JP6244601B2

JP6244601B2 - 低グルテン酵母加水分解産物

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Publication number: JP6244601B2
Application number: JP2016571425A
Authority: JP
Inventors: ファン，ペトルスノルベルトゥスベーレン，
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2014-07-01
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2017-12-13
Anticipated expiration: 2035-06-26
Also published as: EP3164500B1; PL3164500T3; US20170152542A1; CN106659217A; EP3164500A1; US10604780B2; CA2951350A1; WO2016001072A1; JP2017520244A; RS59834B1; DK3164500T3; CN106659217B; CA2951350C

Description

発明の詳細な説明

［発明の分野］
本発明は、低グルテン酵母加水分解産物およびポリイル特異的エンドプロテアーゼを用いた、それを製造するプロセスに関する。

［発明の背景］
酵母抽出物の製造には、通常、パン酵母およびトルラ（ｔｏｒｕｌａ）酵母細胞が自己消化にかけられる。一部の酵母原料（例えば、使用済みビール酵母）は、グルテンの残留物（グリアジン）を含有する。その結果、グリアジンを含有する酵母原料に由来する抽出物および懸濁液は、個体群の一部がグリアジンに対して不耐性（セリアック病）があるために、食品用途での使用が限られる。グリアジンを含有する原料から得られる一般的な酵母抽出物（例えば、ビール酵母抽出物）または自己消化物は、許容可能な閾値２０ｐｐｍ（重量）を超える濃度でグリアジンを含有することが確認された。

グリアジンを含有する酵母原料からグリアジンを減らすことによって、低濃度のグルテンが存在しないことが必要とされる食品用途で、これらの酵母およびその抽出物を使用することが可能となる。

酵母におけるグリアジンの低減に伴う問題は、望ましくない処理の副作用なく、グリアジン含有量を特異的に減らすことである。例えば、グリアジン含有量を減らす目的の処理が、酵母のＲＮＡも分解することは望ましくない。

驚くべきことに、加水分解および／または自己消化プロセス中にプロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートすることによって、グリアジンを含有する酵母原料からグリアジンを除去することができることが見出された。驚くべきことに、酵母自己消化物および抽出物の乾燥物含有量に対して、グリアジンを２０ｐｐｍ（重量）未満のレベルまで有効に加水分解することができることが判明した。さらに、加水分解および／または自己消化プロセス中にプロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートすることによって、酵母に存在するＲＮＡは分解されないことが見出された。

［定義］
「酵母」は本明細書において、酵母細胞を含む固体、ペーストまたは液体組成物として定義される。好ましくは、酵母細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する。その酵母は、一般的なパン酵母を製造するプロセスなどの発酵プロセスで製造され得る。好ましくは、酵母は、ビール醸造プロセスからのサイドストリームとして得られる、使用済みビール酵母などのビール酵母である。

「自己消化」は本明細書において、内因性酵母酵素、および任意に外来性添加酵素を使用する、酵母細胞の酵素的分解として定義される。自己消化は、自己消化物および酵母抽出物の両方を生じ得る（以下の定義を参照のこと）。

「加水分解」は本明細書において、外来性酵素のみを使用する酵母細胞の酵素的分解として定義される。内在性酵母酵素は最初に、例えば熱ショックによって不活性化される。加水分解によっても、酵母自己消化物および酵母抽出物の両方が生じ得る（以下の定義を参照のこと）。

「酵母加水分解産物」は本明細書において、上記で本明細書において定義される自己消化または加水分解によって得られ、かつ以下で本明細書において定義される酵母自己消化物または酵母抽出物を生じる、使用済みビール酵母などの酵母の消化物として定義される。

「酵母自己消化物」は、ビール酵母細胞、好ましくは使用済みビール酵母細胞から得られる、濃縮されているが抽出されていない、部分的に可溶性の消化物である。消化は、上記で定義される酵母細胞の加水分解または自己消化によって達成される。ビール酵母自己消化物は、酵母細胞全体に由来する可溶性成分および不溶性成分の両方を含有する（例えば、ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｄｅｘ）。

「酵母抽出物」は、ビール酵母細胞の水溶性成分のみを含み、その組成は、主にアミノ酸、ペプチド、炭水化物、および塩である。酵母抽出物は、食用酵母に存在する天然酵素による、かつ／または食品グレード酵素の添加による、つまり上記で定義される自己消化または加水分解による、ペプチド結合の加水分解を通じて生成される（ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｄｅｘ）。

「プロテアーゼ」は本明細書において、つまりエキソ式でタンパク質基質中のペプチド結合に作用する、つまりポリペプチド鎖の末端付近に作用する（アミノペプチダーゼは、ポリペプチド鎖のＮ末端側から、アミノ酸、ジ、トリ、またはそれ以上のオリゴペプチドを切断し、カルボキシペプチダーゼは、ポリペプチド鎖のＣ末端側から、アミノ酸、ジ、トリ、またはそれ以上のオリゴペプチドを切断する）ヒドロラーゼとして本明細書で定義される（エキソ）ペプチダーゼと異なり、エンド式でタンパク質基質中のペプチド結合に対して作用する、つまりポリペプチド鎖のどこでもペプチド結合を切断するヒドロラーゼとして定義される。エンドプロテアーゼは、その触媒機構に基づいて、サブクラス：セリンエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．ｘｘ）、システインエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２２．ｘｘ）、アスパラギン酸エンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２３．ｘｘ）およびメタロ−エンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４．ｘｘ）に分類される。

「プロリン特異的エンドプロテアーゼ」は本明細書において、タンパク質またはオリゴペプチド基質におけるプロリン残基のＣ末端側のタンパク質またはオリゴペプチド基質を切断するエンドプロテアーゼとして定義される。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、ＥＣ３．４．２１．２６として分類されている。その酵素は、哺乳動物原料、細菌（フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ））および真菌（アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、特にアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ））などの様々な原料から得ることができる。アスペルギルスニガーの酵素は、国際公開第０２／４５５２４号パンフレット、国際公開第０２／４６３８１号パンフレット、国際公開第０３／１０４３８２号パンフレットに詳細に記述されている。ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）に由来する適切な真菌酵素が国際公開第２００９／１４４２６９号パンフレットに開示されている。フラボハクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）に由来する適切な細菌酵素が国際公開第０３０６８１７０号パンフレットに開示されている。

「グルテン」は、穀物に見られるタンパク質複合体として本明細書で定義され、グリアジンおよびグルテニンタンパク質に分けられる。

［本発明の詳細な説明］
第１の態様において、本発明は、グルテン含有酵母加水分解産物をプロリン特異的エンドプロテアーゼと接触させ、その結果、塩不含酵母乾燥物に対してグルテン、またはグリアジンを１００ｐｐｍ未満含む酵母加水分解産物が生じる工程を含むことを特徴とする、酵母加水分解産物を製造するプロセスを提供する。好ましくは、得られる酵母加水分解産物は、塩不含酵母乾燥物に対して、グルテン、またはグリアジンを５０ｐｐｍ未満、さらに好ましくは４０ｐｐｍ未満、さらに好ましくは３０ｐｐｍ、さらに好ましくは２０ｐｐｍ含んでいる。酵母加水分解産物は好ましくは、グルテン、またはグリアジンを少なくとも５ｐｐｍ、さらに好ましくはグルテン、またはグリアジンを少なくとも４ｐｐｍ、さらに好ましくはグルテン、またはグリアジンを少なくとも３ｐｐｍ、さらに好ましくはグルテン、またはグリアジンを少なくとも２ｐｐｍ含有し得る。最も好ましくは、酵母加水分解産物は、塩不含酵母乾燥物に対してグルテンを少なくとも１ｐｐｍ含有する。本発明の発明者らは意外なことに、本発明のプロリン特異的エンドプロテアーゼが、その酵母のＲＮＡまたは由来する５’リボヌクレオチドが分解されない、または実質的に分解されず、したがって味覚向上（ｔａｓｔｅｅｎｈａｎｃｉｎｇ）５’−リボヌクレオチドへと転化するために利用可能である、低グルテン酵母加水分解産物を提供することを見出した。

あらゆるプロリン特異的エンドプロテアーゼを本発明のプロセスにおいて使用することができる。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、哺乳動物、植物または微生物起源に由来し得る。適切な微生物のプロリン特異的エンドプロテアーゼは、フラボハクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）などの細菌またはペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）またはアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）などの真菌に由来する。好ましい実施形態において、本発明のプロセスは、アスペルギルスニガーのプロリン特異的エンドプロテアーゼを使用するプロセスである。この酵素は、Ｂｒｅｗｅｒ’ｓＣｌａｒｅｘとして市販されており、ＤＳＭＦｏｏｄＳｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ（デルフト（Ｄｅｌｆｔ），オランダ（ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））から入手することができる。

酵母加水分解産物のグルテン含有量を減らすためにプロリン特異的エンドプロテアーゼが使用される工程の、ｐＨおよび温度などの条件は、プロリン特異的エンドプロテアーゼごとに異なるが、種々のプロリン特異的エンドプロテアーゼに関して当技術分野で公知の酵素特性に基づいて、過度な負担なく当業者によって選択され得る。

好ましくは、本発明のグルテン含有酵母加水分解産物と接触させるプロリン特異的エンドプロテアーゼの量は、塩不含酵母乾燥物に対してゼロを超え０．５％（ｗ／ｗ）までの範囲内にある。さらに好ましくは、本発明のグルテン含有酵母加水分解産物と接触させるプロリン特異的エンドプロテアーゼの量は、塩不含酵母乾燥物に対して、０．０１〜０．５の範囲内、さらに好ましくは０．０２〜０．１または〜０．０１ｗ／ｗの範囲内にある。

その酵母加水分解産物は、上記で定義される酵母抽出物または酵母自己消化物であり得る。酵母はいずれかの適切な酵母であり、好ましくは、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）：カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）またはトルラ属（Ｔｏｒｕｌａ）、好ましくはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、さらに好ましくは、パン酵母として使用されるサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または例えばラガービールの製造に醸造産業で使用される、ビール酵母サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）またはその異名Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓから選択される。好ましい実施形態において、酵母は、ビール酵母であり、さらに好ましくはビール醸造プロセスの副生成物である使用済みビール酵母である。

上記で定義される自己消化または加水分解など、当技術分野でよく知られている方法によって、酵母加水分解産物は酵母細胞から生成され得る。酵母の製造プロセスにおいて、グルテンを含有する原料が使用されるため、酵母細胞は、例えばグルテンを含有し得る。特にビール酵母、さらに好ましくは使用済みビール酵母は、ビール醸造プロセスで使用されるオオムギまたはコムギからの残留グルテンを含有し得る。

本発明のプロセスにおいて、塩不含酵母乾燥物に対して、グルテン、またはグリアジンを１００ｐｐｍ未満含む酵母加水分解産物が製造される。好ましくは、得られる酵母加水分解産物は、塩不含酵母乾燥物に対してグルテンまたはグリアジンを５０ｐｐｍ未満、さらに好ましくは４０ｐｐｍ未満、さらに好ましくは３０ｐｐｍ未満、さらに好ましくは２０ｐｐｍ未満含んでいる。そのプロセスで使用されるプロリン特異的エンドプロテアーゼは、プロリン特異的エンドプロテアーゼについて上述の特異性でグルテンを切断することによって、酵母加水分解産物中に存在するグルテンの量を低減する。グルテン１００ｐｐｍ未満の酵母加水分解産物を得るために、プロリン特異的エンドプロテアーゼを用いた工程にかけられる酵母加水分解産物は、１００ｐｐｍを超える量を含有しなければならず、そうでなければ、プロリン特異的エンドプロテアーゼはグルテン含有量を低減することができないことは、当業者であれば容易に理解されよう。同様に、グルテン５０ｐｐｍ未満の酵母加水分解産物を得るために、プロリン特異的エンドプロテアーゼを用いた工程にかけられる酵母加水分解産物は、５０ｐｐｍを超える量を含有しなければならず、またグルテン４０ｐｐｍ未満の酵母加水分解産物を得るために、プロリン特異的エンドプロテアーゼを用いた工程にかけられる酵母加水分解産物は、４０ｐｐｍを超える量を含有しなければならず、さらに、グルテン３０ｐｐｍ未満の酵母加水分解産物を得るために、プロリン特異的エンドプロテアーゼを用いた工程にかけられる酵母加水分解産物は、３０ｐｐｍを超える量を含有しなければならず、さらに、グルテン２０ｐｐｍ未満の酵母加水分解産物を得るために、プロリン特異的エンドプロテアーゼを用いた工程にかけられる酵母加水分解産物は、２０ｐｐｍを超える量を含有しなければならない。一般に、プロリン特異的エンドプロテアーゼを用いた工程にかけられる酵母加水分解産物は、プロリン特異的エンドプロテアーゼがグルテン含有量を低減する工程後に得られる酵母加水分解産物よりも、多いグルテンを含有しなければならない。

グルテン含有酵母加水分解産物をプロリン特異的エンドプロテアーゼと接触させて、塩不含酵母乾燥物に対してグルテンを１００ｐｐｍ未満、少なくとも１ｐｐｍ含む酵母加水分解産物が生成される、本発明の工程に５’−リボヌクレオチドを生成するためのホスホジエステラーゼも、任意に５’−ＡＭＰを５’−ＩＭＰへと転化する酵素的処理を含ませることがさらに好ましい。ホスホジエステラーゼと本発明のプロリン特異的エンドプロテアーゼとの組み合わせを用いる利点は、増量した５’−リボヌクレオチドと共に低グルテン酵母加水分解産物が得られることである。

第２の態様において、本発明は、塩不含酵母乾燥物に対してグルテン、またはグリアジンを１００ｐｐｍ未満含む酵母加水分解産物を提供する。好ましくは、得られる酵母加水分解産物は、塩不含酵母乾燥物に対してグルテン、またはグリアジンを５０ｐｐｍ未満、さらに好ましくは４０ｐｐｍ未満、さらに好ましくは３０ｐｐｍ未満、さらに好ましくは２０ｐｐｍ未満含んでいる。酵母加水分解産物は好ましくは、グルテンを少なくとも５ｐｐｍ、さらに好ましくはグルテンまたはグリアジンを少なくとも４ｐｐｍ、さらに好ましくはグルテン、またはグリアジンを少なくとも３ｐｐｍ、さらに好ましくはグルテン、またはグリアジンを少なくとも２ｐｐｍ含有し得る。最も好ましくは、酵母加水分解産物は、塩不含酵母乾燥物に対してグルテン、またはグリアジンを少なくとも１ｐｐｍ含有する。酵母加水分解産物は、いずれかの適切なプロセスによって得ることができるが、好ましくは、本発明の第１態様のプロセスによって得ることができる、または得られる。

第２の態様の好ましい実施形態において、本発明の酵母加水分解産物はさらに、５’−リボヌクレオチドを含む。「５’−リボヌクレオチド」という用語は、本明細書において遊離５’−リボヌクレオチドまたはその塩のいずれかを意味することが意図される。５’−ＩＭＰ、５’−ＧＭＰは、その風味向上特性について知られている。それらは、特定のタイプの食品において風味および旨味を向上させることができる。したがって、本発明の酵母加水分解産物の利点は、少量のグリアジンおよび／またはグルテンと組み合わせて香味向上特性を提供することである。

本発明の酵母加水分解産物中の５’−リボヌクレオチドの重量パーセント（％ｗ／ｗ）は、酵母加水分解産物のＮａＣｌ不含乾燥物の重量に対するものであり、５’−リボヌクレオチドの二ナトリウム塩七水和物（２Ｎａ．７Ｈ_２Ｏ）として計算される。

第１または第２の態様の更なる好ましい実施形態において、本発明の酵母加水分解産物はさらに、５’−ＧＭＰ（５’−グアニンモノホスフェート）および／または５’−ＩＭＰ（５’−イノシンモノホスフェート）を含む。好ましくは、本発明の酵母加水分解産物は、酵母加水分解産物がそれから得られる、酵母細胞中に存在するＲＮＡの量で最大限に得ることができる５’−ＧＭＰおよび／または５’−ＩＭＰの量に対して、６０％を超える、好ましくは７０％を超える、さらに好ましくは８０％超える、さらに好ましくは９０％を超える、さらに好ましくは９５％を超える５’−ＧＭＰおよび／または５’−ＩＭＰを含む。

好ましくは、本発明の酵母加水分解産物中の５’−ＧＭＰおよび５’−ＩＭＰの総量は、酵母加水分解産物のＮａＣｌ不含乾燥物に対して少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５、４％、５％または少なくとも６％である。酵母加水分解産物が酵母自己消化物である場合には、５’−ＧＭＰおよび５’−ＩＭＰの総量は、酵母自己消化物のＮａＣｌ不含乾燥物に対して少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５、４％、５％または少なくとも６％である。本発明の酵母加水分解産物が酵母抽出物である場合には、酵母抽出物のＮａＣｌ不含乾燥物に対して少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５、４％、５％または少なくとも６％である。好ましくは、本発明の酵母自己消化物または酵母抽出物中に存在する５’−ＧＭＰおよび５’−ＩＭＰの総量は、酵母自己消化物または酵母抽出物のＮａＣｌ不含乾燥物に対して１０％未満、好ましくは６％未満、さらに好ましくは５％未満、または４％未満である。

本発明の第２の態様の酵母加水分解産物は、上記で定義される酵母抽出物または酵母自己消化物であり得る。その酵母はいずれかの適切な酵母であることができ、好ましくは、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）またはトルラ属（Ｔｏｒｕｌａ）、好ましくはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、さらに好ましくは、パン酵母として使用されるサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または例えばラガービールの製造に醸造産業で使用される、ビール酵母サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）またはその異名Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓから選択される。好ましい実施形態において、酵母はビール酵母であり、さらに好ましくはビール醸造プロセスの副生成物である使用済みビール酵母である。

第３の態様において、本発明は、プロセス風味反応における、精肉用途における、または風味増強剤としての、または風味向上剤としての、またはトップノート担体における、または卓上用途における、酵母加水分解産物の使用または本発明の第２態様の酵母抽出物または酵母自己消化物の使用を提供する。

第４の態様において、本発明は、本発明の第２態様の酵母加水分解産物または酵母抽出物または酵母自己消化物を含む、風味増強剤、肉製品、風味向上剤、トップノート担体または卓上用途を提供する。

［材料および方法］
［グルテンの決定］
酵母加水分解産物中のグルテンの量は、グルテン／グリアジンのＵＰＥＸ−抽出（ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｏｌａｍｉｎａｎｄＧｌｕｔｅｌｉｎＥｘｔｒａｃｔａｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎ）によって、かつ本質的にＭ．Ｃ．Ｍｅｎａｅｔａｌ．Ｔａｌａｎｔａ９１（２０１２）ｐｐ３３−４０“ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｌｕｔｅｎｉｎｐｒｏｃｅｓｓｅｄｆｏｏｄｓｕｓｉｎｇａｎｅｗｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄａｎｄａｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＥＬＩＳＡｂａｓｅｄｏｎｔｈｅＲ５ａｎｔｉｂｏｄｙ”に記述されるようにＥＬＩＳＡ試験により定量化することによって決定された。

グルテン抽出手順は、ＰＢＳ（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）製品番号：Ｐ３８１３，オランダ）中でトリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）（シグマ・アルドリッチ社製品番号：Ｃ４７０６，オランダ）およびアニオン界面活性剤Ｎ−ラウロイルサルコシン（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）（シグマ・アルドリッチ社製品番号：６１７４５，オランダ）試剤を還元することに基づく。

１．乾燥酵母加水分解産物２５０ｍｇを計量し、１０ｍｌポリプロピレンチューブに移した。
２．酵母加水分解産物を含有するチューブに、ＵＰＥＸ溶液（ＰＢＳ中に５ｍＭＴＣＥＰ，２％Ｎ−ラウロイルサルコシン，ｐＨ７）２．５ｍｌを添加した。還元剤の不活性化を防ぐために、使用直前に、ＵＰＥＸ溶液を調製した。
３．チューブをしっかりと閉めて、キャップをフィルムで覆い、蒸発を防いだ。
４．５〜１０秒間ボルテックスすることによって、チューブの内容物を完全に混合し、チューブを試験管立てに置いた。
５．タイプ１００３のＧＬ水浴内でチューブを５０℃で４０分間インキュベートした。
６．チューブを室温で５分間冷却した。
７．８０％エタノール／水（ｖ／ｖ）７．５ｍｌを添加し、試料全体の分散が達成されるまで、１０〜６０秒間ボルテックスすることによって、試料を完全に分散させ、次いで、回転（ヘッド−オーバーヘッド）振盪機（ＳｔｕａｒｔＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｏｌｌｅｒｍｉｘｅｒタイプ：ＳＲＴ２）において４５回転／分にて室温で１時間インキュベートした。
８．ベンチトップ遠心機（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）モデル５８１０Ｒ）でチューブを室温にて２５００ｇにて１０分間遠心した。
９．新たなパスツールピペットを使用して、各チューブからの上澄みを清潔な１０ｍｌポリプロピレンチューブに移した。
１０．抽出して２４時間以内にＥＬＩＳＡ試験によって、溶液を分析した。

ＥＬＩＳＡ試験では、Ｒｉｄａｓｃｒｅｅｎ（登録商標）ＧｌｉａｄｉｎＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｋｉｔ（Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ社によって供給されている）を使用した（Ｒ−ＢｉｏｐｈａｒｍＡＧ，ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ），ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））。

［実施例］
［実施例１］
［グリアジンの還元］
使用済み醸造クリーム酵母は、オランダの醸造所から入手された。入手した酵母を５５℃に加熱し、ｐＨを５．３に設定した。Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）は、バシラス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のエンドプロテアーゼサブチリシンのカールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）を含有し、ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）（デンマーク（Ｄｅｎｍａｒｋ））によって製造され、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）から購入し、カタログ番号Ｐ４８６０）を塩不含酵母乾燥物に対して投与量１％（ｗ／ｗ）でスラリーに添加した。懸濁液を一晩インキュベートした。Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）のインキュベーション後、懸濁液をｐＨ５．３に設定し、４つの異なるフラクションに分けた。表１に従って、塩不含乾燥物に対して０〜０．５％（ｗ／ｗ）の範囲でプロリン特異的エンドプロテアーゼを添加した。懸濁液を６１℃で維持し、１５時間インキュベートした。インキュベートした後、懸濁液を加熱して残留酵素活性を止めた。懸濁液および抽出物（懸濁液の清澄化後）の試料を採取し、蒸発させることによって濃縮した。材料および方法（ＭａｔｅｒｉａｌｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ）に記述されるＵＰＥＸ抽出およびＥＬＩＳＡ試験の手段によって、グリアジン含有量について濃縮物を分析した。

［実施例２］
［グリアジンの還元］
粉末製剤のビール酵母抽出物（ＥＸＰＲＥＳＡ２２００Ｓ，ＤＳＭＦＯＯＤＳＰＥＣＩＡＬＴＩＥＳ，デルフト，オランダ）を水に１０％（ｗ／ｗ）まで溶解した。溶液のｐＨを５．３に設定し、温度を６１℃に維持した。試料を２つのフラクションに分けた。

酵母抽出物を含有する２つのフラスコのうちの１つに、プロリン特異的エンドプロテアーゼを添加し、塩不含酵母乾燥物に対して０．５％（ｗ／ｗ）で投与した。その溶液を１５時間インキュベートした。インキュベートした後、溶液を９０℃に加熱して、残留する酵素活性を止めた。水を蒸発させて、得られた溶液を濃縮した。濃縮された試料を使用し、材料および方法（ＭａｔｅｒｉａｌｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ）に記述されるＵＰＥＸ抽出およびＥＬＩＳＡ試験の手段によって、グリアジン含有量について分析した。

［実施例３］
［プロテアーゼと比較したプロリン特異的エンドプロテアーゼのＲＮＡの低減］
この実施例において、プロリン特異的エンドプロテアーゼを使用してグリアジン含有量を低減した後のＲＮＡの望ましくない分解が、グリアジン含有量の低減にも適している市販のプロテアーゼでの処理と比較される。オランダの醸造所から入手したビール酵母を使用して、高い酵母可溶化収量を有するヌクレオチド含有酵母自己消化物を生成した。酵母ＲＮＡが測定され、乾燥物で３．４％であった。最初に、酵母に９５℃で５分間熱ショックをかけた。続いて、乾燥物を２つのプロテアーゼ工程によって溶解した。最初に、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）（Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）は、バシラス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のエンドプロテアーゼサブチリシンのカールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）を含有し、かつノボザイムズ社（デンマーク）によって製造され、シグマ社から購入される，カタログ番号Ｐ４８６０）をｐＨ８および温度６２℃で６時間インキュベートした（投与量：乾燥物で０．８％）。第２のプロテアーゼ処理では、いくつかの異なる酵素を試験した：
・Ｐｒｏｔｅａｘ（ＡｍａｎｏＥｎｚｙｍｅから入手可能）
・ＰｅｐｔｉｄａｓｅＲ（ＡｍａｎｏＥｎｚｙｍｅから入手可能）
・Ａｃｃｅｌｅｒｚｙｍｅ（ＤＳＭから入手可能）
・ＳｕｍｉｚｙｍｅＦＰ（ＳｈｉｎＮｉｈｏｎから入手可能）
・プロリン特異的エンドプロテアーゼ（ＢｒｅｗｅｒｓＣｌａｒｅｘ，ＤＳＭから入手可能）

これらのプロテアーゼを別々に、異なる実験において適用し（乾燥物で１％）、ｐＨ５．２で温度５１．５℃にて１５時間インキュベートした。これらの２つのプロテアーゼ工程後、酵素を８５℃の熱ショックによって不活性化した。５’−ホスホジエステラーゼ（ＤＳＭ）およびデアミナーゼ（Ａｍａｎｏ）と共にインキュベートすることによって、ＲＮＡを転化し、５’ＧＭＰおよび５’ＩＭＰが生成された。インキュベーションをｐＨ５．３および温度６０℃で１５時間行った。これらの異なるプロセスの後、続いて試料中の５’−ＧＭＰおよび５’−ＩＭＰの量（塩化ナトリウム不含乾燥物に対するその二ナトリウム七水和物の重量パーセンテージとして表される）を、以下の方法に従ってＨＰＬＣによって決定した。ＷｈａｔｍａｎＰａｒｔｉｓｉｌ１０−ＳＡＸカラム、溶離剤としてリン酸緩衝液（ｐＨ３．３５）およびＵＶ検出を用いて、ＨＰＬＣによって５’−ＧＭＰおよび５−ＩＭＰを定量化した。５’−ＧＭＰおよび５’−ＩＭＰ標準に基づいて、濃度を計算した。ＪｅｎｗａｙｃｈｌｏｒｉｄｅｍｅｔｅｒＰＣＬＭ３（Ｊｅｎｗａｙ，エセックス（Ｅｓｓｅｘ），英国（Ｅｎｇｌａｎｄ））で試料中の塩化物イオンを測定し、相当する量の塩化ナトリウムを計算することによって、塩化ナトリウムを決定した。

可溶化収率およびタンパク質の加水分解の程度を決定することによって、プロテアーゼの有効性を測定した。その結果を表３にまとめる。

表３から、プロリン特異的エンドプロテアーゼを使用すると、期待量の５’−ＧＭＰおよび５’−ＩＭＰの少なくとも９０％の５’−ＧＭＰおよび５’−ＩＭＰが提供され、出発酵母のＲＮＡ含有率（３．４％）が得られることが分かる。したがって、プロリン特異的エンドプロテアーゼは実施例１および２に示すようにグルテンを低減することができ、酵母中に存在するＲＮＡは分解されず、したがって５’−ＧＭＰおよび５’−ＩＭＰのような５’−リボヌクレオチドへと転化するのに利用可能である。酵母のＲＮＡも明らかに分解した、他のプロテアーゼに関して５’−ＧＭＰおよび５’−ＩＭＰを考慮すると、これは驚くべきことである。

Claims

グルテン含有酵母加水分解産物を、５’−リボヌクレオチドを生成するためのホスホジエステラーゼ及びアスペルギルスニガーのプロリン特異的エンドプロテアーゼと接触させ、その結果、塩不含酵母乾燥物に対してグルテンを１００ｐｐｍ未満かつ少なくとも１ｐｐｍ含み、５’−リボヌクレオチド５’−ＧＭＰおよび／または５’−ＩＭＰを更に含む酵母加水分解産物が生成される工程を含み、
前記５’−ＧＭＰおよび前記５’−ＩＭＰの総量が、酵母加水分解産物のＮａＣｌ不含乾燥物に対して、少なくとも１．５％であることを特徴とする、酵母加水分解産物を製造するプロセス。
得られた前記酵母加水分解産物が、塩不含酵母乾燥物に対してグルテンを５０ｐｐｍ未満含む、請求項１に記載のプロセス。
得られた前記酵母加水分解産物が、塩不含酵母乾燥物に対してグルテンを４０ｐｐｍ未満含む、請求項２に記載のプロセス。
得られた前記酵母加水分解産物が、塩不含酵母乾燥物に対してグルテンを３０ｐｐｍ未満含む、請求項３に記載のプロセス。
得られた前記酵母加水分解産物が、塩不含酵母乾燥物に対してグルテンを２０ｐｐｍ未満含む、請求項４に記載のプロセス。
前記プロリン特異的エンドプロテアーゼがＥＣ３．４．２１．２６と分類される、請求項１から５のいずれか一項に記載のプロセス。
前記酵母加水分解産物が酵母抽出物または酵母自己消化物である、請求項１から６のいずれか一項に記載のプロセス。
前記酵母加水分解産物が使用済みビール酵母加水分解産物である、請求項１から７のいずれか一項に記載のプロセス。
前記酵母が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）またはトルラ属（Ｔｏｒｕｌａ）に由来する種である、請求項１から８のいずれか一項に記載のプロセス。
前記酵母が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する種である、請求項９に記載のプロセス。