BRPI0116036B1

BRPI0116036B1 - construto de ácido nucléico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante microbiana, método para produzir o polipeptídeo e o uso do referido polipeptídeo

Info

Publication number: BRPI0116036B1
Application number: BRPI0116036A
Authority: BR
Inventors: Linda De Lange; Luppo Edens; Petrus Jacobus Theodorus Dekker; Robertus Antonius Mijndert Van Der Hoeven
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 2000-12-07
Filing date: 2001-12-06
Publication date: 2016-03-08
Also published as: DE60132801T2; AU2002234561B2; JP4559023B2; NZ526270A; US20040241664A1; WO2002045524A2; JP2010213703A; CA2430893A1; CA2430893C; CN100506981C; DE60132801D1; CN1300328C; KR20080108630A; AU3456102A; CA2437081A1; JP4119248B2; WO2002045524A3; JP2004517832A; JP4991897B2; EP1339837A2

Abstract

"hidrolisados de proteína enriquecidos em peptídeos tendo um resíduo de prolina de terminal carbóxi". a invenção refere-se a um método de enzimaticamente produzir um hidrolisado de proteína de um substrato de proteína que é descrito, onde uma endoprotease específica de prolina ou uma composição contendo endoprotease específica de prolina e opcionalmente uma subtilisina ou endoprotease de metalo, e outras enzimas tais como carboxipeptidases são usadas para produzir um hidrolisado de proteína enriquecido em fragmentos de peptídeo tendo um resíduo de prolina de terminal carbóxi. tais hidrolisados de proteína podem ser usados como tais ou para reduzir o amargor em alimentos nutricionalmente suplementados por hidrolisados de proteína, bem como para produzir gêneros alimentícios contendo hidrolisado tendo baixa antigenicidade.

Description

CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOM-BINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE MICROBIANA, MÉTODO PARA PRODUZIR O POLIPEPTÍDEO E O USO DO REFERIDO PO- LIPEPTÍDEO

Campo da invenção A presente invenção refere-se a hidrolisados de proteína, um método de produzir os hidrolisados e o uso destes hidrolisados.

Fundamento da invenção Hidrolisados de enzima de leite de vaca ou frações de leite de vaca têm aplicação limitada apenas na indústria de alimento. No entanto, estes hidrolisados ocupam posições adequadas interessantes no mercado, como evidenciado pelo grande volume de literatura descrevendo e reivindicando processos otimizados para obter tais hidrolisados. Leite ou frações do leite são submetidos a enzimas tendo atividade proteolítica para produzir os hidrolisados primeiramente para minimizar a alergenicidade do produto, facilitar a absorção gastrintestinal oferendo-se um dígesto facilmente assimilável, e estabilizar as proteínas em produtos de ácido contra a precipitação durante períodos de armazenagem prolongados.

Embora reduzindo, o peso molecular de proteínas do leite é uma prática comumente aceita para produzir estes efeitos benéficos, a hidrólise enzimática de proteínas do leite tem desvantagens. Aspectos negativos de incubar o leite com enzimas incluem digestão proteolítica incompleta, um sabor cada vez mais amargo na diminuição do comprimento dos fragmentos de peptídeo, produções diminuídas do produto final devido às etapas de purificação necessárias, e mudanças de sabor desagradáveis causadas por níveis elevados de aminoácidos livres. A degradação uniforme e completa de todas as frações do leite por meio de incubação com endoproteases é frequentemente difícil de obter, por exemplo, beta-lactoglobulina é conhecida por ser resistente à protease e digestos parciais desta molécula podem induzir às reações imunogênicas in espera d a mente fortes em fórmulas infantis, bem como precipitações de proteína visíveis em produtos tais como bebidas para prática de esportes acídicos. Para garantir a ausência de proteínas inadequadamente digeridas em um hidrolisado de proteína, uma etapa de ultrafiltração final para a remoção de quaisquer fragmentos de peptídeo grandes restantes do hidrolisado é geralmente requerida. A etapa indispensável de remover estes fragmentos de proteína parcialmente digeridos do hidrolisado inevitavelmente diminui a produção do produto de digestão final, desse modo aumentando os custos de produção. A antigenicidade de proteína pode ser superada digerindo-se proteínas em peptídeos tendo apenas 8-10 resíduos de aminoácidos, porém os peptídeos criados por uma tal digestão proteolítica extensiva podem ser muito amargos. A explicação geral para este fenômeno é aquela que peptídeos menores com um teor elevado de aminoácidos hidrofóbicos promovem sabores amargos. A natureza da matéria-prima proteinácea, o tipo de enzimas proteolíticas empregado para digestão e o comprimento de peptídeos obtidos largamente determinam o grau de amargor associado com o hidrolisado final, por exemplo, caseína, que contém muitos aminoácidos hidrofóbi-dos, é conhecida para gerar muito mais hidrolisados amargos do que proteínas de soro.

Em operações industriais, retirar o amargo de hidrolisados de proteína é realizada pela remoção seletiva de peptídeos amargos empregando absorção ou carbono ativado em resina hidrofóbica. A redução de produção simultânea durante tais etapas de remoção aumenta o custo do produto final. Além disso, este processo tem um impacto negativo sobre o valor nutricional do produto final, quando vários aminoácidos nutricionalmente indispensáveis podem ser perdidos devido à sua natureza hidrofóbica, incluindo triptofano, leucina, fenilalanina e isoleucina. Desse modo, retirar o amargo desta maneira está propenso produzir hidrolisados deficientes nestes aminoácidos nutricionalmente importantes. A retirada do amargo pode também ser obtida submetendo-se os hidrolisados em exopeptidases. Neste método, aminoácidos de terminal amino e terminal carbóxi são liberados de peptídeos em uma tentativa de reduzir sua total hidrofobicidade. A exposição de peptídeos em exoproteases não-seletivas lamentavelmente resulta na liberação de quantidades incontro-láveis de aminoácidos livres no hidrolisado final. O aquecimento subsequente de tais hidrolisados contendo aminoácidos livres, como requerido para esterilização ou secagem por vaporização, frequentemente gera caldas de sabor impróprio por meio de reações Maillard. Além disso, os níveis elevados de aminoácidos livres criados por exoproteases podem aumentar o valor osmótico do produto hidrolisado final para níveis que podem causar diarréia osmótica.

Portanto, a produção de hidrolisados de proteína representa uma troca entre os prós e contras da digestão proteolítica. Prática corrente é otimizar a digestão enzimática de substratos de proteína para as exigências particulares de uma categoria de produto, por exemplo, hidrolisados de proteína destinados para crianças verdadeiramente alérgicas requerem digestão proteolítica extensiva seguida por uma remoção rigorosa de quaisquer fragmentos de peptídeo de peso molecular grande restantes. Por contraste, os produtos designados para adultos, os quais raramente exibem alergias a leite bovino, tipicamente contêm hidrolisados em que o comprimento de peptídeo médio é aumentado para minimizar a possibilidade de sabores distantes e para maximizar a produção do produto.

Todas as maiores proteínas do leite, tal como beta-caseína, be-ta-lactoglobulina e alfa-lactoalbumina, bem como frações de proteína vegetais obtidas de, por exemplo, isolados de soja, proteínas do arroz e glúten de trigo são considerados importantes compostos antigênicos. Desse modo, a digestão enzimática destas proteínas de cereais e do leite em pesos moleculares abaixo de 3000 Da é considerada importante para minimizar a alerge-nicidade. A fração de beta-lactoglobulina em soro é especialmente pensada ser um importante alérgeno porque esta proteína não está presente em leite humano e a digestão proteolítica de beta-lactoglobulina tem comprovado ser difícil. Fórmulas infantis contendo hidrolisados de proteína que são extensivamente hidrolisadas tipicamente contêm níveis elevados de aminoácidos livres, que são indicativos de sabor subideal e osmolalidades elevadas. Avaliações recentes de produtos de fórmula infantil hidrolisada correntemente negociadas têm mostrado que a maioria delas ainda contêm materiais imu-nogênicos com base em soro. Esta observação indica que novas misturas de enzima principal em hidrolisados melhorados em um custo inferior continuam a estarem em procura.

Hidrolisados de proteína em produtos destinados para consumidores com necessidades não-médicas, por exemplo, atletas ou pessoas sobre uma dieta de emagrecimento, devem ser cortados para fornecer boas características de sabor. Sob estas circunstâncias, a alta degustação bem como aspectos físico-químicos, tal como solubilidade sob condições acídi-cas, são de importância excedente. Produtos nesta categoria, incluindo sucos de frutas fortificadas e bebidas para prática de esportes, foco em, entre outras coisas, suplemento de arginina e glutamina para melhorar a saúde do consumidor. Bebidas para prática de esportes, por exemplo, servem para realçar a resistência física e recuperação de um atleta depois de exercício de alta intensidade prolongado. Fontes de proteína de cereal ricas em glutamina, tipo glúten de trigo, ou fontes de proteína ricas em arginina, tipo isolados de soja e proteína do arroz, foram consideradas como alternativas em proteínas do leite para satisfazer as necessidades de suplementação de produtos relacionados à saúde acídicos. Entretanto, tais proteínas de cereal, particularmente glúten de trigo, exibem solubilidades muito inferiores em valores de pH mais acídicos isto é aqueles acima de 4,(significando hidrolisados de glúten completamente solúveis são difíceis de obter.

Por causa da influência negativa sobre o custo do produto e qualidade associada com hidrólise de proteína, várias misturas de enzima que apontaram na melhora das características de hidrolisado e em baixos custos de produção foram descritas em publicações anteriores. Exemplos incluem EP 321 603, que referem ao uso de endoproteases derivadas de animal tipo tripsina, quimiotripsina e pancreatina, e EP n° 325 986 e WO n° 96/13174, que favorece o uso de endoproteases obtidas de espécies de Bacillus ou Aspergillus. Várias exoproteases foram descritas como sendo capazes de tirar o amargo de misturas de peptídeos. Visto que, por exemplo, EP 0223 560 refere-se ao uso de uma endoprotease específica de prolina específica, WO 96/13174 refere-se a uma mistura de amino-peptidases e carboxipepti-dases para este propósito. Várias publicações perseguem os efeitos benéficos de endopro-teases específicas de prolina em combinação com várias exopeptidases para produzir hidrolisados de proteína que têm perfis de amargores relativamente baixos, por exemplo, patente Japonesa JP02039896 refere-se ao uso de uma endoprotease específica de prolina combinada com uma dipeptidil-carboxipeptidase para gerar preparações de peptídeo de baixo peso molecular. A degradação de oligopeptídeos ricos em prolina por três hidrolases de peptídeo específicas de prolina é descrita como essenciais para acelerar o queijo amadurecendo sem amargor (Journal of Dairy Science, 77 (2) 385-392 (1994)). Mais especificamente, o efeito de tirar o amargo de endoprotease específica de prolina em combinação com uma carboxipeptidase é descrito em JP5015314. JP5015314 descreve uma preparação de enzima bruta obtida de Aspergillus oryzae que exibe, à parte de uma atividade pro-teolítica não-específica geral, pequenas quantidades de uma atividade de carboxipeptidase e endoprotease específica de prolina. De acordo com JP5015314, resíduos de prolina presentes nos terminais carbóxi de peptí-deos causam sabores amargos e são indesejáveis. A incubação de proteína de soja com uma mistura de enzima de carboxipeptidase e endoprotease específica de prolina produziu um hidrolisado que foi significantemente menos amargo do que um hidrolisado de soja obtido com preparação de pro-tease necessitando da combinação de uma endoprotease específica de prolina e uma carboxipeptidase.

Coletivamente, o estado da técnica decididamente sugere que a liberação mediada por exopeptidase de resíduos de aminoácidos hidrofóbi-cos de terminal carbóxi (ou terminal amino) de peptídeos é essencial para hidrolisados de peptídeo tirando significantemente o amargo. Da mesma maneira, as referências que especificamente referem-se a endoproteases específicas de prolina para tirar o amargo ensinam que a função desta atividade é expor os resíduos de prolina hidrofóbicos para permitir sua remoção subsequente por uma carboxipeptidase. A implicação desta hipótese é que a atividade de tirar o amargo das endoproteases específicas de prolina está ligada com uma remoção eficiente dos resíduos de prolina de terminal car-bóxi em vez da produção de peptídeos transportando tais resíduos de prolina de terminal carbóxi.

Sumário da Invenção A presente invenção fornece um hidrolisado de proteína que compreende peptídeos onde a fração molar de peptídeos (%) transportando uma prolina de terminal carbóxi é mais do que duas vezes mais alta do que a fração molar (%) de prolina no substrato de proteína empregado para gerar o hidrolisado. A presente invenção também fornece: um hidrolisado de soro que compreende peptídeos onde a fração molar de peptídeos transportando uma prolina de terminal carbóxi é pelo menos 8%, preferivelmente pelo menos 15%, mais preferivelmente de 30 a 70%; um hidrolisado de caseína que compreende peptídeos onde a fração molar de peptídeo transportando uma prolina de terminal carbóxi é pelo menos 25%, preferivelmente pelo menos 30% e mais preferivelmente menor do que 70%; um hidrolisado de soja que compreende peptídeos onde a fração molar de peptídeo transportando uma prolina de terminal carbóxi é pelo menos 20%, preferivelmente de 30 a 70%; um hidrolisado de glúten que compreende peptídeos onde a fração molar de peptídeo transportando uma prolina de terminal carbóxi é pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 30%, vantajosamente menor do que 70%; e um hidrolisado de cevada que compreende peptídeos onde a fração molar de peptídeo transportando uma prolina de terminal carbóxi é pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 30%, vantajosamente menor do que 70%. A presente invenção também fornece uma endoprotease específica de prolina selecionada do grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 40% de identidade de sequência de aminoácido com aminoácidos de 1 a 526 de SEQ ID NO:2 ou um fragmento desta; (b) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza-se sob baixas condições de rigorosidade com (i) a sequência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 1 ou um fragmento desta que é pelo menos 80% ou 90% idênticos em 60, preferivelmente em 100 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 90% idênticos em 200 nucleotídeos, ou (ii) uma sequência de ácido nucléico complementar à sequência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 1. e uma molécula de D NA codificando a endopeptidase. A presente invenção também fornece: o uso de um hidrolisado de proteína da invenção em um alimento ou drinque; o uso de uma endoprotease específica de prolina de acordo com a invenção; um método de enzimaticamente produzir um hidrolisado de proteína de um substrato de proteína, onde o substrato de proteína é incubado com uma endoprotease específica de prolina para produzir um hidrolisado de proteína enriquecido em peptídeos tendo uma prolina de terminal carbóxi; uma composição de enzima compreendendo uma endoprotease específica de prolina da invenção, a composição sendo capaz de produzir um hidrolisado de proteína compreendendo peptídeos, onde a fração molar de peptídeos (%) transportando uma prolina de terminal carbóxi é pelo menos duas vezes a fração molar (%) de prolina na proteína ou um hidrolisado da invenção; e um alimento compreendendo um hidrolisado de proteína da invenção ou obtenível por um método da invenção.

Descrição detalhada da invenção É mostrado que uma alta incidência de resíduos de prolina na extremidade de terminal carbóxi de peptídeos pode estar correlacionada com baixo amargor. Além disso, se tem demonstrado que a alta incidência desejada de resíduos de prolina de terminal carbóxi pode apenas ser obtida com altas concentrações de uma endoprotease específica de prolina, isto é concentrações que excedem a atividade específica em JP5015314 por várias ordens de magnitude e além disso na ausência de uma carboxipeptida-se.

De um ponto de vista econômico, a implicação desta observação é que aí existe uma clara necessidade para meios melhorados de produzir endoproteases específicas de prolina em altas quantidades e uma forma relativamente pura. Uma maneira preferida de fazer isto é por meio da superprodução de uma tal endoprotease específica de prolina empregando técnicas de DNA recombinante. Como muitos produtos de alimento são ací-dicos e as incubações de enzima a longo prazo sob circunstâncias não-estéreis industriais requerem condições de incubação acídica para impedir a contaminação microbiana, uma maneira mais preferida de fazer isto é por meio da superprodução de uma endoprotease específica de prolina estável de ácido empregando técnicas de DNA recombinantes. Uma maneira particularmente preferida de fazer isto é por meio da superprodução de uma endoprotease específica de prolina derivada de Aspergillus e uma maneira mais preferida de fazer isto é por meio da superprodução de uma endopepti-dase específica de prolina derivada de Aspergillus niger. Para permitir a informação de sequência única de rotina mais recente de uma endoprotease específica de prolina derivada de Aspergillus é essencial. Mais preferível, toda a sequência de nucleotídeo do gene de codificação tem de estar disponível.

Logo que a nova enzima foi tornada disponível em uma forma relativamente pura, outra novas e surpreendentes aplicações são consideradas as quais têm vantagens técnicas e econômicas. Uma nova aplicação seria a criação de hidrolisados não-amargos de substratos proteináceos com composições de aminoácido incomuns. Tais composições de aminoácidos incomuns podem oferecer sérios benefícios em certas aplicações de alimento. Exemplos são caseína ou glúten de trigo ou isolado de proteína de milho com níveis elevados de resíduos de aminoácido hidrofóbico presentes. Até agora tais substratos foram de uso não prático por causa dos sabores amargos visados gerados em hidrólise empregando métodos de técnica anterior. Empregando o método de hidrólise de acordo com a invenção, hidrolisados não-amargos, novos podem ser tornados disponíveis por serem empregados em nutrição clínica e de criança, em dietas terapêuticas bem como em dietas de consumidores e nutrição de esporte. À parte de tais novos hidrolisados, as aplicações que têm a vantagem do efeito de redução de amargor das en-doproteases específicas de prolina de ácido como tais são também consideradas, por exemplo, a incorporação da endopeptidase em produtos de alimento proteináceo envolvendo a etapa de fermentação tal como em queijos ou iogurte para suprimir o amargor que pode evoluir no envelhecimento. Da mesma forma em, produtos de alimento proteináceo requerendo tratamento com proteases tal como a produção de queijos modificados por enzima ou a produção de hidrolisados de proteína para a indústria de sabor, a incorporação da enzima de acordo com a invenção ajudará a suprimir o amargor.

Além disso, os benefícios não diretamente relacionados para suprimir os sabores amargos são também investigados. Uma tal nova aplicação é a incubação da enzima com proteínas de alimento para reduzir sua alergenicidade. Várias proteínas de alimento contêm subfrações altamente alergênicas, tal como glúten de trigo que contém prolaminas com sequências de peptídeo rico em prolina. Estas proteínas podem ser submetidas à nova enzima para suavizar sua antigenicidade. Outra nova aplicação é a incorporação da enzima em todas as espécies de massas como foi observado que isto atrasa o envelhecimento dos pães obtidos. Outra nova aplicação é o uso da endoprotease específica de prolina para gerar peptídeos ricos em prolina. Tais peptídeos ricos em prolina são adições desejáveis em vários produtos nutracêuticos ou de alimento quando eles foram implicados em ação anoré-tica, em efeitos anti-hipertensivos e antitrombóticos e fibrinolíticos, em proteção da mucosa gástrica bem como a prevenção de artrite reumatóide.

Outra aplicação surpreendente é a adição da nova enzima em alimentação animal para realçar a utilização da proteína., por exemplo, a adição da enzima induz à digestibilidade melhorada das sequências ricas em prolina duras para digerir presentes na proteína de alimento bem como taxas de conversão melhoradas de proteínas vegetais disponíveis baratas contendo níveis elevados de polifenóis.

Em ainda outra nova aplicação, a enzima é usada na fermentação da cerveja. Proteínas da cevada são ricas em sequências ricas em prolina e em suas proteínas de cereal em forma não-maltada são extremamente difíceis de se degradar nos aminoácidos livres requeridos para criar um mos-to de cerveja fermentável adequado. Muito surpreendentemente a incorporação da nova enzima no processo de mistura foi mostrada para estimular a liberação de aminoácido de cevada moída porém não-maltada a fim de que um mosto de cerveja muito mais rico seja obtido. De uma maneira similar, a fermentação da cerveja de misturas contendo uma alta proporção de outros cereais localmente disponíveis e baratos tal como, por exemplo, o sorgo pode ser melhorada.

Na maioria destas novas aplicações, a endoprotease específica de prolina preferivelmente exibiría um espectro de atividade com um pH ací-dico ideal.

Para superar os problemas acima mencionados, a invenção demonstra que a atividade de uma endoprotease específica de prolina purificada, isolada sozinha, isto é sem a atividade subsequente ou concomitante substancial de uma enzima exoproteolítica, é suficiente para significante-mente tirar o amargo de um hidrolisado de proteína. Portanto, a endoprotease específica de prolina pode compreender pelo menos 5 unidades por grama de proteína da preparação de enzima da invenção, preferivelmente 10 u/g, mais preferivelmente 25 u/g e ainda mais preferivelmente 50 u/g. Além disso, estudos conduzidos de acordo com a invenção demonstram que a atividade de uma endoprotease específica de prolina purificada, isolada sozinha, disposta sem a atividade subsequente ou concomitante de uma enzima exoproteolítica, é suficiente para significantemente diminuir o nível de imunogenicidade total dos hidrolisados de proteína, bem como para signi-ficantemente aumentar sua solubilidade total sob condições acídicas. Os hidrolisados produzidos de acordo com a invenção são enriquecidos em peptídeos tendo um resíduo de prolina de terminal carbóxi.

Uma modalidade da presente invenção fornece uma mistura de enzima compreendendo uma endoprotease específica de prolina purificada, isolada para a produção de alto rendimento de hidrolisados de proteína tendo amargor substancialmente baixo e baixas propriedades alergênicas sem a produção concomitante de níveis substanciais de aminoácidos livres. Esta mistura de enzima é adequada para preparar hidrolisados de várias frações de proteína. Em particular, um substrato de proteína, tal como proteína do leite, pode ser incubado com uma endoprotease específica de prolina purificada, isolada e uma subtilisina para produzir um hidrolisado de proteína enriquecido em fragmentos de peptídeo tendo uma prolina de terminal carbóxi. O termo "enriquecido" é destinado a significar que pelo menos 8% dos fragmentos de peptídeo no produto hidrolisado de divagem enzimática possuem um resíduo de prolina de terminal carbóxi. A presente invenção fornece um hidrolisado de proteína obtido hidrolisando-se uma proteína que compreende peptídeos onde a fração molar de peptídeos (%) transportando uma prolina de terminal carbóxi é pelo menos duas vezes a fração molar (%) de prolina no substrato de proteína empregado para produzir o hidrolisado. O comprimento médio dos peptídeos nos hidrolisados é em geral de 3 a 9 aminoácidos.

Hidrolisados preferidos de acordo com a invenção são: um hidrolisado de soro que compreende peptídeos onde a fração molar de peptídeos transportando uma prolina de terminal carbóxi é pelo menos 8%, preferivelmente pelo menos 15%, mais preferivelmente de 30 a 70%, um hidrolisado de caseína que compreende peptídeos onde a fração molar de peptídeo transportando uma prolina de terminal carbóxi é pelo menos 25%, preferivelmente de 30 a 70%, e um hidrolisado de soja que compreende peptídeos onde a fração molar de peptídeos transportando uma prolina de terminal carbóxi é pelo menos 20%, preferivelmente de 30 a 70%.

Por peptídeos ou fragmentos de peptídeos é significado peptí-deos com massas moleculares de 400 a 2000 Dalton. Estes peptídeos podem ser analisados de acordo com a análise de LC/MC como descreveram a seção "Materiais e Métodos".

Em geral na produção dos hidrolisados de proteína da invenção, o substrato de proteína é substancialmente hidrolisado, vantajosamente para pelo menos 50%. Preferivelmente pelo menos 10% do substrato de proteína são convertidos em peptídeos tendo massas moleculares de 400 a 2000 Dálton. Mais preferivelmente de 20 a 90% e ainda mais preferivelmente de 30 a 80% do substrato de proteína são convertido em tais peptídeos.

Em outra modalidade da invenção, um substrato de proteína pode ser incubado com uma mistura de enzima compreendendo uma endopro-tease específica de prolina purificada, isolada, uma endoprotease de serina ou uma endoprotease de metalo e uma carboxipeptidase para produzir um hidrolisado de proteína enriquecido em fragmentos de peptídeo tendo uma prolina de terminal carbóxi. A mistura de enzima da invenção é particularmente adequada para uso na produção de hidrolisados de proteína destinados para o realce de nutriente e aromatizante de bebidas para prática de esportes e bebidas com base em suco, e a mistura de peptídeo hidrolisada resultante combina um perfil de amargor muito baixo com excelente solubilidade sob as condições acídicas predominantes de tais bebidas. A mistura de enzima da invenção é caracterizada pelo fato de que ela contém pelo menos uma endoprotease, por exemplo, uma protease de serina ou uma endoprotease de metalo em conjunção com uma endoprotease específica de prolina (E.C. 3.4..21.26) para fornecer um hidrolisado primário. Mais especificamente, a invenção re-fere-se a uma endoprotease específica de prolina purificada, isolada e uma protease de serina ou mistura de enzima de protease de metalo capaz de produzir um hidrolisado de proteína compreendendo fragmentos de peptídeo, onde pelo menos 8%, preferivelmente pelo menos 15%, mais preferivelmente de 30 a 70% dos referidos fragmentos de peptídeos têm uma proli- na de terminal carbóxi.

Outra modalidade da invenção é um hidrolisado de proteína enriquecido com um teor de peptídeos relativamente alto tendo prolina como o resíduo de aminoácido de terminal carbóxi. Tais hidrolisados enriquecidos podem compreender pelo menos 8%, preferivelmente pelo menos 15%, mais preferivelmente de 30 a 70% dos fragmentos de peptídeos têm um resíduo de prolina de terminal carbóxi. Uma vez que as preparações de enzima tipicamente utilizadas na gênese de hidrolisados de proteína não são capazes de gerar peptídeos transportando resíduos de prolina em terminais carbóxi, os hidrolisados de proteína que são relativamente ricos em tais peptídeos são novos.

Os substratos para hidrólise por uma mistura de enzima da invenção incluem leite integral, leite desnatado, caseína de ácido, caseína de coalho, produtos de soro ácidos ou produtos de soro de queijo. Muito surpreendentemente, a endoprotease específica de prolina derivada de Asper-gillus não cliva apenas no lado do terminal carbóxi dos resíduos de prolina porém também no lado do terminal carbóxi dos resíduos de hidroxiprolina que fazem outras proteínas animais com base em colágeno tal como gelatina bem como osso ou espinhas de peixe contendo carne residual, substratos interessantes para a enzima. Além disso, substratos vegetais tipo glúten de trigo, cevada moída e frações de proteína obtidas de, por exemplo, soja, arroz ou milho são substratos adequados. Hidrolisados de proteína de leite produzidos de acordo com a invenção podem ser usados com ou sem a fil-tração adicional ou etapas de purificação em várias especialidades de alimentos tal como hidrolisados hipoalergênicos para a nutrição de criança, hidrolisados básicos para nutrição dietética e enteral, bem como concentrados de proteína para várias formas de alimento para saúde. Desse modo, os hidrolisados de proteína da invenção podem ser usados para produzir gêneros alimentícios tendo baixa antigenicidade, tal como fórmula infantil. Em adição, as preparações de enzima de acordo com a invenção podem ser usadas para reduzir o amargor em alimentos condimentados por pelo menos um hidrolisado de proteína, mesmo quando o hidrolisado de proteína está presente em grandes quantidades., por exemplo, os alimentos podem compreender entre 5% e 10% (p/v) de um hidrolisado de proteína e ainda têm seu amargor reduzido empregando uma preparação de enzima da invenção. A presente invenção fornece uma endoprotease específica de prolina purificada, isolada com um pH acídico ideal sozinho ou em uma composição compreendendo uma ou mais enzimas adicionais para a preparação de um hidrolisado de proteína para várias aplicações de alimento. Uma tal endoprotease específica de prolina purificada, isolada é definida por ter pelo menos 10 unidades de atividade de endoprotease específica de pro-lina por grama do material proteináceo. Estas unidades deveríam ser avaliadas empregando o peptídeo sintético Z-Gly-Pro-pNA em 37 graus C e pH 5 no caso do pH ideal da endoprotease específica de prolina estar abaixo do pH 6, por exemplo, no caso da endoprotease específica de prolina de As-pergillus nigerou então as unidades deveríam ser avaliadas em pH = 7, como especificadas na seção Materiais e Métodos. Esta enzima purificada, isolada, sozinha ou em uma mistura de enzima, supera várias desvantagens de misturas de enzima previamente conhecidas na técnica. Mais importantemente, a endoprotease específica de prolina purificada, isolada inventiva é chave na produção de hidrolisados que combina um baixo potencial alergê-nico, um alto rendimento e um baixo perfil de amargor. Além disso, os hidrolisados produzidos com a endoprotease específica de prolina purificada, isolada ou uma mistura de enzima compreendendo esta endoprotease específica de prolina são estáveis em ácido e contêm níveis muito baixos de aminoácidos livres, tal que sabores impróprios mínimos são gerados durante as etapas de aquecimento, tal como secagem por vaporização ou esterilização do produto. Os hidrolisados de acordo com a invenção conterão menos do que 900 micromoles dos aminoácidos livres por grama de pó seco, preferivelmente menos do que 300 micromoles de aminoácidos livres por grama de pó seco, mais preferivelmente menos do que 150 micromoles de aminoácidos livres por grama de pó seco, e ainda mais preferivelmente menos do que 50 micromoles por grama de pó seco. A mistura de enzima de acordo com a invenção é caracterizada pelo fato de que ela compreende outra endoprotease tal como uma protease de serina ou uma endoprotease de metalo em conjunção com uma endoprotease específica de prolina purificada, isolada (E.C. 3.4.21.26) que trabalham juntas para fornecer um hidrolisado de proteína primária.

As proteases de serina representam uma classe bem-conhecida de endoproteases alcalinas e algum de seus representantes mais importantes tal como subtilisina (E.C. 3.4.21.62) e químiotripsina (E.C. 3.4.21.1) preferem a divagem da cadeia de peptídeo no lado do terminal carbóxi de ami-noácidos hidrofóbicos tal como Tyr, Trp, Phe e Leu. A mistura de enzima da invenção pode conter químiotripsina e/ou subtilisina. A subtilisina é produzida por espécies de Bacilo, tem uma especificidade de substrato particularmente ampla e um pH alcalino ideal, amplo. A enzima é da melhor forma ativa entre 50°C e 60°C. A enzima é barata, disponível como um produto comercial regular e é útil na produção de, por exemplo, vários hidrolisados do leite. A químiotripsina que pode ser obtida de pancreases animais, tem uma especificidade de substrato um tanto mais rigorosa em valores de pH levemente mais alcalino do que a subtilisina e é da melhor forma ativo abaixo de 50 graus C. A classe de endoproteases de metalo é de ampla extensão em bactérias, fungos e organismos mais altos. Eles podem ser separados nas metaloproteases de ácido e neutras. Destas duas subclasses apenas as proteases neutras exibem a preferência de divagem desejável isto é clivando a cadeia de peptídeo no lado de terminal carbóxi de resíduos de aminoácido hidrofóbicos tal como Phe e Leu. Representantes bem-conhecidos da categoria das metaloproteases neutras são bacilolisina (E.C. 3.4.24.28) e termo-lisina (E.C. 3.4.24.27) e cada, ou ambas destas, podem estar presentes na mistura de enzima da invenção. Ambas as enzimas são obtidas das espécies de Bacilo e exibem atividade máxima sob condições levemente alcalinas ou neutras. Representantes bem menos conhecidos destas endoproteases de metalo neutras foram obtidos de espécies de Aspergillus. Naqueles casos em que a endoprotease específica de prolina não é usada para seus efeitos de tirar o amargo porém para ajudar na hidrólise de sequências de proteína rica em prolina, combinações com a classe das metaloproteases de ácido, como, por exemplo, deuterolisina (EC 3.4.24.39) podem ser vantajosas. Uma endoprotease específica de prolina é uma endoprotease capaz de clivar peptídeos ou polipeptideos na extremidade de terminal carbóxi de resíduos de prolina. Tais enzimas são amplamente encontradas em animais e plantas, porém sua presença em microorganismos parece ser limitada. Até esta data, a endoprotease específica de prolina foi identificada em espécies de Aspergillus (EP 0 522 428), Flavobacteríum (EP 0 967 285) e Aeromonas (J. Biochem. 113, 790-796), Xanthomonas e Bacteroides. Contudo, as enzimas específicas de prolina da maior parte destes organismos são ativas ao redor do pH 8, a enzima de Aspergillus é da melhor forma ativa ao redor do pH 5. De acordo com uma modalidade preferida, a endoprotease específica de prolina tendo um pH ideal abaixo de 7, preferivelmente tendo um pH ideal de 3,5 a 6,5 é usada por causa das vantagens técnicas e econômicas de tais enzimas. A endoprotease específica de prolina da invenção pode ser isolada de uma das espécies microbianas acima mencionadas, particularmente de uma espécie de Aspergillus. Preferivelmente, a endoprotease específica de prolina é isolada de uma cepa de Aspergillus niger. Mais preferivelmente, a endoprotease específica de prolina é isolada de um hospedeiro de Aspergillus niger construído para superexpressar um gene codificando uma endoprotease específica de prolina, embora outros hospedeiros, tal como E. coli são vetores de expressão adequados, por exemplo, a clonagem e a superprodução da endoprotease específica de prolina derivada de Flavobacteríum em, entre outros, E. coli tem tornado certas endoproteases específicas de prolina disponíveis em uma forma pura. Um exemplo de um tal construto de superprodução é fornecido no World Journal of Microbiology & Biotechno-logy, Vol 11, pp 209-212. Um hospedeiro de Aspergillus niger é preferivelmente empregado para produzir um autoconstruto não-recombinante utilizando promotores de Aspergillus niger para direcionar a expressão de um gene codificando uma endoprotease específica de prolina de A. niger. A maioria das publicações científicas com referência à clonagem e produção do foco de endoproteases específicas de prolina no papel desta enzima na síntese e regulação de proteínas biologicamente ativas. As publicações implicando esta enzima na produção de hidrolisados de proteína úteis são escassas e são concernidas com o uso da enzima em conjunção com uma exoprotease. Várias publicações Japonesas referem-se à presença de atividade endoproteolítica específica de prolina em misturas de enzima complexa e bruta capazes de produzir hidrolisados com baixo perfil de amargor, porém as misturas de enzima empregadas sempre contêm exopro-teases. Nenhuma conexão direta entre tirar o amargo e atividade endoprote-olítica específica de prolina na ausência de exoproteases tipo carboxipepti-dases ou aminopeptidases é sugerida na técnica. Além disso, nenhum hidro-lisado de ligação de dados produzidos usando atividade endoproteolítica específica de prolina com uma resposta imunogênica diminuída ou uma so-lubilidade de ácido melhorada foi previamente descrito.

Um polipeptídeo da invenção que tem endoprotease específica de prolina pode ser em uma forma isolada. Como definido aqui, um polipeptídeo isolado é um endogenamente produzido ou um polipeptídeo recombi-nante que é essencialmente livre de outros polipeptídeos de endoprotease específica de não-prolina, e é tipicamente pelo menos cerca de 20% puro, preferivelmente pelo menos cerca de 40% puro, mais preferivelmente pelo menos cerca de 60% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% puro, ainda mais preferivelmente cerca de 90% puro, e mais preferivelmente cerca de 95% puro, como determinado por SDS-PAGE. O polipeptídeo pode ser isolado por métodos cromatográficos e de centrifugação, ou qualquer outra técnica conhecida na técnica para obter proteínas puras de soluções brutas. Será entendido que o polipeptídeo pode ser misturado com veículos ou diluentes que não interferem com o propósito destinado do polipeptídeo, e desse modo o polipeptídeo nesta forma ainda será considerado como isolado. Geralmente compreenderá o polipeptídeo em uma preparação em que mais do que 20%, por exemplo, mais do que 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95% ou 99% em peso das proteínas na preparação é um polipeptídeo da invenção.

Preferivelmente, o polipeptídeo da invenção é obtenível de um microorganismo que possui um gene codificando uma enzima com atividade de endoprotease específica de prolina. Mais preferivelmente o microorganismo é fúngico, e da melhor forma é um fungo filamentoso. Organismos preferidos são desse modo do gênero Aspergillus, tal como aqueles das espécies Aspergillus niger.

Em uma primeira modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado tendo uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade de seqüência de aminoácido em aminoácidos de 1 a 526 de SEQ ID NO: 2 (isto é o polipeptídeo) de pelo menos cerca de 40%, preferivelmente pelo menos cerca de 50%, preferivelmente pelo menos cerca de 60%, preferivelmente pelo menos cerca de 65%, preferivelmente pelo menos cerca de 70%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 97%, e que tem atividade de endoprotease específica de prolina.

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas ou mais seqüências de aminoácido é determinado por programa de pesquisa de base de dados de proteína BLAST P (Altschul e outros, 1997, Nucleic Acids Research 25: 3389-3402) com matriz Blosum 62 e uma entrada esperada de 10.

Um polipeptídeo da invenção pode compreender a seqüência de aminoácido mencionada na SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência substancialmente homóloga, ou um fragmento de cada seqüência tendo atividade de endoprotease específica de prolina. Em geral, a seqüência de aminoácido de ocorrência natural mostrada na SEQ ID NO: 2 é preferida. O polipeptídeo da invenção pode também compreender uma variante de ocorrência natural ou espécies homólogas do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.

Uma variante é um polipeptídeo que ocorre naturalmente em, por exemplo, fungos, bactérias, levedura ou células de planta, a variante tendo atividade de endoprotease específica de prolina e uma seqüência substancialmente similar à proteína de SEQ ID NO: 2. O termo "variantes" refere-se aos polipeptídeos que têm o mesmo caráter essencial ou funcionalidade biológica básica como a endoprotease específica de prolina de SEQ ID NO: 2, e inclui variantes alélicas. O caráter essencial da endoprotease específica de prolina de SEQ ID NO: 2 é que é uma enzima capaz de clivaro aminoácido de terminal amino de uma proteína ou (poli)peptídeo. Preferivelmente, um polipeptídeo variante tem pelo menos o mesmo nível de atividade de endoprotease específica de prolina como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. As variantes incluem variantes alélicas ou da mesma cepa como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou de uma cepa diferente do mesmo gênero ou espécie.

Similarmente, uma espécie homóloga da proteína inventiva é uma proteína equivalente de seqüência similar que é uma endoprotease específica de prolina e ocorre naturalmente em outras espécies de Aspergillus.

Variantes e espécies homólogas podem ser isoladas empregando os procedimentos descritos aqui que foram empregados para isolar o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e executando tais procedimentos em uma fonte de célula adequada, por exemplo, uma bactéria, levedura, fungo ou célula de planta. Também possível é usar uma sonda da invenção para sondar bibliotecas feitas de levedura, bactéria, fungo ou células de planta a fim de obter clones expressando variantes ou espécies homólogas do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Estes clones podem ser manipulados por técnicas convencionais para gerar um polipeptídeo da invenção que desde então pode ser produzido por técnicas sintéticas ou recombinantes conhecidas por si próprias. A seqüência do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 e de variantes e espécies homólogas podem também ser modificadas para fornecer polipeptídeos da invenção. As substituições de aminoácido podem ser feitas, por exemplo, de 1, 2 ou 3 a 10, 20 ou 30 substituições. O mesmo número de deleções e inserções podem também ser feitas. Estas mudanças podem ser feitas fora das regiões críticas para a função do polipeptídeo, quando um tal polipeptídeo modificado reterá sua atividade de endoprotease específica de prolina.

Os polipeptídeos da invenção incluem fragmentos dos polipeptí-deos de tamanho natural acima mencionados e de variantes destes, incluindo fragmentos da seqüência mencionada na SEQ ID NO: 2, Tais fragmentos tipicamente reterão a atividade como uma endoprotease específica de proli-na. Os fragmentos podem ser pelo menos 50, 100 ou 200 aminoácidos longos ou podem ser este número de aminoácidos curtos da seqüência de tamanho natural mostrada em SEQ ID NO: 2.

Os polipeptídeos da invenção podem, se necessário, ser produzidos por meios sintéticos embora usualmente eles serão feitos recombinan-temente como abaixo descritos. Os polipeptídeos sintéticos podem ser modificados, por exemplo, pela adição de resíduos de histidina ou um rótulo T7 para assistir sua identificação ou purificação, ou pela adição de uma se-qüência de sinal para promover sua secreção de uma célula.

Desse modo, as seqüências de variantes podem compreender aquelas derivadas de cepas de Aspergillus exceto a cepa da qual o polipep-tídeo de SEQ ID NO: 2 foi isolado. As variantes podem ser identificadas de outras cepas de Aspergillus examinando-se quanto à atividade de endoprotease específica de prolina e clonando-se e seqüenciando-se como descrito aqui. As variantes podem incluir a deleção, modificação ou adição de amino-ácidos simples ou grupos de aminoácidos dentro da seqüência de proteína, contanto que o peptídeo mantenha a funcionalidade biológica básica da endoprotease específica de prolina de SEQ ID NO: 2.

As substituições de aminoácido podem ser feitas, por exemplo, de 1, 2 ou de 3 a 10, 20 ou 30 substituições. O polipeptídeo modificado geralmente reterá a atividade como uma endoprotease específica de prolina. As substituições conservativas podem ser feitas; tais substituições são bem-conhecidas na técnica. Preferivelmente as substituições não afetam a prega ou atividade do polipeptídeo.

Seqüências de polipeptídeo mais curtas estão dentro do escopo da invenção, por exemplo, um peptídeo de pelo menos 50 aminoácidos ou até 60, 70, 80, 100, 150 ou 200 aminoácidos no comprimento é considerado estar na categoria do escopo da invenção contanto que demonstre a funcio- nalidade biológica básica da endoprotease específica de prolina de SEQ ID NO: 2. Em particular, porém não exclusivamente, este aspecto da invenção abrange a situação em que a proteína é um fragmento da sequência de proteína completa.

Em uma segunda modalidade, a presente invenção fornece um para polipeptídeo isolado que tem atividade de endoprotease específica de prolina, e é codificado por polinucleotídeos que hibridizam ou são capazes de hibridisar sob baixas condições de rigorosidade, mais preferivelmente condições médias de rigorosidade, e mais preferivelmente altas condições de rigorosidade, com (i) a seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 1 ou um fragmento de ácido nucléico compreendendo pelo menos a porção de terminal c de SEQ ID NO: 1, porém tendo menos do que todas ou tendo bases diferindo das bases de SEQ ID NO: 1; ou (ii) com um filamento de ácido nucléico complementar a SEQ ID NO: 1. O termo "capaz de hibridizar" significa que o polipeptídeo alvo da invenção pode hibridizar para o ácido nucléico empregado como uma sonda (por exemplo, a seqüência de nucleotídeo mencionada em SEQ ID NO: 1, ou um fragmento deste, ou o complemento de SEQ ID NO: 1) em um nível sig-nificantemente acima da base. A invenção também incluí os polinucleotídeos que codificam a endoprotease específica de prolina da invenção, bem como seqüências de nucleotídeo que são complementares a isto. A seqüência de nucleotídeo pode ser RNA ou DNA, incluindo DNA genômico, DNA sintético ou cDNA . Preferivelmente, a seqüência de nucleotídeo é DNA e mais preferivelmente, uma seqüência de DNA genômico. Tipicamente, um polinucleotí-deo da invenção compreende uma seqüência contígua de nucleotídeos que é capaz de hibridizar sob condições seletivas para a seqüência de codificação ou o complemento da seqüência de codificação de SEQ ID NO: 1. Tais nucleotídeos podem ser sintetizados de acordo com os métodos bem-conhecidos na técnica .

Um polinucleotídeo da invenção pode hibridizar para a seqüência de codificação ou o complemento da seqüência de codificação de SEQ ID NO: 1 em um nível significantemente acima da base. A hibridização da base pode ocorrer, por exemplo, por causa de outros cDNAs presentes em uma biblioteca de cDNA. O nível de sinal gerado pela interação entre um polinucleotídeo da invenção e a seqüência de codificação ou complemento da seqüência de codificação de SEQ ID NO: 1 é tipicamente pelo menos 10 vezes, preferivelmente pelo menos 20 vezes, mais preferivelmente pelo menos 50 vezes, e ainda mais preferivelmente pelo menos 100 vezes, tão intensa quanto as interações entre outros polinucleotídeos e a seqüência de codificação de SEQ ID NO: 1. A intensidade da interação pode ser avaliada, por exemplo, radiorrotulando-se a sonda, por exemplo, com 32P. A hibridiza-ção seletiva pode tipicamente ser obtida empregando condições de baixa rigorosidade (0,3M de cloreto de sódio e 0,03M de citrato de sódio em cerca de 40°C), média rigorosidade (por exemplo, 0,3M de cloreto de sódio e 0,03M de citrato de sódio em cerca de 50°C) ou alta rigorosidade (por exemplo, 0,3M de cloreto de sódio e 0,03M de citrato de sódio em cerca de 60°C). Modificações Os polinucleotídeos da invenção podem compreender DNA ou RNA. Eles podem ser de filamento simples ou duplo. Eles podem também ser polinucleotídeos que incluem dentro deles nucleotídeos sintéticos ou modificados incluindo ácidos nucléicos de peptídeo. Vários tipos diferentes de modificações para polinucleotídeos são conhecidos na técnica. Estes incluem cadeias principais de metilfosfonato e fosforotioato, e adição de cadeias de acridina ou polilisina nas extremidades 3'e/ou 5' da molécula. Para os propósitos da presente invenção, deve ser entendido que os polinucleotídeos descritos aqui podem ser modificados por qualquer método disponível na técnica.

Deve ser entendido que pessoas experientes podem, empregando técnicas de rotina, fazer as substituições de nucleotídeo que não afetam a seqüência de polipeptídeo codificada pelos polinucleotídeos da invenção para refletir o uso de códon de qualquer organismo hospedeiro particular em que os polipeptídeos da invenção devem ser expressos. A seqüência de codificação de SEQ ID NO: 1 pode ser modificada por substituições de nucleotídeo, por exemplo, de 1, 2 ou 3 a 10, 25, 50 ou 100 substituições. O polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1 pode alternativamente ou adicionalmente ser modificado por uma ou mais inserções e/ou deleções e/ou por uma extensão em cada ou ambas as extremidades. O polinucleotídeo modificado geralmente codifica um polipeptídeo que tem atividade de endoprotease específica de prolina. Substituições degeneradas podem ser feitas e/ou substituições podem ser feitas as quais resultariam em uma substituição de aminoácido conservativa quando a seqüência modificada é transladada, por exemplo, como discutida com referência aos polipeptídeo mais recentes.

Homólogos Uma seqüência de nucleotídeo que é capaz de seletivamente hibridizar para o complemento do DNA codificando a seqüência de SEQ ID NO: 1 é incluída na invenção e geralmente terá pelo menos 50% ou 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de seqüência para a sequência de codificação de SEQ ID NO: 1 sobre uma região de pelo menos 60, preferivelmente pelo menos 100, mais preferivelmente pelo menos 200 nu-cleotídeos contíguos ou mais preferivelmente sobre o tamanho natural de SEQ ID NO: 1. Da mesma maneira, um nucleotídeo que codifica uma endoprotease específica de prolina ativa e que é capaz de seletivamente hibridizar para um fragmento de um complemento do DNA codificando a SEQ ID NO: 1, é também abrangido pela invenção. Um fragmento de terminal C da seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 1 que é pelo menos 80% ou 90% idêntica em 60, preerivelmente em 100 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 90% idêntica em 200 nucleotídeos é abrangido pela invenção.

Qualquer combinação dos graus acima mencionados de identidade e tamanhos mínimos pode ser usada para definir os polinucleotídeos da invenção, com as combinações mais rigorosas (isto é, identidade elevada em comprimentos mais longos) sendo preferidas. Desse modo, por exemplo, um polinucleotídeo que é pelo menos 80% ou 90% idêntico em 60, preferivelmente em 100 nucleotídeos, forma um aspecto da invenção, como faz um polinucleotídeo que é pelo menos 90% idêntico em 200 nucleotídeos. O pacote UWGCG fornece o programa BESTFIT que pode ser usado para calcular a identidade (por exemplo, usado em suas fixações ausentes).

Os algoritmos PILEUP e BLAST N podem também ser usados para calcular a identidade de seqüência ou para dispor seqüências (tal como identificar seqüências correspondentes ou equivalentes, por exemplo, em suas fixações ausentes).

Software para executar análises BLAST está em geral disponível por meio do Center National for Information Biotechnology (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiro identificar o par de seqüência de marcação alta (HSPs) identificando-se palavras curtas de comprimento W na seqüência de pergunta que ou compara ou satisfaz algum escore limiar avaliado positivo T quando alinhado com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência de base de dados. T é referido como limiar de escore de palavra vizinha. Estes choques de palavra vizinha iniciais agem como sementes para iniciar pesquisas para descobrir HSPs contendo-os. Os choques de palavra são estendidos em ambas as direções juntamente com cada seqüência visto que até o escore de álinhamento cumulativo pode ser aumentado. As extensões para os choques de palavra em cada direção são parados quando: o escore de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X de seu valor máximo obtido; o escore cumulativo caminha para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de marcação negativa; ou a extremidade de cada seqüência é alcançada. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLAST usa como ausências um comprimento de palavra (W) de 11, os alinhamentos matriz de marcação BLOSUM62 (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4, e uma comparação de ambos os filamentos. O algoritmo BLAST executa uma análise estatística da similaridade entre duas seqüências. Uma medida da similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade de soma menor (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade por qual uma comparação entre duas seqüências de aminoácido ou nucleotídeo ocorrería por acaso, por exemplo, uma se-qüência é considerada similar à outra sequência se a probabilidade de soma menor em comparação da primeira seqüência para a segunda seqüência for menor do que cerca de 1, preferivelmente menor do que cerca de 0,1, mais preferivelmente menor do que cerca de 0,01, e mais preferivelmente menor do que cerca de 0,001.

Sondas e Iniciadores Os polinucleotídeos da invenção incluem e podem ser usados como iniciadores, por exemplo, como iniciadores de reação de cadeia de polimerase (PCR), como iniciadores para reações de amplificação alternativas, ou como sondas, por exemplo, rotuladas com um rótulo de revelação por meios convencionais empregando rótulos radioativos ou não radioativos, ou os polinucleotídeos podem ser clonados em vetores. Tais iniciadores, as sondas e outras fragmentos serão pelo menos 15, por exemplo, pelo menos 20, 25, 30 ou 40 nucleotídeos em comprimento. Eles tipicamente serão até 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 ou 300 nucleotídeos em comprimento, ou ainda até alguns nucleotídeos curtos (tal como 5 ou 10 nucleotídeos) da seqüência de codificação de SEQ ID NO:1.

Em geral, os iniciadores serão produzidos por meios sintéticos, envolvendo uma fabricação em etapa do nucleotídeo de uma seqüência de ácido nucléico desejada de uma vez. As técnicas para executar isto empregando protocolos mecanizados são facilmente disponíveis na técnica. Os polinucleotídeos mais longos geralmente serão produzidos empregando meios recombinantes, por exemplo, empregando técnicas de clonagem de PCR. Isto envolverá fazer um par de iniciadores (tipicamente de cerca de 15-30 nucleotídeos) para amplificar a região desejada da endoprotease específica de prolina a ser clonada, trazendo os iniciadores em contanto com o mRNA, cDNA ou DNA genômico obtido de uma levedura, bactéria, planta, célula procariótica ou fúngica, preferivelmente de uma cepa de Aspergillus, executando uma reação de cadeia de polimerase sob condições adequadas para a amplificação da região desejada, isolando o fragmento amplificado (por exemplo, purificando-se a mistura de reação em um gel de agarose) e recuperando o DNA amplificado. Os iniciadores podem ser designados por conter sítios de reconhecimento de enzima de restrição adequados a fim de que o DNA amplificado possa ser clonado em um vetor de clonagem adequado.

Tais técnicas podem ser usadas para obter todo ou parte dos polinucleotídeos codificando as seqüências de endoprotease específica de prolina descritas aqui. Os íntrons, promotores e regiões adjacentes estão no escopo da invenção e podem também ser obtidos da invenção e podem também ser obtidos de uma maneira análoga (por exemplo, por meios re-combinantes, técnicas de PCR ou de clonagem), começando com DNA ge-nômico de um fungo, levedura, bactéria, planta ou célula procariótica .

Os polinucleotídeos ou iniciadores podem carregar um rótulo de revelação. Rótulos adequados incluem radioisótopos, tais como 32P ou 35S, rótulos de enzima, ou outros rótulos de proteína, tais como biotina. Tais rótulos podem ser adicionados aos polinucleotídeos ou iniciadores da invenção e podem ser detectados empregando técnicas conhecidas por pessoas versados na técnica.

Os polinucleotídeos ou iniciadores (ou fragmentos destes) rotulados ou não rotulados podem ser usados em testes com base em ácido nu-cléico para detectar ou seqüenciar uma endoprotease específica de prolina ou uma variante desta em uma amostra fúngica. Tais testes de detecção geralmente compreenderão trazer uma amostra fúngica suspeita de conter o DNA de interesse em contato com uma sonda compreendendo um polínu-cleotídeo ou iniciador da invenção sob condições de hibridização, e detectar qualquer dúplex formado entre a sonda e o ácido nucléico na amostra. A detecção pode ser obtida empregando técnicas, tais como PCR ou imobili-zando-se a sonda ou um suporte sólido, removendo qualquer ácido nucléico na amostra que não é hibridizado para a sonda, e em seguida detectar qualquer ácido nucléico que é hibridizado para a sonda. Alternativamente, o ácido nucléico de amostra pode ser imobilizado em um suporte sólido, a sonda hibridizada e a quantidade de sonda ligada a um tal suporte depois da remo- ção de qualquer sonda não ligada detectada.

As sondas da invenção podem convenientemente ser empaco-tadas na forma de um kit de teste em um recipiente adequado. Em tais kits a sonda pode ser ligada a um suporte sólido onde o formato do ensaio para qual o kit é designado requer tal ligação. O kit pode também conter reagen-tes adequados para tratar a amostra a ser sondada, hibridizando a sonda para ácido nucléico na amostra, reagentes de controle, instruções, e outro. As sondas e polinucleotídeos da invenção podem também ser usadas em microensaio.

Preferivelmente, o polinucleotídeo da invenção é obtenível do mesmo organismo como o polipeptídeo, tal como fungo, em particular um fungo do gênero Aspergillus.

Os polinucleotídeos da invenção também incluem variantes da seqüência de SEQ ID NO: 1 que codifica para um polipeptídeo tendo atividade de endoprotease específica de prolina. As variantes podem ser formadas por adições, substituições e/ou deleções. Tais variantes da seqüência de codificação de SEQ ID NO: 1 podem desse modo codificar polipeptídeos que têm a capacidade de digerir uma cadeia de polipeptídeo no lado de terminal carbóxi de prolina.

Produção de polinucleotídeos Os polinucleotídeos que não têm 100% de identidade com SEQ ID NO: 1 porém incluem-se no escopo da invenção, podem ser obtidos de várias maneiras. Desse modo, as variantes de seqüência de endoprotease específica de prolina descritas aqui podem ser obtidas, por exemplo, sondando-se as bibliotecas de DNA genômico feitas de uma faixa de organismos, tal como aquelas discutidas como fontes dos polipeptídeos da invenção. Em adição, outros homólogos procarióticos, planta ou fungo de endoprotease específica de prolina podem ser obtidos e tais homólogos e fragmentos destes, em geral, serão capazes de hibridizar para SEQ ID NO: 1. Tais seqüências podem ser obtidas sondando-se bibliotecas de cDNA ou bibliotecas de DNA genômico de outras espécies, e sondando tais bibliotecas com sondas compreendendo toda ou parte da SEQ ID NO: 1 sob condi- ções de baixa, média a alta severidade (como descrito mais cedo). Sondas de ácido nucléico compreendendo toda ou parte da SEQ ID NO: 1 podem ser usadas para sondar as bibliotecas genômicas ou de cDNA de outras espécies, tais como aquelas descritas como fontes para os polipeptídeos da invenção.

As espécies homólogas podem também ser obtidas empregando PCR degenerado, que usa iniciadores designados em seqüência alvo dentro das variantes e homólogos que codificam as seqüências de aminoácido conservadas. Os iniciadores podem conter uma ou mais posições degeneradas e serão empregados em condições rigorosas menores do que aquelas usadas para clonar as seqüências com iniciadores de seqüência simples contra seqüências conhecidas.

Alternativamente, tais polinucleotídeos podem ser obtidos por mutagênese direcionada de sítio das seqüências de endoprotease específica de prolina ou variantes destas. Isto pode ser útil onde, por exemplo, mudanças de códon silencioso em seqüências são requeridas para otimizar as preferências de códon para uma célula hospedeira particular em que as seqüências de polinucleotídeo estão sendo expressas. Outras mudanças de seqüência podem ser feitas a fim de introduzir os sítios de reconhecimento de enzima de restrição, ou para alterar a propriedade ou função dos polipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos. A invenção inclui polinucleotídeos de filamento duplo compreendendo um polinucleotídeo da invenção e seu complemento. A presente invenção também fornece polinucleotídeos codificando os polipeptídeos da invenção descritos acima. Uma vez que tais polinucleotídeos serão úteis como seqüências para a produção recombinante de polipeptídeos da invenção, não é necessário para eles serem capazes de hibridizar para a seqüência de SEQ ID NO: 1, embora isto geralmente será desejável. De outra maneira, tais polinucleotídeos podem ser rotulados, empregados, e feitos como descrito acima se desejado.

Polinucleotídeos Recombinantes A invenção também fornece vetores compreendendo um polínu- cleotídeo da invenção, incluindo vetores de expressão e de clonagem, e em outro aspecto, métodos de desenvolver, transformar ou transfectar tais vetores em uma célula hospedeira adequada, por exemplo, sob condições em que a expressão de um polipeptídeo de, ou codificados por uma sequência de, a invenção ocorre. Fornecidas também são células hospedeiras compreendendo um polinucleotídeo ou vetor da invenção em que o polinucleotídeo é heterólogo ao genoma da célula hospedeira. O termo "heterólogo", usualmente com respeito à célula hospedeira, significa que o polinucleotídeo não ocorre naturalmente no genoma da célula hospedeira ou que o polipeptídeo não é naturalmente produzido por aquela célula. Preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula de levedura, por exemplo, uma célula de levedura do gênero Kluyveromyces ou Saccharomyces ou uma célula fúngica filamen-tosa, por exemplo, do gênero Aspergillus.

Os polinucleotídeos da invenção podem ser incorporados em um vetor replicável recombinante, por exemplo, um vetor de expressão ou de clonagem. O vetor pode ser usado para replicar o ácido nucléico em uma célula hospedeira compatível. Desse modo, em uma outra modalidade, a invenção fornece um método de fazer polinucleotídeos da invenção introdu-zindo-se um polinucleotídeo da invenção em um vetor replicável, introduzindo o vetor em uma célula hospedeira compatível, e desenvolvendo-se a célula hospedeira sob condições que realizam a replicação do vetor. O vetor pode ser recuperado da célula hospedeira. Células hospedeiras adequadas são descritas abaixo em conexão com os vetores de expressão.

Vetores O vetor em que o cassete de expressão da invenção é inserido pode ser qualquer vetor que possa convenientemente ser submetido aos procedimentos de DNA recombinantes, e a escolha do vetor freqüentemente dependerá da célula hospedeira em que ele deve ser introduzido. Desse modo, o vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação da qual é independente da replicação cromossômica, tal como um plasmídeo. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hos- pedeira, é integrado no genoma de célula hospedeira e replica-se juntamente com o(s) cromossomo(s) em que ele foi integrado.

Preferivelmente, quando um polinucleotídeo da invenção está em um vetor, ele é operavelmente ligado a uma seqüência reguladora que-é capaz de fornecer para a expressão da seqüência de codificação pela célula hospedeira, isto é, o vetor é um vetor de expressão. O termo "operavelmente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma ligação permitindo-os funcionar em sua maneira destinada. Uma seqüência reguladora, tal como um promotor, intensificador ou outro sinal de regulação de expressão "operavelmente ligado" em uma seqüência de codificação está posicionada de uma tal maneira que a expressão da seqüência de codificação é obtida sob condições compatíveis com as seqüências de controle.

Os vetores podem, por exemplo, no casõ de vetores de plasmí-deo, cosmídeo, vírus ou fago, ser fornecidos com uma origem de replicação, opcionalmente um promotor para a expressão do polinucleotídeo e opcio-nalmente um realçador e/ou um regulador do promotor. Uma seqüência ter-minadora pode estar presente, como pode ser uma seqüência de poliadeni-lação. Os vetores podem conter um ou mais genes marcadores selecionáveis, por exemplo, um gene resistente à ampicilina no caso de um plasmídeo bacteriano ou gene resistente à neomicina para um vetor de mamífero. Os vetores podem ser usados in vitro, por exemplo, para a produção de RNA ou podem ser usados para transferir ou transformar uma célula hospedeira. A seqüência de DNA codificando o polipeptídeo é preferivelmente introduzida em um hospedeiro adequado como parte de um construto de expressão em que a seqüência de DNA é operavelmente ligada aos sinais de expressão que são capazes de direcionar a expressão da seqüência de DNA nas células hospedeiras. Para a transformação do hospedeiro adequado com a transformação de construto de expressão, os procedimentos estão disponíveis os quais são bem-conhecidos pela pessoa versadas. O construto de expressão pode ser usado para a transformação do hospedeiro como parte de um vetor transportando um marcador selecionável, ou o construto de expressão é co-transformado como uma molécula separada juntamente com o vetor transportando um marcador selecionável. Os vetores podem conter um ou mais genes marcadores selecionáveis.

Marcadores selecionáveis preferidos incluem porém não são limitados àqueles que complementam um defeito da célula hospedeira ou conferem resistência a uma droga. Eles incluem, por exemplo, genes marcadores versáteis que podem ser usados para a transformação da maioria das leveduras e fungos filamentosos, tais como genes de acetamidase ou cDNAs (os genes amdS, niaD, facA ou cDNAs de A. nidulans, A. oryzae, ou A. niger), ou genes fornecendo resistência a antibióticos tipo G418, higromi-cina, bleomicina, canamicina, fleomicina ou ou resistentes à benomila (be-nA). Alternativamente, os marcadores de seleção específicos podem ser usados, tais como marcadores auxotróficos que requerem cepas de hospedeiro mutantes correspondentes:, por exemplo, URA3 (de S. cerevisiae ou genes análogos de outras leveduras), pyrG ou pyrA (de A. nidulans ou A. niger), argB (de A. nidulans ou A. niger) ou trpC. Em uma modalidade preferida, o marcador de seleção é deletado da célula hospedeira transformada após a introdução do construto de expressão a fim de obter células hospedeiras transformadas capazes de produzir o polipeptídeo que são livres de genes marcadores de seleção.

Outros marcadores incluem subunidade de sintetase ATP 9 (oliC), orotidina-5'-fosfatodecarboxilase (pvrA), o gene resistente a G418 bacteriano (útil em levedura, porém não em fungos filamentosos), o gene resistente à ampicilina (E.coli), o gene resistente à neomicina (Bacillus) e o gene uidA de E. coli, codificando para glicoronidase (GUS). Os vetores podem ser usados in vitro, por exemplo, para a produção de RNA ou para transferir ou transformar uma célula hospedeira.

Para a maior parte de levedura e fungos filamentosos, o construto de expressão é preferivelmente integrado no genoma da célula hospedeira a fim de obter transformantes estáveis. Entretanto, para certas leveduras, sistemas de vetores epissômicos adequados são também disponíveis nos quais o construto de expressão pode ser incorporado para a expressão de nível estável e elevado. Exemplos destes incluem vetores derivados dos plasmídeos de 2 μιτι, CEN e pKD1 de Saccharomyces e Kluyveromyces, respectivamente, ou vetores contendo uma seqüência AMA (por exemplo, AMA1 de Aspergillus). Quando as construções de expressão são integradas em genomas de célula hospedeira, as construções são ou integradas em locais aleatórios no genoma, ou em locais alvo predeterminado empregando recombinação homóloga, caso em que os locais alvo preferivelmente compreendem um gene altamente expresso. Um gene altamente expresso é um gene cujo mRNA pode preparar pelo menos 0,01% (p/p) do mRNA celular total, por exemplo, sob condições induzidas, ou alternativamente, um gene cujo produto de gene pode preparar pelo menos 0,2% (p/p) da proteína celular total, ou, no caso de um produto de gene segregado, pode ser segregado em um nível de pelo menos 0,05 g/l.

Um construto de expressão para uma dada célula hospedeira usualmente conterá os seguintes elementos operavelmente ligados um ao outro em ordem consecutiva da extremidade 5' a extremidade 3' relativa ao filamento de codificação da seqüência codificando o pólipeptídeo do primeiro aspecto: (1) uma seqüência de promotor capaz de direcionar a transcrição da seqüência de DNA codificando o polipeptídeo na dada célula hospedeira, (2) preferivelmente uma região não-transladada 5' (líder), (3) opcionalmente, uma seqüência de sinal capaz de direcionar a secreção do polipeptídeo da dada célula hospedeira no veículo de cultura, (4) a seqüência de DNA codificando uma forma madura e preferivelmente ativa do polipeptídeo, e preferivelmente da mesma forma (5) uma região de terminação de transcrição (terminador) capaz de terminar a transcrição a jusante da seqüência de DNA codificando o polipeptídeo. A jusante da seqüência de DNA codificando o polipeptídeo, o construto de expressão preferivelmente contém uma região transladada 3' contendo um ou mais sítios de terminação de transcrição, da mesma forma referido como um terminador. A origem do terminador é menos crítica. O terminador pode, por exemplo, ser nativo à seqüência de DNA codificando o polipeptídeo. Entretanto, preferivelmente um terminador de levedura é em- pregado em células hospedeiras de levedura e um terminador fúngico fila-mentoso é empregado em células hospedeiras fungais filamentosas. Mais preferivelmente, o terminador é endógeno à célula hospedeira em que a se-qüência de DNA codificando o polipeptídeo é expressa. A expressão intensificada do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo da invenção pode também ser obtida pela seleção de regiões reguladoras heteróIogas, por exemplo, promotor, seqüência de sinal e regiões terminadoras, que servem para aumentar a expressão e, se desejado, os níveis de separação da proteína de interesse do hospedeiro de expressão selecionado e/ou fornecer para o controle induzível da expressão do polipeptídeo da invenção.

Com exceção do promotor nativo ao gene codificando o polipeptídeo da invenção, outros promotores podem ser usados para direcionar a expressão do polipeptídeo da invenção. O promotor pode ser selecionado quanto à sua eficiência direcionando-se a expressão do polipeptídeo da invenção no hospedeiro de expressão desejado.

Os promotores/realçadores e outros sinais de regulação de expressão podem ser selecionados para serem compatíveis com a célula hospedeira para que o vetor de expressão seja designado, por exemplo, promotores procarióticos podem ser usados, em particular aqueles adequados para uso em cepas de E. coli. Quando a expressão dos polipeptídeos da invenção é realizada em células de mamíferos, os promotores de mamíferos podem ser usados. Os promotores específicos de tecido, por exemplo, promotores específicos de célula de hepatócito, podem também ser usados. Os promotores virais podem também ser empregados, por exemplo, a repetição de terminal longo de vírus da leucemia de murino Moloney (MMLV LTR), o promotor de LTR do vírus do sarcoma de Rous (RSV), o promotor SV40, o promotor IE de citomegalovírus humano (CMV), promotores de vírus do her-pes simples ou promotores de adenovírus.

Promotores de levedura adequados incluem os promotores de ADH e de S. cerevisiae GAL4 e o promotor de adh e S. pombe nmt1. Os promotores de mamíferos incluem o promotor de metalotioneína que pode ser induzido em resposta aos metais pesados, tais como cádmio. Os promotores virais, tais como promotor de antígeno T largo SV40 ou promotores de adenovírus podem também ser usados. Todos estes promotores estão facilmente disponíveis na técnica.

Promotores de mamíferos, tais como promotores de β-actina, podem ser usados . Os promotores específicos, em particular promotores específicos de célula neuronal ou endotelial particulares (por exemplo, os promotores de DDAHI e DDAHII), são especialmente preferidos. Promotores virais podem também ser usados, por exemplo, a repetição de terminal longo de vírus da leucemia de murino Moloney (MMLV LTR), o promotor de LTR do vírus do sarcoma de Rous (RSV), o promotor SV40, o promotor IE de ci-tomegalovírus humano (CMV), adenovírus, promotores de HSV (tais como os promotores IE de HSV), ou promotores de HPV, particularmente a região reguladora a montante de HPV (URR). Promotores virais são facilmente disponíveis na técnica.

Uma variedade de promotores pode ser usada, os quais são capazes de direcionar a transcrição nas células hospedeiras da invenção. Preferivelmente, a seqüência de promotor é derivada de um gene altamente expresso como previamente definido. Exemplos de genes altamente expressos preferidos dos quais os promotores são preferivelmente derivados e/ou que são compreendidos e locais alvo predeterminados preferidos para integração de construtos de expressão, incluem, porém não são limitados a, enzimas glicolíticas de codificação de genes tal como triose fosfato isomerases (TPI), desidrogenases gliceraldeído fosfato (GAPDH), cinases de fosfoglice-rato (PGK), cinases de piruvato (PYK), desidrogenases de álcool (ADH), bem como genes codificando amilases, glicoamilases, proteases, xilanases, celobioidrolases, β-galactosidases, oxidases de álcool (metanol), fatores de prolongamento e proteínas ribossômicas. Exemplos específicos de genes altamente expressos adequados incluem, por exemplo, o gene LAC4 de Kluyveromyces sp., os genes de oxidase de metanol (AOX e MOX) de Han-senula e Pichia, respectivamente, os genes de glicoamilase (glaA) de A. ni-gere A. awamori, o gene de amilase TAKA de A. oryzae, o gene gpdA de A. nidulans e os genes de celobioidrolase de T. reesei.

Exemplos de promotores induzíveis e/ou constitutivos fortes que são preferidos para uso em hospedeiros de expressão fúngicos são aqueles que são obteníveis dos genes fúngicos para xilanase (xinA); fitase, subuni-dade 9 de sintetase de ATP (oliC), triose fosfato isomerase (tpi), desidroge-nase de álcool (AdhA), amilase (amy), aminoglicosidase (AG- do gene glaA), acetamidase (amdS) e promotores de desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (gpd).

Exemplos de promotores de levedura fortes que podem ser usados incluem aqueles obteníveis dos genes para desidrogenase de álcool, lactase, cinase de 3-fosfoglicerato e triosefosfato isomerase.

Exemplos de promotores bacterianos fortes que podem ser usados incluem os promotores de amilase e Spo2, bem como promotores de genes de protease extracelulares.

Promotores adequados para células de planta que podem ser usados incluem sintase de napalina (nos), sintase de octopina (ocs), sintase de manopina (mas), pequena subunidade de ribulose (rubisco ssu), histona, actina de arroz, faseolina, promotores de circorvírus e 35S e 19S de vírus mosaico da couve-flor (CMV). O vetor pode também incluir seqüência flanqueando a polinucle-otídeo dando origem ao RNA que compreende seqüências homólogas àquelas das seqüências genômicas eucarióticas, preferivelmente seqüências ge-nômicas de mamíferos, ou seqüências genômicas virais. Isto permitirá a introdução dos polinucleotídeos da invenção no genoma de células eucarióticas ou vírus por recombinação homóloga. Em particular, um vetor de plas-mídeo compreendendo o cassete de expressão flanqueado por seqüências virais pode ser usado para preparar um vetor viral adequado para liberar os polinucleotídeos da invenção em uma célula de mamífero. Outros exemplos de vetores virais adequados incluem vetores virais de herpes simples e re-trovírus, incluindo lentivírus, adenovírus, vírus adeno-associados e vírus de HPV (tais como HPV-16 ou HPV-18). Técnicas de transferência de gene empregando estes vírus são conhecidas por aqueles versados na técnica.

Vetores de retrovírus, por exemplo, podem ser empregados para estavel-mente integrar o polinucleotídeo dando origem ao RNA de anti-sentido no genoma hospedeiro. Os vetores de adenovírus defeituosos de replicação por contraste permanecem epissômicos e, portanto, permitem a expressão transitória. O vetor pode conter um polinucleotídeo da invenção orientado em uma direção de antisentido para fornecer para a produção de RNA de antisentido. Isto pode ser usado para reduzir, se desejável, os níveis de expressão do polipeptídeo.

Expressão e Células Hospedeiras Em um outro aspecto, a invenção fornece um processo para preparar um polipeptídeo da invenção que compreende cultivar uma célula hospedeira transformada ou transfectada com um vetor de expressão como descrito acima sob condições adequadas para a expressão pelo vetor de uma seqüência de codificação codificando o polipeptídeo, e recuperando o polipeptídeo expresso. Os polinucleotídeos da invenção podem ser incorporados em um vetor replicável recombinante, tal como um vetor de expressão. O vetor pode ser empregado para replicar o ácido nucléico em uma célula hospedeira compatível. Desse modo, em uma outra modalidade, a invenção fornece um método de fazer um polinucleotídeo da invenção introduzindo-se um polinucleotídeo em um vetor replicável, introduzindo o vetor em uma célula hospedeira compatível, e desenvolvendo a célula hospedeira sob condições que realizam a replicação do vetor. O vetor pode ser recuperado da célula hospedeira. Células hospedeiras adequadas incluem bactérias, tais como E. coli, levedura, linhagens de células de mamíferos e outras linhagens de células eucarióticas, por exemplo, células de inseto, tais como células Sf9 e células fúngicas (por exemplo, filamentosas).

Preferivelmente, o polipeptídeo é produzido como uma proteína segregada caso em que a seqüência de DNA codificando uma forma madura do polipeptídeo no construto da expressão é operavelmente ligada a uma seqüência de DNA codificando uma seqüência de sinal. No caso em que o gene codificando a proteína segregada tem na cepa de tipo silvestre uma seqüência de sinal preferivelmente a seqüência de sinal empregada será nativa (homóloga) à seqüência de DNA codificando o polipeptídeo. Alternativamente, a seqüência de sinal é estranha (heteróloga) à seqüência de DNA codificando o polipeptídeo, caso em que a seqüência de sinal é preferivelmente endógena à célula hospedeira em que a seqüência de DNA é expressa. Exemplos de seqüências de sinal adequadas para células hospedeiras de levedura são as seqüências de sinal derivadas de genes Mfalfa de levedura. Similarmente, uma seqüência de sinal adequada para células hospedeiras fúngicas filamentosas é, por exemplo, uma seqüência de sinal derivada de um gene de amiloglicosidase (AG) fúngico filamentoso, por exemplo, gene glaA de A. niger. Esta seqüência de sinal pode ser usada em combinação com o promotor de amiloglicosidase (assim chamado (glico)amilase) propriamente dito, bem como em combinação com outros promotores. Se-qüências de sinal híbridas podem também ser usadas dentro do contexto da presente invenção.

Seqüências líderes de separação heterólogas preferidas são aquelas originando do gene de amiloglicosidase (AG) fúngico (glaA - ambas versões de 18 e 24 aminoácidos, por exemplo, de Aspergillus), o gene Mfalfa (leveduras, por exemplo, Saccharomyces e Kluyveromyces) ou outro gene de alfa-amilase (Bacillus).

Os vetores podem ser transformados ou transfectados em uma célula hospedeira adequada como acima descrito para fornecer para a expressão de um polipeptídeo da invenção. Este processo pode compreender cultivar uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão como acima descrito sob condições adequadas para expressão do polipeptídeo, e opcionalmente recuperando o polipeptídeo expresso.

Um outro aspecto da invenção desse modo fornece células hospedeiras transformadas ou transfectadas com ou compreendendo um poli-nucleotídeo ou vetor da invenção. Preferivelmente, o polinucleotídeo é transportado em um vetor que permite a replicação e expressão do polinucleotídeo. As células serão escolhidas para serem compatíveis com o referido vetor e podem, por exemplo, ser procarióticas (por exemplo, bacterianas), ou células eucarióticas, fungo, levedura ou planta. A invenção abrange processos para a produção de um polipep-tídeo da invenção por meios de uma expressão recombinante de uma se-qüência de D NA codificando o polipeptídeo. Para este propósito, a seqüên-cia de DNA da invenção pode ser empregada para amplificação de gene e/ou permuta de sinais de expressão, tais como promotores, seqüências de sinal de separação, a fim de permitir a produção econômica do polipeptídeo em uma célula hospedeira heteróloga ou homóloga. Uma célula hospedeira homóloga é aqui definida como uma célula hospedeira que da mesma espécie ou que é uma variante dentro das mesmas espécies como as espécies da qual a seqüência de DNA é derivada. Células hospedeiras adequadas são preferivelmente microorganismos procarióticos, tais como bactérias, ou mais preferivelmente organismos eucarióticos, por exemplo, fungos, tais como leveduras ou fungos fila-mentosos, ou células de planta. Em geral, as células de levedura são preferidas em células fúngicas filamentosas porque elas são mais fáceis de manipular. Entretanto, algumas proteínas são ou malsegregadas de leveduras ou em alguns casos não são processadas adequadamente (por exemplo, hiper-glicosilação em levedura). Nestes exemplos, um organismo hospedeiro fún-gico filamentoso deveria ser selecionado.

As bactérias do gênero Bacillus são muito adequadas como hospedeiros heterólogos por causa de sua capacidade de segregar proteínas no veículo de cultura. Outras bactérias adequadas como hospedeiras são aquelas do gênero Streptomyces e Pseudomonas. Uma célula hospedeira de levedura preferida para a expressão da seqüência de DNA codificando o polipeptídeo é aquela do gênero Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, ou Schizosaccharomyces, Mais preferivelmente, uma célula hospedeira de levedura é selecionada do grupo consistindo nas espécies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (também conhecidas como Kluyveromyces marxianus var. lactis), Hansenula polymor-pha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, e Schizosaccharomyces pombe.

Mais preferidas para a expressão da seqüência de DNA codifi- cando o polipeptídeo são, entretanto, células hospedeiras fúngicas filamen-tosas. As células hospedeiras fúngicas filamentosas preferidas são selecionadas do grupo consistindo nos gêneros Aspergillus, Trichoderma, Fusa-rium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, e Talaromyces. Mais preferivelmente, uma célula hospedeira fúngica filamentosa é das espécies Aspergillus oyzae, Aspergillus sojae ou Aspergillus nidulans ou é de uma espécie do grupo de Aspergillus niger (como definido por Raper e Fennell, The Genus Aspergillus, The Willians & Wilkins Company, Baltimore, pp. 293-344, 1965). Estas incluem, porém não são limitadas a, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foatidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae e Aspergillus ficuum, e também aqueles das espécies Trichoderma reesei, Fusarium gra-minearum, Pecicilliun chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum e Thielavia terrestris.

Exemplos de hospedeiros de expressão preferidos dentro do escopo da presente invenção são fungos, tais como espécie de Aspergillus (em particular aquelas descritas em EP-A-184.438 e EP-A-284,603) e espécie de Trichoderma', bactérias, tais como espécie de Bacillus (em particular aquelas descritas em EP-A-134,048 e EP-A-253,455), especialmente espécie de Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Pseudomonas; e leveduras, tais como espécie de Kluyveromyces (em particular, aquelas descritas em EP-A-096,430, tais como Kluyveromyces lactis e em EP-A-301,670) e espécie de Saccharomyces, tais como Saccharomyces cerevisiae. Células hospedeiras de acordo com a invenção incluem células de planta, e invenção portanto estende-se aos organismos trangênicos, tais como plantas e partes destas, que contêm uma ou mais células da invenção. As células podem heterologamente expressar o polipeptídeo da invenção ou podem heterologamente conter um ou mais polinucleotídeos da invenção. A planta transgênica (ou geneticamente modificada) pode, portanto, ter inseri- do (tipicamente estavelmente) em seu genoma uma seqüência codificando os polipeptídeos da invenção. A transformação de células de planta pode ser executada empregando técnicas conhecidas, por exemplo, empregando um plasmídeo Ti ou um Ri de Agrobacterium tumefaciens. O plasmídeo (ou vetor) pode desse modo conter seqüências necessárias para infectar uma planta, e derivados dos plasmídeos Ti e/ou Ri podem ser empregados. A célula hospedeira pode superexpressar o polipeptídeo e técnicas para construir a superexpressão são bem-conhecidas e podem ser empregadas na presente invenção. O hospedeiro pode desse modo ter duas ou mais cópias do polinucleotídeo.

Alternativamente, a infecção direta de uma parte de uma planta, tal como uma folha, raiz ou tronco pode ser executada. Nesta técnica, a planta a ser infectada pode ser ferida, por exemplo, cortando-se a planta com uma navalha, perfurando a planta com uma agulha ou esfregando-se a planta com um abrasivo. A ferida é, em seguida, inoculada com o Agrobacterium. A planta ou parte da planta pode, então, ser desenvolvida em um veículo de cultura adequado e permitida desenvolver em uma planta madura. A regeneração de células transformadas em plantas geneticamente modificadas pode ser obtida empregando-se técnicas conhecidas, por exemplo, selecionando-se os brotos transformados empregando um antibiótico e subcul-tivando-se os brotos em um veículo contendo os nutrientes adequados, hormônios de planta e outro.

Cultura de células hospedeiras e produção recombinante A invenção também inclui as células que foram modificadas para expressar a endoprotease específica de prolina ou uma variante desta. Tais células incluem transitórias, ou preferivelmente linhagens de células eucarió-ticas mais importantes estavelmente modificadas, tais como células de mamíferos ou células de inseto, células eucarióticas mais inferiores, tais como células fúngicas filamentosas e de levedura ou células procarióticas, tais como células bacterianas. É também possível para os polipeptídeos da invenção ser transitoriamente expressos em uma linhagem de célula ou em uma membrana, tal como, por exemplo, em um sistema de expressão de baculovírus. Tais sistemas, que são adaptados para expressar as proteínas de acordo com a invenção, são também incluídos no escopo da presente invenção.

De acordo com a presente invenção, a produção do polipeptídeo da invenção pode ser executada cultivando-se os hospedeiros de expressão microbianos, que foram transformados com um ou mais polinucleotídeos da presente invenção, em um veículo de fermentação de nutriente convencional.

As células hospedeiras recombinantes de acordo com a invenção podem ser cultivadas empregando os procedimentos conhecidos na técnica. Para cada combinação de um promotor e de uma célula hospedeira, as condições de cultura são disponíveis, as quais são condutoras para a expressão da seqüência de DNA codificando o polipeptídeo. Depois de alcançar a densidade de célula desejada ou título do polipeptídeo, a cultura é cessada e o polipeptídeo é recuperado empregando-se procedimentos conhecidos. O veículo de fermentação pode compreender um veículo de cultura conhecido contendo uma fonte de carbono (por exemplo, glicose, malto-se, molasses, etc), uma fonte de nitrogênio (por exemplo, sulfato de amônio, nitrato de amônio, cloreto de amônio, etc.), uma fonte de nitrogênio orgânica (por exemplo, extrato de levedura, extrato de malte, peptona, etc.) e fontes de nutriente inorgânicas (por exemplo, fosfato, magnésio, potássio, zinco, ferro, etc.). Opcionalmente, um indutor (dependendo do construto de expressão empregado) pode ser incluído ou subseqüentemente ser adicionado. A seleção do veículo apropriado pode ser com base na escolha do hospedeiro de expressão e/ou com base nas exigências reguladoras do construto de expressão. Os veículos adequados são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. O veículo pode, se desejado, conter componentes adicionais favorecendo os hospedeiros de expressão transformados em outros microorganismos potencialmente contaminantes. A fermentação pode ser executada durante um período de 0,5 -30 dias. A fermentação pode ser uma batelada, processo alimentado por batelada ou contínuo, em uma temperatura adequada na faixa entre 0°C e 45°C e, por exemplo, em um pH de 2 a 10. As condições de fermentação preferidas incluem uma temperatura na faixa entre 20°C e 37°C e/ou um pH entre 3 e 9. As condições apropriadas são usualmente selecionadas com base na escolha do hospedeiro de expressão e a proteína a ser expressa.

Após a fermentação, se necessário, as células podem ser removidas do caldo de fermentação por meios de centrifugação ou filtração. Depois da fermentação ter parada ou depois da remoção das células, o poli-peptídeo da invenção pode, em seguida, ser recuperado e, se desejado, purificado e isolado por meios convencionais. A endoprotease específica de prolina da invenção pode ser purificada do micélio fúngico ou do caldo de cultura em que a endoprotease específica de prolina é liberada pelas células fúngicas cultivadas.

Em uma modalidade, o polipeptídeo é obtido de um fungo, mais preferivelmente de um Aspergillus, mais preferivelmente de Aspergillus ni-ger.

Modificações Os polipeptídeos da invenção podem ser quimicamente modificados, por exemplo, pós-translacionalmente modificados,· por exemplo, eles podem ser glicosilados (uma ou mais vezes) ou compreendem resíduos de aminoácidos modificados. Eles podem também ser modificados pela adição de resíduos de histidina para assistir a sua purificação ou pela adição de uma seqüência de sinal para promover a separação da célula. O polipeptídeo pode ter extensões de terminal carboxila e amino, tal como um resíduo de metionina de terminal amino, um peptídeo ligante pequeno de até cerca de 20-25 resíduos, ou uma pequena extensão que facilita a purificação, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Um polipeptídeo da invenção pode ser rotulado com um rótulo de divulgação. O rótulo de divulgação pode ser qualquer rótulo adequado que permite o polipeptídeo ser detectado. Rótulos adequados incluem ra-dioisótopos, por exemplo, 125l, 35 S, enzimas, anticorpos, polinucleotídeos e ligantes, tais como bioíina.

Os polipeptídeos podem ser modificados para incluir aminoáci-dos de ocorrência não-natural ou para aumentar a estabilidade do polipeptí-deo. Quando as proteínas ou peptídeos são produzidos por meios sintéticos, tais aminoácidos podem ser introduzidos durante a produção. As proteínas ou peptídeos podem também ser modificados seguindo ou a produção sintética ou recombinante.

Os polipeptídeos da invenção podem também ser produzidos empregando aminoácidos D. Em tais casos, os aminoácidos serão ligados em seqüência reversa na orientação de C para N. Isto é convencional na técnica para produzir tais proteínas e peptídeos. Várias modificações de cadeia lateral são conhecidas na técnica e podem ser feitas para as cadeias laterais das proteínas ou peptídeos da presente invenção. Tais modificações incluem, por exemplo, modificações de aminoácidos por alquilação redutiva por reação com aldeído seguido por redução com NaBhU, amidinação com metilacetimidato ou acilação com ani-drido acético.

As seqüências fornecidas pela presente invenção podem também ser usadas como materiais de partida para a construção de enzimas de "Segunda geração". Proteases específicas de prolina de "segunda geração" são proteases específicas de prolina, alteradas por técnicas de mutagênese (por exemplo, mutagênese direcionada por sítio), que têm propriedades que diferem daquelas proteases específicas de prolina tipo silvestre ou proteases específicas de prolina recombinantes, tais como aquelas produzidas pela presente invenção, por exemplo, sua temperatura ou pH ideal, atividade específica, afinidade de substrato ou termoestabilidade pode ser alterada para ser melhor adaptada quanto ao uso em um processo particular.

Aminoácidos essenciais para a atividade da protease específica de prolina da invenção, e portanto preferivelmente submetidos à substituição, podem ser identificados de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese direcionada por sítio ou mutagênese de varredura de alanina. Na última técnica, as mutações são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade biológica (por exemplo, atividade de endoprotease específica de prolina) para identificar os resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Os sítios de interação de substrato de enzima podem também ser determinados por análise de estrutura de cristal como determinada por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia ou rotulagem por fotoafinidade . O uso de células hospedeiras fúngicas filamentosas e de levedura é esperado fornecer para tais modificações pós-translacionais (por exemplo, processamento proteolítico, miristilação, glicosilação, truncação, e fosfo-rilação de tirosina, serina ou treonina) como pode ser necessário para conferir atividade biológica ideal em produtos de expressão recombinantes da invenção.

Preparações Os polipeptídeos da invenção podem ser em uma forma isolada. Será entendido que os polipeptídeos podem ser misturados com veículos ou diluentes que não interferirão com o propósito destinado do polipeptídeo e ainda serão considerados como isolados. Um polipeptídeo da invenção pode também ser em uma forma substancialmente purificada, caso em que geralmente compreenderá o polipeptídeo em uma preparação em que mais do que 70%, por exemplo, mais do que 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% das proteínas na preparação é um polipeptídeo da invenção.

Os polipeptídeos da invenção podem ser fornecidos em uma forma tal que eles estão fora de seu ambiente celular natural. Desse modo, eles podem ser substancialmente isolados ou purificados, como discutido acima, ou em uma célula em que eles não ocorrem na natureza, por exemplo, uma célula de outras espécies fúngicas, animais, plantas ou bactérias. Remoção ou redução de atividade de endoprotease específica de prolina. A presente invenção também refere-se aos métodos para produzir uma célula mutante de uma célula de origem, que compreende romper ou deletar a seqüência de ácido nucléico endógena codificando o polipeptídeo ou uma seqüência de controle desta, que resulta na célula mutante produ- zindo menos do polipeptídeo do que a célula de origem. O construto das cepas que têm reduzido a atividade de endopro-tease específica de prolina pode ser convenientemente executado por modificação ou inativação de uma seqüência de ácido nucléico necessária para -a expressão da endoprotease específica de prolina na célula. A seqüência de ácido nucléico a ser modificada ou inativada pode ser, por exemplo, uma seqüência de ácido nucléico codificando o polipeptídeo, ou uma parte essencial desta para exibir a atividade específica de prolina, ou a seqüência de ácido nucléico pode ter uma função reguladora requerida para a expressão do polipeptídeo da seqüência de codificação da seqüência de ácido nucléico. Um exemplo de uma tal seqüência reguladora ou de controle pode ser uma seqüência de promotor ou uma parte funcional desta, isto é, uma parte que seja suficiente para afetar a expressão do polipeptídeo. Outras seqüências de controle para possível modificação incluem, porém não são limitadas a, uma seqüência líder, uma seqüência de poliadenilação, uma seqüência de pró-peptídeo, uma seqüência de sinal, e uma seqüência de terminação. A modificação ou inativação da seqüência de ácido nucléico pode ser realizada submetendo-se a célula à mutagênese e selecionado-se as células em que a capacidade de produção de endoprotease específica de prolina foi reduzida ou eliminada. A mutagênese, que pode ser específica ou aleatória, pode ser realizada, por exemplo, por uso de um agente de muta-genização químico ou físico adequado, por uso de um oligonucleotídeo adequado, ou submetendo-se a seqüência de DNA à mutagênese de PCR. Além disso, a mutagênese pode ser realizada por uso de qualquer combinação destes agentes de mutagenização.

Exemplos de um agente de mutagenização químico ou físico adequado para o presente propósito incluem irradiação ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), hidroxilamina de O-metila, ácido nitroso, sulfonato de metano de etila (EMS), bissulfito de sódio, ácido fórmico, e análogos de nucleotídeo.

Quando os agentes são empregados, a mutagênese é tipicamente realizada incubando-se a célula a ser mutagenizada na presença do agente de mutagenização de escolha sob condições adequadas, e selecionando-se para células exibindo expressão reduzida ou não de atividade de endoprotease específica de prolina. A modificação ou inativação de produção de um polipeptídeo da presente invenção pode ser executada por introdução, substituição, ou remoção de um ou mais nucleotídeos na seqüência de ácido nucléico codificando o polipeptídeo ou um elemento regulador requerido para a transcrição ou translação deste, por exemplo, os nucleotídeos podem ser inseridos ou removidos a fim de resultar na introdução de um códon de terminação, a remoção do códon de iniciação, ou uma alteração da estrutura de leitura aberta. Tal modificação ou inativação pode ser executada por mutagênese direcionada por sítio ou mutagênese de PCR de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Embora, em princípio, a modificação pode ser realizada in vivo, isto é, diretamente sobre a célula expressando a seqüência de ácido nucléico a ser modificada, é preferido que a modificação seja realizada in vitro como exemplificada abaixo.

Um exemplo de uma maneira conveniente para inativar ou reduzir a produção da endoprotease específica de prolina por uma célula hospedeira de escolha é baseado em técnicas de substituição de gene ou interrupção de gene, por exemplo, no método de interrupção de gene, uma seqüência de ácido nucléico correspondendo ao gene endógeno ou fragmento de gene de interesse é mutagenizado in vitro para produzir uma seqüência de ácido nucléico defeituosa que é em seguida transformada na célula hospedeira para produzir um gene defeituoso. Por recombinação homóloga, a seqüência de ácido nucléico defeituosa substitui o gene endógeno ou fragmento de gene. Preferivelmente, o gene defeituoso ou fragmento de gene também codifica um marcador que pode ser usado para selecionar transfor-mantes em que o gene codificando o polipeptídeo foi modificado ou destruído.

Alternativamente, a modificação ou inativação da seqüência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser obtida por técnicas de anti-senso estabilizadas empregando uma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência codificando o polipeptídeo. Mais especificamente, a produção do polipeptídeo por uma célula pode ser reduzida ou eliminada introduzindo-se uma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de ácido nucléico codificando o polipeptídeo. O polinu-cleotídeo de antisentido em seguida tipicamente será transcrito na célula e será capaz de hibridizar para o mRNA codificando a endoprotease específica de prolina. Sob condições permitindo a seqüência de nucleotídeo de antisentido complementar hibridizar para o mRNA, a quantidade da endopro-I tease específica de prolina produzida na célula será reduzida ou eliminada. É preferido que a célula a ser modificada de acordo com os métodos da presente invenção é de origem microbiana, por exemplo, uma cepa fúngica que é adequada para a produção dos produtos de proteína desejados, ou homólogos ou heterólogos para a célula. A presente invenção também refere-se a uma célula mutante de uma célula de origem que compreende um rompimento ou deleção da seqüência de ácido nucléico endógena codificando o polipeptídeo ou uma seqüência de controle deste, que resulta na célula mutante produzindo menos do polipeptídeo do que da célula de origem.

As células mutantes deficientes de polipeptídeo desse modo produzidas são particularmente úteis como células hospedeiras para a expressão de polipeptídeos homólogos e/ou heterólogos. Portanto, a presente invenção também refere-se a métodos para produzir um polipeptídeo homólogo ou heterólogo compreendendo (a) cultivar a célula mutante sob condições conducentes para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. No presente contexto, o termo "polipeptídeos heterólogos" é definido aqui como polipeptídeos que não são nativos à célula hospedeira, uma proteína nativa em que as modificações foram feitas para alterar a seqüência nativa, ou uma proteína nativa cuja a expressão é quantitativamente alterada como um resultado de uma manipulação da célula hospedeira por técnicas de DNA recombinantes.

Em ainda um outro aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir um produto de proteína essencialmente livre de atividade de endoprotease específica de prolina por fermentação de uma célula que produz igualmente um polipeptídeo de endoprotease específica de prolina da presente invenção bem como o produto de proteína de interesse. O método compreende adicionar uma quantidade eficaz de um agente capaz de inibir a atividade de endoprotease específica de prolina para o caldo de fermentação ou durante ou após a fermentação ter sido completa, recuperando o produto de interesse do caldo de fermentação, e opcionalmente submetendo o produto recuperado a outra purificação. Alternativamente, após o cultivo, o caldo de cultura resultante pode ser submetido a um tratamento dje temperatura ou pH a fim de reduzir a atividade de endoprotease específica de prolina substancialmente, e permitir a recuperação do produto do caldo de cultura. O tratamento de temperatura ou pH combinado pode ser realizado em uma preparação de proteína recuperada do caldo de cultura.

Os métodos da presente invenção para produzir um produto livre de endoprotease específica de prolina essencialmente são de particular interesse na produção de polipeptídeos eucarióticos, em particular na produção de proteínas fúngicas tais como enzimas. As células deficientes de endoprotease específica de prolina podem também ser usadas para expressar proteínas heterólogas de interesse para a indústria de alimento, ou de interesse farmacêutico.

Fontes preferidas para a endoprotease específica de prolina são obtidas clonando-se um gene microbiano codificando uma endoprotease específica de prolina em um organismo hospedeiro microbiano. Fontes mais preferidas para a endoprotease específica de prolina são obtidas clonando-se um gene derivado de Aspergillus codificando uma endoprotease específica de prolina em um hospedeiro pertencendo ao gênero de Aspergillus capaz de superexpressar o gene de endoprotease específica de prolina .

Na categoria de produtos contendo hidrolisados de proteína alvejando consumidores com necessidades não-médicas, o mercado de nicho empregando-se hidrolisados de proteína em produtos para atletas está aumentado rapidamente. Nesta categoria de produtos, a alergenicidade do produto final não é uma saída. Em vez de, aspectos tais como sabor, o valor nutricional e a presença de aminoácidos específicos para suportar resistência e estimular a recuperação fisiológica após o exercício são parâmetros importantes para tais hidrolisados, particularmente quando usados em bebidas para prática de esportes, por exemplo, a glutamina foi implicada no combate aos estresses metabólicos porém pode apenas ser fornecida em pequenos peptídeos, quando o aminoácido livre não é estável em solução. Os hidrolisados de proteína produzidos de acordo com a invenção são muito adequados para uso em produtos relacionados ao atletismo devido a sua solubilidade muito alta sob as condições de pH ácido predominantes, por exemplo, em bebidas para prática de esportes. Uma implicação importante deste critério é que níveis elevados de hidrolisados produzidos de acordo com a invenção podem ser incluídos em produtos esportes nutricionais sem a desvantagem da precipitação de proteína sobre a esterilização e armazenagem prolongada. Desse modo, as vidas de prateleira de produtos esportes podem ser prolongadas pela adição de um hidrolisado de proteína da invenção. A mistura de enzima de acordo com a invenção pode ser empregada para hidrolizar materiais proteináceos de origem animal tal como leite integral, leite desnatado, caseína, proteína do soro ou misturas de case-ína e proteína do soro. Tais misturas de caseína e proteína de soro podem ser usadas, por exemplo, em relações similares àquelas encontradas em leite humano. Além disso, colágeno com base em proteínas animal forma um substrato por causa da possibilidade de degradar estas proteínas em moléculas menores e por meio destas tirando o amargo de extratos de carne animal ou melhorando a captação de resíduos de hidroxiprolina e prolina com benefícios nas articulações de atletas. A mistura de enzima de acordo com a invenção pode também ser usada para hidrolizar os materiais proteináceos de origem de planta tal como, por exemplo, glúten de trigo ou cevada maltada ou não-maltada ou outros cereais usados para fazer cerveja, leite de soja, concentrados ou isolados destes, concentrados de proteína de milho e isolados destes, e proteínas de arroz. A invenção será também ilustra- da pelos seguintes Exemplos não-limitantes.

Exemplos Materiais e Métodos Beta-caseína de leite bovino (pó essencialmente livre de sal, lio-filizado) com um mínimo de 90% de beta-caseína foi obtida de Sigma. Colá-geno (Tipo 1, insolúvel de tendão de Aquiles bovino) foi também obtido de Sigma.

Caseinato de sódio (Miprodan 30®) foi obtido de MD Foods (Viby, Denmark). Concentrado de soro doce, não-pasteurizado, 10% de ds, 35% de proteína foram obtidos de Borculo Domo (Zwolle, The Netherlands) Um hidrolisado de soro de baixo amargor Vitalarmor® 800 LB bem como proteína de soro enriquecida em beta-lactoglobulina (Protarmor® 905) foi obtido de Armor Proteines (Saint-Briceen-Cogles, France). Outros hidrolisados comerciais foram obtidos do produtor ou comprados em farmácias.

Isolado de soja obtido como Soyamin® 90 HV de Lucas Meyer, Hamburg, Germany.

Subtilisina de B. licheniformis (Delvolase®, 560 000 DU por grama) foi obtida de DSM Food Specialities (Seclin, France). Simizyme® LP 75.000 foi obtido de Shin Nihon (Anjyo, Japan). Flavourzyme® 1000L foi obtido de NOVO Industries, Bagsvaerd, Denmark. Termolisina (Thermoase; um metalo-endoprotease estável quente de Bacillus thermoproteolyticus Rokko com uma atividade de 14000 PU/mg como produzida por Daiwa Kasei, Osa-ka, Japan) Endoprotease específica de prolina de Flavobacterium menin-gosepticum e clonada de E. coli foi isolada empregando construtos de plas-mídeo conhecidos e métodos de purificação de enzima (T. Diefenthal e H. Dargatz, World Journal of Microbiology & Biotechnology 11,209-212 (1995)). A atividade enzimática foi testada em 0,26 mM de CBZ-Gly-Pro-pNA em 0,1 M de tampão de fosfato pH 7.0 a 25°C. O pH 7.0 foi usado neste teste por que o pH ideal desta enzima é acima do pH 6.0. O produto foi monitorado espectrofotometricamente em 410 nm. Uma unidade foi definida como a quantidade de enzima que provoca a liberação de 1 pmol de p-nitroanilida por minuto sob estas condições.

Endoproteases específicas de prolina de Aspergili foram avaliadas de acordo com o método descrito na patente Japonesa JP5015314 com pequenas modificações. Em resumo, a atividade enzimática é testada em CBZ-Gly-Pro-pNA a 37 graus C em um tampão de fosfato de citrato/dissódio pH 5. O pH 5.0 é selecionado por que neste teste o pH ideal da enzima é abaixo do pH 6. O produto de reação foi da mesma forma monitorado espec-trofotometricamente em 410 nM.

Eletroforese em gel bidimensional A eletroforese em gel bidimensional e sequenciamento de ami-noácido parcial de endopeptidase específica de prolina de Aspergillus niger. A endoprotease específica de prolina de A. niger G-306 foi produzida e isolada como descrito no Exemplo 4. A purificação completa foi realizada usando a eletroforese em gel bi-dimensional. Para essa finalidade, o material ativo isolado da coluna Superdex 75 foi primeiro dessalinizado por diluição (aproximadamente 20 vezes) em 10 mM de tampão de Tris/HCI pH 6.8 e então concentrado com um miniconcentrador de 30 kD Centricon (Amicon).

Basicamente, a eletroforese bi-dimensional foi executada como descrito em "eletroforese 2-D usando gradientes de pH imobilizado; Principies and Methods; Amersham Pharmacia Biotech 80-6429-60 Ver A/10-98". A primeira dimensão (IEF) foi executada em um IPGphor (Amersham-Pharmacia) usando uma variação de pH da faixa de IPG de 11 cm de 3 - 6 (BioRad). A amostra concentrada 3 vezes, dessalinizada foi diluída em 8M de uréia (6M de uréia e 2 M de tiouréia). Isto foi misturado com 18,5 microli-tros de tampão de rehidratação concentrado 10X, contendo 6M de uréia, 2M de tiouréia a 20% de CHAPS, e faixa de tampão de IPG a 5% de 3 - 10. O total foi usado para rehidratar a tira de IPG. A focagem foi feita durante 29.320 Vh usando o protocolo como descrito no folheto da Biorad fornecido com as tiras como uma norma. A segunda dimensão (SDS) foi feita em uma Criterion Mini Vertical Cell (BioRad) usando um gel pré-moldado de 12% (Type Prep+2 Comb) adquirido de BioRad. A tira de IPG foi primeiro incubada em tampão de equilíbrio de SDS contendo DTT (1%) e uma segunda vez em tampão contendo iodoace-tamida (2,5%). Ambas incubações foram durante 15 minutos a 20°C. O tampão de equilíbrio de SDS consistido de 50 mM de Tris/HCI pH 8.8, 6 M de uréia, 30% (v/v) de glicerol e 2% (p/v) de SDS e um traço de bromofenol azul.

Após a incubação, a tira de IPG foi preparada para ajustar-se ao tipo de gel mencionado e transportado com tampão de TGS (BioRad) diluído 10x. Após o transporte, o gel foi manchado com Sypro Ruby (Molecular Pro-bes, Leiden, The Netherlands) durante 3 - 4 horas e lavado com água Milli Q durante 2 horas. A imagem foi executada em The Imager (Appligene). A maior mancha foi cortada, lavada várias vezes com 50 milimoles/litro de bica rbonato de amônio, incubada durante a noite a 37 graus C com tripsina de grau de seqüenciamento (nr. 1047841, Boehringer Mannheim). Os peptídeos foram extraídos da parte de gel lavando-se várias vezes com acetonitri-la/água contendo ácido fórmico (50/50/5, v/v/v). As amostras foram secadas usando uma centrífuga a vácuo (New Brunswick Scientifiç, The Netherlands) e armazenadas a - 20°C, até a análise.

Análise de LC/EM A HPLC (cromatografia líquida de alto desempenho) usando um Qtof-2 (Micromass, Manchester, UK) o espectrômetro de massa foi usado para separar os peptídeos formados durante a digestão com tripsina. 5 mi-crolitros da solução de peptídeo foram apanhados em uma micro-pré-coluna, C18, 5*0,3 mm (MCA30-05-C18, LC Packings, Amsterdam, Netherlands) usando água Milli Q contendo 0,1% de ácido fórmico em uma taxa de fluxo de 20 microlitros/min. Os peptídeos foram então eluídos da pré-coluna, usando um gradiente rápido de 0,1% de ácido fórmico em água Milli Q (Milli-pore, Bedford, MA, USA; Solução A) e 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila (Solução B). O gradiente começou em 100% de Solução A e aumentou para 60% de solução B em 20 minutos e foi mantido na última taxa durante outros 5 minutos. A taxa de fluxo usada durante a eluição dos peptídeos foi 200 nl/min. Usando a análise de LC/EM/EM, as seqüências de aminoácido parciais da endopeptidase específica de prolina A. niger pode ser determinada, pelo sequenciamento de novo de peptídeos adequados. A HPLC usando um espectrômetro de massa de armadilha de íon (Thermoquest®, Breda, the Netherlands) acoplado a uma bomba P4000 (Thermoquest®, Breda, the Netherlands) foi usada caracterizando-se os hi-drolisados de proteína enzimática produzidos pela mistura de enzima inventiva. Os peptídeos formados foram separados usando uma coluna PEPMAP C18 300A (MIC-15-03-C18-PM, LC Packings, Amsterdam, The Netherlands) em combinação com um gradiente de 0,1% de ácido fórmico em água Milli Q (Millipore, Bedford, MA, USA; Solução A) e 0,1% de ácido fórmico em aceto-nitrila (Solução B) durante a eluição. O gradiente começou em 100% de Solução A e aumentou para 70% de solução B em 45 minutos e foi mantido na última relação durante outros 5 minutos. O volume por injeção usado foi 50 microlitros, a taxa de fluxo foi 50 microlitros por minuto e a temperatura de coluna foi mantida a 30°C. A concentração de proteína da amostra injetada foi aproximadamente 50 microgramas/mililitro. A informação detalhada sobre os peptídeos individuais foi obtida empregando-se o algoritmo de EM/EM "dependente de varredura" que é algoritmo característico para um espectrômetro de massa de armadilha de íon. A análise de varredura completa foi seguida por análise de varredura com aproximação (zoom) para a determinação do estado de carga do íon mais intenso na faixa de massa de varredura completa. A análise de EM/EM subseqüente do último íon em informação de seqüência de peptídeo parcial, que pode ser usada para pesquisa de base de dados usando a aplicação de SEQUEST de Xcalibur Bioworks (Thermoquest®, Breda, the Netherlands). Os bancos de dados usados foram extraídos do banco de dados OWL.fasta, disponível em NCBI (National Centre for Biotechnology in-formatics), contendo as proteínas de interesse para a aplicação usada. Naqueles experimentos nos quais os substratos de proteína bem caracterizados tais como caseínas ou proteínas do soro foram avaliados, a precisão da técnica de análise foi aumentada omitindo-se aqueles espectros com uma seqüência combinada menor que 50%.

Apenas os peptídeos com uma massa variando de aproximadamente 400 a 2000 Dáltons foram considerados adequados para outra análise por sequenciamento de EM.

Angiotensina (M=1295,6) foi usada para ajuste para sensibilidade ideal no modo EM e para fragmentação ideal no modo EM /EM, executando-se infusão constante de 60 pg/ml, resultando em espécies principalmente duplamente e triplamente carregadas no modo EM, e uma energia de colisão ideal de cerca de 35% no modo EM/EM.

Análise de LC/EM de fórmulas infantis e hidrolisados de proteína comercial.

Antes do material graxo de LC/EM ter sido removido das fórmulas infantis. Para esta finalidade, as amostras de nutrição completas (13,5 g de pó em 100 ml de água MilliQ) foram extraídas três vezes com 30 ml de hexano. Pequenas quantidades de NaCI foram adicionadas para melhorar a separação das camadas de solvente. Então 5 ml da camada de água foram obtidos e secados em refrigerador. Antes da análise, a amostra foi redissol-vida em 25 ml de água MilliQ, centrifugada 2 vezes (em 13000 rpm) e filtrada através de um filtro de 0,22 pm. A partir das amostras hidrolisadas puras, 400 mg foram dissolvidos em 100 ml de água MilliQ, centrifugados 2 vezes (em 13000 rpm) e filtrados através de um filtro de 0,22 pm. Para caracterizar os peptídeos presentes nos hidrolisados de proteína comerciais, a mesma estratégia foi seguida como acima descrito para os hidrolisados enzimáticos formados pela mistura de enzima inventiva, isto é, o hidrolisado filtrado foi aplicado à coluna de HPLC e peptídeos individuais com massas moleculares entre 400 a 2000 Dáltons foram também caracterizados pela análise de EM/EM. Entretanto, o banco de dados usado para obter a informação da seqüência de peptídeo sobre hidrolisados derivados de caseína ou soro consistiu em seqüências de proteína do leite de vaca apenas.

Determinação da fração molar de peptídeos (%) transportando uma prolina de terminal carbóxi. LC/EM/EM podem ser usados para a análise do terminal C de um peptídeo. Com um algoritmo no qual a massa molecular do peptídeo (analisada com LC/EM) e sua seqüência de aminoácido (parcial) (analisada com LC/EM/EM) são ligadas com procedimentos de cisalhamento automático dentro do banco de dados da proteína, as misturas de peptídeo complexas podem ser analisadas. Estas opções têm permitido quantificar a incidência de peptídeos transportando um resíduo de prolina de terminal carbóxi. Devido à série de limitações pela coluna de separação de peptídeo PEPMAP usada, apenas os peptídeos com um peso molecular entre aproximadamente 400 a 2000 Dáltons são analisados usando esta técnica. Felizmente, em hidrolisados de proteína, a maioria dos peptídeos tem tais pesos moleculares.

Para determinar em um hidrolisado de proteína a fração molar de peptídeos transportando uma prolina de terminal carbóxi, picos de peptídeo individual eluíndo da coluna PEPMAP são selecionados e as seqüências de aminoácido de terminal carbóxi parciais são determinadas usando as técnicas acima especificadas. A análise de pelo menos 20, preferivelmente pelo menos 30 e mais preferivelmente entre 40 a 60, por exemplo, 50 dos peptídeos aleatoriamente selecionados, mais abundantes, desta maneira fornece discernimento na freqüência na qual os peptídeos transportando um resíduo de prolina no terminal carbóxi do peptídeo encontram-se. O quociente do número de peptídeos encontrados para transportar um resíduo de prolina de terminal carbóxi 100 vezes e o número total de peptídeos analisados desta maneira fornece a fração molar de peptídeos (%) transportando uma prolina de terminal carbóxi.

Determinação da fração molar (%) da prolina no substrato de proteína usada para gerar o hidrolisado. O material graxo como pode ocorrer em produtos de fórmulas infantis foi primeiro removido por extração de hexano como detalhado no parágrafo descrevendo a análise de LC/EM de hidrolisados de proteína co- mercial e fórmulas infantis. A hidrólise de ácido do substrato de proteína para converter as proteínas presentes em aminoácidos livres, foi obtida prepara ndo-se uma suspensão de 100 miligramas de material proteináceo em 2 mililitros de 6 N de HCI. A hidrólise de ácido foi realizada durante 22 horas'a 112 graus C em uma atmosfera livre de oxigênio. Após a centrifugação, o sobrenadante foi diluído 10 vezes em HCI diluído. Após esta hidrólise, os aminoácidos foram derivatizados e analisados de acordo com o método Pi-cotag como especificado no manual dos operadores do Amino Acid Analysis System of Waters (Milford MA, USA). O nível de prolina presente foi quantificado usando métodos de HPLC. Para determinar a fração molar (%) de prolina na amostra, os micromoles de prolina presentes 100 vezes foram divididos pela soma dos micromoles de todos os aminoácidos presentes na amostra analisada. Visto que durante a hidrólise do ácido, Trp e Cys são destruídos, estes dois aminoácidos não são incluídos nesta soma dos micromoles de todos os aminoácidos.

Determinação dos níveis de aminoácidos livres nos hidrolisados de proteína ou fórmulas infantis.

Uma amostra precisamente pesada do material proteináceo foi dissolvida em ácido diluído e os precipitados foram removidos por centrifugação em uma centrifuga Eppendorf. A análise de aminoácido foi realizada sobre o sobrenadante claro de acordo com o método PicoTag como especificado no manual dos operadores do Amino Acid Analysis System of Waters (Milford MA, USA). Para essa finalidade, uma amostra adequada foi obtida do líquido, adicionada ao ácido diluído e homogeneizada. A partir da última solução, uma nova amostra foi tirada, secada e derivatizada usando feniliso-tiocianato. Os vários aminoácidos derivatizados presentes, foram quantificados usando métodos de HPLC e adicionados até calcular o nível total de aminoácidos livre na amostra pesada.

Para relatar este nível total de aminoácidos livres na amostra ao nível total de aminoácidos que podem ser liberados desta amostra, a amostra é da mesma forma submetida à hidrólise de ácido seguida por uma quantificação dos aminoácidos livres totais presentes como acima detalhado.

Legendas das figuras Figura 1: Mapa de plasmídeo de plasmídeo de expressão pGB-FIN11-EPO. Endo-Pro representa a endoprotease específica de prolína.

Figura 2: A análise de SDS-PAGE de filtrados de cultura da cepa hospedeira (A. niger CBS513.88) e vários transformantes que superexpres-sam a endoprotease específica de prolina, aqui indicado com a seta.

Exemplo 1 Hidrólise de beta-caseína usando subtilisina em combinação com uma endoprotease específica de prolina de F. meninaoseoticum.

Beta-caseína representa uma das frações de caseína principal do leite bovino. A proteína tem sido bem caracterizada em termos de sua seqüência de aminoácido e é comercialmente disponível em uma forma quase pura. Tal como, a beta-caseína oferece um excelente substrato de teste para estudar a relação entre os sítios de divagem de enzima e o comprimento de vários peptídeos formados durante a hidrólise de enzima.

Este Exemplo demonstra que em relação ao caractere do espectro amplo da subtilisina, a adição de uma enzima muito específica tipo uma endoprotease específica de prolina pode ter um maior impacto sobre o tamanho dos fragmentos de beta-caseína formados. Os rendimentos melhorados para as frações de caseína sobre a incubação com subtilisina em combinação com uma endoprotease específica de prolina podem portanto ser obtidos. A beta-caseína é relativamente rica em prolina como hidrólise de ácido seguida por análise de aminoácido realizada de acordo com as seções de Materials & Methods revelou que sua fração molar de prolina é 14% (moles de prolina/moles de todos os aminoácidos como especificado na seção de Materials & Methods). O pó de beta-caseína (Sigma) foi dissolvido em uma concentração de 10% (peso/peso) juntamente com 0,1% (peso/peso) Delvolase® em um tampão de fosfato de 0,1 mol/litro pH 7.0. Após uma incubação de 24 horas a 45°C em um banho de água com agitação, a reação foi interrompida aquecendo-se a solução durante 15 minutos a 90°C. Em uma metade da solução (1 ml contendo 100 miligramas de beta-caseína) 100 microlitros de endoprotease específica de prolina de F, meningosepticum (correspondente a 4 unidades de acordo com o procedimento descrito em World Journal of Microbiology & Biotechnology, Vol 11, pp209 - 212) foram adicionados e a reação foi contínua durante outras 24 horas a 45°C. Após outro choque térmico a 90°C, as amostras de ambos Delvolase® e Delvolase® + material de beta-caseína tratado por endoprotease específica de prolina foram analisadas pelo equipamento de LC/EM como especificado na seção de Materials & Methods.

Na amostra digerida com Delvolase sozinho, a análise de LC/EM/EM identificou 40 peptídeos cobrindo várias partes da molécula de beta-caseína. Juntos estes peptídeos deram a razão de 79% da seqüência de beta-caseína total. Os diferentes tempos de retenção dos peptídeos na coluna C18 podem ser planejados outra vez para comprimentos de onda variando de 2 a 23 resíduos de aminoácido. A glutamina provou ser o resíduo de terminal carbóxi ocorrendo mais freqüentemente (10 dentre 40 peptídeos). Nenhum dos peptídeos analisados pode ser demonstrado por ter prolina como o resíduo de terminal carbóxi.

Por contraste, a amostra digerida com Delvolase® e endoprotease específica de prolina geraram 28 peptídeos identificáveis de beta-caseína. Juntos estes peptídeos cobriram 63% da seqüência de proteína de beta-caseína total. A distribuição de tamanho do peptídeo foi extraordinari-mente homogênea, como os peptídeos variaram em comprimento apenas entre 3 e 9 resíduos. Dentro desta população, a glutamina foi o resíduo de carbóxiterminal em 3 peptídeos apenas e a prolina provou ser o resíduo de terminal carbóxi mais abundante (em 17 dentre os 28 peptídeos analisados). Os resultados mostram que no hidrolisado feito com a endoprotease específica de prolina, aqueles peptídeos que transportam um resíduo de prolina de terminal carbóxi representa uma fração molar de 61% do total dos peptídeos presentes na faixa de peso molecular entre 400 e 2000 Dáltons. Desta maneira, a incubação de beta-caseína com uma endopeptidase específica de prolina resulta na geração de peptídeos com prolina como o resíduo de terminal carbóxi. Além disso, a combinação de subtilisina mais uma endopro- tease específica de prolina resulta em distribuição de tamanho extraordina-rimente homogênea dos vários peptídeos gerados, sugerindo rendimentos de produção elevados na ultrafiltração de um tal hidrolisado.

Exemplo 2 Amarqor e hidrolisados de beta-caseína Embora o Exemplo 1 ilustre o efeito de uma endoprotease específica de prolina sobre o tamanho do peptídeo e a proporção de peptídeos com prolina como o resíduo de aminoácido de terminal carbóxi, o efeito desta enzima sobre o amargor não foi avaliado no Exemplo 1. Os hidrolisados de caseína são notoriamente amargos e esta propriedade foi ligada a seu teor relativamente alto de resíduos de aminoácido hidrofóbico.

Para testar o efeito de uma endoprotease específica de prolina sobre o sabor de beta-caseína hidrolisada por uma subtilisina, as incubações de enzima usando Delvolase® e Delvolase® com endoprotease específica de prolina foram executados como descrito no Exemplo 1. Seguindo a inativa-ção por aquecimento de ambas subtilisina e endoprotease específica de prolina, as amostras foram resfriadas em temperatura ambiente e água destilada foi adicionada para produzir concentrações de caseína final de 4% (pe-so/peso). O sabor das últimas soluções foi então avaliado por um painel de sabores experimentados. Os provadores foram unânimes em suas conclusões, que o hidrolisado obtido pela combinação de subtilisina mais endoprotease específica de prolina foi significantemente menos amargo do que o hidrolisado obtido usando subtilisina sozinha.

Desta maneira, o tratamento dos hidrolisados de caseína com uma endoprotease específica de prolina substancialmente reduz o amargor do produto final.

Exemplo 3 Isolamento de uma endoprotease específica de prolina de Asperaillus niger Uma grande coleção de moldes capazes de formar esporos pretos foi permitida desenvolver-se em um meio de pH 6,5 contendo 1,0 grama de K2HP04, 0,5 grama de KH2P04, 0,5 grama de KCI, 0,5 grama de MgS04. 7H20, 0,01 grama de FeS04. 7H20, 5 gramas de glicose, 15 gra- mas de colágeno (Sigma) e água destilada foi adicionada para obter um volume de 1 litro. O inóculo para cada experimento foi preparado por um método no qual os esporos dos fungos desenvolvendo-se em um declive de ágar (5 dias de idade) foram tomados em 5 mililitros de água estéril. Da última suspensão, 2% (v/v) foram usados para inoculação do meio de pH 6.5. O desenvolvimento foi permitido durante 100 horas a 28 graus C com agitação depois que a cultura foi filtrada e as amostras do filtrado claro foram incubadas com Z-Ala-Pro-pNA de peptídeo sintético (Bachem; Bubendorf, Switzer-land) em pH 5.0, 50 graus C. As amostras capazes de liberar pNA foram identificadas avaliando-se o aumento na absorvência em 410 nanômetros. As cepas positivas rendendo atividades relativamente altas foram também investigadas. A cepa G-306 excretou uma endoprotease específica de prolina e foi identificada como Aspergillus niger Van Tieghem var. niger. Esta cepa particular foi usada para isolamento, purificação e também caracterização de uma endoprotease específica de prolina. Para purificar a enzima, 1 litro de sobrenadante de cultura foi aplicado a uma coluna de bacitracina-silocromo de 400 mililitros equilibrada com 0,05 mol/litro de acetato de sódio pH 5.0. As proteases ligadas à coluna foram eluídas usando o tampão de acetato suplementado com 1 mol/litro de NaCI e 10% (v/v) de isopropanol (J. Appl. Bio-chem., 1983 pp420 - 428. As frações ativas foram coletadas e dialisadas contra água destilada e aplicadas em uma coluna de bacitracina-sefarose de 200 mililitros, novamente equilibradas com tampão de acetato. Como antes, a eluição foi realizada usando o tampão de acetato suplementado com NaCI e isopropanol. As frações ativas foram coletadas, dialisadas contra um tampão de acetato de 5 milimoles/litro pH 5.0 e então concentradas por meios de ultrafiltração com uma membrana Amicon PM-10. Para obter uma endoprotease específica de prolina quase completamente pura, o líquido concentrado foi cromatografado em uma coluna 75 Superdex® equilibrado com o tampão de acetato de sódio de 0,05 mol/litro pH 5.0 e suplementado com 0,5 mol/litro de NaCI.

Outros experimentos realizados com a enzima purificada indica- ram um peso molecular perto de 66,6 kDálton, um IEP perto de 4,2, um pH ideal perto de 5,0 e uma termoestabilidade quase 100% na incubação durante 4 horas a 50 graus C.

Para obter seqüências de aminoácido parciais da enzima, a preparação de enzima isolada foi primeiro submetida a eletroforese em gel bidimensional de acordo com o procedimento descrito na seção de Materials & Methods. A maior mancha foi cortada, incubada com tripsina e eluída. Os peptídeos revestidos foram então submetidos a análise de LC/EM/EM como descrito na seção de Materials & Methods para determinar as seqüências de aminoácido parciais.

As seqüências de aminoácido seguintes podem ser derivadas da endoprotease específica de prolina de Aspergillus niger. NH2- ATTGEAYFE -COOH NH2- ATVNSWTGGWDFTR -COOH NH2- DGAPEGTST -COOH NH2- EREAGAAVTP -COOH.

Estas seqüências de aminoácido foram usadas para sintetizar as seqüências de DNA necessárias para o isolamento do gene codificando a endoprotease específica de prolina de Aspergillus niger.

Nos últimos experimentos (observe o Exemplo 10) a seqüência NH2-ATTGEAYFE-COOH pode ser mostrada para representar o terminal amino da endoprotease específica de prolina madura.

Exemplo 4 Endoprotease específica de prolina e seus efeitos na hidrólise de proteína de soja. A patente Japonesa JP501314 descreve uma preparação de enzima bruta obtida de Aspergillus oryza FS1-32 que exibe maiores quantidades de uma atividade endoproteolítica não-específica e maiores quantidades de uma endoprotease específica de prolina e uma atividade de carboxi-peptidase. A incubação da proteína de soja com esta preparação de enzima bruta é reivindicada para render um hidrolisado que é significantemente menos amargo do que um hidrolisado de soja que pode ser obtido com outra preparação de protease que necessita de uma endoprotease específica de prolina em combinação com uma carboxipeptidase. É sugerido na JP5015314 que a atividade da endoprotease específica de prolina exponha os resíduos de prolina que são subseqüentemente removidos pela carboxipeptidase. A remoção destes resíduos de prolina de terminal carbóxi, hidro-fóbicos pela carboxipeptidase é acreditado ser essencial para obter hidroli-sados menos amargos.

Para testar esta afirmação, um dos Exemplos fornecidos na JP5015314 foi repetido e os hidrolisados de soja resultantes foram analisados usando a tecnologia de LC/EM acima descrita em vez de avaliar um efeito sobre o sabor.

De acordo com a JP5015314, suas incubações com Aspergillus oryzae FS 1-32 continham por grama de substrato as seguintes atividades enzimáticas.

Protease : na ordem de 650 PU; carboxipeptidase : na ordem de 0,01 unidade e endoprotease específica de prolina : na ordem de 0,03 miliunidades.

Por causa de Aspergillus oryzae FS 1-32 original, a preparação não foi disponível, duas preparações de enzima comercial, da mesma forma derivada de Aspergillus oryzae, foram usadas no presente Exemplo. Além disso, uma endoprotease específica de prolina cromatograficamente purificada isolada de Aspergillus niger (observe o Exemplo 3) foi usada para obter uma superdosagem da endoprotease específica de prolina de ácido.

As atividades enzimáticas das várias preparações foram avaliadas de acordo com os procedimentos fornecidos na JP5015314 e são fornecidas abaixo Sumizyme LP 75.000, uma preparação de enzima de Aspergillus oryzae comercial conhecida por ser rica em atividade endoproteolítica.

As atividades enzimáticas são estimadas de acordo com os métodos da JP5015314: Protease : 226 PU/grama do produto ; carboxipeptidase : 21 uni-dades/grama do produto ; prolilendopeptidase : 430 miliunidades/grama do produto Flavourzyme 1000L, uma preparação de enzima de Aspergillus oryzae comercial conhecida por ser rica em atividade exoproteo-lítica.

As atividades enzimáticas são estimadas de acordo com os métodos da JP5015314: Protease : 332 PU/grama do produto ; carboxipeptidase : 10 uni-dades/grama do produto ; prolil-endopeptidase : não detectável Endoprotease específica de prolina cromatograficamente pura obtida de Aspergillus niger e isolada como descrito no Exemplo 3.

As atividades enzimáticas são estimadas de acordo com os métodos da JP5015314: Protease : não-detectável : carboxipeptidase : não detectável ; prolil-endopeptidase :45 miliunidades/mililitro. A partir destes dados é evidente que embora Simizyma e Flavourzyme sejam bem-conhecidos por suas atividades proteolíticas elevadas, nenhuma delas possa fornecer a mesma relação muito elevada da atividade de (endo)protease para carboxipeptidase como mencionado na JP5015314. Surpreendentemente, Sumizyme LP 75.000 foi constatado conter uma atividade consideravelmente mais elevada de endoprotease específica de prolina do que aquela relacionada na JP5015314.

As várias preparações de enzima foram incubadas de acordo com o protocolo descrito na JP5015314 porém padronizadas de acordo com a atividade de carboxipeptidase desejada (0,01 unidade por grama de substrato). A soja isolada (Soyamin 90 FIV) foi usada como o substrato nestas reações. Após a incubação durante 5 horas em pH 5 e 50 graus C, as amostras foram centrifugadas e os sobrenadantes foram mantidos congelados até a análise de LC/EM. A análise de LC/EM foi realizada como especificada na seção de Materials & Methods. Nestes experimentos, o banco de dados da proteína consistiu de proteínas de soja apenas. Os resultados obtidos são especificados na Tabela 1 PEP : endopeptidase de prolila ou endoprotease específica de prolina.

Sumizyme LP 75.000 contém uma atividade endoproteolítica especifica de prolina que é cerca de 7 vezes maior do que a atividade endoproteolítica específica de prolina registrada na cepa FS 1-32 e rende uma fração molar de aproximadamente 10% de peptídeos de soja transportando uma prolina de terminal carbóxi. Sumizyme LP 75.000 enriquecido com a endoprotease específica de prolina isolada de Aspergillus niger contém uma atividade endoproteolítica específica de prolina que é cerca de 50 vezes maior do que a atividade registrada com a cepa FS 1-32 porém da mesma forma rende uma fração molar de aproximadamente 10% de peptídeos de soja transportando uma prolina de terminal carbóxi. Estes dados foram confirmados analisando-se o número de resíduos de prolina que estão presentes nos peptídeos, porém não na posição terminal carbóxi. Flavourzyme não contém endoprotease específica de prolina detectável, porém rende entre os peptídeos gerados e adequados para análise com a técnica de LC/EM uma fração molar de 6% de peptídeos transportando uma prolina na extremidade de terminal carbóxi. Se combinado com um teor de prolina de aproximadamente 5% desta proteína de soja isolada, estas três observações indicam que a presença e a atividade da endoprotease específica de prolina em combinação com a atividade de carboxipeptidase têm um efeito menor sobre a incidência molar dos resíduos de prolina de terminal carbóxi apenas. Desta maneira, é difícil imaginar que o efeito de tirar o amargo descrito na JP5015314 e atribuído a uma atividade de endoprotease específica de prolina de 0,03 miliunidades apenas pode ser ligado a uma alta incidência de peptídeos transportando prolina como o resíduo de aminoácido de terminal carbóxi.

Exemplo 5 Dosaqens aumentadas de endoprotease específica de prolina e seus efeitos sobre a hidrólise de proteína de soja.

Neste Exemplo é demonstrado que altos níveis de uma endoprotease específica de prolina são requeridos para gerar hidrolisados de soja contendo uma quantidade significante de peptídeos transportando um resíduo de prolina de terminal carbóxi. O projeto total destes experimentos foi idêntico àqueles descritos na Exemplo 4. Novamente, proteína de soja isolada foi incubada com Sumizyme LP 75.000 padronizado de acordo com a atividade de carboxipeptidase desejada de 0,01 unidade por grama de proteína de soja e sob condições descritas na JP5015314. A incubação ocorreu durante ou 2,5 ou 5,0 horas em pH 5 e 50 graus C e foi interrompida mantendo-se o material durante 10 minutos a 100 graus C. Subsequentemente, um pouco do material incubado durante 5 horas foi obtido e seu pH foi aumentado para 7.0. Deste material, 3 amostras foram obtidas nas quais diferentes porções da endoprotease específica de prolina de F. meningosepti-cum produzida por E. coli foram adicionadas. À primeira amostra, 1,5 miliunidades de endoprotease específica de prolina (de acordo com JP5015314 porém avaliada em pH 7.0 e 30 graus C para ajustar o pH e a temperatura ideal da endoprotease específica de prolina derivada de E. coli) foram adiei- onadas, à segunda amostra, 150 miliunidades foram adicionadas e à terceira amostra 15000 miliunidades foram adicionadas e então as amostras foram novamente incubadas durante 2 horas a 40 graus C. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas e os sobrenadantes foram mantidos congelados até a análise de LC/EM. A análise de LC/EM ocorreu como mais cedo especificado. Os resultados obtidos são especificados na Tabela 2. PEP : endopeptidase de prolila ou endoprotease específica de prolina.

Os resultados obtidos claramente ilustram que um aumento sig-nificante na incidência de peptídeos transportando um resíduo de prolina de terminal carbóxi no hidrolisado é totalmente dependente da adição da endoprotease específica de prolina. Entretanto, apenas as atividades que excedem a atividade mencionada na JP5015314 e a atividade presente em Su-mizyme LP 75 000 por várias ordens de magnitude são capazes de fazer isto. A implicação desta observação é que uma endoprotease específica de prolina isolada e pura é essencial para obter a composição de peptídeo desejada do hidrolisado.

Exemplo 6 Incidência molar de peptídeos transportando prolina como o resíduo de terminal carbóxi em hidrolisados comerciais.

Como descrito mais cedo, LC/EM/EM podem ser usados para -a análise do terminal C de um peptídeo. Com um algoritmo no qual a massa molecular do peptídeo (analisada com LC/EM) e sua seqüência de aminoá-cido (parcial) (analisada com LC/EM/EM) são ligadas com procedimentos de busca automática dentro dos bancos de dados de proteína, as misturas de peptídeo complexas podem ser analisadas.

Nestes Exemplos estas possibilidades foram usadas para analisar um número de produtos de fórmulas infantis comerciais bem como hidrolisados de proteína comerciais para a incidência molar de peptídeos transportando resíduos de prolina de terminal carbóxi que tem um peso molecular entre 400 e 2000 Dáltons.

Os seguintes produtos foram analisados. 1. Nidal® HA 1(Nestlé), contendo 11,5 g de hidrolisados de proteína do soro por 100 g de pó 2. Alfare® (Nestlé), contendo 16,5 g de proteína do soro por 100 g de pó 3. Nutrilon® Pepti Plus (Nutricia), contendo 13,5 g de proteína do soro por 100 g de pó 4 Nutrilon® Pepti Junior (Nutricia), contendo 16,5 g de hidrolisados de proteína do soro por 100 g de pó 5. Aptamil® HA (Milupa), contendo 12,3 g de hidrolisados de case-ína e proteína do soro por 100 g de pó 6. Pregomin® HA (Milupa), contendo 13,3 g de provavelmente hidrolisados de colágeno e soja por 100 g de pó 7. Nutramigen® (Mead Johnson), contendo 14,0 g de provavelmente 100 g de pó de hidrolisados de caseína 8. Vitalarmor® 800 LB,(Armor Proteines), contendo 100% de hidrolisados de proteína do soro 9. WPH 916 (New Zealand Milk Products), contendo 100% de hi- drolisados de proteína do soro 10. WE80 BG (DMV International), contendo 100% de hidrolisados de proteína do soro Como as fórmulas infantis contêm aproximadamente 15% de hidrolisados de proteína mais gorduras (25%) e carboidratos (50%), uma extração de hexano destes produtos para remover a fase de gordura provou ser indispensável. Os hidrolisados puros podem ser usados tal como. Para ligar as seqüências de proteína parciais obtidas com as seqüências de proteínas conhecidas, um banco de dados contendo seqüências de proteína do leite de vaca apenas foi usado para todas as amostras exceto a amostra de Pregomin. A amostra de Pregomin foi analisada usando um banco de dados contendo dados de seqüência específica de colágeno e soja. Por razões analíticas, a análise de LC/EM focaliza sobre os peptídeos com um peso molecular variando de 400 a aproximadamente 2000 Dáltons de modo que os peptídeos fora desta faixa não são levados em consideração.

Em cada amostra entre 32 e 76 peptídeos contendo a informação da seqüência das proteínas hidrolisadas usadas podem ser identificados. Em mais amostras, mais do que 95% dos 25 picos mais intensos no cromatograma pode ser relacionado à informação da seqüência de proteínas do leite. Na amostra de Pregomin, apenas 65% dos 25 picos mais intensos podem ser relacionados à informação da seqüência de proteínas de colágeno e soja. Possíveis razões para isto são a incorporação de outras fontes de proteína na base de proteína ou dados de EM/EM inferiores devido à pequena ou picos de co-eluição.

Para testar a repitibilidade e a reproducibilidade do sistema, a amostra de Nutrilon Pepti Plus foi extraída duas vezes e analisada em triplo (no começo das séries, no meio e no fim). Os dados obtidos das várias análises sobre a distribuição dos resíduos de aminoácido de terminal carbóxi foram constatados estar em bom acordo. A incidência molar dos peptídeos transportando os resíduos de prolina de terminal carbóxi nos vários produtos comerciais é fornecida na Tabela 3. A incidência molar de tais peptídeos é da mesma forma relaciona- da ao teor de prolina do material bruto proteináceo usado para preparar o hidrolisado, por exemplo, caseína e colágeno têm teores de prolina muito maiores do que proteínas de soja ou soro. Para levar este aspecto em conta, as frações molares de prolina entre os aminoácidos presentes na base de proteína usados para cada produto comercial foram reduzidas usando hidró-lise de ácido seguida por análise de aminoácido usando técnicas como descrito na seção de Materials & Methods. Além disso, o material bruto usado pode diferir em sua suscetibilidade para divagem de enzima, por exemplo, por causa da presença de seqüências de aminoácido de repetição específicas.

Dos dados apresentados na Tabela 3, está claro que nos hidroli-sados de soro popular a incidência molar dos peptídeos transportando os resíduos de prolina de terminal carbóxi é baixa. Se da mesma é levado levamos o teor de prolina do soro em conta, concluir-se-á que dos produtos com base em soro comerciais contêm uma fração molar nenhum dos peptí-deos transportando os resíduos de prolina de terminal carbóxi que é maior do que a fração molar da prolina ocorrendo na base da proteína. Tipicamente, a fração molar dos peptídeos transportando uma prolina de terminal carbóxi nestes produtos comerciais com base em soro é 5% ou menor.

Olhando na incidência molar dos resíduos de prolina de terminal carbóxi em um produto com base em caseína tipo Nutramigen, foi observado um nível substancial maior do que pode ser constatado nos produtos com base em soro ainda se o teor de prolina relativamente alto de caseína for levado em conta. Entretanto, comparando o produto Nutramigen por outro lado com o hidrolisado de beta-caseína feito por incubação com subtilisina e uma endoprotease específica de prolina (observe o Exemplo 1) mostra a vasta diferença composicional que pode ocorrer entre um hidrolisado de caseína comercial existente e um hidrolisado de caseína de acordo com a invenção. Ao passo que o produto comercial (isto é Nutramigen) exibe uma incidência molar de peptídeos transportando os resíduos de prolina de terminal carbóxi de 22%, este algarismo para o hidrolisado de caseína de acordo com o Exemplo 1 é 61%.

Exemplo 7 Incidência molar de peptídeos de soro transportando prolina de terminal carbóxi em relação à concentração de endoprotease específica de prolina adicionada.

Neste Exemplo uma proteína de soro comercial foi incubada sob várias condições com uma endoprotease específica de prolina como produzida por E. coli. No hidrolisado resultante, a incidência molar de peptídeos transportando resíduos de prolina de terminal carbóxi foi determinada.

Uma solução de Protarmor 905 (Armor Proteins) em água (10% em peso/peso) foi vagarosamente aquecida acima de 25°C a 60°C durante 1 hora na presença de 2,5% (enzima em peso/substrato em peso) de Delvo-lase em pH 8,5. Após 1 hora, a solução foi rapidamente aquecida a 80°C e imediatamente resfriada até 60°C depois que uma nova dosagem de 2,5% de Delvolase foi adicionada. A hidrólise foi permitida continuar durante outra hora; e então aquecida a 95°C durante 5 minutos e resfriada novamente. Após o ajuste do pH a 7,4, a endoprotease específica de prolina foi adicionada em concentrações de 0, 87 e 170 unidades/grama de substrato (U/g na Tabela 4; unidades de acordo com o procedimento descrito em World Journal of Microbiology & Biotechnology, Vol 11, pp209 - 212) e a hidrólise foi permitida prosseguir durante outras 3 horas a 45°C. No término, a solução foi mantida a 95°C durante 5 minutos para inativar a enzima e para pasteurizar a solução. Os hidrolisados quando obtidos, foram então analisados por LC/EM para determinar a incidência molar dos resíduos de prolina de terminal carbóxi nos peptídeos formados como descrito anteriormente. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 4. A partir desta Tabela, revela-se que a 45°C a incidência molar de peptídeos transportando prolina em seu terminal C aumenta com a dose da endoprotease específica de prolina. Usando as dosagens de enzima mais elevadas, até 50% dos peptídeos obtidos deste produto de soro pode ser mostrado para transportar um resíduo de prolina de terminal carbóxi. Quando a incubação é executada a 30°C, a incidência molar de peptídeos transportando um resíduo de prolina de terminal carbóxi pode alcançar 52% com 87 unidades/grama de substrato e é dificilmente aumentada com doses mais elevadas da enzima. A incidência mais elevada alcançada com 87 U/g a 30°C comparada a 45°C pôde ser explicada por uma baixa termoestabilida-de da enzima de E. coli.

Exemplo 8 Sabor e composição de hidrolisados de soro produzidos com e sem endo-protease específica de prolina.

Neste Exemplo uma endoprotease específica de prolina obtida de E. coli foi usada em combinação com subtilisina (Delvolase) para produzir um hidrolisado de soro de baixo amargor. Usando os dados gerados no Exemplo 7, a dosagem da endoprotease específica de prolina foi selecionada tal que apenas um aumento marginal de peptídeos transportando resíduos de prolina de terminal carbóxi pode ser esperado. O hidrolisado formado com a endoprotease específica de prolina foi comparado com um hidrolisado similar formado sem uma endoprotease específica de prolina bem como um hidrolisado de soro de baixo amargo, comercial. Todos os três produtos foram caracterizados em termos de sabor e seus conteúdos de peptídeos transportando um resíduo de prolina de terminal carbóxi.

Uma solução de Protarmor 905 (Armor Proteins) em água (10% em peso/peso) foi vagarosamente aquecida acima de 25°C a 60°C durante 1 hora na presença de 2,5% (enzima em peso/substrato em peso) de Delvolase em pH 8,5. Após 1 hora, a solução foi rapidamente aquecida a 80°C e imediatamente resfriada até 60°C depois que uma nova dosagem de 2,5% de Delvolase foi adicionada. A hidrólise foi permitida continuar durante outra hora; e então aquecida a 95°C durante 5 minutos e resfriada novamente. Após o ajuste do pH a 7,4, a endoprotease específica de prolina foi adicionada em uma concentração de 50 unidades/grama de substrato. Isto foi permitido continuar durante 3 horas a 45°C. De acordo com os dados obtidos no Exemplo 7, estas condições levam a um aumento marginal nos peptídeos transportando um resíduo de prolina de terminal carbóxi. No término, a solução foi mantida a 95°C durante 5 minutos para inativar a enzima e para pasteurizar a solução. E então a solução foi resfriada. O mesmo tratamento foi aplicado a outras amostras, porém sem adicionar a endoprotease específica de prolina. A análise sensorial dos hidrolisados foi realizada em testes de comparação de dois pares assim chamados. Este tipo de teste é usado pela American Society of Brewers Chemists (ASBC) para comparar o amargor de 2 diferentes cervejas. Se for aceito um risco de 5% de erro em um tal teste unilateral, o valor limiar para ter uma diferença estatística é 17 dentre as 24 respostas. Em cada teste, os hidrolisados foram experimentados em 2,5% de concentrações de matéria seca e porções de 1 ml de cada solução foram apresentadas em um frascoe descartável. Cada avaliador foi convidado a taxar o nível de amargor sem engolir e a bochechar a boca com água posteriormente. Todas as amostras foram codificadas e distribuídas ao acaso entre os avaliadores. O primeiro teste foi dirigido avaliando-se o benefício da combinação da subtilisina e a endoprotease específica de prolina versus subtilisina sozinha. O segundo teste dirigido avaliando-se o amargor do hidrolisado obtido com a combinação de subtilisina e endoprotease específica de prolina versus um hidrolisado de baixo amargo, comercial (Vitalarmor 800 LB). Para essa finalidade, o Vitalarmor 800 LB foi diluído no mesmo tampão como usado para o outro hidrolisado para obter uma concentração de proteína comparável.

Das 24 pessoas participantes no primeiro teste, 17 avaliaram a amostra obtida com a combinação de subtilisina e endoprotease específica de prolina como menos amargo do que a amostra obtida com subtilisina sozinha. Este resultado é estatisticamente significante e confirma a atividade de tirar o amargo de uma endoprotease específica de prolina, ainda se aplicada em concentrações relativamente baixas (cf. Exemplo 7). Vale a pena notar que estas "baixas" concentrações de enzima são várias ordens de magnitude mais elevadas do que as dosagens de enzima aplicadas na patente JP5015314 e que um efeito de tirar o amargo foi reivindicado.

Na segunda comparação de amostra emparelhada, 19 dentre os 24 participantes avaliaram a amostra tratada com a combinação de subtilisina e endoprotease específica de prolina como menos amargo do que o produto Vitalarmor 800 LB comercial. A última observação é estatisticamente da mesma forma significante e ilustra o valor econômico dos hidrolisados e misturas de enzima da invenção.

Os hidrolisados obtidos com ou sem a endoprotease específica de prolina foram analisados por LC/EM como anteriormente descrito. No hi-drolisado obtido com a subtilisina sozinha, 41 peptídeos foram analisados. Isto mostrou que nenhum destes peptídeos transportou um resíduo de prolina de terminal carbóxi a despeito do fato que 18 peptídeos foram mostrados conter pelo menos um resíduo de prolina.

No hidrolisado obtido com a combinação de subtilisina e endoprotease específica de prolina, 31 peptídeos foram analisados e 6 foram mostrados transportar um resíduo de prolina de terminal carbóxi. Esta observação, que está de acordo com o que pode ser esperado sobre a base dos resultados obtidos no Exemplo 6, mostra que como os resultados da incubação com a endoprotease específica de prolina, a incidência molar dos peptídeos suportando um resíduo de prolina de terminal carbóxi foi aumentada de 0 a 19%. Como a análise sensorial dos últimos produtos tem demonstrado um amargor estatisticamente significantemente reduzido, este experimento claramente liga um leve aumento na incidência molar de resíduos de prolina de terminal carbóxi com amargor reduzido.

Além da diminuição do nível de amargor, esta incubação com um baixo nível de endoprotease específica de prolina pode da mesma forma ser mostrada para diminuir o comprimento do peptídeo do hidrolisado. No hidrolisado tratado com Delvolase sozinho, a análise de LC/EM revelou que os peptídeos variam em comprimento de 4 a 14 aminoácidos com um comprimento médio de 7,5 aminoácidos. No hidrolisado tratado com a combinação de Delvolase e a endoprotease específica de prolina, o comprimento do peptídeo pode ser mostrado variar de 4 a 12 aminoácidos com um comprimento médio de 6,1 aminoácidos. Estes comprimentos de peptídeo reduzidos não apenas melhorarão o rendimento do processo de produção de hidrolisado, porém da mesma forma reduzirá a alergenicidade total do hidrolisado e minimizará a precipitação sob condições de ácido.

Exemplo 9 Clonagem da endoprotease específica de prolina de Asperaillus niaer Os iniciadores de oligonucleotídeo reversos e dianteiros foram desenvolvidos usando as seqüências de peptídeo que foram elucidadas no Exemplo 3. Para reduzir a degeneração dos iniciadores, as bases de inosina foram introduzidas em várias posições. Isto aumenta a abundância de iniciadores de oligonucleotídeo no aglomerado que são capazes de iniciar uma reação PCR, porém a desvantagem é que a especificação da reação aumenta. O DNA genômico de A. niger G306 (depositado como CBS109712 com CBS em 10 de Setembro, 2001) foi isolado usando técnicas padrão e usado como padrão na reação PCR com os iniciadores de oligonucleotídeo indicados na Tabela 5.

Tabela 5: Peptídeo- e iniciadores de oligonucleotídeo de endo-Pro (I = inosina) No experimento, todas as combinações possíveis de iniciadores reversos e dianteiros foram usadas para amplificar o gene codificando a endoprotease específica de prolina de A. niger. Os experimentos iniciais foram executados sob condições de PCR padrão (desnaturação a 94°C, recozi-mento a 55°C e extensão a 72°C). Surpreendentemente, estes experimentos não renderam qualquer produto de PCR específico. Uma vez que um resultado negativo pôde da mesma forma ser devido a impurezas no DNA padrão, foram executados as reações PCR de controle usando iniciadores de PCR para várias diferentes mas de genes de A. niger conhecidos: Em reações comparáveis, estes últimos genes podem ser de forma bem sucedida amplificados de DNA genômico de A. niger G306, mostrando que a incapacidade para amplificar um fragmento usando os iniciadores de endo-Pro não foi devido às impurezas na preparação de DNA genômico.

Subseqüentemente, foi decidido diminuir a severidade da reação PCR, diminuindo-se a temperatura de recozimento até 45°C. Conseqüente-mente, a especificidade da PCR foi diminuída e várias faixas foram amplificadas, embora a maioria destas faixas tenham sido da mesma forma detectadas nas reações PCR de controle necessitando de um dos iniciadores. Vários destes produtos de PCR foram clonados no vetor de clonagem geral pCR2.1 (Invitrogen, Groningen, The Netherlands), e a seqüência de DNA destes fragmentos foi determinada. Infelizmente, nenhum dos fragmentos clonados codificados para o gene codificando endoprotease específica de prolina.

Adicionalmente, muitos outros ajustes ao protocolo de PCR foram feitos tal como o uso de uma polimerase diferente, aumentando a concentração padrão ou de iniciador, uma PCR de toque descendente e introdução de uma partida a frio, porém nenhum destes protocolos renderam um fragmento específico do gene codificando a endoprotease específica de prolina. Para minimizar os riscos óbvios deste método incerto, foi decidido tentar outro procedimento de clonagem bem menos conhecido.

3'-RACE

Uma vez que nenhuma das nossas tentativas para amplificar o gene codificando a endoprotease específica de prolina de DNA genômico de A. niger G306 foram bem-sucedidas, decidiu-se usar um método diferente no qual o RNA é usado como o padrão para síntese de cDNA. O método de clonagem de um gene conhecido usando 3'-RACE, 5'-RACE e amplificação da estrutura de leitura aberta completa, foi descrito em W09938956. A vantagem deste procedimento, comparado ao procedimento de PCR direto descrito anteriormente, é que um sítio de preparação adicional é introduzido na extremidade 3 do cDNA, para que apenas um oligonucleotídeo específico de gene simples mais um iniciador universal seja requerido para amplificar parte da seqüência de codificação, em lugar de dois iniciadores degenerados. Adi- cionalmente, usando o cDNA como problemas de envolvimentos padrão em amplificação devido aos íntrons. O uso do cDNA como padrão na reação de amplificação da mesma forma aumenta a concentração do padrão comparado a amplificação do DNA genômico.

De acordo com este método, A. niger G306 foi desenvolvido em um meio contendo colágeno como única fonte de carbono para induzir a expressão do gene codificando a endoprotease específica de prolina. A composição do meio é descrita na seção de Materials & Methods. O micélio novo foi colhido após 48 horas de desenvolvimento a 34°C, e usado para isolamento do RNA total. Para esta finalidade, o micélio foi colhido usando filtra-ção através de cobertor de filtração Miracloth e lavado com água destilada (demiwater) estéril congelada. O micélio (250 mg) foi congelado imediatamente em nitrogênio líquido e triturado até um pó branco fino usando alfoma-riz e pilão. O pó branco foi transferido em um tubo Greiner de 15 ml estéril e o RNA total foi isolado com o método Trizol exatamente como descrito pelo fornecedor (Life Technologies, Paisley, UK). A preparação do RNA foi usada para sintetizar o cDNA do inicia-dor de fixação do kit 3'-RACE (AP; Life Technologies), estendendo o cDNA da cauda de poli-A do mRNA. Após o tratamento de RNAse Η, o cDNA foi amplificado por PCR com o iniciador de amplificação universal resumido (AUAP; Life Technologies) e os iniciadores dianteiros específicos de gene substituídos por inosina (N° 1, 3, 5 e 7) descritos anteriormente. Apenas com o iniciador N° 1 mais AUAP um produto de amplificação específico de ~1,4 kb pode ser amplificado de RNA de A. niger G306. Com os outros iniciado-res apenas a amplificação não-específica em baixa severidade foi obtida. Este fragmento de cDNA de 1,4 kb foi clonado em pCR2.1 e a seqüência de DNA foi determinada.

5'-RACE

Desta seqüência, três iniciadores específicos de gene foram designados para outra amplificação da parte 5' do gene. Todos os três iniciadores, 5'-TTCAGTACTCCACCAGTACCTC-3', 5'-TGGGAAAAGGTGCCCTTCTCC-3' e 5'-GGATTATGATGGTCCAGCAGC-3', foram complementares e reversos à seqüência de codificação do gene codificando para endoprotease específica de prolina. O RNA total de A. niger G306 foi usado para sintetizar o cDNA com o kit 5'-RACE (Life Technologies) usando o iniciador TTCAGTACTCCACCAGTACCTC-3'. Após o tratamento com RNAse, o cDNA foi purificado usando o cartucho Glasmax (Life Technologies). Uma cauda de poli-dC foi adicionada ao cDNA usando transferase terminal (TdT; Life Technologies). O cDNA foi amplificado em uma reação de PCR usando o iniciador de fixação resumido (AAP; Life Technologies) e com o primeiro iniciador aninhado 5'-TGGGAAAAGGTGCCCTTCTCC-3'. Uma segunda reação de amplificação usando o iniciador AUAP (Life Technologies) e um segundo iniciador 5'-GGATTATGATGGTCCAGCAGC-3' foi requerido para obter um produto de amplificação específico de -0,25 kb. Este fragmento foi purificado por meio de eletroforese de gel de agarose e clonado em pCR2.1 e a seqüência de DNA foi determinada. Isto mostrou que este fragmento contém a parte 5' do gene codificando para a endoprotease específica de prolina.

Caracterização do gene Combinando as seqüências de superposição da 3'RACE e da 5'-RACE resulta na seqüência de codificação completa do gene codificando a endoprotease específica de prolina. A SEQJD1 mostra a seqüência completa da estrutura de leitura aberta deste gene. A seqüência de proteína deduzida de 526 aminoácidos é descrita em SEQ ID NO: 2. O peptídeo ATTGEAYFE pareceu ser completamente correto. O peptídeo DGAPEGTST é também correto porém é codificado por DNA genômico que é interrompido por um íntron (observe SEQJD 15 e exemplo 11 para a clonagem e seqüência de DNA genômico de Aspergillus niger CBS513.88). Os outros dois pep-tídeos incorporam erros devido ao método LC/EM/EM que foi empregado para sua caracterização (observe Exemplo 3). Em relação a estas incertezas, bem-sucedidamente foi selecionada e identificada a informação genética desejada codificando a endoprotease específica de prolina de Aspergillus durante o primeiro momento. A novidade da endoprotease específica de pro- lina de Aspergillus foi confirmada por pesquisas de BLAST em bases de dados bem-conhecidas tal como SwissProt, PIR e trEMBL. Nenhuma identidade forte desta proteína com qualquer outra proteína pode ser detectada quando comparada às bases de dados de seqüência de proteína.

Exemplo 10 Superexpresão do gene codificando endoprotease específica de prolina, e isolamento da endoprotease específica de prolina A estrutura de leitura aberta completa do gene codificando a endoprotease específica de prolina foi amplificada por PCR de cDNA de A. ni-ger G306 empregando iniciadores 5'-ATGCGTGCCTTCTCCGCTGTC-3' e o iniciador AUAP (Life Technologies). O fragmento de PCR obtido foi clonado no vetor de clonagem pCR2.1 (Invitrogen). O plasmídeo resultante foi digerido com EcoRI e o fragmento contendo o endo-Progene foi clonado no sítio EcoRI do vetor de expressão pGBFIN-11 (W09932617). Os clones resultantes foram checados por restrição com Xhol, que produz um fragmento de -0,65 kb quando o fragmento é inserido na orientação correta. O plasmídeo resultante é mostrado na Figura 1 e foi nomeado pGBFINI 1-EPO. A. niger CBS 513.88 foi usado como hospedeiro para a superex-pressão do gene codificando a endoprotease específica de prolina. Portanto, o vetor de expressão pGBFINI 1-EPO foi linearizado por digestão com Not\, que remove todas as seqüências derivadas de E. coli do vetor de expressão. O DNA digerido foi purificado empregando extração de fe-nol:clorofórmio:álcool isoamílico (24:23:1) e precipitação com etanol. O procedimento de transformação de A. niger é extensivamente descrito em WO 98/46772. É também descrito como selecionar para transformantes em placas de ágar contendo acetamida, e selecionar integrantes de multicópia alvejados. Preferivelmente, transformantes de A. niger contendo cópias múltiplas do cassete de expressão são selecionados para outra geração de material de amostra.

Cultivo e isolamento de protease Uma cepa de A. niger contendo cópias múltiplas do cassete de expressão foi usada para a geração cromatográfica do material de amostra por cultivo da cepa em culturas em frasco de agitação. Um método útil para cultivo de cepas de A, niger e separação do micélio do caldo de cultura é descrito em WO 98/46772. O caldo de cultura obtido foi analisado em SDS-PAGE que é descrito na Figura 2. Subseqüentemente, o caldo de cultura foi usado para purificação cromatográfica da protease para remover quaisquer atividades endo- e exoproteolíticas contaminantes. Para essa finalidade o caldo de fermentação foi primeiro centrifugado para remover o volume da massa fúngica e o sobrenadante foi, em seguida, passado através de vários filtros com tamanhos de poros decrescentes para remover todos os fragmentos de célula. Finalmente, o ultrafiltrado obtido foi diluído dez vezes em 20 milimoles/litro de acetato de sódio pH 5,1 e aplicado em uma coluna Q-Sepharose FF. As proteínas foram eluídas em um gradiente de 0 a 0,4 mol/litro de NaCI em 20 milimoles/litro de acetato de sódio pH 5,1. Frações de pico exibindo atividade em direção à divagem de Z-Gly-Pro-pNA (Ba-chem, Switzerland) foram coletadas e agrupadas, de acordo com o protocolo descrito em World Journal of Microbiology & Biotechnology 11, 209 - 212 (1995), porém sob condições de ensaio ligeiramente modificadas. Levando o pH de ácido ideal da endoprotease específica de prolina derivada de A. niger em conta, o ensaio de enzima foi realizado em pH 5 em um tampão de citra-to/fosfato em 37°C. O agrupamento das frações ativas seguido por concentração final finalmente produziu uma preparação que mostrou apenas uma faixa simples em SDS/PAGE e um pico em HP-SEC. Outra análise por cro-matografia de interação hidrofóbica confirmou a pureza da preparação de enzima obtida.

Além disso, a endoprotease específica de prolina purificada foi empregada para a determinação do terminal amino da proteína madura, por degradação Edman. O terminal amino da endoprotease específica de prolina madura começa na posição 42 em SEQJD 2 e SEQJD_17.

Exemplo 11 Avaliação de espécies fúnaicas exceto A. niger para a presença do gene codificando a endoprotease específica de prolina.

Sobre a base da baixa homologia de seqüência de nucleotídeo entre o F. meningosepticum e o gene A. niger codificando a endoprotease específica de prolina, a hibridização cruzada entre estes dois genes pode ser excluída. Para obter uma impressão da conservação da seqüência de nucle-otídeo específica de A. niger em microorganismos mais relacionados, as cepas seguintes foram selecionadas durante uma experiência de hibridização. As espécies fúngicas Aspergillus niger CBS102.12, Aspergillus niger CBS513.88, Aspergillus niger G306, Aspergillus carbonarius ATCC1025, Aspergillus sojae DSM2809, Aspergillus ochraceus ATCC18500, Aspergillus acculeatis CBS101.43, Verticillium psalliotae CBS396.58, Phialophora mus-tea CBS142.41, Penicillium chrysogenum URCM237, Phoma exígua CBS431.74, Microsporum gallinae CBS221.55, Acremonium strictum ATCC20371, Rhizomucor miehei CBS370.65, Alternaria alternata CBS103.33, Talaromyces emersonii CBS393.64, Cladosporium chlorocepha-lum CBS213.73, Cladosporium tenuissinum CBS117.79, e Trichoderma ree-sii ATCC26921 foram cultivadas em 100 ml de PDB (Potato Dextrose Broth, Difco) em 30°C (exceto para a cepa de Talaromyces que foi cultivada em 50°C) e agitadas em 220 rpm.

Quando as culturas foram suficientemente cultivadas, a massa micelial foi colhida por filtração através do filtro Miracloth, lavada com 10 mM de tampão de KPi (pH 7,0) e secado entre papel-filtro. O micélio foi triturado sob nitrogênio líquido com um almofariz e pilão, até que um pó fino branco fosse obtido. Subseqüentemente, o DNA cromossomal foi isolado empregando o kit PureGene (Gentra Systems, Minneapolis USA) de acordo com as instruções pelo fornecedor.

Saccharomyces cerevisiae ATCC20785 foi usado como controle negativo na experiência e cultivado em YePD em 30°C e agitado em 220 rpm.

Para a preparação de uma mancha do Sul, o DNA cromossomal de todas as espécies foi digerido com Xhol e os fragmentos de restrição foram separados por eletroforese em gel de agarose em um gel de agarose a 0,8% em tampão de TAE. Após a separação, os fragmentos de DNA foram manchados em membranas de nitrocelulose (0,2 pm, Schleicher & Schuell) por procedimento convencional (Sambrook e outros (1982): Clonagem molecular; um manual de laboratório, ISBN 0-87969-309-6), e a mancha foi sustentada durante 2 horas em 80°C. A sonda para hibridização foi sintetizada com PCR em pGB-FIN11-EPO como padrão usando iniciadores 5'- ATGCGTGCCTTCTCCG-CTGTC-3' e o iniciador AUAP. Cerca de 30 nanogramas do fragmento de DNA foi rotulado com 32P-alfa-dATP (Amersham, England) com o sistema de rotulagem de DNA RadPrime (Life Technologies) de acordo com as instruções do fornecedor. Após a rotulagem, dNTP's não-incorporados foram removidos purificando-se o fragmento de sonda em uma coluna Sephadex G-50 de acordo com o procedimento de coluna tecida (Sambrook e outros, 1982) Antes de adicionar à mistura de hibridização, a sonda purificada foi desnaturada por incubação em água fervente durante 5 minutos seguido por resfriamento rápido em gelo, e usada imediatamente. A pré-hibridização das manchas foi em 50 ml de 6 x SSC, 0,5% de SDS, 5 x Denhardt, 0,1 mg/ml de DNA de esperma Herring (Life Technologies) durante 1 hora em 50°C sob condições de agitação. Após a adição da sonda para a solução de pré-hibridização, a hibridização foi realizada durante 16 horas em 50°C. As manchas foram lavadas duas vezes com 200 ml de 6 x SSC, 0,1 % de SDS durante 30 minutos em temperatura ambiente, e uma vez com 200 ml de 6 x SSC, 0,1% de SDS durante 30 minutos em 50°C, para remover a hibridização específica para a mancha. Filmes X-Omat AR (Kodak) foram usados para visualizar a hibridização.

Os resultados desta experiência são descritos na Tabela 6. Cepas de A, niger e A. carbonarius fornece forte hibridização com a sonda. Da mesma forma outras cepas de Aspergillus tipo A. sojae, A. ochraceus e A. acculeatis fornece hibridização com a sonda. Aparentemente o gene codificando a endoprotease específica de prolina é bem conservado dentro do gênero de Aspergillus. Surpreendentemente, da mesma forma fungos que são mais distantes de Aspergillus, tipo Phialophora mustea, Rhizomucor mi-ehei, Alternaria a Item ata, Talaromyces emersonii, e Trichoderma reesii for- nece boa hibridização para o cDNA da endoprotease específica de prolina. Saccharomyces cerevisiae que foi incluído como controle negativo, bem como algumas outras espécies não mostram qualquer hibridização com o cDNA de A. niger (observe Tabela 6). Este resultado mostra que o gene codificando a endoprotease específica de prolina é conservado em muitas espécies fúngicas, e uma pessoa versada na técnica entenderá que os genes destas espécies podem ser isolados empregando a hibridização heteróloga mostrada aqui como método de detecção.

Para ilustrar isto, o fragmento de cDNA de Aspergillus niger G306, empregado neste exemplo, foi usado como sonda para a avaliação de uma biblioteca de DNA genômico de Aspergillus niger CBS513.88. Uma pessoa versdana técnica terá o conhecimento de gerar uma biblioteca de DNA, e avaliar uma tal biblioteca com uma sonda de DNA rotulada. Este procedimento foi também descrito extensivamente literatura (Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning; a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Clones positivos na avaliação foram purificados e o DNA foi seqüenciado. DNA genômico de Aspergillus niger CBS513.88 codificando para a endoprotease específica de prolina é representado em SEQJD 15. Este exemplo ilustra que é possível isolar o gene codificando a endoprotease específica de prolina de outras espécies e cepas empregando hibridização para o cDNA deste gene de Aspergillus niger G306. A seqüência de codificação deduzida e seqüência de aminoáci-do da endoprotease específica de prolina de CBS513.88 é descrita em SEQ ID 16 e SEQJD 17 respectivamente.

Exemplo 12 Mistura de enzima obtida de Asperaillus orvzae FS 1-32 e seus efeitos na hidrólise de proteína de soja.

Patente Japonesa JP5015314 descreve uma preparação de enzima bruta obtida de Aspergillus oryzae FS 1-32 contendo maiores quantidades de uma atividade endoproteolítica não-específica e menores quantidades de uma endoprotease específica de prolina. Esta preparação bruta também contém uma atividade de carboxipeptidase significante. Na incubação de proteína de soja com esta preparação de enzima bruta, um hidrolisado de proteína de soja é obtido o qual é reivindicado por ser significantemente menos amargo do que um hidrolisado de soja que pode ser obtido com outras preparações de protease. A explicação dada em JP5015314 para este benefício de tirar o amargo é que outras preparações de protease necessitam da presença de uma endoprotease específica de prolina em combinação com uma carboxipeptidase. JP5015314 sugere que a base para o efeito de tirar o amargo é a remoção dos resíduos de prolina que são expostos pela ativida- de da endoprotease específica de prolina e subseqüentemente removidos pela carboxipeptidase.

Exemplo 4 do presente pedido descreve os efeitos em proteína de soja de uma mistura de enzimas comerciais parecendo-se com o perfil de atividade proteolítica da cepa A. oryzae FS 1-32. Uma das conclusões deste trabalho experimental é que a incorporação de uma atividade endoproteolíti-ca específica de prolina em níveis como registrados com cepa FS 1-32 não induz a um aumento apreciável em peptídeos de soja transportando um resíduo de prolina de terminal carbóxi. Como esta conclusão tem implicações importantes com relação a hidrolisados de proteína não-amargos descritos no presente pedido, decide-se repetir a experiência porém usando a mistura de enzima como obtida de A. oryzae FS 1-32 e sob condições como descritas em JP5015314.

Aspergillus oryzae FS 1-32 (como obtido do depósito 12193 de Micr. Ind Lab in Japan) foi plotado em placas de agar de extrato de malte, incubado durante quatro dias em 35°C e, em seguida, armazenado durante um dia em 4°C. Os esporos destas placas foram usados para inocular o meio de inoculação contendo 20 gramas/kg de dextrose, 15 gramas/kg de farinha de soja desengordurada, 5 gramas/kg de baixo extrato de levedura de sal, 1 grama/kg de KFI2P04 e 0,2 grama/kg de antiespuma. Após a dissolução em água desmineralizada, o pH do meio foi ajustado com ácido sulfú-rico em para 5,5 e em seguida dividido em porções de 20 ml em frascos de agitação de 100 ml com abafadores. Os frascos de agitação com meio foram esterilizados durante 30 minutos em 121°C e inoculados após resfriamento. Após dois dias em um incubador de agitação em 32°C, 1 ml foi usado para inocular outro meio de inoculação de 100 ml. Depois de outro dia no incubador de agitação em 32°C, esta cultura foi usada para inocular o meio de cultura. Porque JP501314 nõ fornece a informação com relação aos procedimentos de fermentação empregados, o protocolo de fermentação e meio como fornecido em EP 0 522 428 foram usados. O meio de cultura de acordo com EP 0 522 428 contém os seguintes componentes: 25,4 gramas/litro de caseína ácida (Armor Proteins, France), 8,6 gramas/litro de farinha de soja torrada (Cargill, Netherlands), 15,0 gramas/litro de farelo de trigo (Zonnatura, Netherlands), 20,0 gramas/litro de amido de milho, 16,0 gramas/litro de ácido tânico (Omnichem) e 26,6 gramas/litro de KH2PO4. Porque o ácido tânico recomendado (para estimular a formação da endoprotease específica de prolina) não foi especificado em EP 0522428, dois tipos de ácido tânico, isto é BREWTAN C e TA-NAL W2 (ambos de Omnichem (Wetteren, Belgium) foram usados. Finalmente 0 valor de pH do meio de cultura foi ajustado com ácido fosfórico (20%) para 4,5 e, em seguida, dividido em porções de 100 ml em frascos de agitação de 500 ml com abafadores. Frascos foram esterilizados por 30 minutos a 121°C.

Após a inoculação com 1 mililitro do meio de inoculação pré-cultivado, as culturas foram incubadas por 2 e 4 a 32°C, 250 rpm. Para re-movoer a biomassa, o caldo do cultivo foi filtrado em um filtro de microfibra de vidro Whatman (cat no 1820090) as quais foram, em seguida, armazenadas em -20°C. Parte deste material congelado foi liofilizada e usada para medições de atividade bem como incubações com proteína de soja.

As atividades de prolil-endopeptidase, carboxipeptidase e endoprotease nos materiais liofilizados foram avaliadas exatamènte como descrito em JP5015314. As amostras que tinham sido fermentadas durante 2 dias mostraram níveis de atividade de enzima apreciavelmente mais altas, em seguida, as amostras que tinham sido fermentadas durante os 4 dias recomendados de modo que foi decidido usar estas amostras de dois dias para a incubação final com proteína de soja. Os dados de atividade da enzima daquelas amostras mostrando as atividades de prolil-endopeptidase mais altas são mostradas aqui abaixo.

As atividades de propil-endopeptidase e de carboxipeptidase avaliadas nas amostras 1, 3 e 4 são comparáveis com as figuras fornecidas em JP5015314. Entretanto, as atividades de endoprotease avaliadas nestas amostras parecerem ser de aproximadamente 200 vezes menor do que indicado na JP n° 501314. Em vista das atividades endoproteolítica relatadas em várias preparações de enzima industriais (observe Exemplo 4); as atividades endoproteolíticas extremamente altas obtidas com A. oryzae FS 1-32 e especificadas em JP5015314 são provavelmente não-realísticas.

Em uma tentativa de copiar Exemplo 2 de JP5015314 tão precisamente quanto possível, a experiência seguinte foi realizada. Dez gramas de proteína de soja Soyamin 90HV (Lucas Meyer, Hamburg, Germany) foram suspensas em 100 ml de água desmineralizada e o pH foi ajustado com 4N de NaOH para 8,5. Em seguida, 0,5 g de Delvolase (DSM Food Speciali-ties, Seclin, France) foi ajustada (em lugar de Protin AY de Daiwa Kasei; ambos Delvolase e Protin AY são endoproteases alcalinas derivadas de Ba-cillus) e a solução de proteína foi incubada durante 2 horas em 60°C (em JP5015314, o tempo de incubação e a temperatura com Protin AY não são especificados). Finalmente, Delvolase foi inativada aquecendo-se a solução durante 10 minutos em 92°C. O hidrolisado de proteína resultante foi, em seguida, incubado com as amostras de enzima 1,3 e 4 de acordo com o protocolo descrito em JP5015314 porém padronizado de acordo com a atividade de carboxipeptidase desejada (0,01 unidade por grama de substrato). A implicação foi que, por grama de isolado de soja, 2,0 miligramas da amostra 1 de enzima liofoli-zada tiveram de ser adicionados, 2,7 miligramas da amostra 3 de enzima liofilizada e 1,3 miligrama da amostra 4 de enzima liofilizada . As atividades de prolil endoprotease e endoprotease resultantes são apresentadas na Tabela 8.

Após a incubação durante 5 horas em pH 5 e 50 graus C, as amostras foram centrifugadas e os sobrenadantes foram mantidos congelados até a análise LC/EM. A análise LC/EM foi realizada como especificada na seção de Materiais & Métodos. Nesta experiência, o banco de dados de proteína consiste apenas em proteínas de soja. A freqüência de resíduos de prolina de terminal carbóxi detectados nos peptídeos obtidos está especificada abaixo. PEP: prolil-endopeptidase ou endoprotease específica de prolina. A partir dos dados obtidos, é óbvio que a incubação da proteína de soja com a preparação de enzima bruta obtida de Aspergillus oryzae FS 1-32 não resulta em um aumento significante da fração molar de peptídeos transportando um resíduo de prolina de terminal carbóxi. Desse modo o efeito de tirar o amargo descrito em JP5015314 não pode ser atribuído a uma alta incidência de tais peptídeos no hidrolisado final.

Exemplo 13 Um hidrolisado de caseína não-amargo obtido combinando-se termolisina com uma endoprotease específica de prolina de Aspergillus.

Endoprotease específica de prolina de A. niger G306 foi supe- rexpressa e cromatograficamente purificada (observe Exemplo 10) e subse-qüentemente usada para produzir um hidrolisado de caseína não-amargo. Para essa finalidade, adicionou-se em 100 mL de uma solução de caseinato de sódio (Miprodan 30) contendo 60 gramas por litro, 100 mg de termolisina (Thermoase). A incubação em pH de 6,7 e 85 graus C resultou em uma flo-culação imediata e precipitação de proteína caseinácea. A incubação durante duas horas finalmente resultou em uma solução clarificada ainda contendo algum precipitado. Em seguida o pH da solução foi ajustado para pH de 5,0 e a Thermoase foi inativada por aquecimento durante 45 minutos em 95 graus C. Após o resfriamento, a solução foi testada e observada por estar muito amargo. Neste estágio o DH (Grau de Hidrólise; estabilizado empregando o método TNBS) da solução de caseinato foi aproximadamente 35%. A análise de 64 peptídeos por LC/EM/EM empregando um banco de dados para caseinatos bovinos indicou uma incidência molar de peptídeos transportando um resíduo de prolina de terminal carbóxi de 14%.

Em seguida, 3 unidades da endoprotease específica de prolina cromatograficamente purificada de A. niger foram adicionadas em 25 mililitros do hidrolisado. Após a incubação durante 20 horas em 50 graus C, outro ciclo de inativação de enzima foi realizado aquecendo-se a solução durante 30 minutos em 90°C. Após o resfriamento em temperatura ambiente, a solução foi decantada e o sobrenadante claro foi ajustado para um valor de pH em 4,0; o hidrolisado de caseinato foi encontrado para permanecer completamente dissolvido e claro. O sabor demonstrou a ausência de qualquer amargor ou gostos. O DH deste hidrolisado final empregando o método TNBS foi aproximadamente 50%; análise LC/EM/EM de 64 peptídeos mostrou que a incidência molar de peptídeos transportando um resíduo de prolina de terminal carbóxi foi aumentada para 45%. Estes 45% são quase 4 vezes mais elevado do que a fração molar da prolina ocorrendo no substrato Miprodan.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Construto de ácido nucléico caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1 operavelmente ligado a uma ou mais sequências de controle heterólogas que direcionam a produção do polipeptídeo que possui atividade endoprotease específica de prolina em um hospedeiro de expressão adequado.

2. Vetor de expressão recombinante caracterizado pelo fato de que compreende o construto de ácido nucléico conforme definido na reivindicação 1.

3. Célula hospedeira recombinante microbiana caracterizada pelo fato de que compreende o construto de ácido nucléico conforme definido na reivindicação 1, ou o vetor conforme definido na reivindicação 2.

4. Célula hospedeira recombinante microbiana, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de ser um Aspergillus niger.

5. Método para produzir o polipeptídeo que possui atividade endoprotease específica de prolina compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 caracterizado pelo fato de compreender o cultivo de uma célula hospedeira recombinante, conforme definida na reivindicação 3 ou 4, para produzir um sobrenadante e/ou células compreendendo o polipeptídeo; e a recuperação do polipeptídeo.

6. Método para produzir o polipeptídeo que possui atividade endoprotease específica de prolina compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de uma célula hospedeira que compreende um construto de ácido nucléico compreendendo um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo sob condições adequadas para a produção do polipeptídeo; e a recuperação do polipeptídeo.

7. Uso de um polipeptídeo produzido pelo método como definido na reivindicação 5 ou 6 caracterizado pelo fato de ser na preparação de alimento ou alimentação.