción molar de péptidos que tienen una prolina carboxtrterminal Puede usarse para el análisis del extremo C de un Pueden analizarse mezclas complejas de péptidos con un algoritmo donde se relaciona la masa molecular del péptido con y su secuencia de aminoácidos analizada con con procedimientos de búsqueda automática en bancos de datos de opciones permiten cuantificar la incidencia de los péptidos que tienen un residuo carboxiterminal de Debido a las limitaciones indicadas por la columna de separación de péptidos PEPMAP solamente se analizan los péptidos con un peso molecular de entre aproximadamente 400 y 2000 Dalton usando esta en los idrolizados la mayor parte de los péptidos tienen estos pesos moleculares Para determinar en un hidrolizado proteico la fracción molar de péptidos que tienen una prolina se seleccionan picos de péptidos individuales que eluyen de la columna y se determinan las secuencias parciales de aminoácidos usando las técnicas antes mencionadas Por el análisis de al menos preferiblemente al menos 30 y más preferiblemente entre 40 y por e emplo de los péptidos más seleccionados al permite evaluar la frecuencia en la que aparecen los péptidos que tienen un residuo de prolina en el extremo El cociente entre la cantidad de péptidos que poseen un residuo carboxiterminal de multiplicada por 100 y la cantidad total de péptidos analizados por lo la fracción molar de péptidos que tienen una prolina carboxiterminal Determinación de la fracción molar de prolina en el sustrato usado para generar el hidrolizado Se eliminó primero el material que puede aparecer en los productos de fórmulas por extracción con como se detalla en el párrafo que describe el análisis de de fórmulas infantiles e hidrolizados proteicos La hidrólisis ácida del sustrato proteico para convertir las proteínas presentes en aminoácidos libres se logró preparando una suspensión de 100 miligramos de material proteico en 2 mililitros de HC1 6 Se realizó la hidrólisis ácida durante 22 horas a 112 grados en una atmósfera libre de Después de la se diluyó el sobrenadante 10 veces en HC1 Despuée de esta se derivatizaron los aminoácidos y se los analizó de acuerdo con el método como se especifica en el manual de operación del sistema de análisis de aminoácidos de Waters Se cuantificó el nivel de prolina presente usando métodos de Para determinar la fracción molar de prolina en la los micromoles de prolina presente multiplicados por 100 se dividieron por la suma de los micromoles de todos los aminoácidos presentes en la muestra durante la hidrólisis se destruye el Trp y la no se incluyen estos dos aminoácidos en esta suma de micromoles de todos los aminoácidos Determinación de los niveles de aminoácidos libres en los proteicos o las fórmulas infantiles Se disolvió una muestra del material pesada con precisión en ácido y se eliminaron los precipitados por centrifugación en una centrífuga Eppendorf Se realizaron los análisis de aminoácidos en el sobrenadante de acuerdo con el método como se detalla en el manual de operación del sistema de análisis de aminoácidos de aters Con este se obtuvo una muestra adecuada del se la agregó a ácido diluido y se De esta última se tomó una muestra y se la derivatizó usando isotiocianato de Los distintos aminoácidos presentes se cuantificaron usando métodos de y se los agregó para calcular el nivel total de aminoácidos libres en la muestra Para relacionar este nivel total de aminoácidos libres en la muestra con el nivel total de aminoácidos que puede liberarse de esta la muestra se sometió también a una hidrólisis seguida por una cuantificación de los aminoácidos totales libres como se describió previamente Leyendas de las figuras Figura mapa del de expresión representa la endoproteasa específica para Figura análisis de de filtrados de cultivo de la cepa huésped y varios transformantes que sobreexpresan la endoproteasa específica para indicada en este caso con una Ejemplo 1 Hidrólisis de usando aubtilisina en combinación con una endoproteasa específica para prolina de enincfosepticurn La representa una de las mayores fracciones de caseína de la leche La proteína ha sido bien caracterizada en términos de su secuencia de y está disponible comercialmente en una forma casi Como la caseína ofrece un sustrato de prueba excelente para estudiar la relación entre los sitios de corte de la enzima y la longitud de los distintos péptidos formados durante la hidrólisis Este Ejemplo demuestra a pesar del carácter de amplio espectro de la la adición de una enzima muy específica como una endoproteasa específica para prolina puede tener un impacto importante sobre el tamaño de los fragmentos formados de caseína pueden obtenerse rendimientos mejorados de fracciones de caseína al incubar la aubtilisina en combinación con una endoproteasa específica para La es relativamente rica en ya que la hidrólisis ácida seguida por el análisis de aminoácidos realizado de acuerdo con la sección de Materiales y Métodos reveló que esta fracción molar de prolina es de de de todos los como se ejemplifica la sección de Materiales y Se disolvió polvo de a una concentración de junto con de en de amortiguador pH Después de una incubación de 24 horas a en un baño de agua con se detuvo la reacción calentando la solución por 15 minutos a 90 A una mitad de la solución mi que contenía 100 miligramos de se agregaron 100 microlitros de endoproteasa específica para prolina de a 4 de acuerdo con el procedimiento descripto en World Journal of Microbiology Volumen páginas y se continuó la reacción por otras 24 horas a Después de otro choque de calor a 90 se analizaron muestras del material de caseína tratado con y endoproteasa específica para prolina empleando un equipo de como se especifica en la sección de Materiales y Métodos En la muestra digerida con Delvolase el análisis de identificó 40 péptidos que cubrían varias partes de la molécula de estos péptidos dan cuenta de de la secuencia total de Pudieron rastrearse distintos tiempos de retención para los péptidos en la columna hasta péptidos con longitudes que variaban entre 2 y 23 residuos de La glutamina probó ser el residuo carboxiterminal de aparición más frecuente de 40 Se demostró que ninguno de los péptidos analizados tenía prolina como residuo En la muestra digerida con y endoproteasa específica para prolina generó 28 péptidos identificables de estos cubrieron de la secuencia total de la proteína de La distribución de tamaños de péptidos fue remarcablemente ya que los péptidos variaron en longitud solamente entre 3 y Dentro de esta población de la glutamina fue el residuo carboxiterminal en 3 péptidos y la prolina probó ser el residuo carboxiterminal más abundante 17 de los 28 péptidos Los resultados muestran en el hidrolizado preparado con la endoproteasa específica para los péptidos que tenían un residuo carboxiterminal de prolina representaron una fracción molar de del total de los péptidos presentes en el rango de peso molecular de entre 400 y 2000 Por la incubación de la con una endopeptidasa específica para prolina resulta en la generación de péptidos con prolina como residuo carboxiterminal Más la combinación de subtilisina más una endoproteasa específica para prolina resulta en una distribución de tamaños remarcablemente homogénea para los péptidos lo que rendimientos de productos elevados al ultrafiltrar dicho Ejemplo 2 Hidrolizados de y sabor ama Aunque el Ejemplo 1 ilustra el efecto de una endoproteasa específica para prolina sobre el tamaño de los péptidos y la producción de péptidos con prolina como residuo de aminoácido carboxiterminal no se midió el efecto de esta enzima sobre el sabor amargo en el Ejemplo Los hidrolizados de caseína son notablemente y esta propiedad se ha relacionado con un contenido relativamente alto de residuos de aminoácidos Para evaluar el efecto de la endoproteasa específica para prolina sobre el sabor de una hídrolizada con una se realizaron incubaciones enzimáticas usando y con endoproteasa específica para como se describe en el Ejemplo Después de la inactivación con calor de la subtilisina y la endoproteasa específica para se enfriaron las muestras a temperatura ambiente y se agregó agua destilada para obtener concentraciones finales de caseína de Se evaluó luego el sabor de estas últimas soluciones en un panel de degustadores experimentados Los degustadores fueron unánimes en su conclusión de que el hidrolizado obtenido por la combinación de subtilisina más endoproteasa específica para prolina era ivamente menos amargo que el hidrolizado obtenido usando subtilisina Por el tratamiento de los hidrolizados de caseína con una endoproteasa específica para prolina reduce sustancialmente el sabor amargo del producto Ejemplo 3 Aislamiento de endoproteasas especificas para prolina de niger Se cultivó una gran colección de mohos capaces de formar esporas negras en un medio a pH que contenía gramos de gramos de gramos de gramos de gramos de 5 gramos de 15 gramos de colágeno y agua para obtener un volumen de 1 Se preparó el inócula para cada experimento empleando un método en el que se colocaron las esporas de los que crecían en una placa de agar días de en 5 mililitros de agua estéril de la última se usó un del medio de pH Se permitió su desarrollo por 100 horas a 28 grados C con después de lo cual se filtró el y se incubaron muestras del filtrado transparente con el péptido sintético a pH 50 grados Se identificaron las muestras capaces de liberar pNA midiendo el incremento en la absorbancia a 410 Se investigaron con mayor detalle las cepas positivas que brindaron actividades elevadas La cepa excretó una endoproteasa específica para prolina y fue identificada como Aspergillua niger Tieghem Se usó esta cepa particular para purificar y caracterizar adicionalmente la endoproteasa específica para Para purificar la se aplicó 1 litro de sobrenadante de cultivo a una columna de 400 mililitros de equilibrada con de amortiguador de acetato de pH Se eluyeron las proteasas unidas a la columna usando el amortiguador de suplido con 1 de NaCl y de isopropanol Appl 1983 páginas Se recolectaron las fracciones se las dializó contra agua destilada y se las aplicó a una columna de 400 mililitros de equilibrada nuevamente con amortiguador de Como se realizó la elución usando el amortiguador de acetato suplido con NaCl e Se recolectaron las fracciones se las dializó contra 5 de amortiguador de pH y luego se las concentró por medio de una ultrafiltración con una membrana PM Para obtener una endoproteasa específica para prolina casi completamente se sometió el lí uido concentrado a cromatografía en una columna equilibrada con de amortiguador de acetato de pH y se agregaron de NaCl Experimentos adicionales realizados con la enzima purificada indicaron un peso molecular de aproximadamente un de aproximadamente pH un pH óptimo de aproximadamente y casi de al incubársela por 4 horas a 50 grados Para obtener secuencias parciales de aminoácidos de la la preparación enzimática aislada se sometió primero a electroforesis bidimensional en de acuerdo con el procedimiento descripto en la sección de Materiales y Se recortó la mancha más se la incubó con tripsina y se Los péptidos recuperados se sometieron luego a un análisis de como se describió en la sección de Materiales y para determinar las secuencias parciales de Se obtuvieron las siguientes secuencias de aminoácidos de la endoproteasa específica para prolina de Aspergillua ATTGEAYFE ATV DGAPEGTST EREAGAAVTP Se usaron estas secuencias de aminoácidos para sintetizar las secuencias de necesarias para aislar el gen que codifica la endoproteasa específica para prolina de Aspergillus En experimentos posteriores el Ejemplo se demostró que la secuencia ATTGEAYFE representaba el extremo amino de la endoproteasa específica para prolina madura Ejemplo 4 Endoproteasa específica para prolina y sus efectos sobre la hidrólisis de proteínas de soja La patente japonesa JP501314 describe una preparación enzímática obtenida de Aspergillus oryza que muestra cantidades importantes de actividad endoproteolítica no específica y cantidades menos importantes de actividad de endoproteasa específica para prolina y carboxipeptidasa Se reivindica que la incubación de proteínas de soja con esta preparación enzimática cruda da como resultado un hidrolizado que es significativamente menos amargo que el hidrolizado de soja que puede obtenerse con otra preparación de endoproteasa específica para prolina en combinación con una Se sugiere en JP5015314 que la actividad de la endoproteasa específica para prolina expone residuos de prolina que son subsiguientemente retirados por la Se cree que la remoción de estos residuos hidrofóbicos de prolina carboxiterminal por la carboxipeptidasa es esencial para obtener estos hidrolizados menos Para evaluar esta se repitió uno de los Ejemplos provistos en JP5015314 y se analizaron los hidrolizados de soja resultantes usando la tecnología de antes en vez de evaluar el efecto sobre el De acuerdo con sus incubaciones con la FS de Aspergillus oryzae por gramo de las siguientes actividades en el orden de 650 en el orden de unidad y endopeptidasa específica para en el orden de mili Debido a que la preparación original de FS de Aspergillus oryzae no estaba se usaron dos preparaciones enzimáticas también derivadas de Aspergillus en el presente Más se usó una endoproteasa específica para prolina purificada por aislada de Aspergillus níger el para lograr una sobredosificación de la endoproteasa específica para prolina Se midieron las actividades enzimáticas de las distintas preparaciones de acuerdo con los procedimientos provistos en y se las provee a Sumizyme LP una preparación enzimática comercial de Aspergillus oryzae conocida por ser rica en actividad Actividades enzimáticas evaluadas de acuerdo con los métodos de 226 de carboxipeptidas 21 unidades de 430 de producto Flavourzyme una preparación enzimática comercial de Aspergillus oryzae conocida por ser rica en actividad exoproteolítica Actividades enzimáticas evaluadas de acuerdo con los métodos de 332 de 10 de no detectable Endoproteasa específica para prolina purificada por obtenida de Aspergillus niger y aislada como se describe en el Ejemplo Actividades enzimáticas evaluadas de acuerdo con los métodos de no carboxipep no 45 A partir de estos es evidente que aunque Sumizyme y Flavourzyme son bien conocidos por sus actividades proteolí ninguno de ellos puede proveer la misma relación elevada entre actividad de y como se indica en se halló que Sumizyme LP 75000 contenía una actividad considerablemente mayor de endoproteasa específica para prolina que aquella informada en Se incubaron las distintas preparaciones enzimáticas de acuerdo con el protocolo que se describe en pero se lo estandarizó con la actividad deseada de carboxipeptidasa unidad por gramo de Se usó el aislado de soja 90 como sustrato en estas Después de una incubación por 5 horas a pH 5 y 50 grados se centrifugaron las muestras y se mantuvieron los sobrenadantes congelados hasta el análisis de Se realizó el análisis de como se indica en la sección de Materiales y En este el banco de datos de proteínas consistió solamente en proteínas de Se especifican los resultados obtenidos en la Tabla 1 Tabla Proteínas de soja tratadas con varias Unidades Cantidad de Fracción molar de enzimáticas por péptidos péptidos con gramo de sustrato prolina en el extremo C Ninguna 10 0 39 10 PEP Flavourzyme 31 6 ninguno Sumizyrne 31 10 PEP JP5015314 Desconocida Desconocida 650 PEP o endoproteasa específica para prolina Sumizyme LP 75000 contiene una actividad endoproteolítica específica para prolina que es aproximadamente 7 veces mayor que la actividad endoproteolítica específica para prolina registrada en la cepa FS y da como resultado una fracción molar de aproximadamente de péptidos de soja que tienen una prolina carboxiterminal Sumizyme LP 75000 enriquecido con la endoproteasa específica para prolina aislada de Aspergillus niger contiene una actividad endoproteolítica específica para prolina que es aproximadamente 50 veces mayor que la actividad registrada con la cepa FS pero también da como resultado una fracción molar de aproximadamente de péptidos de soja que tienen una prolina Estos datos fueron confirmados analizando la cantidad de residuos de prolina presentes en los pero no en la posición no contiene una endoproteasa específica para prolina pero da como entre los péptidos generados y adecuados para un análisis con la técnica de una fracción molar de de péptidos que tienen una prolina en el extremo Si se lo combina con el contenido de prolina de aproximadamente de este aislado de proteínas de estas tres observaciones indican que la presencia y la actividad de la endoproteasa específica para en combinación con la actividad de tiene un efecto solamente menor sobre la incidencia molar de los residuos de prolina carboxiterminal Por lo es difícil imaginar que la remoción del sabor amargo descripta en JP5015314 y atribuida a una actividad de endoproteasa específica para prolina de solamente puede relacionarse con una incidencia elevada de péptidos que tienen una prolina como residuo aminoacídico carboxiterminal Ejemplo 5 Dosificaciones incrementadas de endoproteasa especifica para prolina y sus efectos sobre la hidrólisis de proteínas de soja En este se demuestra que se requiere de altos niveles de endoproteasa específica para prolina para generar hidrolizados de soja que contienen una cantidad significativa de péptidos que tienen un residuo carboxiterminal de El diseño completo de estos experimentos fue idéntico al de aquellos descriptos en el Ejemplo se incubó un aislado de proteínas de con Sumizyme LP estandarizado de acuerdo con la actividad deseada de de unidad por gramo de proteína de y bajo las condiciones descriptas en La incubación tuvo lugar por o a pH 5 y 50 grados y fue detenida al colocar el material por 10 minutos a 100 grados se obtuvo parte del material incubado por 5 horas y se incrementó su pH a A partir de este se obtuvieron 3 muestras a las cuales se agregaron porciones diferentes de la endoproteasa específica para prolina de producida por En la primera se agregaron unidades de endoproteasa específica para prolina acuerdo con pero medida a pH y 30 grados para acomodar el pH y la temperatura óptima al de la endoproteasa específica para prolina derivada de En la segunda se agregaron 150 y en la tercera se agregaron 15000 y se incubaron nuevamente las muestras por 2 horas a 40 grados Después de la se centrifugaron las muestras y se mantuvieron los sobrenadantes congelados hasta el análisis de El análisis de tuvo lugar como se indicó Los resultados obtenidos se indican en la Tabla Tabla Proteínas de soja tratadas con altas concentraciones de endoproteasa específica para Enzima en Cantidad de Fracción molar de unidades por gramo péptidos péptidos con Pro de sustrato analizados en el extremo C Ninguna 4 0 Sumizyme 5 horas 26 12 Surnizyme 27 11 horas Sumí 5 0 horas 22 14 Sumi zyme horas 24 17 150 Sumi zyme 5 0 horas 22 36 15000 o endoproteasa específica para prolina Los resultados obtenidos ilustran claramente que el incremento significativo en la incidencia de péptidos que tienen un residuo carboxiterminal de prolina en el hidrolizado depende totalmente de la adición de la endoproteasa específica para Sin solamente las actividades que excedieron la actividad mencionada en JP5015314 y la actividad presente en Sumizyme LP 75000 por varios órdenes de magnitud pueden hacer La implicación de esto es que la endoproteasa especifica para prolina pura y aislada es esencial para obtener la composición peptídica deseada para el Ejemplo 6 Incidencia molar de péptidos que tienen prolina como residuo carboxiterminal en hidrolizados comerciales Como se describió puede usarse para el análisis del extremo C de un Pueden analizarse mezclas peptídicas complejas con un algoritmo en el que se relaciona la masa molecular del péptido con y su secuencia de aminoácidos con con procedimientos de búsqueda automática dentro de bancos de datos de En este se usaron estas posibilidades para analizar en una cantidad de productos de fórmulas así como en hidrolizados proteicos la incidencia de péptidos que tienen residuos carboxiterminales de que tienen un peso molecular de entre 400 y 2000 daltons Se analizaron los siguientes HA 1 que contiene g de proteico de suero por cada 100 g de polvo que contiene g de proteína de soja por cada 100 g de polvo Pepti Plus que contiene g de proteína de soja por cada 100 g de polvo Pepti Júnior que contiene g de hidrolizado proteico de suero por cada 100 de polvo HA que contiene g de proteína de hidrolizado de soja y caseína por cada 100 g de polvo que contiene g de hidrolizado probablemente de soja y colágeno por cada 100 g de polvo que contiene g de hidrolizado probablemente de caseína por cada 100 g de polvo 800 que contiene de hidrolizado proteico de suero 916 Zealand Milk que contiene de hidrolizado proteico de suero BG que contiene de hidrolizado proteico de suero Como las fórmulas infantiles contienen aproximadamente de hidrolizado más grasas e hidratos de carbono resultó indispensable una extracción con hexano de estos productos para eliminar la faae Los hidrolizados puros pudieron usarse como Para conectar las secuencias parciales de proteínas obtenidas con las secuencias de proteínas se usó un banco de datos que contenía solamente secuencias de proteínas de leche vacuna para todas las excepto para la muestra de Se analizó la muestra de Pregormin usando un banco de datos que contenía datos de secuencias específicos para soja y Por razones de los análisis de se centraron en péptidos con un peso molecular que variaba entre 400 y aproximadamente 2000 de modo que no se tomaron en consideración los péptidos fuera de esta En cada pudieron identificarse entre 32 y 76 péptidos que contenían información de secuencia sobre las proteínas hidrolizadas En la mayor parte de las más de de los 25 picos más intensos en el cromatograma pudieron relacionarse con información de secuencia de las proteínas de la En la muestra de solamente de los 25 picos más intensos en el cromatograma pudieron relacionarse con información de secuencia de las proteínas de soja y Las razones posibles para esto son la incorporación de otras fuentes proteicas en la base de las proteínas o datos pobres de debidos a picos pequeños o Para evaluar la posibilidad de repetir y reproducir el análisis en el se extrajo la muestra de Nutrilon Pepti Plus dos veces y se la analizó por triplicado comienzo de la en el medio y al Se halló que los datos obtenidos de los distintos análisis sobre la distribución de los residuos de aminoácidos carboxiterminales concordaban Se provee la incidencia molar de los péptidos que tienen residuos carboxiterminales de prolina en los distintos productos comerciales en la Tabla La incidencia molar de dichos productos también se relaciona con el contenido de prolina en el material proteico inicial usado para preparar el Por la caseína y el colágeno tienen contenidos proteicos muco más elevados que las proteínas de suero o Para tomar en cuenta este se dedujeron también las fracciones molares de prolina entre los aminoácidos presentes en la base proteica usada para cada producto usando hidrólisis ácida seguida por análisis de aminoácidos y empleando procedimientos como los que se describen en la sección de Materiales y Más el material inicial usado puede diferir en su susceptibilidad al corte por debido a la presencia de secuencias de aminoácidos repetitivas Tabla 3 Incidencia molar de los péptidos que tienen una prolina carboxiterminal en productos comerciales Fórmulas Base proteica Cantidad Fracción Fracción infantiles de molar de molar de péptidos péptidos prolina analizados que en la tienen base la prolina C terminal Nidal HA 1 Suero 49 0 5 Suero 50 2 7 Pepti Plus Suero 74 4 7 Pepti Suero 72 3 7 J nior Aptamil HA 69 3 9 Pregomin Soj 41 7 8 Nutramigen Caseína 32 22 11 Hidrolizados Suero 54 6 6 800 LB 916 Suero 69 0 5 WE 80 BG Suero 76 3 8 A partir de los datos presentados en la Tabla está claro en los hidrolizados populares de la incidencia molar de los péptidos que tienen residuos carboxiterminales de prolina es Si también se considera el contenido de prolina de se concluye que ninguno de los productos basados en suero contiene una fracción molar de péptidos que tienen residuos carboxiterminales de prolina que sea mayor que la fracción molar de prolina que ocurre en la base la fracción molar de péptidos que tienen una prolina en estos productos comerciales basados en suero es de o Observando la incidencia molar de residuos carboxiterminales de prolina en un producto basado en caseína como se aprecia un nivel mayor que el que puede hallarse en los productos basados en aún si se toma en cuenta el contenido relativamente alto de prolina en la Sin cuando se compara el producto de Nutramigen con el hidrolizado de preparado mediante una incubación con subtilisina y una endoproteasa específica para prolina el Ejemplo se observa la gran diferencia en la composición que puede darse entre un hidrolizado comercial de caseína y un hidrolizado de caseína de acuerdo con la Mientras que el producto comercial muestra una incidencia molar de péptidos que tienen un residuo carboxiterminal de prolina de esta cifra para el hidrolizado de caseína de acuerdo con Ejemplo 1 es de Ejemplo 7 Incidencia molar de péptidos de suero que tienen prolinas en relación a la concentración de endoproteasa específica para prolina agregada En este se incubó una proteína comercial de bajo varias con una endoproteasa específica para prolina producida por En el hidrolizado se determinó la incidencia molar de péptidos que tienen residuos carboxiterminales de Se calentó lentamente una solución de en agua desde hasta durante 1 en presencia de de la del de Delvolase a pH Después de 1 se calentó lentamente la solución a y se la enfrió inmediatamente hasta 60 después de lo cual se agregó una nueva dosis de de Se dejó continuar la hidrólisis por una hora luego se calentó a por 5 minutos y se enfrió Después de ajustar el pH a se agregó la endoproteasa específica para prolina en concentraciones de 0 87 y 170 de sustrato en la Tabla unidades de acuerdo con el procedimiento que se describe en World Journal of Volumen páginas y se dejó proceder la hidrólisis por otras 3 horas a 45 Al se mantuvo la solución a por 5 minutos para inactivar la enzima y pasteurizar la Los obtenidos fueron analizados luego por para determinar la incidencia molar de residuos carboxiterminales de prolina en los péptidos como se describió Se presentan los resultados obtenidos en la Tabla Tabla Dosificación enzimática e incidencia molar de péptidos que tienen una prolina carboxiterminal A partir de esta puede observarse que la incidencia molar de péptidos que tienen una prolina en su extremo a 45 aumenta con la dosis de endoproteasa específica para Usando las mayores dosificaciones hasta de los péptidos obtenidos de este producto de tienen un residuo carboxiterminal de Cuando se realiza la incubación a la incidencia molar de los péptidos que tienen un residuo carboxiterminal de prolina puede alcanzar el con 87 de y raramente aumenta con mayores dosis de La mayor incidencia alcanzada con a 30 en comparación con 45 puede explicarse por la baja termoestabilidad de la enzima de Ejemplo 8 Sabor y composición de hidrolizados de suero producidos con y sin endoproteasa especifica para prolina En este se usó una endoproteasa específica para obtenida de en combinación con subtilisina para producir un hidrolizado de suero de escaso sabor Usando los datos generados en el Ejemplo se seleccionó la dosificación de endoproteasa específica para de modo que pudiera esperarse solamente un incremento marginal de péptidos con residuos carboxiterminales de El hidrolizado formado con la endoproteasa específica para prolina se comparó con un hidrolizado formado sin una endoproteasa específica para así como con un hidrolizado comercial con escaso sabor Todos estos productos se caracterizaron en términos de sabor y de su contenido de péptidos con residuos carboxiterminales de Se calentó lentamente una solución de Protarmor en agua desde hasta durante 1 en presencia de de la del de Delvolase a pH Después de 1 la solución se calentó lentamente a 80 y se enfrió inmediatamente a 60 después de lo cual se agregó una nueva dosificación de de Se dejó proceder la hidrólisis por una hora luego se calentó a 95 por 5 minutos y se enfrió Después de ajustar el pH a se agregó la endoproteasa específica para prolina a una concentración de 50 de Se dejó proceder la reacción por 3 horas a De acuerdo con los datos obtenidos en el Ejemplo estas condiciones conducen a un incremento marginal en los péptidos que tienen solamente un residuo carboxiterminal de Al se mantuvo la solución a 95 por 5 minutos para inactivar la enzima y pasteurizar la se enfrió la Se aplicó el mismo tratamiento a otra pero sin agregar la endoproteasa específica para El análisis sensorial de los hidrolizados se realizó en pruebas de comparación llamadas de dos Este tipo de prueba se usa en la Asociación Americana de Químicos de la Cerveza para comparar el sabor amargo de 2 cervezas Si se acepta un de riesgo de error en dicha prueba de una el valor umbral para tener una diferencia estadística es de 17 sobre 24 En cada se evaluaron los hidrolizados en concentraciones de de materia y se presentaron porciones de 1 mi de cada solución en un recipiente A cada asesor se le requirió que evaluara el nivel de sabor sin y luego que se lavara la boca con Todas las muestras fueron codificadas y distribuidas al azar entre los asesores La primera prueba se dirigió a evaluar el beneficio de la combinación de subtilisina y la endoproteasa específica para versus subtilisina La segunda prueba se dirigió a evaluar el sabor amargo del hidrolizado obtenido con la combinación de subtilisina y endoproteasa específica para versus un hidrolizado comercial poco amargo Con tal se diluyó Vitalarmor 800LB en el mismo amortiguador usado para el otro de modo de obtener una concentración comparable de De las 24 personas que participaron en la primera 17 evaluaron la muestra obtenida con la combinación de subtilisina y endoproteasa específica para prolina como menos amarga que la muestra obtenida con subtilisina Este resultado es significativo desde el punto de vista estadístico y confirma la actividad de remoción del amargor de la endoproteasa específica para aún si se la aplica a concentraciones relativamente bajas el Vale la pena destacar que estas concentraciones de enzima son varios órdenes de magnitud mayores que las dosificaciones enzimáticas aplicadas en la patente para las cuales se reivindicó un efecto de remoción del En la segunda comparación de muestras de 24 participantes evaluaron la muestra tratada con la combinación de subtiliaina y endoproteasa específica para prolina como menos amarga que el producto comercial Vitalarmor Esta última observación también es significativa desde el punto de vista e ilustra el valor económico de los hidrolizados y las mezclas enzimáticas de la Los hidrolizados obtenidos con o sin la endoproteasa específica para prolina se analizaron por como se describió En el hidrolizado obtenido con subtilisina se analizaron 41 Resultó que ninguno de estos péptidos tenía un residuo de a pesar de que se demostró que 18 péptidos contenían al menos un residuo de En el hidrolizado obtenido con la combinación de subtilisina y endoproteasa específica para se analizaron 31 péptidos y se demostró que 6 tenían un residuo carboxiterminal de Esta que concuerda con lo que podría esperarse sobre la base de los resultados obtenidos en el Ejemplo muestra como resultado de la incubación con la endoproteasa específica para la incidencia molar de péptidos con un residuo carboxiterminal de prolina aumentó de 0 a Como el análisis sensorial de estos últimos productos ha demostrado un sabor amargo significativamente este experimento relaciona claramente el incremento leve en la incidencia molar de residuos carboxiterminales de prolina con un sabor menos Aparte de disminuir el nivel de podría mostrarse que esta incubación con un bajo nivel de endoproteasa específica para disminuye la longitud de los péptidos en el En el hidrolizado tratado con Delvolase el análisis de reveló que los péptidos varían en longitud entre 4 y 14 con una longitud promedio de En el hidrolizado tratado con la combinación de Delvolase y la endoproteasa específica para pudo demostrarse que la longitud de los péptidos variaba entre 4 y 12 con una longitud promedio de Estas longitudes peptídicas reducidas no solamente mejorarán el rendimiento del proceso de producción del sino que también reducirán la alergenicidad total del hidrolizado y minimizarán la precipitación bajo condiciones emplo 8 Clonación de la endoproteasa especifica para prolina de Asperqillus Se diseñaron oligonucleótidos cebadores directos e inversos usando las secuencias peptídicas que se describieron en el Ejemplo Para reducir la degeneración de los se introdujeron bases de inosina en varias Esto incrementa la abundancia de oligonucleótidos cebadores en la reserva que pueden cebar una reacción de pero la desventaja es que disminuye la especificidad de la Se aisló genómico de nlger G306 CBS109712 en el el 10 de septiembre de usando técnicas y se lo usó como molde en una reacción de PCR con los oligonucleótido cebadores indicados en la Tabla Tabla Péptidos y oligonucleótidos cebadores de Pép ido Cebador ATTGEAYFE 1 2 5 3 3 4 DGAPEGTST 5 5 6 EREAGAAVTP 7 5 8 En el se realizaron todas las combinaciones posibles de cebadores directos e inversos para amplificar el gen que codifica la endoproteasa específica para prolina de Se realizaron los experimentos iniciales bajo condiciones de PCR convencionales a anillado a y extensión a estos experimentos no dieron como resultado un producto específico de Como este resultado negativo pudo deberse también a impurezas en el ADN se realizaron reacciones control de PCR usando cebadores de PCR para varios genes diferentes conocidos de En reacciones estos últimos genes pudieron amplificarse exitosamente a partir de ADN genómico de niger lo que muestra que la incapacidad de amplificar un fragmento usando los cebadores no se debió a impurezas en la preparación de se decidió disminuir la severidad de la reacción de disminuyendo la temperatura de anillado a se redujo la especi icidad de la PCR y se amplificaron varias aunque la mayor parte de estas bandas se detectaron también en reacciones control de PCR que carecían de uno de los cebadores Se clonaron varios de estos productos de PCR en el vector general de clonación Países y se determinó la secuencia de ADN de estos ninguno de los fragmentos clonados codificaba el gen que codificaba una endoproteasa específica para se realizaron muchos otros ajustes al protocolo de de modo tal de usar una polimerasa incrementando la concentración de cebadores o una PCR inmediata y la introducción de un inicio pero ninguno de estos protocolos dio como resultado un fragmento específico del gen que codifica la endoproteasa específica para Para minimizar los riesgos obvios de este enfoque se decidió intentar otro procedimiento de clonación menos 3 Como ninguno de los intentos de amplificar el gen que codifica la endoproteasa específica para prolina a partir de genó ico de G306 fue se decidió usar un enfoque en el que se empleó ARN como molde para la síntesis de Se ha el enfoque de la clonación de un gen desconocido usando y y la amplificación del marco abierto de en La ventaja de este en comparación con el procedimiento de PCR es que se introduce un sitio adicional en el extremo del de modo que solamente se requiere de un único oligonucleótido específico para el más un cebador para amplificar parte de la secuencia en lugar de dos cebadores el uso de ADNc como molde evita los problemas en la amplificación debidos a intrones El uso de ADNc como molde en la reacción de amplificación también incrementa la concentración de en comparación con la amplificación a partir de ADN De acuerdo con este se cultivó niger G306 en un medio que contenía colágeno como única fuente de carbono para inducir la expresión del gen que codifica la endoproteasa específica para Se describe la composición del medio en la sección de Materiales y Se cosechó micelio joven después de 48 horas de cultivo a y se lo usó para aislar ARN Con este se cosechó micelio usando filtración a través de una envoltura de filtración Miracloth y se lavó con agua helada Se congeló micelio inmediatamente en nitrógeno líquido y se molió hasta obtener un polvo usando un mortero y un El polvo blanco se transfirió a un tubo Greiner estéril de 15 mi y se aisló ARN total con el método de exactamente como lo describe el proveedor Reino Se usó la preparación de ARN para sintetizar ADNc a partir del cebador ancla del equipo 3 Life extendiendo el ADNc desde la cola de tail del ARNm Después de un tratamineto con ARNasa se amplificó el ADNc por PCR con el cebador puente de amplificación universal Life y los cebadores específicos para el gen con sustituciones de inisona 5 y antes descriptos Solamente con el cebador 1 más AUAP pudo obtenerse un producto de amplificación específico de aproximadamen e kb a partir de de niger Con los otros se obtuvo solamente una amplificación no específica bajo condiciones de baja Este fragmento de ADNc de kb se clonó en y se determinó su secuencia de 5 A partir de esta se diseñaron cebadores específicos para el de modo de amplificar adicionalmente la parte del Los primeros tres cebadores 5 y 3 fueron complementarios e inversos respecto de la secuencia codificante del gen que codifica la endoproteasa específica para Se usó ARN total de niger G306 para sintetizar ADNc con el equipo 5 usando el cebador Después del tratamiento con se purificó ADNc usando el cartucho Se agregó una cola de al usando transferasa terminal Life Se amplificó el ADNc en una reacción de usando el cebador de anclaje de puente Life y el primer cebador anidado Se requirió de una segunda amplificación usando el cebador AUAP y un segundo cebador para obtener un producto de amplificación específico de aproximadamente Se purificó este fragmento por electroforesis en gel de se lo clonó en y se determinó su secuencia de Esto demostró que este fragmento contiene la parte del gen que codifica la endoproteasa específica para Caracterización del gen La combinación de las secuencias superpuestas de RACE y 5 resulta en la secuencia codificante completa del gen que codifica la endoproteasa específica para SEQ ID 1 muestra el marco abierto de lectura de este Se ilustra la secuencia de la proteína de 526 en SEQ ID El péptido ATTGEAYFE pareció ser completamente El péptido DGAPEGTST también es pero está codificado por ADN genómico que está interrumpido por un intrón SEQ ID 15 y el ejemplo 11 para hallar la clonación y la secuencia del ADN genómico de Aapergillus níger los otros dos péptidos incorporan errores debido al enfoque de que se usó para su caracterización el Ejemplo A pesar de esta incertidumbres se seleccionó e identificó exitosamente la información genética deseada que codifica la endoproteasa específica para prolina de Aspergillus por primera La novedad de la endoproteasa específica para prolina de Aspergillus fue confirmada mediante búsquedas BLAST en bases de datos bien tales como y No se detectó una identidad fuerte de esta proteína con cualquier otra cuando se comparó con las secuencias proteicas en las bases de datos Ejemplo 10 Sobreexpresión del gen que codifica endoproteasa especifica para prolina y aislamiento de la endoproteasa específica para prolina Se amplificó el marco abierto de lectura del gen que codifica endoproteasa específica para prolina por PCR a partir de de niger usando loa cebadores y el cebador AUAP El fragmento obtenido por PCR se clonó en el vector de clonación El plásmido resultante se digirió con y el fragmento que contenía el gen se clonó en el sitio EcoRI del vector de expresión Se evaluaron los clones resultantes por restricción con lo que permite obtener un fragmento de aproximadamente cuando se inserta el fragmento en la orientación Se muestra el plásmido resultante en la Figura y se lo denomina Se usó niger CBS como huésped para la Bobreexpresión del gen que codifica la endoproteasa específica para se linealizó el vector de expresión por medio de una digestión con que elimina todas las secuencias derivadas de coli del vector de Se purificó el ADN digerido usando una extracción con alcohol isoamílico y una precipitación con etanol Se describe en forma detallada el procedimiento de transformación de niger en También se describe cómo seleccionar transformantes en placas de agar que contienen y cómo seleccionar integradores para copias se seleccionan transformantes de niger que contienen múltiples copias del cassette de expresión para la generación de más material de Cultivo y aislamiento de la proteasa Se usó una cepa de niger que contenía múltiples copias del cassette de expresión para la generación cromatográfica de material de a través del cultivo de la muestra en cultivos en frascos con Se describe un método útil para cultivar cepas de niger y separar el micelio del caldo de cultivo en WO El caldo de cultivo obtenido se analizó en lo que se ilustra en la Figura se usó el caldo de cultivo para la purificación cromatográfica de la para eliminar cualquier actividad endo y exoproteolítica Con este se centrifugó primero el caldo de fermentación para eliminar la mayor parte de la masa fúngica y se pasó luego el sobrenadante a través de una cantidad de filtros con tamaños de poros para eliminar los fragmentos el ultrafiltrado obtenido se diluyó diez veces en 20 de acetato de pH y se aplicó a una columna de Se eluyeron las proteínas en un gradiente de 0 a de NaCl en 20 de acetato de pH Se recolectaron las fracciones pico que mostraban actividad de corte sobre y se las de acuerdo con el protocolo descripto en World Journal of Microbiology Biotechnology pero bajo condiciones de ensayo ligeramente Teniendo en cuenta el pH óptimo ácido de la endoproteasa específica para prolina derivada de se realizó el ensayo enzimático a pH 5 en un amortiguador de a 37 La agrupación de las fracciones activas por concentración dio como resultado final una preparación que mostró solamente una única banda en y un pico en Otros análisis por de interacción hidrofóbica confirmaron la pureza de la preparación enzimática la endoproteasa específica para prolina purificada se usó para la determinación de el extremo amino de la proteína madura por degradación de El extremo amino de la endoproteasa específica para prolina madura comienza en la posición 42 de SEQ ID 2 y SEQ ID Ejemplo 11 Análisis de especies de hongos distintos de Niger para determinar la presencia del gen que codifica endoproteasa especifica para prolina Sobre la base de la baja homología de secuencias de nucleótidos entre los genes de y niger que codifican endoproteasas específica para se excluyó la hibridización cruzada entre estos dos Para obtener una impresión de la conservación de la secuencia de nucleótidos específica de niger en microorganismos más se seleccionaron las siguientes cepas para un experimento de Se cultivaron las especies fúngicas Asperglllus niger Asperglllus niger Asperglllus niger Asperglllus carbonarius Asperglllus sojae Asperglllus ochzaceus Aspergílus aeculeatus Vertícíllium psalgotae Phialophura Penicillium U Pho a exigua galllnae Acremoniurn strictum Rhizomucor Talaro yces chlorocephalum Cladosporium y Trichoderma reesii ATCC26921 En 100 mi de de de a la cepa de que se cultivó a 50 y se agitó a 220 Cuando los cultivos se hablan desarrollado lo se cosechó masa de micelio por filtración a través de un tamiz se lavó con amortiguador de KPI 10 mM y se secó con papel de Se molió el micelio bajo nitrógeno líquido con un mortero y un martillo hasta que se obtuvo un polvo fino se aisló el ADN cromosómico usando el equipo PureGene de acuerdo con las instrucciones del Se usó Saccharomyces cerevisiae ATCC20785 como control negativo en el se cultivó en YePD a y se agitó a 220 Para la preparación de un Southern se digirió ADN cromosómico de todas las especies con Xhol y se separaron los fragmentos de restricción mediante una electroforesis en un gel de agarosa al en amortiguador Después de la se transfirieron los fragmentos de ADN a membranas de nitrocelulosa Schleicher a través de un procedimiento convencional et Molecular a laboratory ISBN y se desarrolló la transferencia por 2 horas a Se sintetizó la sonda de hibridizaciÓn por con como usando los cebadores y el cebador AUA Se marcaron aproximadamente 30 nanogramos de ADNc con con el sistema de marca de ADN de acuerdo con las instrucciones del Después de la se eliminaron los dNTP no incorporados en una columna Sephadex de acuerdo con el procedimiento de columna centrifugada et Antes de agregarla a la mezcla de la sonda purificada se desnaturalizó incubándola en agua en ebullición por 5 seguida por un enfriamiento rápido en y se la usó de La hibridizaciÓn previa de las transferencias fue en 50 mi de SSC de Denhardt 5x de ADN de esperma de arenque por 1 hora a bajo agitación Después de agregar la sonda a la solución de hibridizaciÓn se realizó la hibridizaciÓn por 16 horas a 50 Las transferencias se lavaron dos veces con 200 mi de SSC de SDS por 30 minutos a temperatura y una vez con 200 mi SSC de SDS por 30 minutos a para eliminar la hibridizaciÓn inespecífica con al Se usaron películas AR para visualizar la Se ilustran loa resultados de este experimento en la Tabla Las cepas de niger y carbonarlus dieron como resultado una fuerte hibridización con la otras cepas de como echraceus y acculeatus hibridizaron con la el gen que codifica la endoproteasa específica para prolina está bien conservado dentro del género también otros hongos que son más distantes de como Phialophora Rhizomucor Alternaría emersonii y Trichodema reesll brindaron hibridización con el ADNc de la endoproteasa específica para que se incluyó control así como otras pocas no hibridizaron con el ADNc de niger la Tabla Este resultado muestra que el gen que codifica la endoproteasa específica para prolina está conservado en muchas especies de y aquél entrenado en la técnica comprenderá que pueden aislarse los genes de estas especies usando una hibridización como se indica en la presente documentación como método de Para ilustrar se usó el fragmento de ADNc de Aspergillus niger usado en este como sonda para el análisis de una biblioteca de ADN genómico de Aspergillus niger Aquél entrenado en la técnica comprenderá cómo generar una biblioteca de ADN y cómo analizar dicha biblioteca con una sonda de ADN Se ha descripto también este procedimiento en forma extensa en la literatura et Molecular a laboratory Cold Spring Harbor Laboratory Se purificaron los clones positivos en el análisis y se secuenció el El ADN genómico de A3pergillus niger que codifica la endoproteasa específica para se representa en SEQ ID Este ejemplo ilustra que es posible aislar el gen que codifica la endoproteasa específica para prolina de otras especies y usando la hibridización del ADNc de este gen de ñspergillus niger La secuencia codificante y la secuencia de aminoácidos deducida de la endoproteasa específica para prolina de se ilustra en SEQ 16 y SEQ ID Tabla Hibridización del gen de niger con ADN cromosómico de varios hongos Especie Hibridización Aspergillus niger AapergilluB niger Aspergíllus niger Aspergíllus carbonarias ATCC1025 Aspergillus sojae Aspergillus ochraceus ATCC18500 Aspergillus acculeatus cerevisiee ATCC20785 paalliotae Phiatophora muatea chrysogenum exigua gallinae strictum ATCC20371 Rhizomucor miehei Alternaría alternata emersonii Cladosporium chlorocephalum Cladosporium tenuissinum Trichodemra reeaii Ejemplo 2 Mezcla enzimática obtenida de oryzae FS y BUS efectos sobre la hidrólisis de proteínas de soja La patente japonesa JP5015314 describe una preparación enzimática cruda obtenida de Aspergillus oryzae FS que contiene cantidades importantes de una actividad endoproteolítica no especificada y cantidades menores de una endoproteasa específica para Esta preparación cruda contiene además una actividad significativa de Al incubarse las proteínas de soja con esta preparación enzimática se obtiene un hidrolizado proteico de soja del que se establece que es significativamente menos amargo que un hidrolizado de soja que puede obtenerse con otras preparaciones de La explicación brindada en JP5015314 sobre este efecto beneficiosos de remoción del sabor amargo es que las otras preparaciones de proteasa carecen de la presencia de una endoproteasa específica para en combinación con una carboxipep JP5015314 sugiere que la base del efecto de remoción del sabor amargo es la remoción de los residuos de que son expuestos por la actividad de la endoproteasa específica para prolina y son subsiguientemente eliminados por la El Ejemplo 4 de la presente solicitud describe los efectos sobre proteínas de soja de una mezcla de enzimas comerciales que tiene un perfil de actividad proteolítica similar al de la cepa FS de Una de las conclusiones de este trabajo experimental es que la incorporación de una actividad endoproteolítica específica para prolina en niveles como los registrados con la cepa FS no conduce a un incremento apreciable en los péptidos de soja que tienen un residuo carboxiterminal de Como esta conclusión tiene implicaciones importantes respecto de los hidrolizados proteicos sin sabor amargo que se describen en la presente se decidió repetir el experimento usando la enzimática obtenida de oryzae FS y bajo condiciones como las que se describen en Se plaqueó Aspergillus oryzae FS del depósito 12193 del laboratorio en en placas de agar con extracto de se incubó por cuatro días a y luego se almacenó por un día a Se usaron las esporas de estas placas para inocular un medio de inoculación que contenía 20 de 15 de harina de soja sin 5 de extracto de levadura con bajo contenido de 1 de y de Después de la disolución en agua se ajustó el pH del medio con ácido sulfúrico a y luego se la dividió en porciones de 20 en frascos de 100 mi con Los frascos con medio se esterilizaron por 30 minutos a 121 y se inocularon después de que se Después de dos días en el incubador con agitación a se usó 1 mi para inocular otros 100 mi de medio de Después de otro día en el incubador con agitación a 32 se usó este cultivo para inocular el medio de Como JP501314 no brinda información respecto de los procedimientos usados para la se usó el protocolo y el medio de fermentación descripto en EP 0 522 El medio de cultivo de acuerdo con EP 0 522 428 contiene los siguientes caseína agregada harina de soja cocida Países germen de trigo Países almidón de ácido tánico y Como el ácido tánico recomendado estimular la formación de la endoproteasa específica para no se estaba especificado en EP se usaron dos tipos de ácido es C y TA AL W2 de se ajustó el valor de pH del medio de cultivo con ácido fosfórico hasta y luego se lo dividió en porciones de 100 en frascos de 500 mi con Los frascos se esterilizaron por 30 minutos a Después de inocular con 1 mililitro de medio de cultivo desarrollado se incubaron los cultivos por 2 y 4 días a 32 250 Para eliminar la se filtraron los caldos de cultivo a través de un tamiza de microfibra de vidrio Whatrnan que luego se almacenó a Parte de este material se liofilizó y se usó para las mediciones de así como para las incubaciones con proteína de Se midieron las actividades de la la y la endoproteasa en los materiales liofilizados exactamente como se describe en Las muestras que habían fermentado por 2 días mostraron niveles de actividad enzimática apreciablemente mayores que las muestras que habían fermentado por los 4 días de modo que se decidió usar estas muestras de 2 días para la incubación final con proteínas de Los datos de actividad enzimática de estas muestras mostraron las mayores actividades de que se indican a Tabla7 Actividades enzimáticas por gramo de material liofilizado Las actividades de y carboxipeptidasa medidas en las muestras 3 y 4 son comparables con las cifras provistas en Sin las actividades de endoproteasa medidas en estas muestras resultaron ser aproximadamente 200 veces menores que las indicadas en Teniendo en cuenta las actividades enoproteolíticas descriptas en varias preparaciones enzimáticas industriales el Ejemplo las actividades endoproteolíticas ext emadamente altas obtenidas con oryzae FS y especificadas en JP5015314 son probablemente poco En un intento de copiar el Ejemplo 2 de JP5015314 tan precisamente como fuera se realizó el siguiente Se suspendieron diez gramos de proteínas de soja Soyamin 90HV en 100 mi de agua desmineralizada y se ajustó el pH con NaOH 4 N en se agregaron g de Delvolase Food Specialities lugar de Protin de Daiwa tanto Delvolase como Protin AY son endoproteasas alcalinas derivadas de y se incubó la solución proteica por 2 horas a no se detalla el tiempo de incubación o la temperatura para Protin se inactivó el Delvolase calentando la solución por 10 minutos a El hidrolizado proteico resultante se incubó luego con las muestras enzimáticas 3 y de acuerdo con el protocolo descripto en pero estandarizado de acuerdo con la actividad deseada de carboxipeptidasa unidades por gramo de La implicación fue por gramo de aislado de tenían que agregarse miligramos de muestra de enzima liofilizada miligramos de muestra de enzima liofilizada 3 y miligramos de muestra de enzima liofilizada Las actividades resultantes de endoproteasa y prolil endoproteasa se presentan en al Tabla Después de una incubación por 5 horas a pH 5 y 50 grados se centrifugaron las muestras y se mantuvieron los sobrenadantes congelados hasta el análisis de Se realizó el análisis de como se detalla en la sección de Materiales y En este el banco de datos de proteínas consistió solamente en proteínas de Se detalla a continuación la frecuencia de residuos de prolina en los péptidos Tabla Proteínas de soja tratadas con varias enzimas Unidades por gramo Cantidad de Fracción de sustrato péptidoa molar de analizados péptidoa con prolina en el extremo C Ninguna 73 3 Muestra 1 76 1 Proteasa Carboxipep PEP Muestra 3 78 3 Proteaaa Carboxipep PEP Muestra 4 70 2 Proteasa Carboxipep PEP 650 PEP o endoproteasa específica para prolina A partir de los datos es obvio que la incubación de proteínas de soja con la preparación enzimática cruda obtenida de Aspergillus oryzae FS no resulta en un incremento aignificativo de la fracción molar de péptidos que tienen un residuo carboxiterrainal de no puede atribuirse el efecto de remoción del sabor amargo en JP5015314 a una incidencia elevada de dichos péptidos en el hidrolizado Ejemplo 13 Un hidrolizado de caseína no amargo obtenido por medio de la combinación de con una endoproteasa especifica para prolina de Aspergillus Se sobreexpresó la endoproteasa específica para prolina de niger se la purificó pro cromatografía el Ejemplo y se la usó subsiguientemente para producir un hidrolizado de caseína sin sabor Con este se agregaron 100 mi de una solución de caseinato de sodio que contenían 60 gramos por 100 de termolisina La incubación a pH y 85 grados C resultó en una floculación inmediata y en la precipitación de la proteína de La incubación por dos horas resultó finalmente en una solución transparente que aún contenía algo de se ajustó el pH de la solución a pH y se inactivo la Thermoase calentando la solución por 45 minutos a 95 grados Después de se probó la solución y se observó que era muy En esta el DH de establecido usando el método de la solución de caseinato era de aproximadamente El análisis de 64 péptidos por usando un banco de datos para caseinatos bovinos indicó una incidencia molar de péptidos con un residuo de prolina de se agregaron 3 unidades endoproteasa específica para prolina de niger purificada por cromatografía a 25 mililitros de Después de incubar por 20 horas a 50 grados se realizó otro ciclo de inactivación enzimática calentando la solución por 30 minutos a 90 Después de enfriar a temperatura se decantó la solución y se ajustó el pH en el sobrenadante transparente en un valor de se halló que el hidrolizado de caseinato permanecía completamente disuelto y La evaluación del sabor demostró la ausencia de cualquier sabor amargo o El DH de este hidrolizado usando el método fue de aproximadamente el análisis de de 64 péptidos mostró que la incidencia molar de péptidos con un residuo carboxiterminal de prolina aumentó a Este es casi 4 veces mayor que la fracción molar de prolina que aparece en el sustrato Miprodan c 1500 13 at ??? ??? 1 10 Ala Pro Vrn val SO JO Éic Aja ib Pro 3 Clu aly 3nr 75 Val 95 5S Val y Gly 3er Tyr 135 Í Val 15 V llar ci Trp G Val Ala Gly Val 135 r Tyr 310 Aap Glu Tyr Val Val ??ß Trp y Fhe Val Ala Ala Rio Prc Gly el 3CS 315 32 J Ala Tyr Trp ? Vfll 360 Leu Pro Pro Arg 390 L ß Thr Trp Aap Thr Arg r Trp Sor r Gly Ala Ala Aun Pro Qlu Pro Gly 49D Aap Ala Gly Vil Val 535 Val Lys Qlu Val Glu 515 3 3 Thr Glu Ala i i ADN 26 24 3 14 nlgar Vtl 222 til 7 yac ADN lu 15 lu 1 11 ADN in lu 7 15 20 10 12 Ala Ibr 10 ADN lu y 21 ADN 23 ADN t 11c g 1020 11 1 ta 1 t ff SO Lctctt 2310 a fl c g g A N 1S t 72D 7B0 1209 tÍ ag 1500 17 Bar Val val Ala Ala Ala S Ais Pxu 25 Sar Ala 35 ene Asp Oly 6S p Tyr Gly Sly Gly 70 Ser Qly Tyr 90 110 Gly Qly 123 Glu Sor P t 145 150 iei 176 Sor Gly lou Thr ias Trp Ala Tyr Ala Pro G 195 Tyr 21C Val 223 Clu Tyr Val Pro Gly Gln fl ft Val Thr Sor Ala Val Val Ala Gly Aíu Ala 33S Tyr y Trp Ala P ftap Val Gly 365 51a Trp Trp Gly Val Gln Tyr Pro Aarj Cly Thr Gly Trp Thr T Thr 43b Ato Gly Tyr fru Cly Gly Tul Kar Thr 4 dt 00 insufficientOCRQuality

Claims (24)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes reivindicaciones : REIVINDICACIONES
1. Un hidrolizado proteico que comprende péptidos, donde la fracción molar de péptidos (%) que tienen una prolina carboxiterminal es más del doble de la fracción molar (%) de prolina en el sustrato proteico usado para generar el hidroli zado .
2. un hidrolizado proteico de acuerdo con la reivindicación 1, donde la fracción molar de péptidos (%) que tienen una prolina carboxiterminal es de al menos el triple de la fracción molar (%) de prolina en la proteína.
3. Un hidrolizado proteico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde la longitud promedio del péptido es de entre 3 y 9 aminoácidos.
4. Un hidrolizado proteico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde al menos 10% del sustrato proteico está hidrolizado, preferiblemente entre 20 y 90% del sustrato proteico está hidrolizado.
5. Un hidrolizado de suero que comprende péptidos, donde la fracción molar de péptidos que tienen una prolina carboxiterminal es de al menos 8%, preferiblemente al menos 15%, más preferiblemente entre 30 y 70%.
6. Un hidrolizado de caseína que comprende péptidos, donde la fracción molar de péptidos que tienen una prolina carboxiterminal es de al menos 25%, preferiblemente entre 30 y 70%.
7. Un hidrolizado de soja que comprende péptidos, donde la fracción molar de péptidos que tienen una prolina carboxiterminal es de al menos 20%, preferiblemente entre 30 y 70%.
8. Un hidrolizado de gluten que comprende péptidos, donde la fracción molar de péptidos que tienen una prolina carboxiterminal es de al menos 20%, preferiblemente entre 30 y 70%.
9. El uso de un hidrolizado proteico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en un alimento o bebid .
10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde el alimento o la bebida comprende entre 5% y 10% (p/v) de hidrolizado proteico.
11. El uso de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, donde el alimento tiene un sabor amargo reducido y/o baja antigenicidad .
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, donde el alimento comprende una fórmula infantil.
13. Un método para producir por vía enzimática un hidrolizado proteico a partir de un sustrato proteico, donde el sustrato proteico se incuba con una endoproteasa específica para prolina para producir un hidrolizado proteico enriquecido en péptidos que tienen una prolina carboxiterminal .
14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde el sustrato proteico se incuba en forma consecutiva o concomitante con la endoproteasa específica para prolina y otra endoproteasa.
15. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde el sustrato proteico se incuba en forma consecutiva o concomitante con la endoproteasa específica para prolina y la otra endoproteasa, que es una endoproteasa de serina o una metalo-endoproteasa, o una combinación de una endoproteasa de serina y una metalo-endoproteasa.
16. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, donde el hidrolizado proteico se recupera sin un paso de ultrafiltración o microfiltración .
17. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, donde el sustrato proteico se incuba con una composición enzimática que comprende una endoproteasa específica para prolina, subtilisina, y carboxipeptidasa .
18. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, donde, en el hidrolizado proteico, la fracción molar de péptidos (%) que tienen una prolina carboxiterminal es más del doble de la fracción molar (%) de prolina en el sustrato proteico.
19. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, donde se usan al menos 150 mili-unidades de endoproteasa específica para prolina por gramo de sustrato, preferiblemente al menos 1 unidad de endoproteasa específica para prolina.
20. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, donde la endoproteasa específica para prolina tiene un pH óptimo menor que 7.
21. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, donde se usa una endoproteasa específica para prolina de A. niger.
22. Una composición enzimática que comprende una endoproteasa específica para prolina, donde la composición es capaz de producir un hidrolizado proteico que comprende péptidos, donde la fracción molar de péptidos (%) que tienen una prolina carboxiterminal es al menos el doble de la fracción molar (%) de prolina en la proteína o el hidrolizado, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
23. Una composición enzimática de acuerdo con la reivindicación 22, donde la composición comprende además al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en subtilisina y carboxipeptdasa .
24. Un alimento que comprende un hidrolizado proteico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o que puede obtenerse empleando un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21.
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