MX2010012847A - Proteasa especifica de prolina de penicillium chrysogenum. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que tiene actividad proteasa específica de prolina que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2, o una variante del mismo o un fragmento de cualquiera de los mismos. La invención también se relaciona con métodos para utilizar el polipéptido en procesos industriales. También se incluyen en la invención células transformadas con un polinucleótido de conformidad con la invención adecuadas para producir estas proteínas.

Description

PROTEASA ESPECÍFICA DE PROLINA DE PENICILLIUM CHRYSOGENUM CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con una proteasa específica de prolina. La invención también se relaciona con métodos en los que se utiliza la proteasa específica de prolina y con usos de la proteasa específica de prolina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteasas específicas de prolina son enzimas capaces de dividir una proteína o un péptido cerca o en posiciones en donde la proteína o el péptido contienen un residuo prolilo en su cadena.

Las proteasas específicas de prolina han sido propuestas para uso en un número de aplicaciones, por ejemplo para minimizar la posibilidad de sabores extraños en la preparación de hidrolizados de proteína, para reducir la antigenicidad de tales hidrolizados y en la prevención o reducción de turbidez en bebidas .

Es deseable que las enzimas que se utilizan en aplicaciones para bebidas o alimentos tengan un pH ácido adecuado, óptimo y, de manera preferible, no son activas en la preparación final en las que se utilizan para generarlas. De acuerdo con lo anterior, las enzimas para uso en aplicaciones para bebidas o alimentos pueden deseablemente ser inactivadas de manera fácil.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con un polipéptido que tiene actividad proteasa especifica de prolina que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2, o una variante del mismo o fragmento de cualquiera de los mismos.

La enzima específica de prolina de la invención es una que tiene un pH óptimo de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 5 y que puede fácilmente ser inactivada. De acuerdo con lo anterior, puede ser particularmente útil en aplicaciones para bebidas o alimentos.

Un polipéptido de la invención puede tener por lo menos aproximadamente 60% de identidad de secuencia con la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 3. Un polipéptido de la invención puede tener por lo menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud. Un polipéptido que tiene actividad proteasa específica de prolina puede comprender un dominio funcional de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

La invención también se relaciona con un polinucleótido que comprende : (a) la secuencia de nucleótidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 o la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 1; (b) una secuencia de nucleótidos que híbrida selectivamente con un polinucleotido que es el complemento inverso de la SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 2; (c) una secuencia de nucleótidos que tiene. por lo menos aproximadamente 50% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 2; (d) un fragmento de una secuencia de nucleótidos como se define en (a) , (b) o (c) que tiene por lo menos 100 nucleótidos ; (e) una secuencia que se degenera como un resultado del código genético a una secuencia como se define en uno cualquiera de (a) , (b) , (c) o (d) ; o (f) una secuencia de nucleótidos que es el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (a) , (b) , (c) , (d) o (e) .

La invención proporciona adicionalmente : un vector que incorpora una secuencia de polinucleotido de la invención; una célula que comprende un polipéptido, un polinucleotido o un vector de la invención; un método para la preparación de un polipéptido que tiene actividad proteasa específica de prolina, cuyo método comprende cultivar una célula de la invención bajo condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido y, opcionalmente , recuperar el polipéptido expresado; - un polipéptido obtenido por un método tal; una composición que comprende: (i) un polipéptido de la invención; y, opcionalmente, (ii) una proteasa que es diferente del polipéptido en (i) ; un método para la preparación de un hidrolizado de proteína, cuyo método comprende poner en contacto un sustrato de proteína con un polipéptido de una composición de la invención; uso de un polipéptido o una composición de la invención en la preparación de un hidrolizado de proteína; - un " hidrolizado de proteína obtenido por el método establecido anteriormente; un producto alimenticio o alimento o una bebida que comprende un tal hidrolizado de proteína; un método para la preparación de un producto alimenticio o alimento o una bebida cuyo método comprende incorporar un polipéptido o una composición de la invención durante la preparación del producto de alimento, el producto alimenticio o bebida; un producto alimenticio o alimento o bebida obtenible por un tal método; uso de un polipéptido o una composición de la invención en la preparación de un producto alimenticio o alimento o una bebida; - un producto alimenticio o alimento o una bebida obtenible por un tal método o uso; y un polipéptido de la invención para uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno siquiátrico o un trastorno ligado a enfermedad celiaca.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 establece la estrategia utilizada para clonar la proteasa especifica de prolina ZFX.

La Figura 2 establece la secuencia de un fragmento de ADN cromosómico de Penicillium chrysogenum CBS 455.95 que contiene el gen que codifica la proteasa específica de prolina ZFX (SEQ ID NO: 1) . La secuencia de codificación (SEQ ID NO: 2) está resaltada ligeramente y se indica la secuencia de proteína (SEQ ID NO: 3) .

La Figura 3 muestra la temperatura óptima de la proteasa específica de prolina aislada ZFX.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 establece la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN cromosómico de Penicillium chrysogenum CBS 455.95 que contiene el gen que codifica la proteasa específica de prolina ZFX.

SEQ ID NO: 2 establece la secuencia que codifica el nucleótido de la proteasa específica de prolina ZFX .

SEQ ID NO: 3 establece la secuencia de aminoácidos de la proteasa específica de prolina ZFX.

SEQ ID NO: 4 establece el cebador PCR directo (ZFX-dir) que contiene la secuencia que codifica ZFX de 24 nucleótidos que parte del codón de inicio ATG, precedida por una secuencia de 23 nucleótidos que incluye un sitio de restricción Pací.

SEQ ID NO: 5 establece el cebador inverso (ZFX-rev) que contiene nucleótidos complementarios de la hebra inversa de la región de la dirección 3' de la secuencia que codifica ZFX precedida por un sitio de restricción AscI.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una nueva proteasa específica de prolina que se ha identificado en el hongo Penicillium chrysogenum. Esto es sorprendente ya que se mostró en la WO02/45524 que un fragmento de cADN que codifica una proteasa específica de prolina de A. niger no híbrida con ADN genómico aislado de Penicillium chrysogenum (ver Ejemplo 11 y Tabla 6 en WO 02/45524) .

La nueva enzima descrita aquí tiene un pH ácido óptimo y puede ser sustancialmente, o de manera preferible, inactivado totalmente por vía, por ejemplo, de una etapa de calentamiento (tal como un proceso de pasteurización estándar) . Así la enzima es adecuada para uso en aplicaciones alimenticias que típicamente tienen ambientes ácidos y en donde es altamente deseable que el producto final (alimento) no tenga sustancialmente actividad enzimática residual.

También, la presente invención cumple la demanda por una proteasa específica de prolina que se puede producir en altas cantidades. De manera preferible, tal una proteasa específica de prolina se secreta de la célula anfitriona. La secreción activa es de suprema importancia para un proceso de producción económicamente viable ya que ésta es capaz de recuperar la enzima en una forma casi pura sin ir a través de un proceso de purificación voluminoso. La sobreexpresión de tal una proteasa específica de prolina secretada activamente por un anfitrión fúngico grado alimenticio tal como Aspergillus, produce una enzima de grado alimenticio y un proceso de producción de costo efectivo, y por lo tanto es preferible. Los procesos se describen para la producción de proteasa específica, de prolina en grandes cantidades mediante el anfitrión de producción grado alimenticio Aspergillus niger .

Desde un punto de vista ' económico existe una clara necesidad para unos medios mejorados de producción de proteasas específicas de prolina en altas cantidades y en forma relativamente pura. Mostramos aquí que. una forma preferida para hacer esto es por vía de la sobreproducción de tal una proteasa específica de prolina utilizando técnicas de ADN recombinante . Una forma particularmente preferida de hacer esto es por vía de la sobreproducción de una proteasa específica de prolina derivada de hongos y una forma más preferida de hacer esto es por vía de la sobreproducción de una proteasa específica de prolina derivada de Penicillium. Es esencial posibilitar la información de secuencia única de la ruta de producción final de una proteasa específica de prolina derivada de Penicillium. Más de manera preferible tiene que estar disponible la secuencia de nucleótidos completa del gen codificante.

Una vez la nueva enzima ha estado disponible en grandes cantidades y en una forma relativamente pura, los productos alimenticios (similares a pan, pasta o fideos) o hidrolizados de proteína con propiedades organolépticas, inmunológicas y/o de texturas mejorada, se pueden preparar en un grado alimenticio y forma económica. La enzima también se puede utilizar potencialmente como un conservante. Adicionalmente , la enzima se puede utilizar en la preparación de bebidas, en particular en un método para la prevención o reducción de turbidez en una bebida.

Aquí, la actividad proteasa específica de prolina se define como la actividad proteasa que divide los enlaces de péptido que involucran un residuo prolina en una proteína y/o un péptido. Una proteína se puede considerar generalmente para los propósitos de esta invención por comprender más de aproximadamente 30 aminoácidos. Un péptido se puede considerar generalmente para los propósitos de esta invención por comprender aproximadamente 30 o menos aminoácidos. .

De acuerdo con lo anterior, una proteasa específica de prolina aquí puede tener actividad endoproteasa específica de prolina y/o oligopeptidasa específica de prolina (EC 3.4.21.26). De manera preferible, una proteasa específica de prolina de la invención, tal como una endoproteasa específica de prolina y/o una oligopeptidasa específica de prolina, es una que hidroliza una proteína y/o un péptido en una ubicación en donde la proteína o el péptido contienen un residuo prolina.

En la invención, una proteasa específica de prolina es de manera preferible una que hidroliza el enlace péptido en el extremo de la terminal carboxilo de los residuos prolina.

Sin embargo, una proteasa específica de prolilo que corta los residuos prolilo en su terminal NH2 , se describe por ejemplo en una publicación en Nature de 15 de enero de 1998, Vol.391, p.301-304.

En este texto, los términos endoproteasa específica de prolilo, endoproteasa específica de prolina, endopeptidasa específica de prolina, oligopeptidasa específica de prolina, oligopeptidasa específica de prolilo, oligopeptidasa prolilo, proteína/péptido que tiene una actividad específica de prolilo o expresiones similares se utilizan intercambiablemente .

La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican una proteasa específica de prolina, a la que se hace referencia aquí como "ZFX" , que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 3 o una secuencia variante de la misma (por ejemplo una secuencia que es equivalente funcionalmente a la SEQ ID NO: 3) o una secuencia que es un fragmento de cualquiera de las mismas. La secuencia de aminoácidos también se establece en la Figura 2.

La secuencia del gen que codifica la proteasa específica de prolina ZFX se determina por secuenciación del genoma de Penicillium chrysogenum. La invención proporciona secuencias de polinucleótido que comprende el gen que codifica la proteasa específica de prolina ZFX así como también su secuencia de codificación. De acuerdo con lo anterior, la invención se relaciona con un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO: 1 ó 2 y con variantes, tal como equivalentes funcionales de los mismos. Las secuencias de nucleótidos también se establecen en la Figura 2.

En particular, la invención se relaciona con un polinucleótido aislado que es capaz de hibridar selectivamente, por ejemplo, bajo condiciones severas, de manera preferible bajo condiciones altamente severas, con el complemento inverso de un polinucleótido que comprende la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 1 ó la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2.

Ventajosamente, tales polinucleotidos de acuerdo con la invención (y los polipéptidos codificados) pueden ser obtenibles y/o se pueden obtener de un hongo, en particular de un hongo de la división Ascomycota, tal como de la subdivisión Pezizomycotina, por ejemplo de la clase Eurotiomycetes , tal como del orden Eurotiales, én particular de la familia Trichocomaceae , tal como del género Penicillium, de manera preferible de las especies Penicillium chrysogenum.

Más específicamente, la invención se relaciona con un polinucleótido que comprende o consiste esencialmente en una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 1 ó la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2.

La invención también se relaciona con un polinucleotido aislado que comprende o consiste esencialmente en una secuencia que codifica por lo menos un dominio funcional de un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 3 o una variante, tal como un equivalente funcional, de los mismos o un fragmento de cualquiera de los mismos .

Como se utiliza aquí, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que se pueden aislar de ADN cromosómico, que incluyen un marco de lectura abierto que codifica una proteína, por ejemplo una proteasa específica de prolina de Penicillium chrysogenum de acuerdo con la presente invención.

Un gen puede incluir las secuencias de codificación, las secuencias no codificantes, intrones y/o secuencias reguladoras. Más aun, el término "gen" se puede referir a una molécula de ácido nucleico aislada como se define aquí.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, tal como una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 1 ó la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2 o un equivalente funcional del mismo, se puede aislar utilizando técnicas de biología molecular estándar y la información de la secuencia proporcionada aquí. Por ejemplo, utilizando todo o parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 ó 2 como una sonda de hibridación, se pueden aislar moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención utilizando técnicas de clonación e hibridación estándar (por ejemplo, como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Más aun, una molécula de ácido nucleico abarca todo o una parte de SEQ ID NO: 1 ó 2 se puede aislar por la reacción de cadena polimerasa (PCR) utilizando cebadores de oligonucleótido sintéticos diseñados con base en la información de secuencia contenida en SEQ ID NO: 1 ó 2.

Un ácido nucleico de la invención se puede amplificar utilizando cADN, mARN o alternativamente, ADN genómico, como una plantilla y cebadores de oligonucleótido apropiados de acuerdo con técnicas de amplificación PCR estándar. El ácido nucleico así amplificado se puede clonar en un vector apropiado y caracterizar por un análisis de secuencia de ADN. Se describe aquí el aislamiento y clonación del fragmento de la SEQ ID NO: 1. El fragmento se amplifica por PCR utilizando los cebadores de oligonucleótido establecidos en la SEQ ID NOs: 4 y 5.

Adicionalmente , los oligonucleótidos que corresponden a 0 pueden hibridar una secuencia de nucleotidos de acuerdo con la invención se pueden preparar mediante técnicas sintéticas , estándar, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN automatizado .

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleotidos que es la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 1 ó la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2. La secuencia de SEQ ID NO: 2 corresponde a la región codificante de la proteasa específica de prolina Penicillium chrysogenum de cADN. Este cADN comprende secuencias que codifican el péptido de proteasa específica de prolina de Penicillim chrysogenum de acuerdo con SEQ ID NO: 3.

En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es el complemento inverso de la secuencia de nucleotidos mostrado en SEQ ID NO: 1 ó 2 o una variante, tal como un equivalente funcional, de tal una secuencia de nucleótido .

Una molécula de ácido nucleico que es complementaria con otra secuencia de- nucleotidos es una que es suficientemente complementaria con la otra secuencia de nucleotidos tal que se puede hibridar con la otra secuencia de nucleotidos que forma por lo tanto un dúplex estable.

Un aspecto de la invención se relaciona con moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido de la invención o una variante, tal como un equivalente funcional del mismo, por ejemplo un fragmento o dominio biológicamente activo, así como también moléculas de ácido nucleico suficientes para uso como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de la invención y fragmentos de tales moléculas de ácido nucleico adecuadas para uso como cebadores PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico.

Un ejemplo de un fragmento o dominio biológicamente activo es un fragmento o dominio que es capaz de por lo menos dividir un grupo detectable de un sustrato (sintético) cuyo sustrato (sintético) comprende una "prolina acoplada a medios para detección" en el terminal carboxilo del sustrato (sintético) y en donde dicho medio para detección se acopla al lado carboxilo de la prolina por vía de un enlace químico que se puede dividir mediante una proteasa. La parte experimental proporciona ejemplos de sustratos adecuados (sintético) . Un ejemplo de un medio .para detección es un grupo cromogénico o fluorogénico .

Un polinucleótido de acuerdo con la invención se puede "aislar" . En el contexto de esta invención, un "polinucleótido aislado" o "ácido nucleico aislado" es un ADN o ARN que no es inmediatamente contiguo con la secuencia de codificación con la cual es inmediatamente contigua (uno en el extremo 5' y uno en el extremo 3') en el genoma de ocurrencia natural del organismo del cual este se deriva. Así, en una realización, un ácido nucleico aislado incluye algunas o todas las secuencias 5' no codificantes (por ejemplo, promotor) que son inmediatamente contiguas a la secuencia de codificación. El término por lo tanto incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus de replicación autónomamente, o en el ADN genómico de una procariota o eucariota, o que existe como¦ una molécula separada (por ejemplo, un cADN o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o tratamiento de endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias. Esto también incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica un polipéptido adicional que es sustancialmente libre del material celular, material vírico, o medio de cultivo (cuando se produce por técnicas de ADN recombinante) , o precursores químicos u otros químicos (cuando se sintetiza químicamente) . Más aún, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un fragmento de ácido nucleico que no es de ocurrencia natural como un fragmento y no se podría encontrar en el estado natural.

Como se utiliza aquí, los términos "polinucleótido" o "molécula de ácido nucleico" pretenden incluir moléculas de ADN (por ejemplo, cADN o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, mARN) y análogos del ADN o ARN generados utilizando análogos de nucleótido. Es decir, un polinucleótido de la invención puede comprender ADN y/o ARN. Un polinucleótido de acuerdo con la invención puede así ser una secuencia de ADN o una secuencia de ARN. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero de manera preferible es ADN bicatenario. El ácido nucleico se puede sintetizar utilizando nucleótidos sintéticos o modificados que incluyen los ácidos nucleicos de péptido, análogos de oligonucleótido o derivados (por ejemplo, inosina, nucleótidos de metilfosfonato o fosforotioato y adición de cadenas acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula). Se pueden utilizar tales nucleótidos y oligonucleótidos , por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que tienen capacidades de pares base alterados o resistencia incrementada a las nucleasas. Para los propósitos de la presente invención, se entiende que los poli-nucleótidos descritos aquí se pueden modificar por cualquier método disponible en la técnica.

Otra realización de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que es anticodificante para la molécula de ácido nucleico ZFX, por ejemplo, la cepa codificante de una molécula de ácido nucleico ZFX. También se incluyen dentro del alcance de la invención las hebras complementarias de las moléculas de ácido nucleico descritas aquí .

La información de secuencia como se proporciona aquí no se debe constituir estrechamente para requerir la inclusión de las bases erróneamente identificadas. Las secuencias específicas descritas aquí se pueden utilizar fácilmente para aislar el gen completo de un hongo filamentoso, en particular de Penicillium chrysogenum que a su vez se puede someter fácilmente a análisis de secuencia adicional identificando por lo tanto errores de secuenciación.

A menos que se indique otra cosa, todas las secuencias de nucleótidos determinadas por secuenciación de una molécula de ADN aquí se determinan utilizando un secuenciador de ADN automatizado y todas las secuencias de · aminoácidos de polipéptidos codificados por moléculas de ADN determinados aquí se predicen mediante traducción de una secuencia de ADN determinada como se hizo anteriormente. Por lo tanto, como se conoce en la técnica para cualquier secuencia de ADN determinada por este método automatizado, cualquier secuencia de nucleótidos determinada aquí puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas por automatización son típicamente por lo menos aproximadamente 90% idénticas, más típicamente por lo menos aproximadamente 95% o por lo menos aproximadamente 99.9% idénticas a la secuencia actual de nucleótido de la molécula de ADN secuenciada.

La secuencia actual se puede determinar más precisamente mediante otros métodos que incluyen métodos de secuenciación de ADN manuales bien conocidos en la técnica. Como también se conoce en la técnica, una única inserción o eliminación en una secuencia de nucleótidos determinada comparado con la secuencia actual originará un cambio de marco en traducción de la secuencia de nucleótidos tal que la secuencia de aminoácidos predicha codificada por una secuencia de nucleótidos determinada será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos actualmente codificada por la molécula de ADN secuenciada, comenzando en el punto de tal una inserción o eliminación.

La persona experta en la técnica es capaz de identificar tales bases identificadas erróneamente y conocidas como correctas para tales errores.

Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede comprender solo una porción o un fragmento de la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 1, por ejemplo un fragmento que se puede utilizar como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una porción de una 2 O proteína ZFX.

La secuencia de nucleótidos determinada por la clonación del gen ZFX y cADN permite la generación de sondas o cebadores diseñados para uso en la identificación y/o clonación de otros miembros de la familia ZFX, así como también los homólogos ZFX de otras especies.

La sonda/cebador comprende típicamente un oligonucleótido sustancialmente purificado que comprende típicamente una región de secuencia de nucleótidos que híbrida, por ejemplo bajo condiciones altamente severas, por lo menos aproximadamente 12 a 15, de manera preferible aproximadamente 18 a 20, de manera preferible aproximadamente 22 a 25, más de manera preferible aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, o 75 o más nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:l ó 2 (o de un equivalente funcional del mismo o del complemento inverso de cualquiera de los mismos.

Las sondas basadas en las secuencia de nucleótidos ZFX se pueden utilizar para detectar transcriptos o secuencias de ZFX genómicas que codifican las mismas o proteínas homologas por ejemplo en otros organismos. En realizaciones preferidas, la sonda comprende adicionalmente un grupo marcado adherido a éste, por ejemplo, el grupo marcado puede ser radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor de enzima. Tales sondas también se pueden utilizar como parte de un paquete de prueba de diagnóstico para identificar células que expresan una proteína ZFX.

Los términos "homología", "identidad de secuencia" y similares se utilizan intercambiablemente aquí. Para el propósito de esta invención, se define aquí que con el fin de determinar el grado de identidad de secuencia compartida por dos secuencias de aminoácidos o mediante dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptimos (por ejemplo, se pueden introducir espacios en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o ácido nucleico para alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos) . Tal alineación se puede llevar a cabo sobre longitudes completas de las secuencias que van a ser comparadas. Alternativamente, la alineación se puede llevar a cabo sobre una longitud más corta, por ejemplo basados sobre aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100 ó más ácidos nucleicos/aminoácidos.

Luego se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácido correspondientes amino o las posiciones de nucleótido. Cuando se ocupa una posición en la primera secuencia por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido como la posición correspondiente en la segunda secuencia, luego las moléculas son idénticas en esta posición. El grado de identidad compartido que está entre las secuencias se expresa típicamente en término de identidad de porcentaje entre las dos secuencias y es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (es decir posiciones sobrepuestas) x 100) . Las dos secuencias se pueden comparar sobre sus longitudes completas.

La persona experta será consiente del hecho de que varios programas de ordenador diferentes están disponibles para determinar la homología entre dos secuencias. Por ejemplo, una comparación de secuencias y determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede llevar a cabo utilizando un logaritmo matemático.

El porcentaje de identidad de dos aminoácidos o la secuencia de nucleótidos se puede determinar utilizando, por ejemplo, el algoritmo de E. Meyers y W. iller (CABIOS, 4:11-17 (1989) qué se ha incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) (disponible en el ALIGN Query utilizando los datos de secuencia del servidor de Genestream IGH Montpellier France http : //vega. igh . cnrs . fr/bin/align-guess . cgi) utilizando una tabla de residuo de peso PAM120, una penalidad de longitud de espacio de 12 y una penalidad de espacio de 4.

Las secuencias de proteína y ácido nucleico de la presente invención se pueden utilizar adicionalmente como una "consulta de secuencia" para desarrollar una investigación contra bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales búsqueda se pueden desarrollar utilizando los programas BLASTN, BLASTP y BLASTX (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de nucleótido BLAST en la base de datos de nucleótido se pueden desarrollar con el programa BLASTN para obtener secuencias de nucleótidos homologas a las moléculas de ácido nucleico ZFX de la invención. Las búsquedas BLAST con una secuencia de nucleótidos traducida en la base de datos de proteína se pueden desarrollar con el programa BLASTX para obtener secuencias de aminoácidos homologas al gen ZFX traducido de la invención. Alternativamente, para comparación de secuencias de proteína con la base de datos de proteínas el programa BLASP se puede utilizar con la matriz Blosum 62, un umbral esperado = 10, longitud de palabra = 3, costos de existencia de espacio de 11 y costos de extensión de espacio de 1. Cuando se utilizan los programas BLAST, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX, BLASTP y BLASTN) . Ver la página web del Centro Nacional para Información Biotecnológica en htt : //www . ncbi . nlm . nih . gov/ para toda la información relevante en búsquedas de homología en bases de datos públicas.

Se puede utilizar los algoritmos BLASTP y BLASTN .para calcular la identidad de secuencias o alinear secuencias (tal como secuencias de identificación equivalentes o correspondientes, por ejemplo en sus configuraciones por defecto) .

El software para desarrollar los análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra identificar primero el par de secuencia de alta clasificación (HSP) al identificar palabras cortas de longitud en la secuencia de consulta que coinciden o satisfacen alguna clasificación de umbral valiosa positiva T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere al umbral de clasificación de palabra vecina. Estas coincidencias de palabra vecina inicial actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP que los contienen. La palabra coincidencia se extiende en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia por lo que se puede incrementar la clasificación de alineación acumulada. Las extensiones para la palabra coincidencia en cada dirección se detienen cuando: la clasificación de alineación acumulada cae por la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la clasificación acumulada va de cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineaciones de residuos de clasificación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros de algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN de la comparación de ADN-ADN utiliza como defecto una longitud de palabra (W) de 11, expectativa (E) de 10, y una comparación de ambas hebras. Él programa BLASTP para la comparación proteína-proteína utiliza como defecto una longitud de palabra (W) de 3 , la matriz de clasificación BLOSU 62, una penalidad de existencia de espacio de 11 con una penalidad de extensión de espacio de 1, y una expectativa (E) de 10.

, El algoritmo BLAST desempeña un análisis estadístico de similitud entre dos secuencias. Una medición de similitud dada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una coincidencia entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos pudiera ocurrir por oportunidad. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más pequeña en comparación de la primera secuencia a la segunda secuencia es menor de aproximadamente 1, de manera preferible menor de aproximadamente 0.1, más de manera preferible menor de aproximadamente 0.01, y lo más de manera preferible menor de aproximadamente 0.001.

También, un motivo de péptido se puede utilizar para identificar genes que codifican proteínas que contienen este motivo péptido. En lugar de un motivo de péptido, también una combinación de dos o más motivos de péptido se puede utilizar para identificar genes que codifican proteínas que contienen los motivos de péptido. Cuando se identifica uno o varios motivos de péptido que codifican para las proteasas específicas de prolina es así posible identificar genes que codifican las proteasas específicas de prolina que utilizan uno o una combinación de varios de estos motivos de péptido. • Las proteasas específicas de prolina se utilizan como un ejemplo de cómo tales genes se pueden identificar, pero los métodos descritos son aplicables generalmente. Se puede utilizar un motivo de péptido para una investigación de las secuencias de ADN traducidas de un banco de datos de ADN o secuencias de proteína de un banco de datos de secuencia de proteína utilizando un programa similar a Patscan (http://www-unix.mcs.anl.gov/compbio/PatScan/HTML/) . La secuencia de aminoácidos ha sido ingresada en un formato especial que se describe en el sitio web. Otro método que se puede desarrollar es utilizar la secuencia del motivo para una investigación de las secuencias de ADN traducidas de un banco de datos ADN o secuencias de proteína de un banco de datos de secuencias de proteína utilizando un programa similar http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/. Para este programa el motivo se ingresa en el campo de investigación en el así llamado formato Prosite, y las bases de datos se investigan para la presencia del motivo en la secuencia de proteína o en la secuencia de ADN traducida. Este método se puede utilizar para identificar genes fúngicos que codifican las proteasas específicas de prolina útiles. Los genes que se identifican utilizando uno de estos métodos que se pueden traducir en una secuencia de proteína utilizando programas conocidos por aquellos expertos en la técnica, y se inspecciona para la presencia de una secuencia de señal en su terminal amino. Para detectar una secuencia de señal uno puede utilizar un programa similar a SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). La búsqueda para una secuencia de proteína que contiene las secuencias de consenso y una secuencia de señal predicha da una ventaja mayor para la producción industrial de tal una enzima.

Otra posibilidad para identificar genes de proteasa específica de prolina utilizando los motivos de péptido para diseñar los cebadores oligonucleótido con base en la retroconversión de la secuencia de aminoácidos en el motivo en una secuencia de nucleótidos con codón preferido utilizado del organismo en el que se desea identificar un gen proteasa específico de prolina, y utilizar este oligonucleótido para hibridación a una genoteca, o en un cebador PCR en un grupo mARN de transcripción inversa. Utilizando un motivo de secuencia de péptido, también es posible aislar genes que codifican la proteasa específica de prolina cuando se desconoce la secuencia del gen. Los métodos se han descrito en la literatura para diseñar cebadores de oligonucleótido degenerados que se pueden utilizar para este propósito (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press) . También, se han descrito métodos para aislar genes de un organismo, utilizando un oligonucleótido degenerado como sonda o cebador.

Los oligonucleótidos que codifican el motivo péptido son útiles para aislamiento de los genes que codifican las propiedades de proteasa específica de prolina. La degeneración de tal un grupo de oligonucleótidos se puede reducir por la introducción de bases inosina (I) en posiciones en donde el nucleótido no se conoce. Adicionalmente , las posiciones en donde las bases citosina (C) y timidina (T) ' son posible se puede reemplazar por uracilo (U) , y en posiciones en donde la adenina (A) y guanina (G) son posibles solo la guanina se puede introducir, con el fin de reducir la degeneración con solo un pequeño efecto en la especificidad del cebador de oligonucleotido. Adicionalmente , para detección de la presencia de proteasas específicas de prolina que codifican genes en organismos de los cuales se conoce el codón preferido, la degeneración del oligonucleotido se puede reducir adicionalmente al tener en cuenta el codón de preferencia en el diseño del oligonucleotido. Una persona experta en la técnica conocerá cómo se hace esto. Adicionalmente, todas las posibles combinaciones de cebadores oligonucleotido, sin degeneración, se pueden sintetizar separadamente y utilizar en experimentos de detección individuales.

Primero, una genoteca de cADN o EST se construye de las especies de interés en un vector universal. Los métodos adecuados para la construcción de genotecas se describen en la literatura (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Segundo, un oligonucleotido degenerado descrito anteriormente se utiliza en una reacción de PCR junto con un oligonucleotido universal que ceba en el vector, en el límite del inserto de ADN recombinante, en ADN aislado de la genoteca. Se han descrito estrategias útiles en la literatura para el aislamiento de un gen deseado cuando solo está disponible un cebador de oligonucleótido degenerado único (por ejemplo Miñambres et al. (2000) Biochem. Biophys . Res. Commun. 272, 477-479; PCR technology (1989) Ed. H.A. Erlich pp. 99-104, Stockton Press). Tercero, el fragmento amplificado PCR luego se marca y se utiliza como sonda para la detección de la genoteca· mediante medios convencionales. El gen de longitud completa se puede sub-clonar en un vector de expresión adecuado para sobreexpresión de la proteasa específica de prolina en ün organismo anfitrión de producción deseado.

En un método diferente, cuando no está disponible la genoteca de las especies que se detectan para la presencia de un gen que codifica una proteasa específica de prolina, parte del gen se puede amplificar por PCR con diferentes cebadores degenerados, o con 3' -RACE utilizando un cebador degenerado único. Para esto, el ARN se aisla de las especies de interés y se utiliza en una reacción 3 '-RACE utilizando un cebador degenerado único como cebador específico de gen. La amplificación de parte de un cADN desconocido utilizando un oligonucleótido degenerado y un cebador universal, mediante 3' -RACE, se ha descrito previamente (W099/38956) .

El método tradicional para aislar un gen de longitud completa utilizando la información de sólo un péptido pequeño es la hibridación de un oligonucleótido degenerado marcado para filtrar en el que se replica una genoteca. Métodos que describen la detección de las genotecas de gen utilizando oligonucleótidos degenerados, y métodos para calcular o determinar las condiciones de hibridación óptimas de estos oligonucleótidos, se han descrito extensamente en la literatura (Sambrook et al. (1989)). Los oligonucleótidos descritos anteriormente se pueden utilizar por este método para aislar genes que codifican una proteasa específica de prolina de especies diferentes.

En una variación para este método, se puede construir primero una genoteca parcial. Para esto, se fracciona ADN, después de lo cual los fragmentos de ADN que contienen el gen que codifica una proteasa específica de prolina se detectan por hibridación para los oligonucleótidos marcados descritos anteriormente. Estos fragmentos se aislan y se utilizan en la construcción de una genoteca parcial enriquecida en el gen que codifica una proteasa específica de prolina. Esta genoteca se puede detectar por medios convencionales. Para este método, el ADN genómico se digiere primero con restricción de las enzimas antes de fraccionamiento mediante electroforesis de gel, mientras que el cADN se puede fraccionar directamente.

Un método diferente para aislar el gen que codifica una proteasa específica de prolina es al utilizar anticuerpos elevados contra cualquiera de los péptidos de la secuencia de consenso. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales . Los métodos describen la producción de anticuerpos específicos para los péptidos pequeños se han descrito extensivamente en la literatura (Harlow, E y Lañe, D (1988) Antibodies; a laboratory manual, ISBN 0-87969-314. -2) . : Las genotecas de expresión se pueden construir a partir de las especies de interés, mediante clonación de cADN o ADN genómico en un vector adecuado para expresar el inserto en un anfitrión conveniente, tal como E. coli o una levadura. Los vectores de expresión se pueden o no basar en fago lambda. La inmunodetección de los antígenos se produce por genotecas de expresión, y se han publicado métodos que describen la purificación de clones específicos que expresan el antígeno. Utilizando un anticuerpo específico para cualquiera de los péptidos del motivo consenso, es posible aislar el gen que codifica una proteasa específica de prolina que abarca este motivo, utilizando este método.

En efecto, muchos métodos diferentes se pueden utilizar para aislar un gen que codifica una proteasa específica de prolina cuando la información descrita en esta invención se tiene en cuenta. La ventaja de utilizar la información de la secuencia de motivo de péptido sobre los métodos de la técnica anterior, es la velocidad y facilidad relativa con la que se puede identificar un nuevo gen que codifica una proteasa específica de prolina activa. El uso de la información de secuencia da una indicación del valor de una nueva proteasa específica de prolina en aplicaciones en la industria de alimentos, sin desarrollar pruebas laboriosas de todo lo posible en experimentos de aplicación directa.

Como se utiliza aquí, el término "hibridar selectivamente " y términos similares están destinados a describir condiciones para hibridación y lavado bajo secuencias de nucleótidos en por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, más de manera preferible por lo menos aproximadamente 85%, aún más de manera preferible por lo menos aproximadamente 90%, de manera preferible por lo menos 95%, más de manera preferible por lo menos aproximadamente 98% o más de manera preferible por lo menos aproximadamente 99% homólogo a cada uno permanece típicamente hibridado uno al otro. Se dice que tales secuencias de hibridación pueden compartir por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, más de manera preferible por lo menos aproximadamente 85%, aún más de manera preferible por lo menos aproximadamente 90%, más de manera preferible por lo menos 95%, más de manera preferible por lo menos 98% o más de manera preferible por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia.

¦ Asi, una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar selectivamente el complemento inverso de la secuencia de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 se incluye en la invención y tendrá generalmente por lo menos 50% o 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de identidad de secuencia a la secuencia de codificación de SEQ ID NO:l y/o SEQ ID NO: 2 sobre una región de por lo menos 60, de manera preferible por lo menos 100, más de manera preferible por lo menos 200 nucleótidos contiguos o más de manera preferible sobre la longitud completa de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2.

De esta forma, un nucleótido que codifica una proteasa específica de prolina activa y que es capaz de hibridar selectivamente a un fragmento de un complemento de la secuencia que codifica ADN de la SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2, también es abarcado por la invención. Cualquier combinación de los grados de identidad y tamaños mínimos mencionados anteriormente se puede utilizar para definir poli-nucleótidos de la invención, prefiriéndose condiciones más severas (es decir mayor identidad sobre mayor longitud) .

Así, por ejemplo, un polinucleótido que tiene por lo menos 80% o 90% de identidad sobre 60, de manera preferible sobre 100 nucleótidos, forma un aspecto de la invención, como lo hace un polinucleótido que tiene por lo menos 90% de identidad sobre 200 nucleótidos.

Un ejemplo no limitante preferido de tales condiciones de hibridación es la hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45 °C, seguido por uno o más lavados en 1 X SSC, 0.1 % SDS a 50 °C, de manera preferible a 55°C, de manera preferible a 60°C y aún más de manera preferible a 65 °C.

Condiciones altamente severas incluyen, por ejemplo, hibridación a 68 °C en solución 5x SSC/5x de Denhardt/1.0% de SDS y lavado en SSC/0.1% SDS 0.2x a temperatura ambiente. Alternativamente, se desarrolla lavado a 42°C.

El experto sabrá qué condiciones aplicar para las condiciones de hibridación severas y altamente severas. La guía adicional con respecto a tales condiciones está fácilmente disponible en la técnica, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N. Y. ) .

Por supuesto, reside un polinucleótido que híbrida solo a una secuencia poli A (tal como tracto del terminal 3' poli (A) de mAR ) , o para una extensión complementaria de T (o U) , no se incluiría en un polinucleotido de la invención utilizado para hibridar específicamente a una porción de un ácido nucleico de la invención, Ya que tal un polinucleotido hibridaría a cualquier molécula de ácido nucleico que contiene una extensión poli (A) o el complemento del mismo (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de cADN bicatenario) .

En un método típico, las genotecas de cADN construidas de otros organismos, por ejemplo un hongo filamentoso, en particular de la familia de micro-organismos Trichomaceae , por ejemplo se puede detectar a partir del género Aspergillus o Penicillium.

Por ejemplo, cepas Penicillium se pueden detectar para polinucleótidos ZFX homólogos mediante análisis Northern blot . Luego de detección de transcriptos homólogos a polinucleótidos de acuerdo con la invención, las genotecas de cADN se pueden construir de ARN aislado de la cepa apropiada, utilizando técnicas estándar bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Alternativamente, una genoteca de ADN total se puede detectar utilizando una sonda capaz de hibridar a un polinucleotido ZFX de acuerdo con la invención.

Las secuencias de gen homologas se pueden aislar, por ejemplo, al desarrollar PCR utilizando dos grupos de cebador de oligonucleótido degenerados diseñados sobre la base de las secuencias de nucleótidos como se enseña aquí.

La plantilla para la reacción puede ser cADN obtenido por transcripción inversa de mARN preparado de las cepas conocidas o que sospechan de expresar un polinucleótido de acuerdo con la invención. El producto PCR se puede subclonar y secuenciar para asegurar que las secuencias amplificadas representan las secuencias de una nueva secuencia de ácido nucleico ZFX, o un equivalente funcional del mismo.

El fragmento PCR luego se puede utilizar para aislar un clon de cADN longitud completa mediante una variedad de métodos conocidos. Por ejemplo, el fragmento amplificado se puede marcar y utilizar para detectar un bacteriófago o genoteca de cADN cósmida. Alternativamente, el fragmento marcado se puede utilizar para detectar una genoteca.

La tecnología PCR también se puede utilizar para aislar las secuencias de cADN de longitud completa de otros organismos. Por ejemplo, el ARN se puede aislar, siguiendo procedimientos estándar, de una fuente celular o de tejido apropiado. Una reacción de transcripción inversa se puede desarrollar en el ARN utilizando un cebador de oligonucleótido específico para la mayor parte del extremo 5' del fragmento amplificado para el cebador de la primera síntesis de hebra. - El híbrido ARN/ADN resultante luego se puede "alargar" (por ejemplo, con guaninas) utilizando una reacción de transferasa de terminal estándar, el híbrido se puede digerir con R asa H, y la segunda síntesis de hebra se puede cebar luego (por ejemplo, con un cebador poli-C) . Así, la secuencia en la dirección 5' de cADN del fragmento amplificado se puede aislar fácilmente. Para una revisión de estrategias de clonación adecuadas, ver por ejemplo, Sambrook et al., supra; y Ausubel et al., supra.

Otro aspecto de la invención pertenece a vectores, que incluyen vectores de clonación y expresión, que comprenden un polinucleótido de la invención que codifica una proteína ZFX o un equivalente funcional del mismo y métodos de crecimiento, transformación o transíectación de tales vectores en una célula anfitriona adecuada, por ejemplo bajo condiciones en las que ocurre la expresión de un polipéptido de la invención. Como se utiliza aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual este se ha ligado.

Los polinucleótidos de la invención se pueden incorporar en un vector de replicación recombinante , por ejemplo un vector' de clonación o expresión. El vector se puede utilizar para replicar el ácido nucleico en una célula anfitriona compatible. Así en una realización adicional, la invención proporciona un método para elaborar polinucleótidos de la invención al introducir un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introducir el vector en una célula anfitriona compatible, y hacer crecer la célula anfitriona bajo condiciones que producen replicación del vector. El vector se puede recuperar de la célula anfitriona. Las células anfitrionas adecuadas se describen adelante.

El vector en el cual el cásete de expresión o polinucleótido de la invención se inserta puede ser cualquier vector que se puede someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante , y la elección del vector dependerá frecuentemente de la célula anfitriona en la cual este se introduce .

Un vector de acuerdo con la invención puede ser un vector de replicación autónomo, es decir un vector que existe como una entidad extra-cromosómica, la replicación de la que es independiente de replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula anfitriona, se integra en el genoma de célula anfitriona y se replica junto con los cromosomas a los cuales éste se ha integrado.

Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular dentro de los cuales se 4 O pueden alinear los segmentos adicionales de ADN. Otro tipo del vector es un vector vírico, en donde los segmentos adicionales de ADN se pueden ligar en el genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula anfitriona en la que ellos se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores mamíferos episómicos) . Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episómicos) se integran dentro del genoma de una célula anfitriona luego de la introducción en la célula anfitriona, y por lo tanto se replican junto con el genoma anfitrión. Más aún, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales ellos se ligan operablemente. Tales vectores se refieren aquí como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están frecuentemente en la forma de plásmidos. Los términos "plásmido" y "vector" se pueden utilizar intercambiablemente aquí ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como cósmido, vectores víricos (por ejemplo, retrovirus de replicación "defectuosa, adenovirus y virus asociados adeno) y vectores fago que sirven como funciones equivalentes .

Los vectores de acuerdo con la invención se pueden utilizar in vitro, por ejemplo para la producción de AR o utilizar para transfectar o transformar una célula anfitriona.

Un vector de la invención puede comprender dos o más, por ejemplo tres, cuatro o cinco, polinucleótidos de la invención, por ejemplo para sobreexpresión .

Los vectores de expresión recombinante de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula anfitriona, que significa que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células arifitrionas a ser utilizadas para expresión, que se ligan operablemente a la secuencia de ácido nucleico a ser expresada.

Dentro de un vector de expresión recombinante, "ligado operablemente" pretende significar que la secuencia de nucleótidos de interés se liga a las secuencias reguladoras en una forma que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema in vitro de transcripción/traducción o en una célula anfitriona cuando el vector se introduce dentro de la célula anfitriona) , es decir el término "ligado operablemente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su forma propuesta. Una secuencia reguladora tal como un promotor, mejorador u otra señal de la regulación de expresión "ligado operablemente" a una secuencia de codificación se posiciona en tal una forma que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo la condición compatible con las secuencias de control o la secuencias que están dispuestas de tal manera que ellas funcionan de acuerdo con su propósito pretendido, por ejemplo la transcripción se inicia en un promotor y procede a través de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido.

La invención así proporciona un vector, que puede ser un vector de expresión, por ejemplo en donde la secuencia de polinucleótido se liga operablemente con una secuencia reguladora, que permite la expresión de la secuencia de polinucleótido en una célula, por ejemplo la célula de un hongo filamentoso.

El término "secuencia reguladora" está destinada a incluir promotores, mej oradores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señal de poliadenilación) . Se describen tales secuencias reguladoras, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

El término secuencias reguladoras incluye aquellas secuencias que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células anfitrionas y aquellos que dirigen la -expresión de la secuencia de nucleótidos solo en cierta célula anfitriona (por ejemplo secuencias reguladoras específicas de tejido) .

Un vector o construcción de- expresión de una célula anfitriona dada puede comprender así los siguientes elementos ligados- operablemente uno al otro en un orden consecutivo del extremo 5' al extremo 3' relacionado con la hebra codificante de la secuencia que codifica el polipéptido de la primera invención: (1) una secuencia promotora capaz de dirigir la transcripción de la' secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en la, célula anfitriona dada; (2) opcionalmente , una secuencia de señal capaz de dirigir la ¦ secreción del polipéptido de la célula anfitriona dada en un medio de cultivo; (3) una secuencia- de ADN de la invención que codifica una forma madura y de manera preferible activa de un polipéptido que tiene actividad proteasa específica de prolina; y 'de manera preferible también (4) una región de terminación de transcripción (terminador) capaz de terminar la transcripción en la dirección 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. La dirección 3' de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención puede ser una región 3 ' no traducida que contiene uno o más sitios de terminación de transcripción (por ejemplo un terminador) .

El origen del terminador es menos crítico. El terminador puede, por ejemplo, ser nativo a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Sin embargo, de manera preferible se utiliza un terminador de levadura en células anfitrionas de levadura y en terminador fúngico filamentoso se utiliza en células anfitrionas fúngicas filamentosas. Más de manera preferible, el terminador es endógeno a la célula anfitriona (en la que la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido va a ser expresada) . En la región transcrita, puede estar presente un sitio de unión a ribosoma para traducción. La porción codificante de los trascriptos maduros expresados por las construcciones incluirán una traducción que inicia AUG en el codón de inicio o terminación que se posiciona apropiadamente en el extremo del polipéptido a ser traducido.

La expresión mejorada del polinucleótido de la invención también se puede alcanzar mediante la selección de las regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo promotor, líder de secreción y/o regiones terminadoras , que pueden servir para incrementar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción de la proteína de interés del anfitrión de expresión y/o para proporcionar el control inducible de la expresión de un polipéptido de la invención.

La invención así proporciona, inter alia, un vector, que puede ser un vector de expresión, por ejemplo en donde la secuencia de polinucleótido se liga operablemente con una secuencia reguladora, que permite la expresión de la secuencia de polinucleótido en una célula, por ejemplo la célula de un hongo filamentoso.

Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de tales factores como la elección de la célula anfitriona a ser transformada, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en las células anfitrionas que producen por lo tanto las proteínas o los péptidos, se codifican por ácidos nucleicos como se describe aquí (por ejemplo proteínas ZFX, formas mutantes de las proteínas ZFX, fragmentos, variantes o equivalentes funcionales del mismo, proteínas de fusión, etc . ) .

Los promotores/mej oradores y otras señales de regulación de la expresión se pueden seleccionar por ser compatibles con la célula anfitriona por el cual se diseña el vector de expresión. Por ejemplo se pueden utilizar promotores procarióticos , en particular aquellos adecuados para uso en las cepas E.coli. Cuando la expresión de los polipéptidos de la invención se lleva a cabo en células de mamífero se pueden utilizar promotores de mamífero. Los promotores específicos a tejidos, por ejemplo promotores específicos a célula hepatocito, también se pueden utilizar. Los promotores víricos también se pueden utilizar, por ejemplo la repetición de Terminal largo de virus de la leucemia de murino Moloney (MMLV LTR) , el promotor LTR del virus sarcoma de Rous (RSV) , el promotor SV40, el promotor IE de citomegalovirus humano (CMV) , promotores de virus de herpes simplex o promotores adenovirus.

Los promotores de levadura adecuados incluyen los promotores S. cerevisiae GAL4 y ADH y el promotor S. pombe nmtl y adh. Los promotores de mamífero incluyen el promotor metalotioneina que se puede inducir en respuesta a metales pesados tal como cadmio. También se pueden utilizar los promotores víricos tal cómo el promotor de antígeno T mayor SV40 o promotores adenovirus. Todos estos promotores están fácilmente disponibles en la técnica.

Se pueden utilizar los promotores de mamífero, tal como promotores ß-actina. Los promotores específicos a tejido, en particular promotores específicos de célula endotelial o neuronal (por ejemplo los promotores DDAHI y DDAHII) , se prefieren especialmente. También se pueden utilizar promotores víricos, por ejemplo la repetición de Terminal largo del virus de la leucemia de murino Moloney (MMLV LTR) , el promotor LTR del virus de sarcoma de Rous (RSV) , el promotor SV40, el .promotor IE de citomegalovirus humano (CMV) , adenovirus, promotores HSV (tal como los promotores HSV IE) , o promotores HPV, particularmente la región reguladora en la dirección 5' HPV (URR) . Los promotores víricos están fácilmente disponibles en la técnica.

Los vectores de expresión recombinante de la invención se pueden diseñar para la expresión de proteínas en células procarióticas o eucarióticas . Por ejemplo, las proteínas ZFX se pueden expresar en células bacterianas tal como E. coli, células de insectos (utilizando vectores de expresión baculovirus) células de levadura, células de hogos o células de mamífera. Las células anfitrionas adecuadas se discuten adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Alternativamente, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo utilizando las secuencias reguladoras de promotor T7 y polimerasa T7.

Para levadura y hongos más filamentosos, el vector o construcción de expresión se integra de manera preferible en el genoma de la célula anfitriona con el fin de obtener transformantes estables. Sin embargo, para ciertas levaduras y hongos también los vectores episómicos adecuados están disponibles en la construcción de expresión que se pueden incorporar para alto nivel de expresión y estabilidad, ejemplos de los mismos incluyen vectores derivados de los plásmidos 2µ, CEN y pKDl de Saccharomyces y Kluyveromyces, respectivamente, o vectores que contienen una secuencia AMA. (por ejemplo AMA1 de Aspergillus) . En el caso de las construcciones de expresión se integran en el genoma de células anfitrionas, las construcciones se integran en un lugar aleatorio en el genoma, o en lugar objetivo predeterminado utilizando recombinación homologa, en cuyo caso el lugar objetivo comprende de manera preferible un gen altamente expresado. Un gen altamente expresado es un gen cuyo mARN se puede hacer por lo menos 0.01% (p/p) "del mARN celular total, por ejemplo bajo condiciones inducidas, o alternativamente, un gen cuyo producto de gen se puede hacer por lo menos 0.2% (p/p) de la proteína celular total, o, en caso de un producto de gen secretado, se puede secretar en un nivel de por lo menos 0.05 g/1.

De acuerdo con lo anterior, los vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen vectores derivados de virus, episómicos y cromosómicos por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófago, episoma de levadura, elementos cromosómicos de levadura, virus tales como baculovirus, virus papova, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de seudorabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tal como aquellos derivados de plásmido y elementos genéticos de bacteriófago, tal como cósmidos y fagémidos .

El inserto de nucleotido se debería ligar operablemente a un promotor apropiado. A parte del promotor nativo para el gen que codifica el polipéptido de la invención, otros promotores se pueden utilizar para dirigir la expresión del polipéptido de la invención. El promotor se puede seleccionar por su eficiencia en dirigir la expresión del polipéptido de la invención en el anfitrión de expresión deseado. Ejemplos de promotores que pueden ser útiles en la invención incluyen el promotor de fago lambda PL, promotores lac, E. coli, trp y tac, los promotores SV40 tardíos y tempranos y promotores de LTR retrovíricos , por nombrar unos pocos. Otros promotores adecuados se conocerán por la persona experta. En una realización específica, se -prefieren promotores que sean capaces de dirigir un alto nivel de expresión de una proteasa específica de prolina en un hongo o levadura. Tales promotores se conocen en la técnica.

Una variedad de promotores se pueden utilizar que son capaces de dirigir transcripción en las células anfitrionas de la invención. De manera preferible la secuencia promotora se deriva de un gen altamente expresado. Ejemplos de genes altamente expresados preferidos de cuyos promotores se derivan de manera preferible y/o los que están comprendidos en el lugar objetivo predeterminado preferido para la integración de las construcciones de expresión, incluye pero no se limita a genes que codifican las enzimas glicolíticas tal como isomerasas triosa- fosfato (TPI) , deshidrogenasas gliceraldehído- fosfato (GAPDH) , quinasas fosfoglicerato (PGK) , quinasas piruvato (PYK o PKI) , deshidrogenasas de alcohol (ADH) , así como también genes que codifican amilasas, glucoamilasas , proteasas, xilanasas, celobiohidrolasas , ß-galactosidasas , alcohol (metanol) oxidasas, factores de elongación y proteínas ribosómicas . Ejemplos específicos del gen altamente expresado adecuado incluyen por ejemplo el gen LAC4 de Kluyveromyces sp., los genes de oxidasa metanol (AOX y MOX) de Hansenula y Pichia, respectivamente, los genes glucoamilasa (glaA) de' A. niger y A. awamori, el gen TAKA-amilasa A. oryzae, el gen gpdA A. nidulans y los genes celobiohidrolasa T. reesei.

Ejemplos de promotores inducibles o fuertemente constitutivos que se prefieren para uso en anfitriones de expresión fúngica son aquellos que se obtienen de los genes fúngicos para promotores xilanasa (xlnA) , fitasa, ATP-sintetasa, subunidad 9 (oliC) , isomerasa triosa fosfato (tpi) , alcohol deshidrogenasa (AdhA) , a-amilasa (amy) , amiloglucosidasa (AG del gen glaA) , acetamidasa (amdS) y deshidrogenada de gliceraldehído-3-fosfato (gpd) .

Ejemplos de promotores de levadura fuertes son aquellos que se obtienen de los genes para alcohol deshidrogenasa, lactasa, quinasa 3-fosfoglicerato e isomerasa triosefosfato .

Ejemplos de promotores bacterianos fuertes son los promotores a-amilasa y SPo2 así como también promotores de los genes proteasa extracelulares .

Promotores adecuados para células de planta incluyen promotores de sintasa nopalina (nos) , sintasas octopino (oes) , sintasa manopina (mas) , subunidad pequeña de ribulosa (rubisco ssu) , histona, actina de arroz, faseolina, virus mosaico de coliflor (CMV) 35S y 19S y circovirus.

Todos los promotores mencionados anteriormente están fácilmente disponibles en la técnica.

El vector puede incluir adicional secuencias que flanquean el polinucleótido que hacen surgir el ARN que comprende secuencias homologas a secuencias genómicas eucarióticás o secuencias genómicas víricas. Esto permitirá la introducción de los polinucleótidos de la invención dentro del genoma de una célula anfitriona. En particular, se puede utilizar un vector de plásmido que comprende el cásete de expresión flanqueado mediante secuencias fúngicas para preparar un vector adecuado para suministrar los polinucleótidos de la invención a una célula fúngica. Las técnicas de transformación utilizando estos vectores fúngicos se conocen por aquellos expertos en la técnica.

El vector puede contener un polinucleótido de la invención orientado en una dirección anticodificante para proporcionar para la producción de ARN anticodificante . El vector puede contener un polinucleótido de la invención orientado en una dirección anticodificante para proporcionar la producción de ARN anticodificante . Esto se puede utilizar para reducir, si es deseable, los niveles de expresión del polipéptido.

El ADN vector se puede introducir en células eücarióticas o procarióticas por vía de técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se utiliza aquí, los términos "transformación" y "transfección" están destinados a referirse a una variedad de técnicas reconocidas en el arte para introducir el ácido nucleico externo (por ejemplo, ADN) en una célula anfitriona, que incluye coprecipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, transducción, infección, lipofección, transfección mediada por lípido catiónico o electroporación. Métodos adecuados para transformar o transfectar células anfitrionas se pueden encontrar en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis et al., Basic ethods in Molecular Biology (1986) y otros manuales de laboratorio.

Para la transfección estable de las células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección utilizada, solo una fracción pequeña de células puede integrar el ADN externo en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a los antibióticos) se introduce generalmente en las células anfitrionas junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que confieren resistencia a los fármacos o que complementan un defecto en la célula anfitriona. Ellos incluyen por ejemplo genes de marcador versátiles que se pueden utilizar para la transformación de la mayoría de levaduras y hongos filamentosos tal como genes acetamidasa o cADN (los genes amdS, niaD, facA o cADN de A. nidulans, A. oryzae o A. niger) , o genes que proporcionan resistencia a los antibióticos como G418, higromicina, bleomicina, canamicina, metotrexato, fleomicina orbenomilo (benA) . Alternativamente, los marcadores de selección específicos ¦ se pueden utilizar tal como marcadores auxotróficos que requieren cepas de anfitrión mutantes correspondientes: por ejemplo URA3 (de S. cerevisiae o genes análogos de otras levaduras) , pyrG o pyrA (de A. nidulans o A. n'iger) , argB (de A. nidulans o A. niger) o trpC. En una realización preferida el marcador de selección se elimina de la célula anfitriona transformada después de la introducción de la construcción de la expresión para obtener las células anfitrionas transformadas capaces de producir el polipéptido que es libre de los genes de marcador de selección.

Otros marcadores incluyen sintetasa ATP, subunidad 9 (oliC) , orotidina-5 ' -fosfatodecarboxilasa (pvrA) , el gen de resistencia bacteriana G418 (esto también se puede utilizar en levadura, pero no en hongos, el gen de resistencia a la ampicilina (E. coli) , el gen de resistencia a la neomicina (Bacillus) y el gen uidA E. coli, que codifica ß-glucuronidasa (GUS) . Los vectores se pueden utilizar in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o utilizar para transfectar o transformar una célula anfitriona.

La expresión de las proteínas en procariotes se lleva a cabo frecuentemente en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de las proteínas de fusión y no fusión. Los vectores de fusión agregan un número de aminoácidos de una proteína codificada allí, por ejemplo al terminal amino de la proteína recombinante . Tales vectores de fusión típicamente sirven para tres propósitos: 1) para incrementar la expresión de la proteína recombinante; 2) para incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) para ayudar en la purificación de la proteína recombinante al actuar como un ligando en purificación de afinidad. Frecuentemente, en fusión de vectores de expresión, un sitio de división proteolítico se introduce en conjunto con el grupo funcional de fusión y la proteína recombinante permite la separación de la proteína recombinante del grupo funcional de fusión posterior a la purificación de la proteína de fusión.

Como se indica, los vectores de expresión contendrán de manera preferible marcadores seleccionables . Tales marcadores incluyen resistencia a dihidrofolato reductasa o neomicina para el cultivo celular eucariótico y resistencia a la tetraciclina o ampicilina para cultivar E. coli y otras bacterias. Ejemplos representativos del anfitrión adecuado incluyen células bacterianas, tal como E. coli, Streptomyces Salmonella typhimurium y ciertas especies Bacillus; células de hongos tal como especies Aspergillus, por ejemplo A. niger, A. oryzae y A. nidulans, tal como levadura tal como Kluyveromyces , por ejemplo K. lactis y/o Pichia, por ejemplo P. pastoris; células de insecto tal como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de animales tal como CHO, COS y melanoma Bowes; y células de plantas. Los medios de cultivo apropiados y condiciones para las células anfitrionas descritas anteriormente se conocen en la técnica.

Los vectores preferidos para uso en bacterias se describen por ejemplo en WO-Al-2004/074468, que se incorporan aquí como referencia. Otros vectores adecuados serán fácilmente evidentes para el experto.

Promotores conocidos bacterianos adecuados para uso en la presente invención incluyen los promotores descritos en WO-Al-2004/074468, que se incorporan aquí como referencia.

La transcripción del ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención mediante eucariotes mayores se puede incrementar al insertar una secuencia mejoradora dentro del vector. Los mej oradores son elementos de acción cis de ADN, usualmente aproximadamente de 10 a 300 bp que actúan para incrementar la actividad transcripcional de un promotor en un tipo de célula anfitriona dado. Ejemplos mej oradores incluyen el mej orador SV40, que se ubica en el lado tardío del origen de replicación a bp 100 a 270, el mej orador de promotor temprano citomegalovirus , el mej orador polioma en lado tardío del origen de replicación, y los mejoradores de adenovirus .

Para secreción de la proteína traducida dentro del lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el ambiente extracelular, se puede incorporar la señal de secreción apropiada en el polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas al polipéptido o ellas pueden ser señales heterólogas.

El polipéptido ZFX se puede expresar en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no solo señales de secreción sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Así, por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, se pueden agregar al terminal N del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula anfitriona, durante la purificación o durante la manipulación posterior almacenamiento. También, el grupo funcional péptido se puede agregar al polipéptido para facilitar la purificación.

La invención : proporciona un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NÓ: 3,· y una secuencia de aminoácidos obtenido para expresar el polinucleótido de SEQ ID. NO: 1 ó 2 en un anfitrión apropiado. También, un péptido o polipéptido que comprende un equivalente funcional de los polipéptidos anteriores se comprenden dentro de la presente invención. Los polipéptidos anteriores se comprenden colectivamente en el término "polipéptidos de acuerdo con la invención" .

Los términos "péptido" y "oligopéptido" se consideran sinónimos (como se reconoce comúnmente) y cada término se puede utilizar intercambiablemente como el contexto requerido para indicar una cadena de por lo menos dos aminoácidos acoplados por enlaces peptidilo. La palabra "polipéptido" se utiliza aquí para cadenas que contienen más de siete residuos de aminoácido. Todas las secuencias y fórmulas de polipéptido y oligopéptido aquí se escriben de izquierda a derecha y en la dirección de un terminal amino al terminal carboxilo. El código de aminoácidos de una letra utilizado aquí se conoce comúnmente en la técnica y se puede encontrar en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd,ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) La proteína o polipéptido "aislado" está destinado a un polipéptido o proteína removido de su ambiente nativo. Por ejemplo, polipéptidos producidos recombinantemente y proteínas expresadas en las células anfitrionas se consideran aisladas pará el propósito de la invención como lo son los polipéptidos nativos o recombinantes que se han purificado sustancialmente mediante cualquier técnica adecuada tal como, por ejemplo, el método de purificación de una única etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

La proteasa ZFX específica de prolina de acuerdo con la invención se puede recuperar y purificar de cultivos celulares recombinantes por métodos conocidos en la técnica.

Más de manera preferible, se emplea para purificación cromatografía líquida de alto desempeño ("HPLC" ).

Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados naturalmente, productos de procedimientos sintéticos químicos, y productos producidos por técnicas recombinantes de un anfitrión procariótico o eucariótico, que incluye, por ejemplo, bacterias, levaduras, plantas mayores, células de insectos y mamíferos. Dependiendo del anfitrión empleado en un procedimiento de producción recombinante , los polipéptidos de la presente invención se pueden glucosilar o no glucosilar. Adicionalmente , los polipéptidos de la invención también pueden incluir un residuo metionina modificado inicial, en algunos casos como un resultado de procesos mediados por anfitrión.

La invención también caracteriza fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos de acuerdo con la invención.

Los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de la invención incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos de la proteína ZFX (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3) , que incluyen menos aminoácidos que la proteína de longitud completa pero que exhibe por lo menos una actividad biológica de la proteína de longitud completa correspondiente. Típicamente, los fragmentos biológicamente activos comprenden un dominio o motivo con por lo menos una actividad de la proteína ZFX. Un fragmento biológicamente activo de una proteína de la invención puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud. Más aún, otras porciones biológicamente activas, en las cuales se eliminan otras regiones de la proteína, se pueden preparar mediante técnicas recombinantes y evaluar para una o más de las actividades biológicas de la forma nativa de un polipéptido de la invención .

La invención también caracteriza fragmentos de ácido nucleico que codifican los fragmentos biológicamente activos anteriores de la proteína ZFX.

La proteínas de la presente invención o equivalentes funcionales de los mismos, por ejemplo, porciones biológicamente activas de los mismos, se pueden ligar operablemente a un polipéptido no ZFX (por ejemplo, secuencias heterólogas de aminoácido) para formar proteínas de fusión. Un "polipéptido no ZFX " se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína que no es sustancialmente homologa a la proteína ZFX . Tal "polipéptido no ZFX" se puede derivar del mismo o un organismo diferente. Dentro de una Proteína de fusión ZFX el polipéptido ZFX puede corresponder a todo o un fragmento biológicamente activo de una proteína ZFX. En una realización preferida, una proteína de fusión ZFX comprende por lo menos dos porciones biológicamente activas de una proteína ZFX. Dentro de la proteína de fusión, el término "ligado operativamente" pretende indicar que el polipéptido ZFX y el polipéptido ZFX no se fusionan en marco uno al otro. El polipéptido no ZFX se puede fusionar al terminal N o terminal C del polipéptido ZFX.

Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión ZFX GST en los que las secuencias ZFX se fusionan al terminal C de las secuencias GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de ZFX recombinante . En otra realización, la proteína de fusión es una proteína ZFX que contiene una secuencia de señal heterologa en su terminal N. En ciertas células anfitrionas (por ejemplo, células anfitrionas de mamífero y levadura) , expresión y/o secreción de ZFX se puede incrementar a través del uso de una secuencia de señal heterologa.

En otro ejemplo, la secuencia secretora gp67 de la proteína de envoltura de baculovirus se puede utilizar como una secuencia de señal heterologa (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds . , John Wiley & Sons, 1992) . Otros ejemplos de secuencias de señal heterólogas eucarióticas incluyen las secuencias secretoras de melitin y fosfatasa alcalina de placenta humana (Stratagene; La Jolla, California) . En todavía otro ejemplo, las secuencias de señal heteróloga procariótica útiles incluyen la señal secretora phoA (Sambrook et al., supra) y señal secretora de proteína A (Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey) .

Una secuencia de señal se puede utilizar para facilitar la secreción y aislamiento de una proteína o polipéptido de la invención. Las secuencias de señal se caracterizan típicamente mediante un núcleo de aminoácidos hidrófobos, que se dividen generalmente de la proteína madura durante la secreción en uno o más eventos de división. Tales péptidos de señal contienen los sitios de procesamiento que permiten la división de la secuencia de señal de las proteínas maduras cuando ellas pasan a través de la ruta secretora. La secuencia de señal dirige la secreción de la proteína, tal como de un anfitrión eucariótico en el que se transforma el vector de expresión, y la secuencia de señal se divide posteriormente o concurrentemente. La proteína luego se purifica fácilmente del medio extracelular mediante métodos conocidos. Alternativamente, la secuencia de señal se puede ligar a la proteína de interés utilizando una secuencia, que facilita la purificación, tal como con un dominio GST. Así, por ejemplo, la secuencia que codifica el polipéptido se puede fusionar a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido, que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido hexa-histidina, tal como la etiqueta proporcionada en el vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente . Como se describe en Gentz et al, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, hexa-histidina proporciona la purificación conveniente de la proteína de fusión. La etiqueta HA es otro péptido útil para la purificación que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de influenza, que se ha descrito por Wilson et al., Cell 37:767 (1984), por ejemplo.

Las enzimas secretadas, similar a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, se sintetizan frecuentemente que incluye una secuencia de señal o preseñal y / o una prosecuencia. Estas secuencias se remueven frecuentemente de la proteína durante o después del proceso de secreción. Por lo tanto la proteína secretada madura frecuentemente no contiene más de estas pre- y pro-secuencias. Una versión procesada de la SEQ ID NO: 3 carece de pre- o pro-secuencias posibles como parte de la invención. Un sitio de procesamiento posible en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 se ubica en el terminal carboxilo de aminoácido 20. La enzima madura de acuerdo con la invención en este caso iniciará el número de aminoácido 21. Todas las otras modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 debido a qué se le permite procesamiento adicional mientras que ellos no interrumpan la actividad de la enzima.

De manera preferible, una proteína de fusión ZFX de la invención se produce por técnicas de ADN recombinante estándar. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican las secuencias de polipéptido diferentes se ligan en marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo al emplear terminales de extremo romo o escalonado para ligado, digestión de la enzima de restricción para proporcionar en terminal apropiado, llenado de extremos cohesivos como sea apropiado, tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar unión indeseable, y ligado enzimático. En otra realización, el gen de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación PCR de los fragmentos de gen se puede llevar a cabo utilizando cebadores de anclaje, que hacen surgir proyecciones complementarias entre dos fragmentos de gen consecutivos que se pueden hibridar posteriormente y reamplificar para generar una secuencia de gen quimérica (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds . Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Más aún, muchos vectores de expresión que están disponibles comercialmente codifican un grupo funcional de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST) . Un ácido nucleico que codifica a ZFX se puede clonar en tal un vector de expresión tal que el grupo funcional de fusión se liga en marco a la proteína ZFX.

Los términos "variantes" , "variantes funcionales" y "equivalentes funcionales" se utilizan intercambiablemente aquí. Las variantes/equivalentes funcionales de los polinucleótidos ZFX son fragmentos de ácido nucleico aislado que codifican un polipéptido que exhibe una función particular de la proteasa específica de prolina ZFX Penicillium chrysogenum como se define aquí. Un equivalente funcional de un polipéptido ZFX de acuerdo con la invención es un polipéptido que exhibe por lo menos una función de una proteasa específica de prolina Penicillium chrysogenum como se define aquí. Por lo tanto los equivalentes funcionales también abarcan fragmentos biológicamente activos .

Un polipéptido de la invención puede así comprender la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 3 o una secuencia sustancialmente homologa, o un fragmento de la secuencia que tiene actividad proteasa específica de prolina.

En general, se prefiere la secuencia de aminoácidos de ocurrencia natural mostrada en SEQ ID NO: 3.

El polipéptido de la invención también puede comprender una variante de ocurrencia natural o especies homologas del polipéptido de la SEQ ID NO: 3.

Una variante es un polipéptido que ocurre naturalmente en, por ejemplo, la variante de hongos, bacterias, levadura o células de plantas, que tiene actividad proteasa específica de prolina y una secuencia sustancialmente similar a la proteína de la SEQ ID NO: .3. El término "variantes" se refiere a polipéptidos que tienen el mismo carácter esencial o funcionalidad biológica básica como la proteasa específica de prolina de la SEQ ID NO: 3, e incluye variantes alélicas. De manera preferible, una variante polipéptido tiene por lo menos el mismo nivel de actividad proteasa específica de prolina como el polipéptido de la SEQ ID NO: 3. Las variantes incluyen variantes alélicas sea de la misma cepa como el polipéptido de la SEQ ID NO: 3 o de una cepa diferente del mismo género o especie.

De forma similar, un homólogo de especie de la proteína de la invención es una proteína equivalente de la secuencia similar que es una proteasa específica de prolina y ocurre naturalmente en otras especies.

Los homólogos de variantes y especies se pueden aislar utilizando los procedimientos descritos aquí y desarrollar tales procedimientos en una fuente celular adecuada, por ejemplo una célula de bacteria, levadura, hongo o célula de planta. También es posible utilizar una sonda de la invención para sondear genotecas de ADN hechas de levadura, bacterias, hongos, o células de plantas con el fin de obtener clones que expresan variantes o especies homologas del polipéptido de la SEQ ID NO: 3. Los métodos que se pueden utilizar para aislar variantes y especies homologas de un gen conocido se describen extensivamente en la literatura, y se conocen por aquellos expertos en la técnica. Estos genes se pueden manipular mediante técnicas convencionales para generar un polipéptido de la invención que después de esto se puede producir por técnicas conocidas per se recombinantes o sintéticas.

La proteína funcional o los equivalentes de polipéptido pueden contener solo sustituciones conservadoras de uno o más aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos no esenciales. De acuerdo con lo anterior, un aminoácido no esencial es un residuo que se puede alterar en la SEQ ID NO: 3 sin alterar sustancialmente la función biológica.

Es decir, la secuencia del polipéptido de la SEQ ID NO: 3 y de variantes y especies homologas también se pueden modificar para proporcionar polipéptidos de la invención. Se pueden hacer las sustituciones de aminoácido, por ejemplo de 1, 2 o 3 a 10, 20 o 30 sustituciones. El mismo número de eliminaciones e inserciones también se pueden hacer. Estos cambios se pueden hacer típicamente por fuera de las regiones críticas para la función del polipéptido, de tal manera que un polipéptido modificado retendrá su actividad proteasa específica de prolina.

El término "sustitución conservadora" pretende indicar una sustitución en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Estas familias se conocen en la técnica e incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina e histidina) , cadenas laterales acidas (por ejemplo ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparaginas, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) .

Polipéptidos de la invención incluyen fragmentos de los polipéptidos de longitud completa mencionados anteriormente y de variantes de los mismos, que incluye fragmentos de la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 3. Tales fragmentos retendrán típicamente la actividad como una proteasa específica de prolina. Fragmentos puede ser por lo menos 50, 100 o 200 aminoácidos de largo o puede ser este número de aminoácidos corto de la secuencia de longitud completa mostrada en SEQ ID NO: 3.

Polipéptidos de la invención se pueden, si es necesario, producir por medios sintéticos aunque usualmente ellos se harán recombinantemente como se describió anteriormente. Los polipéptidos recombinantes o sintéticos se pueden modificar, por ejemplo, mediante la adición de residuos histidina o una etiqueta T7 para ayudar su identificación o purificación, o mediante la adición de una secuencia de señal para promover su secreción de una célula.

Así, las secuencias de variante pueden comprender aquellos derivados de las cepas Penicillium diferentes a la cepa de la cual se aisla el polipéptido de la SEQ ID NO: 3. Las variantes se pueden identificar de otras cepas Penicillium mediante búsqueda para la actividad proteasa específica, de prolina y clonación y secuenciación como se describe aquí. Las variantes pueden incluir la eliminación, modificación o adición de aminoácidos únicos o grupos de aminoácidos dentro de la secuencia de proteína, mientras que el péptido mantiene la funcionalidad biológica básica de la proteasa específica de prolina de la SEQ ID NO: 3.

Las sustituciones de aminoácidos se pueden hacer, por ejemplo de 1 , 2 o de 3 a 10, 20 o 30 sustituciones. El polipéptido modificado retendrá generalmente la actividad como una proteasa específica de prolina. Se pueden hacer sustituciones de aminoácidos conservadoras; tales sustituciones son bien conocidas en la técnica.

Las secuencias de polipéptidos más cortas o más largas están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, un péptido de por lo menos 50 aminoácidos o hasta 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700 o 800 aminoácidos de longitud se considera caen dentro del alcance de la invención mientras demuestra la funcionalidad biológica básica de la proteasa específica de prolina de la SEQ ID NO: 3. En particular, pero no exclusivamente, este aspecto de la invención abarca la situación en la que la proteína es un fragmento de la secuencia de proteína completa.

Para la presente invención es preferible que la proteína de interés se secrete activamente en el medio de crecimiento. Las proteínas secretadas se sintetizan normalmente originalmente como pre-proteínas y la presecuencia (secuencia de señal) se remueve posteriormente durante el proceso de secreción. El proceso de secreción es básicamente similar en procariotas y eucariotas : la preproteína secretada activamente se enrosca a través de una membrana, la secuencia de señal se remueve mediante peptidasa de señal especifica, y la proteina madura se (re)plega. También se puede reconocer para la secuencia de señal una estructura general. Las secuencias de señal para secreción se ubican en el terminal amino de la preproteína, y son generalmente 15-35 aminoácidos de longitud. El terminal amino de manera preferible contiene aminoácidos cargados positivamente, y de manera preferible aminoácidos no ácidos. Se enseña que esta región cargada positivamente interactúa con los grupos delanteros cargados negativamente de los fosfolípidos de la membrana. Esta región se sigue por una región de núcleo de extensión de membrana hidrófoba. Esta región tiene generalmente 10-20 aminoácidos de longitud y consiste principalmente de aminoácidos hidrófobos. Los aminoácidos cargados no se presentan normalmente en esta región. La región de extensión de membrana se sigue por el sitio de reconocimiento para la peptidasa de señal. El sitio de reconocimiento consiste de aminoácidos con la preferencia para pequeño-X-pequeño . Los aminoácidos pequeños pueden ser alanina, glicina, serina o cisteína. X puede ser cualesquiera aminoácidos .

Los equivalentes de ácido nucleico funcionales pueden contener típicamente mutaciones sinónimas o mutaciones que no alteran la función biológica del polipéptido codificado. De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas ZFX que contienen cambios en los residuos de aminoácido no esenciales para una actividad biológica particular. Tales proteínas ZFX difieren en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 todavía retienen por lo menos una actividad biológica por lo tanto. En una realización la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, en donde la proteína comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente homologa de por lo menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homólogo que la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3.

Por ejemplo, la guía que se relaciona con como elaborar sustituciones de aminoácido fenotípicamente sinónimas se proporciona en Bowie, J.U. et al., Science 247:1306-1310 (1990) y las referencias citadas allí. Como lo establece los autores, estos estudios han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de aminoácido. Los autores indican adicionalmente que probablemente se permiten cambios en una cierta posición de la proteína.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína ZFX homologa a la proteína de acuerdo con SEQ ID NO: 3 se puede crear al introducir una o más sustituciones de nucleótido, adiciones o eliminaciones en las secuencias de nucleótidos codificantes de acuerdo con SEQ ID NO: 1 ó 2 tal que una o más sustituciones de aminoácido, eliminaciones o inserciones se introducen en la proteína codificada. Tales mutaciones se pueden introducir mediante técnicas estándar, tal como mutagenia dirigida a sitio y mutagenia mediada por PCR.

El término "equivalentes funcionales" también abarca ortólogos de la proteína proteasa específica de prolina Penicillium chrysogenum. Los ortólogos de la proteína ZFX Penicillium chrysogenum son proteínas que se pueden aislar de otras cepas o especies y posee una actividad biológica idéntica o similar. Tales ortólogos se' pueden identificar fácilmente ya que comprenden una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homologa a la SEQ ID NO: 3.

Como se define aquí, el término "sustancialmente homólogo" se refiere a un primer aminoácido o secuencia de nucleótidos que contiene número suficiente o ' mínimo de aminoácidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con cadena lateral similar) o nucleótidos para un segundo aminoácido o secuencia de nucleótidos tal el primer y segundo aminoácido o secuencia de nucleótidos tiene un dominio común. Por ejemplo, el aminoácido o las secuencias de nucleótidos qué contienen un dominio común que tiene aproximadamente 60%, de manera preferible 65%, más de manera preferible 70%, aún más de manera preferible 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad o más se definen aquí como suficientemente idénticos .

También, los ácidos nucleicos que codifican otros miembros de la familia ZFX, que tienen así una secuencia de nucleótidos que difieren de la SEQ ID NO: 1 ó 2, están dentro del alcance de la invención. Más aún, los ácidos nucleicos que codifican las proteínas ZFX son especies .diferentes que pueden tener una secuencia de nucleótidos que difiere de SEQ ID NO: 1 ó 2 están dentro del alcance de la invención.

Moléculas de ácido nucleico que corresponden a las variantes (por ejemplo variantes alélicas naturales) y homólogos del polinucleótido FX de la invención se pueden aislar con base en su homología para los ácidos nucleicos ZFX descritos aquí utilizando los cADN descritos aquí o un fragmento adecuado del mismo, como una sonda de hibridación de acuerdo con técnicas de hibridación estándar de manera preferible bajo condiciones de hibridación altamente severas.

Adicionalmente a las variantes alélicas de ocurrencia natural de la secuencia ZFX, la persona experta reconocerá que se pueden introducir cambios por mutación en las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 2 que conduce por lo tanto a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína ZFX sin alterar sustancialmente la función de la proteína ZFX.

En otro aspecto de la invención, se proporcionan las proteínas ZFX mejoradas. Las proteínas ZFX mejoradas son proteínas en donde por lo menos se mejora una actividad biológica. Tales proteínas se pueden obtener mediante mutaciones introducidas aleatoriamente a lo largo de toda . o parte de la secuencia que codifica ZFX, tal como mediante saturación de mutagenia, y los mutantes resultantes se pueden expresar recombinantemente y detectar para actividad biológica. Por ejemplo, la técnica proporciona ensayos estándar para medir la actividad enzimática de las proteasas específicas de prolina y así mejorar las proteínas que se pueden seleccionar fácilmente.

En una realización preferida la proteína ZFX tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 3. En otra realización, el polipéptido ZFX es sustancialmente homólogo a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 3 y, típicamente, retiene por lo menos una actividad biológica de un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 3, difiere en la secuencia de aminoácidos debido a la variación natural o mutagenia como se describió anteriormente.

En una realización adicionalmente preferida, la proteína ZFX tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un fragmento de ácido nucleico aislado capaz de hibridar a un ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 1 ó 2, de manera preferible bajo condiciones de hibridación altamente severas .

De acuerdo con lo anterior, la proteína ZFX es de manera preferible una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homologa a (es decir comparte identidad de secuencia con) la secuencia de aminoácidos mostrado en SEQ ID NO: 3. Típicamente, tal una proteína retiene por lo menos una actividad funcional del polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 3, por ejemplo en relación con la actividad proteasa específica de prolina.

Equivalentes funcionales de una proteína de acuerdo con la invención también se pueden identificar por ejemplo al detectar genotecas combinatorias de mutantes detectados, por ejemplo mutantes de truncación, de la proteína de la invención para la actividad proteasa específica de prolina. En una realización, una genoteca variegada de variantes se genera por mutagenia combinatoria en el nivel de ácido nucleico. Una genoteca variegada de variantes se puede producir por, por ejemplo, al ligar enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en las secuencias de gen tal que un conjunto degenerado de las secuencias de proteína secuencial se puede expresar como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión grandes (por ejemplo para presentación de fago) . Existen una variedad de métodos que se pueden utilizar para producir las genotecas de variantes potenciales de los polipéptidos de la invención de una oligosecuencia de nucleótidos degenerada. Métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).· Adicionalmente, las genotecas de fragmentos de la secuencia de codificación de un polipéptido de la invención se pueden- utilizar para generar una población variegada de polipéptidos para detectar una selección "posterior .de variantes. Por ejemplo, una genoteca de fragmentos de secuencia de codificación se puede generar al tratar un fragmento PCR bicatenario de la secuencia de codificación de interés con una nucleasa bajo condiciones en donde ocurre mellado solo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizar el. ADN bicatenario, renaturizar el ADN para formar ADN bicatenario que puede incluir pares codificantes/anticodificantes de diferentes productos mellados, remover las porciones de hebra únicas de dúplex reformados mediante el tratamiento con nucleasa SI, y ligar la genoteca de fragmento resultante en un vector de expresión. Mediante este método, una genoteca de expresión se puede derivar que codifica fragmentos internos y de terminal N de varios tamaños de la proteína de interés.

Varias técnicas se conocen en el arte para detectar productos de genoteca combinatorias hechas por mutaciones de punto de truncación, y para detectar la genoteca de cADN para productos de gen que tienen una propiedad seleccionada. Las técnicas utilizadas más ampliamente, que son favorables para análisis de alto rendimiento, para detectar genotecas mayores incluyen típicamente la clonación de la genoteca en vectores de expresión replicables, transformar células apropiadas con la genoteca resultante de vectores, y expresar genes combinatorios bajo condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detecta. La mutagenia recursiva de conjunto (REM) , una técnica que mejora la frecuencia de mutantes funcionales en las genotecas, se puede utilizar en combinación con los ensayos de detección para identificar variantes de una proteína de la invención (Arkin y Yourvan (1992) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331).

Se entiende que las personas expertas pueden, utilizando técnicas de rutina, hacer sustituciones de nucleótido que no afectan la secuencia del polipéptido codificado por los poli-nucleótidos de la invención para reflejar el uso del codón en cualquier organismo anfitrión particular en el que los polipéptidos de la invención se expresan.

La secuencia de codificación de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 se puede modificar mediante sustituciones de nucleótido, por ejemplo de 1, 2 o 3 a 10, 25, 50, 100, o más sustituciones. El polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 se puede modificar alternativamente o adicionalmente por una o más inserciones y/o eliminaciones y/o mediante una extensión en cualquiera o ambos extremos. El polinucleótido modificado generalmente codifica un polipéptido que tiene actividad proteasa específica de prolina. Se pueden hacer sustituciones degeneradas y/o sustituciones que resultarían en una sustitución de aminoácidos conservadora cuando se traslada la secuencia modi'ficáda, por ejemplo- como sé discute con referencia a los últimos polipéptidos.

Las secuencias proporcionadas por la presente invención también se pueden utilizar como materiales de partida para la construcción de las enzimas de "segunda generación". Las proteasas específicas de prolina de "segunda generación" son las proteasas específicas de prolina alteradas por técnicas de mutagenia (por ejemplo mutagenia dirigida a sitio o técnicas de mezcla de gen) , que tienen propiedades que difieren de aquellas de proteasa específica de prolina tipo intacto o proteasa específica de prolina recombinante tal como aquellos producidos por la presente invención. Por ejemplo, su temperatura o pH óptimo, la actividad específica, afinidad de sustrato o termoestabilidad se pueden alterar con el fin de adecuarse mejor para su uso en un proceso particular.

Los aminoácidos esenciales para la actividad de la proteasa específica de prolina de la invención, y por lo tanto de manera preferible objeto para sustitución, se puede identificar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tal como mutagenia dirigida a sitio o mutagenia de barrido de alanina. En las mutaciones de la última técnica se introducen en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se prueban para actividad biológica (por ejemplo actividad proteasa específica de prolina) para identificar residuos de aminoácido que son críticos para' la actividad de la molécula. Los sitios de interacción del sustrato de enzima también se pueden determinar mediante el análisis de la estructura de cristal como se determina mediante tales técnicas como resonancia magnética nuclear, etiquetado de fotoafinidad o cristalografía.

Técnicas de mezcla genética proporcionadas en forma aleatoria introducen mutaciones en una secuencia de polinucleótido . Después de la expresión los aislados con las mejores propiedades se reaíslan, combinan y se mezclan de nuevo para incrementar la diversidad genética. Al repetir este procedimiento un número de veces, se pueden aislar los genes que codifican las proteínas bastamente mejoradas. De manera preferible el procedimiento de mezcla genética se inicia con una familia de genes que codifican las proteínas con una función similar. La familia de secuencias de polinucleótido proporcionadas con esta invención sería bien adecuada para mezcla genética para mejorar las propiedades de las proteasas específicas de prolina secretadas.

Alternativamente las técnicas y selección de mutagenia aleatoria clásica, tal como mutagenia con tratamiento NTG o mutagenia UV, se puede utilizar para mejorar las propiedades de una proteína. La mutagenia se puede desempeñar directamente en el ADN aislado, o en células transformadas con el ADN de interés. Alternativamente, se' pueden introducir mutaciones en el ADN aislado mediante un número de técnicas que son conocidas por la persona experta en la técnica. Ejemplos de estos métodos son PCR propenso a error, amplificación de ADN de plásmido en una célula ánfitriona deficiente de reparación, etc.

Adicionalmente a la secuencia de gen ZFX mostrada en SSEQ ID NO: 1 ó 2, será evidente para la persona experta en la técnica que- los polimorfismos de la secuencia de ADN pueden existir dentro de la población dada, que puede conducir a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína ZFX. Tales polimorfismos genéticos pueden existir en las células de diferentes poblaciones o dentro de una población debido a la variación alélica natural. Las variantes alélicas también pueden incluir equivalentes funcionales.

Fragmentos de un polinucleótido de acuerdo con la invención también pueden comprender polinucleótidos que no codifican los polipéptidos funcionales. Tales polinucleótidos pueden funcionar como sondas o cebadores para una reacción PCR. .

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención independiente dé sí ellos codifican los polipéptidos funcionales o no funcionales se pueden utilizar como sondas de hibridación o cebadores de reacción de cadena polimerasa (PCR) . Los usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican un polipéptido que tiene una actividad ZFX incluyen, inter alia, (1) aislar el gen que codifica la proteína ZFX, o variantes alélicas de los mismos de una genoteca cADN por ejemplo de otros organismos diferentes a Penicillium chrysogenum; (2) hibridación in situ (por ejemplo FISH) para rociados cromosómicos de metafase para proporcionar la ubicación cromosómica precisa del gen ZFX como se describe en Verma et al., Human Chromosomes : a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988) ; (3) análisis northern blot para detectar la expresión de mARN ZFX en tejidos específicos y/o células y 4) sondas y cebadores que se pueden utilizar como una herramienta de diagnóstico para analizar la presencia de un ácido nucleico hibridizable en la sonda ZFX en una muestra biológica dada (por ejemplo tejido) .

También abarca la invención un método para obtener un equivalente funcional de un gen ZFX. Tal un método implica obtener una sonda etiquetada que incluye un ácido nucleico aislado que codifica todo o una parte de la secuencia de proteína de acuerdo con SEQ ID NO: 3 o una variante del mismo; detectar un fragmento de genoteca de ácido nucleico con la sonda etiquetada bajo condiciones que permiten hibridación de la prueba para los fragmentos de ácido nucleico en la genoteca, formar por lo tanto dúplex de ácido nucleico, y preparar un gen de secuencia de longitud completa del fragmento de ácido nucleico en cualquier dúplex etiquetado para obtener un gen relacionado con el gen ZFX.

En una realización, un ácido nucleico ZFX de la invención es por lo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, .91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más homólogo a una secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 2 o el complemento de éste.

En otra realización, la invención caracteriza células, por ejemplo, células anfitrionas transformadas o células anfitrionas recombinantes que contienen un ácido nucleico abarcado por la invención. Una "célula transformada" o "Células recombinante" es una célula en la que (o en un ancestro del cual) se ha introducido, por medio de técnicas de ADN recombinante, un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Se incluyen células procarióticas y eucarióticas , por ejemplo, bacterias, hongos, levadura, y similares, se prefieren especialmente células de hongos filamentosos, en particular Aspergillus niger.

De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona una célula anfitriona que comprende un polipéptido, un polinucleótido o un vector de la invención. El polinucleótido puede ser heterólogo al genoma de la célula anfitriona. El término "heterólogo", usualmente con respecto a la célula anfitriona, significa que el polinucleótido no ocurre naturalmente en el genoma de la célula anfitriona o que el polipéptido no se produce naturalmente por la célula.

Se puede seleccionar una célula anfitriona que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto de gen en una forma deseada, específica. Tales modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y procesamiento (por ejemplo, división) de los productos de proteína pueden facilitar el funcionamiento óptimo de la proteína . ¦ ' Varias células' anfitrionas tienen- características "y mecanismos específicos para el procesamiento post-conversión y modificación de proteínas y productos de gen. Las estirpes celulares apropiadas o sistemas anfitriones familiares por aquellos expertos en la técnica de la biología y/o microbiología molecular se pueden seleccionar para asegurar la modificación correcta y deseada y procesamiento de la proteína anterior expresada. Para este fin, se pueden utilizar las células anfitrionas eucarióticas que poseen la · maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcripto principal, glucosilación, y fosforilación del producto de gen. Tales células anfitrionas son bien conocidas en la técnica : Si se desea, una célula como se describió anteriormente se puede utilizar en la preparación de un polipéptido de acuerdo con la invención. Tal un método comprende típicamente cultivar una célula anfitriona (por ejemplo transformada o transfectada con un vector de expresión como se describió anteriormente) bajo condiciones para proporcionar la expresión (por el vector) de una secuencia de codificación que codifica el polipéptido, y opcionalmente recuperar el polipéptido expresado.

Los polinucleótidos de la invención se pueden incorporar en un vector de replicación recombinante , por ejemplo un vector de expresión. El vector se puede utilizar para replicar el ácido nucleico en una célula anfitriona compatible.

Así en una realización adicional, la invención proporciona un método para elaborar un polinucleótido de la invención al introducir un polinucleótido de la invención en un vector de replicación, que introduce el vector en una célula anfitriona compatible, y hacer crecer la célula anfitriona bajo condiciones que traen aproximadamente la replicación del vector. El vector se puede recuperar de la célula anfitriona.

Las células anfitrionas adecuadas incluyen bacterias tal como E. coli, levadura, estirpes celulares de mamífero y otras estirpes celulares eucarióticas , por ejemplo células de insecto tal como células Sf9 y células de hongos (por ejemplo filamentosas) .

De manera preferible el polipéptido se produce como una proteína secretada en cuyo caso la secuencia de nucleótidos que codifica una forma madura del polipéptido en la construcción de ¦ expresión se liga operablemente a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de señal. De manera preferible la secuencia de señal es nativa (homologa) a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Alternativamente la secuencia de señal es externa (heteróloga) a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, en cuyo caso la secuencia de señal es de manera preferible endógeha a la célula anfitriona en la que se expresa la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención. Ejemplos de secuencias de señal adecuadas para células anfitrionas de levadura son las secuencias de señal derivadas de genes de factor de levadura. De forma similar, una secuencia de señal adecuada para células anfitrionas fúngicas filamentosas es por ejemplo una secuencia de señal derivada de un gen amiloglucosidasa fúngico filamentoso (AG) , por ejemplo el gen glaA A. niger. Esto se puede utilizar en combinación con el mismo . promotor amiloglucosidasa (también llamado (gluco) amilasa) , así como también en combinación con otros promotores. Las secuencias de señal híbrida también se pueden utilizar con el contexto de la presente invención.

Las secuencias líderes de secreción heteróloga preferida son 'aquellas que se originan del gen amiloglucosidasa fúngico (AG) (glaA de versiones de 18 y 24 aminoácidos por ejemplo de Aspergillus) , el gen de factor (levaduras por ejemplo Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen amilasa (Bacillus).

Los vectores se pueden transformar o transfectar en una célula anfitriona adecuada como se describió anteriormente para proporcionar la expresión de un polipéptido de la invención. Este proceso puede comprender cultivar una célula anfitriona transformada con un vector, tal como un vector de expresión, como se describió anteriormente bajo condiciones para proporcionar la expresión por el vector de una secuencia de codificación que codifica el polipéptido y, opcionalmente , recuperar el polipéptido expresado.

•La invención abarca un polipéptido obtenible u obtenido mediante tal proceso.

En una realización preferida un polipéptido de la invención se produce de un hongo, más de manera preferible de un Aspergillus, más de manera preferible de Aspergillus niger.

La invención así proporciona células anfitrionas transformadas o transfectadas con o que comprenden un polinucleótido o vector de la invención. De manera preferible el polinucleótido se lleva en un vector para la replicacion y expresión del polinucleótido. Las células se seleccionarán para ser compatibles con el dicho vector y pueden ser por ejemplo procarióticos (por ejemplo bacterias) , hongos, levaduras o células de planta: Las células anfitrionas adecuadas son de manera preferible microorganismos procarióticos tal como bacterias, o más de manera preferible organismos eucarióticos , por ejemplo hongos, tal como levaduras u hongos filamentosos, o células de plantas. En general, las células de levadura se prefieren sobre las células de hongo debido a que ellos son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas se secretan más pobremente de las levaduras, o en algunos casos no se procesan apropiadamente (por ejemplo hiperglucosilación en levadura) . En estos casos, se debe seleccionar un organismo anfitrión fúngico.

La célula anfitriona puede sobreexpresar el polipéptido, y se conocen bien técnicas para sobreexpresión por ingeniería. El anfitrión así puede tener dos o más copias del polinucleótido codificante (y el vector así puede tener dos o más copias de acuerdo con lo anterior) .

Las bacterias de los genes Bacillus son muy adecuadas como anfitriones heterólogos debido a su capacidad para secretar proteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como anfitriones son aquellas de los géneros Streptomyces y Pseudomonas. Una célula anfitriona de levadura preferida para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido es del género Saccharomyces , Kluyveromyces , Hansenula, Pichia, Yarrowia, y Schizosaccharomyces .

Más de manera preferible una célula anfitriona de levadura se selecciona del grupo que consiste de las especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (también conocido como Kluyveromycesmarxianus var. lactis), Hansenulapolimorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolitica y Schizosaccharomyces pombe .

Se prefieren más, sin embargo, células anfitrionas de hongos (por ejemplo filamentosos) . Las 'células anfitrionas de hongos filamentosos preferidos se seleccionan del grupo que consiste del genero Aspergillus, Trichodernza, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Spor.otrichum, Thielavia y Talaromyces.

Más de manera preferible una célula anfitriona de hongo filamentoso es de la especie Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans, o una especie del grupo Aspergillus niger. Esto incluye, pero no se limita a Aspergillus niger, Aspergillusawamori , Aspergillus tubingensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae y Aspergillus ficuum y consiste adicionalmente de las especies de Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thernaophilurri , Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum y Thielavia terrestris.

Ejemplos de anfitriones de expresión preferidos dentro del alcance de la presente invención son hongos tal como especies Aspergillus (en particular aquellos descritos en EP-A-184,438 y EP-A-284 , 603 ) y especies Trichoderma; bacterias tal como especies Bacillus (en particular aquellas descritas en EP-A-134,048 y EP-A-253 , 455) , especialmente especies Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis , Bacillus amiloliquefaciens , Pseudomonas ; y levaduras tal como especies Kluyveromyces (en particular aquellas descritas en EP-A-096,430 tal como Kluyveromyces lactis y en EP-A-301, 670) y especies Saccharomyces , tal como Saccharomyces cerevisiae.

La invención abarca procesos para la producción del polipéptido de la invención por medio de la expresión recombinante de una secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Para este propósito la secuencia de ADN de la invención se puede utilizar para amplificación de gen y/o intercambio de señales de expresión, tal como promotores, secuencias de señal de secreción, con el fin de permitir la producción económica del polipéptido en una célula anfitriona heteróloga o homologa adecuada. Una célula anfitriona homologa es una célula anfitriona que es de la misma especie o que es una variante dentro, de la misma especie como las especies de las cuales se deriva la secuencia de ADN. El término "heterólogo" , usualmente con respecto a la célula anfitriona, significa que el polinucleótido no ocurre generalmente en el genoma de la célula anfitriona o que el polipéptido no se produce naturalmente por la célula.

De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona un medio mejorado para producir la nueva proteasa secretada identificada específica de prolina en altas cantidades y una forma relativamente pura por vía de la sobreproducción de Penicillium que codifica la enzima utilizando técnicas de ADN recombinante . Una forma preferida de hacer esto es por vía de la sobreproducción de tal una proteasa específica de prolina secretada en un grado de microorganismo anfitrión alimenticio. Microorganismos de grado alimenticio bien conocidos incluyen Aspergilli, Trichoderma, Streptomyces , Bacilli y levaduras tal como Saccharomyces y Kluyveromyces . Una forma aún más preferida de hacer esto es por vía de la sobreproducción del Penicillium secretado derivado de proteasa específica de prolina en un hongo de grado alimenticio tal como Aspergillus. Se prefiere más la sobreproducción de la proteasa específica de prolina secretada en un hongo de grado alimenticio en el que el uso del codón de gen que codifica la proteasa específica de prolina se ha optimizado por el anfitrión de grado alimenticio utilizado. En general, es deseable permitir las últimas rutas de optimización, la información de secuencia única de una proteasa específica de prolina secretada. Se prefiere más la secuencia de nucleótidos de la proteasa específica de prolina completa que codifica el gen que tiene que estar disponible. Una vez el gen que codifica una proteasa específica de prolina secretada se transforma en un anfitrión preferido, las cepas seleccionadas se pueden utilizar para fermentación y aislamiento de la proteína de proteasa específica de prolina secretada del caldo de cultivo de fermentación.

Las células anfitrionas de acuerdo con la invención incluyen células de plantas, y la invención por lo tanto se extiende a organismos transgénicos, tales como plantas y partes de estas, que contienen una o más células de la invención. La células pueden expresar heterologamente el polipéptido de la invención o pueden contener heterologamente uno o más de los polinucleótidos de la invención. La planta transgénica (o modificada genéticamente) se puede por lo tanto insertar (por ejemplo establemente) en su secuencia de genoma que codifica uno o más de los polipéptidos de la invención. La transformación de las células de plantas se puede desarrollar utilizando técnicas conocidas ,· por ejemplo utilizando un plásmido Ti o a Ri de Agrobacterium tumefaciens. El plásmido (o vector) puede así contener secuencias necesarias para infectar una planta, y se pueden emplear derivados de los plásmidos Ti y/o Ri.

Alternativamente se puede efectuar la infección directa de una parte de una planta, tal como una hoja, raíz o tallo. En esta técnica la planta a ser infectada se puede herir, por ejemplo al cortar la planta con una cuchilla o punzar la planta con una aguja o frotar la planta con un abrasivo. La herida luego se inocula con el Agrobacterium. La planta o parte de la planta luego se puede hacer crecer en un medio de cultivo adecuado y permitir desarrollar en una planta madura. La regeneración de las células transformadas en plantas modificadas genéticamente se puede lograr al utilizar técnicas conocidas, por ejemplo al seleccionar brotes transformados utilizando un antibiótico y al sub-cultivar los brotes en un medio que contiene los nutrientes apropiados, hormonas de planta y similares.

La invención asi incluye células que se han modificado para expresar la proteasa' específica de prolina o su variante. Tales' células incluyen estirpes celulares eucarióticos transientes, o de manera preferible estables, tal como células de mamífero o células de insecto, células eucarióticas inferiores, tal como levadura y células de hongos (por ejemplo filamentosos) o células procarióticas tal como células bacterianas.

La presente invención también se relaciona con métodos para producir una célula mutante de una célula paterna, que comprende' interrumpir o eliminar la secuencia de ácido nucleico endógena que codifica el polipéptido o una secuencia de control del mismo, que resulta en la menor producción celular mutante del polipéptido que el de la célula padre.

La construcción de las cepas que han reducido la actividad proteasa específica de prolina se puede llevar a cabo convenientemente mediante la modificación o inactivación de una secuencia de ácido nucleico necesaria para la expresión de la proteasa específica de prolina en la célula. La secuencia de ácido nucleico a ser modificada o inactivada puede ser, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica el' polipéptido o una parte de este esencial para exhibir la actividad proteasa específica de prolina, o la secuencia de ácido nucleico puede tener una función reguladora requerida para la expresión del polipéptido de la secuencia de codificación de la secuencia de ácido nucleico. Un ejemplo de tal una secuencia reguladora o de control puede ser una secuencia promotora o una parte funcional por lo tanto, es decir, una parte que es suficiente para afectar la expresión del polipéptido. Otras secuencias de control para posible modificación incluyen, pero no se limitan a, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, una secuencia de señal, y una secuencia de terminación.

La modificación o inactivación de la secuencia de ácidos nucleicos se puede desarrollar al someter la célula a mutagenia y seleccionar células en las que la proteasa éspecífica de prolina produce la capacidad de ser reducido o eliminado. La mutagenia, que puede ser específica o aleatoria, se puede desarrollar, por ejemplo, mediante el uso de un agente de mutación química o física adecuada, mediante el uso de un oligonucleótido adecuado, o al someter la secuencia de ADN a mutagenia PCR. Adicionalmente , la mutagenia se puede desarrollar mediante el uso de cualquier combinación de estos agentes mutagénicos .

Ejemplos de un agente mutagénico químico o físico adecuado para el presente propósito incluye irradiación ultravioleta (UV) , hidroxilamina, N-metil-N1 -nitro-N- nitrosoguanidina (NTG) , O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, sulfonato de etil metano (EMS) , bisulfito de sodio, ácido fórmico, y análogos de nucleótido.

Cuando se utilizan tales agentes, la mutagenia se desarrolla típicamente al incubar la célula a ser mutada en la presencia del agenté mutagénico de elección bajo condiciones adecuadas, y seleccionar células que inhiben o reducen o no la expresión de la actividad proteasa específica de prolina .

La modificación o inactivación de la producción de un polipéptido de la presente invención se puede lograr mediante la introducción, sustitución, o remoción de uno o más nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido o un élemento regulador requerido para la transcripción o traducción del mismo. Por ejemplo, se pueden insertar nucleótidos o remover con el fin de resultar en la introducción de un codón de parada, la remoción del codón de inicio, o un cambio de un marco de lectura abierto. Tal modificación o inactivación se puede lograr mediante mutagenia dirigida a sitio o mutagenia PCR de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

Aunque, en principio, la modificación se puede desarrollar in vivo, es decir, directamente en la célula que expresa la secuencia de ácido nucleico a ser modificada, se prefiere que la modificación se desarrolle in vitro como se ejemplifica adelante.

Un ejemplo de una forma conveniente para inactivar o reducir la producción de la proteasa específica de prolina por una célula anfitriona de elección se basa en técnicas de reemplazo de gen o interrupción de gen. Por ejemplo, en el método de interrupción de gen, una secuencia de ácido nucleico correspondiente al gen endógeno o el fragmento de gen de interés se muta in vitro para producir una secuencia de ácido nucleico defectuosa que luego se transforma en la célula anfitriona para producir un gen defectuoso. Por recombinación homologa, la secuencia de ácido nucleico defectuosa reemplaza el gen endógeno o el fragmento de gen. De manera preferible el gen defectuoso o fragmento de gen también codifica un marcador que se puede utilizar para seleccionar transformantes en los que el gen que codifica el polipéptido se ha modificado o destruido.

Alternativamente, la modificación o inactivación de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención se puede alcanzar mediante técnicas anticodificantes establecidas utilizando una secuencia de nucleótidos complementaria al polipéptido que codifica la secuencia. Más específicamente, la producción del polipéptido por una célula se puede reducir o eliminar al introducir una secuencia de riucleótidos complementaria a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. El poli-nucleótido anticodificante luego se transcribirá típicamente en la célula y será capaz de hibridar al mARN que codifica la proteasa específica de prolina. Bajo condiciones que permiten la secuencia de nucleótidos anticodificante complementaria para hibridar al mARN, la cantidad de la proteasa específica de prolina producida en la célula se reducirá o eliminará.

Se prefiere que la célula que va a ser modificada de acuerdo con los métodos de la presente invención es de origen microbiano, por ejemplo, una cepa fúngica que es adecuada para la producción de los productos de proteína deseados, homólogos o heterólogos a la célula.

La presente invención se relaciona adicionalmente con una célula mutante de una célula padre que comprende una interrupción o eliminación de la secuencia de ácido nucleico endógena que codifica el polipéptido o una secuencia de control del mismo, que resulta en menos producción de la célula mutante del polipéptido que de la célulá padre.

Las células imitantes deficientes de polipéptido creadas son particularmente útiles como células anfitrionas para la expresión de los péptidos homólogos y/o heterólogos. Por lo tanto, la presente invención se relaciona adicionalmente con métodos para producir un polipéptido homólogo o heterólogo que comprende (a) cultivar la célula mutante bajo condiciones conducidas para la producción del polipéptido; y (fc>) recuperar el polipéptido. En el presente contexto, el término "polipéptidos heterólogos" se define aquí como polipéptidos que no son nativos a la célula anfitriona, una proteína nativa en la que se han hecho las modificaciones para alterar la secuencia nativa, o una proteína nativa cuya expresión se altera cuantitativamente como un resultado de una manipulación de la célula anfitriona mediante técnicas de ADN recombinante .

En todavía un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para producir un producto de proteína esencialmente libre de actividad proteasa específica de prolina mediante la fermentación de una célula que produce un polipéptido de proteasa específica de prolina de la presente invención así como también el producto de proteína de interés . El método comprende agregar una cantidad efectiva de un agente capaz de inhibir la actividad proteasa específica de prolina para el caldo de cultivo de fermentación durante o después de la fermentación que ha sido completada, recuperar el producto de interés del caldo de cultivo de fermentación, y opcionalmente someter la recuperación del producto a purificación adicional. Alternativamente, después de cultivar el caldo de cultivo resultante se puede someter a un pH o tratamiento de temperatura con el fin de reducir sustancialmente la actividad proteasa específica de prolina, y permitir la recuperación del producto de caldo de cultivo. El pH combinado o tratamiento de temperatura se puede desarrollar en una preparación de proteína recuperada del caldo de cultivo.

El método descrito anteriormente para la producción de un producto libre de proteasa esencialmente específica de prolina es de particular interés en la producción de polipéptidos eucarióticos , en particular en la producción de proteínas de hongo tales como las enzimas. Las células deficientes de proteasa específica de prolina también se pueden ' utilizar para expresar las proteínas heterólogas de interés para la industria alimenticia, o de interés farmacéutico.

De acuerdo con la presente invención, la producción del polipéptido de la invención se puede efectuar al cultivar los anfitriones de expresión microbianos, que se han transformado con uno o más polinucleótidos de la presente invención, en un medio de fermentación de nutriente convencional.

Las células anfitrionas recombinantes de acuerdo con la invención se pueden cultivar utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Para cada combinación de un promotor y una célula anfitriona, están disponibles las condiciones de cultivo, las cuales son conductoras para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Después de alcanzar la densidad celular deseada o título del polipéptido, se detiene el cultivo y el polipéptido se recupera utilizando procedimientos conocidos.

El medio de fermentación puede comprender un medio de cultivo conocido que contiene una fuente de carbón (por ejemplo glucosa, maltosa, melasas, etc.), una fuente de nitrógeno (por ejemplo sulfato de amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio, etc.), una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo extracto de levadura, extracto de malta, peptona, etc.) y fuentes de nutrientes inorgánicos (por ejemplo fosfato, magnesio, potasio, zinc, hierro, etc.). Opcionalmente , se puede incluir un inductor (por ejemplo celulosa, pectina, maltosa, maltodextrina o xilogalacturonano) .

La selección del medio apropiado se puede basar en la elección del anfitrión de expresión y/o basar en los • requerimientos reguladores de la construcción de expresión. El medio puede, si se desea, contar adicionalmente con componentes de sabor de anfitriones de expresión transformados sobre otros microorganismos potencialmente contaminantes .

La fermentación se puede desarrollar durante un periodo de 0.5-30 días. Puede ser una tanda, proceso continuo o de alimentación-tanda, adecuado en una temperatura en el rango de, por ejemplo, de aproximadamente 0 a 45 °C y/o en un pH, por ejemplo, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10. Las condiciones de fermentación preferidas son una temperatura en el rango de aproximadamente 20 a aproximadamente 37 °C y/o en un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 9. Las condiciones apropiadas se seleccionan usualmente con base en la elección del anfitrión de expresión y la proteína que va a ser expresada.

Después de la fermentación, si es necesario, las células se pueden remover a partir de la fermentación por medio de centrifugación o filtración. Después que la fermentación se detiene o después de la remoción de las células, el polipéptido de la invención luego se puede recuperar y, si se desea, purificar y aislar por medios convencionales .

Un polipéptido de la invención que tiene actividad proteasa específica de prolina puede estar en una forma aislada. Como se define aquí, un polipéptido aislado puede ser un polipéptido recombinante o producido endógenamente (clásicamente) que es esencialmente libre de otro sin polipéptidos de proteasa específica de prolina, y es típicamente por lo menos aproximadamente 20% puro, de manera preferible por lo menos aproximadamente 40% puro, más de manera preferible por lo menos aproximadamente 60% puro, aún más de manera preferible por lo menos aproximadamente 80% puro, aún más de manera preferible aproximadamente 90% puro, y más de manera preferible aproximadamente 95% puro, aproximadamente 98% puro o aproximadamente 99% puro tal como se determina por SDS-PAGE.

El polipéptido se puede aislar mediante filtración, seguido por concentración (por ejemplo ultrafiltración) o cualquier otra técnica conocida en el arte para obtener proteínas puras de soluciones crudas. La preparación resultante se puede secar por rociado o mantener como una preparación líquida. Se entenderá que el polipéptido se puede mezclar con portadores o diluyentes que no interfieren con el propósito - destinado del polipéptido, y así el polipéptido en esta forma se relacionará como aislado. Esto comprenderá generalmente el polipéptido en una preparación en la que más de 20%, por ejemplo más de 30%, 40%,' 50%, 80%, 90%, 95% o 99%, en peso de las proteínas en la preparación es un polipéptido de la invención.

Los polipéptidos de la invención se pueden proveer en una forma tal que sean externos a su ambiente celular natural. Así, se pueden aislar o purificar sustancialmente , como se discutió anteriormente, o en una célula en la que no se presentan en la naturaleza, por ejemplo una célula de otras especies de hongos, animales, plantas o bacterias.

De manera preferible, el polipéptido de la invención es el que se obtiene de un microorganismo que posee un gen que codifica una enzima con actividad proteasa específica de prolina. Más de manera preferible el polipéptido de la invención se secreta de un microorganismo. Aun más de manera preferible el microorganismo es el hongo, y óptimamente es un hongo filamentoso. Los organismos donantes preferidos son así del género Penicillium, tal como aquéllos de las especies Penicillium chrysogenum .

La presente invención proporciona un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad de secuencia de aminoácidos en el polipéptido de la SEQ ID NO: 3 (es decir el polipéptido) de por lo menos aproximadamente 60%, tal por lo menos aproximadamente 70%, tal por lo menos aproximadamente 80%, de manera preferible por lo menos aproximadamente 85%, más de manera preferible por lo menos aproximadamente 90%, aún más de manera preferible por lo menos aproximadamente 95%, aún más de manera preferible por lo menos aproximadamente 98%, y más de manera preferible por lo menos aproximadamente 99%, y que tiene actividad proteasa específica de prolina.

De manera preferible, un polipéptido aislado o purificado de acuerdo con la invención de manera preferible tiene por lo menos 10 unidades de la actividad proteasa especifica de prolina por gramo de material proteináceo. Estas unidades se deben medir utilizando el péptido sintético Z-Gly-Pro-pNA a 37° C y pH 5, como se describe en la sección de los métodos .

Típicamente, un polipéptido de la invención tendrá también características similares o mejoradas como el polipéptido de SEQ ID NO: 3 con respecto a la temperatura óptima y/o termolabilidad. Así, el polipéptido puede tener una temperatura óptima de aproximadamente 60 °C o menos, aproximadamente 50°C o menos, aproximadamente 40°C o menos, aproximadamente 37 °C o menos.

Puede ser posible para inactivar un polipéptido de la invención el calentar el polipéptido a aproximadamente 60 °C durante aproximadamente 10 minutos- a aproximadamente 30 minutos, tal como durante aproximadamente 15 a aproximadamente 25 minutos, tal como durante aproximadamente 20 minutos. Tal inactivación se puede llevar a cabo utilizando un proceso de pasteurización. La inactivación en este contexto implica que no existe o sustancialmente no se detecta actividad enzimática residual siguiendo el proceso de inactivación por calor.

De acuerdo con lo anterior, cualquiera de los métodos de uso descritos aquí en los que un polipéptido de la invención se utiliza puede incluir una etapa de polipéptido de inactivación. Tal una' etapa puede ser una etapa de activación por calor como se describió anteriormente. El resultado de tal una etapa puede no existir o sustancialmente no detectarse . la actividad enzimática residual del polipéptido .

Los polipéptidos de la invención se pueden modificar químicamente, por ejemplo modificar post-traslacionalmente . Por ejemplo, ellos se pueden glucosilar (una o más veces) o comprender los residuos de aminoácido adecuados. Ellos también se pueden modificar mediante la adición de residuos histidina para asistir su purificación o mediante la adición de una secuencia de señal para promover la secreción de la célula. El polipéptido puede tener extensiones de terminal amino- o carboxilo, tal como un residuo metionina de terminal amino, un péptido ligador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una extensión pequeña que facilita la purificación, tal como un segmento poli-histidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

Un polipéptido de la invención se puede marcar con una marca de revelación. La marca de revelación puede ser cualquier marca adecuada que permite detectar el polipéptido. Las marcas adecuadas incluyen radioisótopos, por ejemplo 1251, 35S, enzimas, anticuerpos, polinucleótidos y ligadores tal como biotina.

Los polipéptidos se pueden modificar para incluir aminoácidos de ocurrencia no natural o para incrementar la estabilidad del polipéptido. Cuando las proteínas o los péptidos se producen por medios sintéticos, tales aminoácidos se pueden introducir durante la producción. Las proteínas o los péptidos también se pueden modificar siguiendo la producción sintética o recombinante .

Los polipéptidos de la invención también se pueden producir utilizando los aminoácidos D. En tales casos los aminoácidos se ligarán en la secuencia inversa en la orientación C a N. Esto es convencional en la técnica para producir tales proteínas o péptidos. · Un número de modificaciones de cadena lateral se conocen en la técnica y se pueden hacer en las cadenas laterales de las proteínas o los péptidos de la presente invención. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, modificaciones de aminoácidos mediante alquilación reductiva mediante la reacción con un aldehido seguido por reducción con NaBH4 , amidinación con metilacetimidato o acilación con anhídrido acético.

Un polipéptido de la invención se puede utilizar en cualquier método o aplicación en la que se requiere la actividad enzimática de la proteasa específica de prolina.

La invención así proporciona una composición que comprende un polipéptido de la invención. Tal una composición se puede utilizar en un método o uso de la invención.

La actividad enzimática auxiliar, tal como la actividad proteasa adicional, se puede requerir en un método o uso de acuerdo con la invención. Así, la invención proporciona una composición que comprende: (i) un polipéptido de acuerdo con la invención y; (ii) un polipéptido que proporciona actividad que es diferente del polipéptido en (i) , tal como una proteasa que es diferente del polipéptido en (i) .

Por ejemplo, se puede utilizar, una proteasa específica de prolina diferente adicional. Ejemplos de tales enzimas se encuentran ampliamente en animales y plantas y se han reportado en microorganismos: por ejemplo, las proteasas específicas de prolina se han identificado en las especies Aspergillus (EP 0 522 428) , Flavobacterium (EP 0 967 285) y Aeromonas (J.Biochem.113 , 790-796), Xanthomonas y Bacteroides .

Alternativamente, se pueden utilizar proteasas adicionales. De manera preferible, tales proteasas adicionales tienen un pH deseado óptimo. Ejemplos de tales enzimas se describen en WO 03/102195 y también aquí.

De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona un método para la preparación de un hidrolizado de proteína, cuyo método comprende poner en contacto un sustrato de proteína con un polipéptido o composición de acuerdo con la invención. Así, la invención también proporciona el uso de un polipéptido o composición de la. invención en la preparación de un hidrolizado de proteína. La invención también se relaciona con un hidrolizado de proteína obtenible o que se obtiene por tal un método o uso.

Tal un método puede ser de uso en la creación de hidrolizados no amargos de sustratos proteínicos con composiciones de aminoácido no usuales. Tales composiciones de aminoácido no usuales pueden ofrecer serios beneficios en ciertas aplicaciones alimenticias. Los ejemplos son caseína o gluten de trigo o proteína de maíz aislada con altos niveles de residuos de aminoácidos hidrófobos presentes. Utilizando el método de la invención, hidrolizados no amargos se pueden hacer disponibles para ser utilizados en nutrición clínica y neonatal, en dietas terapéuticas así como también en dietas de consumo y nutrición de deportistas.

Una realización la presente invención proporciona una mezcla de enzima que comprende una proteasa específica de prolina purificada, aislada (es decir polipéptido de la invención) para producción de alto rendimiento de hidrolizados de proteína que tienen propiedades alergénicas bajas y sustancialmente baja amargor sin la producción concomitante de niveles sustanciales de aminoácidos libres. Esta mezcla de enzima es adecuada para preparar hidrolizados de varias fracciones de proteína. En particular, un sustrato de proteína, tal como una proteína de leche, se puede incubar con una proteasa específica de prolina purificada, aislada y una subtilisina para producir un hidrolizado de proteína enriquecido en los fragmentos de péptido que tienen una prolina de terminal carboxilo. El término "enriquecido" está destinado a significar que por lo menos 8% de los fragmentos de péptido en . el producto de hidrolizado de división enzimática poseen un residuo prolina de terminal carboxilo.

Los hidrolizados de proteína que se obtienen al hidrolizar una proteína pueden comprender los péptidos en donde la fracción molar de los péptidos (%) lleva a cabo una prolina de terminal carboxilo, es por lo menos dos veces la fracción molar (%) de prolina en el sustrato de proteína utilizado para producir el hidrolizado.

La longitud promedio de los péptidos en los hidrolizados es en general de 3 a 9 aminoácidos.

Los hidrolizados preferidos preparados utilizando un polipéptido de la invención son: un hidrolizado de suero que comprende los péptidos en donde la fracción molar de los péptidos que llevan a cabo una prolina de terminal carboxilo es por lo menos 8%, de manera preferible por lo menos 15%, más de manera preferible de 30 a 70%, un hidrolizado caseína que comprende los péptidos en donde la fracción molar del péptido que lleva a cabo una prolina de terminal carboxilo es por lo menos 25%, de manera preferible de 30 a 70%, y un hidrolizado de soja que comprende los péptidos en donde la fracción molar de los péptidos que lleva a cabo la prolina de terminal carboxilo es por lo menos 20%, de manera preferible de 30 a 70%.

En relación con los hidrolizados descritos anteriormente, por péptidos o fragmentos de péptido se entienden los péptidos con masas moleculares de 400 a 2000 Dalton. Estos péptidos se pueden analizar utilizando métodos conocidos por aquéllos expertos en la técnica (por ejemplo utilizando LC/MC) .

En general en la producción de los hidrolizados de proteína de la invención el sustrato de proteína se hidroliza sustancialmente , ventajosamente por. lo menos 50%. De manera preferible por lo menos 10% del sustrato de proteína se convierte en los péptidos que tienen masas moleculares de 400 a 2000 Dalton. Más de manera preferible de 20 a 90% y aun más de manera preferible de 30 a 80% del sustrato de proteína se convierte en tales péptidos.

En otra realización de la invención, un sustrato de proteína se puede incubar con una mezcla de enzima que comprende una proteasa específica de prolina purificada, aislada, una proteasa serina o una metaloproteasa y una carboxipeptidasa para producir un hidrolizado de proteína enriquecido en los fragmentos de péptido que tienen una prolina de terminal carboxilo.

La mezcla de enzima de la invención es particularmente adecuada para uso en la producción de hidrolizados de proteína destinados a saborizar y mejorar los nutrientes de bebidas para deportistas y bebidas con base en jugo, como la mezcla de péptido hidrolizada resultante que combina una muy baja característica de amargor con excelente solubilidad bajo las condiciones ácidas prevalentes de tales bebidas. La mezcla de enzima de la invención se caracteriza porque esta contiene por lo menos una proteasa por ejemplo una proteasa serina o una metaloendoproteasa en conjunto con una proteasa específica de prolina para proporcionar un hidrolizado principal. Más específicamente, la invención se relaciona con una proteasa específica de prolina purificada, aislada (es decir un polipéptido de la invención) y una proteasa serina o mezcla de enzima metaloproteasa capaz de producir un hidrolizado de proteína que comprende el péptido fragmentos, en donde por lo menos 8%, de manera preferible por lo menos 15%, más de manera preferible de 30 a 70% de dichos fragmentos de péptido que tienen una prolina de terminal carboxilo. v Los sustratos para hidrólisis mediante una mezcla de enzima · de la invención incluyen leche entera, leche desnatada, caseína acida, caseína de cuajo, productos de suero ácidos o productos de suero de queso. Bastante sorprendentemente la proteasa específica prolina derivada de Aspergillus no sólo divide el lado del terminal carboxilo de los residuos prolina sino que también en el lado de terminal carboxilo de residuos hidroxiprolina que hace otras proteínas con base en colágeno originadas en proteínas animales tal como gelatina así como también huesos o huesos de pescado que contienen carne- residual, sustratos interesantes para la enzima. Más aun, los sustratos vegetales como gluten de trigo, cebada molida y fracciones de proteína obtenidos de, por ejemplo, soja, arroz o maíz son sustratos adecuados. Los hidrolizados de proteína de leche producida de acuerdo con la invención se pueden utilizar con o adicionalmente en etapas de filtración o purificación en varios alimentos de especialidad tales como hidrolizados hipoalergénicos para nutrición neonatal, hidrolizados básicos para nutrición entérica y dietética, así como también concentrados de proteína para varias formas de alimentos saludables. Así, los hidrolizados de proteína de la invención se pueden utilizar para producir productos alimenticios que tienen baja antigenicidad, tal como fórmula neonatal. Adicionalmente , las preparaciones de enzima de acuerdo con la invención se pueden utilizar para reducir la amargor en alimentos de sabor de por lo menos un hidrolizado de proteína, aún cuando el hidrolizado de proteína está presente en cantidades mayores. Por ejemplo, los alimentos pueden comprender entre 5% y 10% (p/v) de un hidrolizado de proteína y aún tienen su amargor reducido utilizando una preparación de enzima de la invención.

De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona un producto alimenticio o alimento o una bebida que comprende un hidrolizado de proteína como se describe aquí.

Un polipéptido de la presente invención proporciona proteasa específica de prolina purificada, aislada con un pH ácido óptimo, sola o en una composición que comprende una o más enzimas adicionales para la preparación de un hidrolizado de proteína para varias aplicaciones alimenticias.

Tal proteasa específica de prolina purificada aislada puede tener de manera preferible por lo menos 10 unidades de la actividad proteasa específica de prolina por gramo de material proteínico. Estas unidades se deben medir utilizando el péptido sintético Z-Gly-Pro-pNA a 37°C y pH 5 en el caso que el pH óptimo - de la proteasa específica de prolina está por encima pH 6, por ejemplo en el caso de la proteasa endo específica de prolina Aspergillus niger o también las unidades se deben medir a pH = 7, como se especifica en la sección de Materiales y Métodos.

Esta enzima purificada, aislada sola o en una mezcla de enzima, supera un número de ventajas de mezcla de enzima previamente conocidas en la técnica. De manera más importante, un polipéptido de la invención es la clave en la producción de hidrolizados que se combinan con un potencial bajo alergénico, un alto rendimiento y una baja característica de amargor. Más aún, los hidrolizados producidos con la proteasa específica de prolina purificada, aislada o una mezcla de enzima que comprende esta proteasa específica de prolina son ácidos estables y contienen muy bajos niveles de aminoácidos libres, de tal manera que se generan mínimos sabores extraños durante las etapas de calentamiento, tal como secado por rociado o esterilización de producto. Los hidrolizados de acuerdo con la invención contendrán menos de 900 micromoles de aminoácidos libres por gramo de polvo seco, de manera preferible menos de 300 micromoles de aminoácidos libres por gramo de polvo seco, más de manera preferible menos de 150 micromoles de aminoácidos libres por gramo de polvo seco, y aún más de manera preferible menos de 50 micromoles por gramo de polvo seco.

La mezcla de enzima de acuerdo con la invención se caracteriza porque esta comprende otra endoproteasa tal como una proteasa serina o una metaloendoproteasa en conjunto con proteasa específica de prolina purificada, aislada que trabaja junta para proporcionar un hidrolizado de proteína primario .

Las proteasas serina representan una clase bien conocida de endoproteasas alcalinas y algunos de sus más importantes representantes tal como subtilisina (E.C. 3.4.21.62) y quimotripsina (E.C. 3.4.21.1) se prefiere la división de la cadena de péptido en el lado de terminal carboxilo de aminoácidos hidrófobos tal como Tyr, Trp, Phe y Leu. La mezcla de enzima de la invención puede contener quimotripsina y/o subtilisina. La subtilisina es producida por especies de Bacillus, tiene una especificidad de sustrato particularmente amplia y un pH óptimo alcalino, amplio. La enzima es óptimamente activa entre 50°C y 60°C. La enzima es disponible en forma económica como un producto comercial regular y es útil en la producción de, por ejemplo, varios hidrolizados de leche. La quimiotripsina se puede obtener de pancreasas animales, tiene una especificidad de sustrato algo más estrecha en valores de pH ligeramente más alcalinos más específicos que la subtilisina y es óptimamente activa por debajo de 50° C.

La clase de metaloendoprpteasas se extiende ampliamente en bacterias, hongos y organismos mayores. Se pueden separar en las metaloproteasas acidas y neutras. De estas dos subclases solo las proteasas neutras exhiben la división deseada de preferencia, es decir, dividen la cadena de péptido en el lado de terminal carboxilo de los residuos de aminoácido hidrófobo tal como Phe y Leu. Representantes bien conocidos de la categoría de las metaloproteasas neutras son bacilolisina (E.C. 3.4.24.28) y termolisina (E.C. 3.4.24.27), o ambas, pueden estar presentes en la mezcla de enzima de la invención. Ambas enzimas se obtienen de las especies Bacillus y exhiben la actividad máxima bajo condiciones ligeramente alcalinas o neutras. Se han obtenido representantes menos conocidos de estas metaloendoproteasas neutras a partir de las. especies Aspergillus. En aquellos casos en los que la proteasa específica de prolina no se utiliza para eliminar sus efectos de amargor pero ayudan en la hidrólisis de secuencias de proteína ricas en prolina, pueden ser ventajosas combinaciones con la clase de las metaloproteasas ácidas, como por ejemplo deuterolisina (EC 3.4.24.39).

A pesar de la preparación de tales hidrolizados , también se consideran las aplicaciones que toman ventaja del efecto reductor del amargor de las proteasas específicas de prolina como tal. Por ejemplo, la incorporación de la endopeptidasa en productos alimenticios ¦ proteináceos involucra una etapa de fermentación tal como en quesos o yogurt para suprimir el amargor que puede evolucionar al madurar. También en productos alimenticios proteináceos que requieren tratamiento con proteasas tal como la producción de quesos modificados por enzimas o la producción de hidrolizados de proteína para la industria del sabor, la incorporación de la enzima de acuerdo con la invención ayudará a suprimir la amargor.

Así, la invención proporciona un método para la preparación de un producto alimenticio o alimento o una bebida cuyo método comprende incorporar un polipéptido o una composición de la invención durante la preparación del producto de alimento, el producto alimenticio o bebida. La invención también proporciona el uso de un polipéptido o una composición de la invención en la preparación de un producto alimenticio o alimento o una bebida. También se proporciona por la invención un producto alimenticio o alimento o bebida obtenido por el método o uso anterior.

Las aplicaciones para los polipéptidos y composiciones de las reivindicaciones, por ejemplo en un alimento o una bebida no se limitan por las situaciones en donde se desea la supresión de un sabor amargo.

Por ejemplo, un polipéptido de la invención se puede poner en contacto con una proteína alimenticia para reducir su alergenicidad . Varias proteínas alimenticias contienen subfracciones altamente alergénicas, tal como gluten de trigo que contienen prolaminas con secuencias de péptido ricas en prolina. Estas proteínas se pueden someter a la nueva enzima para aliviar su antigenicidad.

De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona un método para la preparación de un producto alimenticio o alimento o bebida cuyo método comprende incorporar un polipéptido o una composición de la invención durante la preparación del producto de alimento, el producto alimenticio o bebida y en donde el alimento resultante o el producto alimenticio no comprende sustancialmente epítopos relacionados con la enfermedad celiaca.

Adicionalmente, la invención proporciona un polipéptido de la invención para uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno psiquiátrico o un trastorno ligado a enfermedad celiaca .

Las proteínas de la dieta ricas en prolina tal como caseínas en leche bovina o glútenes en cereales se conocen por resistir la degradación proteolítica en el tracto gastrointestinal humano. Como resultado, pueden constituir péptidps ricos en prolina y pueden conducir a efectos indeseables en grupos específicos de individuos. Algunos de estos efectos han sido atribuidos al hecho de que los péptidos ricos en prolina actúan como opioides que se unen a los receptores en tejidos periféricos y el sistema nervioso central. Por ejemplo, los síndromes mostrados por pacientes esquizofrénicos o autistas se han ligado con el consumo de proteínas en la dieta ricas en prolina. Otros efectos son el resultado de la intolerancia a los péptidos ricos en prolina. Por ejemplo secuencias ricas en prolina específica son responsables por la toxicidad observada del gluten en la enfermedad celíaca. La enfermedad celíaca es una enfermedad autoinmune altamente prevalente del intestino delgado que solo se puede tratar por una dieta libre de gluten de por vida. La enfermedad celíaca también se acompaña ocasionalmente por síntomas neurológicos y siquiátricos que ilustran el gran alcance que pueden tener las consecuencias de un metabolismo interrumpido de péptidos ricos en prolina.

El uso de una proteasa específica de prolina para remover péptidos ricos en prolina tóxica de alimentos antes de consumo o para el suministro oral de enzimas correctivas para compensar un proceso de digestión intestinal inadecuada se describe en detalle en la WO 2005/027953 que se incorpora aquí como referencia.

El polipéptido de la invención se puede así utilizar para hidrolizar, por ejemplo en pH por debajo de 5.5, los péptidos ricos en prolina que se relacionan con trastornos siquiátricos incluyen autismo, esquizofrenia, ADHD, trastorno bipolar del estado de ánimo y depresión y trastornos similares a enfermedad celíaca como trastornos autoinmunes, especialmente diabetes tipo A, dermatitis herpetiforme, tiroiditis autoinmune, enfermedades de colágeno, alopecia autoinmune y hepatitis autoinmune y IBS. De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona un polipéptido de acuerdo con la invención para uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno siquiátrico o un trastorno ligado a enfermedad celíaca.

Ventajosamente, la enzima codificada por un polipéptido de la invención se utiliza para producir alimentos, por ejemplo cerveza o pan que son más bajos en, por ejemplo epítopos sustanciálmente libres relacionados con la enfermedad celíaca, de manera preferible epítopos de gluten, más de manera preferible epítopos de trigo o cebada.

La incorporación de un polipéptido de la invención en cualquier clase de masa puede ser deseable ya que se ha observado . que éste retarda la rancidez de los productos, tales como panes así obtenidos.

Una proteasa específica de prolina de la invención se puede utilizar en un método para generar péptidos ricos en prolina. Tales péptidos ricos en prolina son adiciones deseables de varios productos alimenticios o nutracéuticos cuando se han implicado en la acción anoréxica, en efectos fibrinolíticos y antitrombóticos y antihipertensivos , en protección de la mucosa gástrica así como también la prevención de la artritis reumatoide .

Una aplicación adicional es la adición de un polipéptido de la invención en un alimento animal para mejorar la utilización de la proteína. Por ejemplo, la adición de un polipéptido de la invención se puede utilizar para mejorar la digestibilidad de secuencias ricas en prolina difíciles dé digerir presentes en proteínas de alimentos así como' también para índices de conversión mejorados de proteínas vegetales disponibles económicamente que contienen altos niveles de polifenoles Adicionalmente, la invención proporciona uso de un polipéptido de la invención en la preparación de una bebida, por ejemplo en fabricación de cerveza. Las proteínas de cebada, por ejemplo, son ricas en secuencias ricas en prolina y en sus proteínas de cereal en forma no malteada son extremadamente difíciles de degradar en los aminoácidos libres requeridos para crear un mosto fermentable adecuado. De acuerdo con lo anterior, la incorporación de un polipéptido de la invención en el proceso de maceración se puede utilizar para estimular la liberación de aminoácidos de cebada molida pero no malteada de tal manera que se obtiene un mosto mucho más rico. En una forma similar se puede mejorar la fermentación de la cerveza de macerados que contienen una alta proporción de cereales localmente disponibles y otros económicos tal como por ejemplo sorgo.

La invención también proporciona un método para la prevención o reducción de turbidez en una bebida. Tal un método comprende agregar un polipéptido de la invención a una bebida, o incorporar un polipéptido de la invención durante la preparación de la bebida para prevenir por lo tanto o reducir turbidez en la bebida. Aquí, el término "bebida" incluye cualquier bebida en cualquier etapa de su preparación. Así, una bebida no es sólo una bebida para lista para consumo sino también cualquier composición utilizada para preparar la bebida. Por ejemplo, el mosto utilizado en la preparación de la cerveza se abarca por el término "bebida" como se utiliza aquí. También, la adición de un polipéptido de la invención durante la preparación de una bebida para composiciones que no son o no son totalmente líquidas se pretende caber dentro del método de acuerdo con la invención. Un polipéptido de la invención agregado a un macerado al inicio de la fabricación de la cerveza es un ejemplo de tal una composición. El uso de las proteasas específicas de prolina en la reducción o prevención de turbidez en la cerveza se describe en detalle en O 02/46381 y WO 2007/101888.

Aquí, las palabras péptido y proteína se utilizan intercambiablemente. En este texto, las palabras "turbidez", "nuboso" y "turbidez" también se utilizan de forma intercambiable. Para cuantificar la cantidad de turbidez en una bebida, se utiliza a menudo un turbidímetro . En un turbidímetro se mide la cantidad de luz que se dispersa en un ángulo pre-descrito con respecto a la dirección del rayo de luz incidente. Las mediciones de turbidez son muy adecuadas para la medición de turbidez formada como el resultado de interacciones de proteína-polifenol . La forma en la que las mediciones de turbidez se pueden llevan a cabo en bebidas a las que se ha agregado un polipéptido de la invención, se describe en detalle en WO 2007/101888. Cuando se utiliza una proteasa específica de prolina en un método para reducir o prevenir la turbidez, parece que las mediciones de turbidez se pueden llevar a cabo de manera preferible utilizando un ángulo de dispersión de 25 grados.

Un polifenol se define como un compuesto que tiene una estructura química cuya estructura contiene por lo menos dos anillos aromáticos sustituidos con por lo menos un grupo hidroxilo o que tiene una estructura química que contiene por lo menos un anillo aromático sustituido con por lo menos dos grupos hidroxilo. Ejemplos de polifenoles son taninos y flavonoides, que incluyen por ejemplo catequinas, flavonoles y antocianinas ..

El método de acuerdo con la invención se puede aplicar ventajosamente a la cerveza, vino y jugos de frutas. También se puede aplicar ventajosamente una bebida alcohólica diferentes a cerveza y vino.

El término "cerveza" como se utiliza aquí pretende cubrir por lo menos cerveza preparada de macerados preparados de cereales no macerados así como también todos los macerados preparados a partir de cereales · maleados, y todos los macerados preparados a partir de una mezcla de cereales malteados y no malteados . El término "cerveza" también cubre cervezas preparadas con auxiliares, y cervezas con todos los contenidos de alcohol posibles.

El zumo de frutas puede ser un zumo obtenido de por ejemplo bayas rojas, fresas, manzanas, peras, tomates, zumos de cítricos, vegetales, etc.

La cantidad de un polipéptido de la invención que se agrega a una bebida, en el método de acuerdo con la invención', puede variar entre amplios límites. En una realización preferida del método de acuerdo con la invención por lo menos 150 mili-unidades de actividad de proteasa específica de prolina, en donde la actividad se determina por una medición de la actividad utilizando Z-Gly-Pro-pNA como un sustrato, se agrega por gramo de proteína en la bebida. Más de manera preferible, por lo menos 500 mili-unidades de proteasa específica de prolina se agregan a la bebida, y más de manera preferible, se agrega por lo menos 1 unidad de proteasa específica de prolina.

No se puede especificar una cantidad máxima de un polipéptido de la invención para ser agregada. La cantidad máxima es por ejemplo dependiente de la cantidad deseada de reducción o prevención de turbidez, la composición de la bebida/ el pH de la bebida y el pH en el cual la proteasa tiene su actividad máxima.

Un polipéptido de la invención se puede agregar en diferentes etapas durante la preparación de una bebida. Durante el proceso de preparación de la cerveza, un polipéptido de la invención se puede agregar ventajosamente a un macerado. El polipéptido de la invención se puede agregar a una cerveza fermentada antes que se forme turbidez. Sin embargo, también es posible que un polipéptido de la invención se agregue a una cerveza fermentada después que se ha formado la turbidez . Un polipéptido de la invención se puede agregar ventajosamente al macerado o etapa de maduración en un proceso para la preparación de la cerveza.

Durante la preparación de un vino, un polipéptido de la invención se puede agregar de manera preferible a un vino fermentado. El polipéptido se puede agregar ventajosamente después de una fermentación alcohólica o después de una fermentación maloláctica en un proceso para la producción de un vino.

En un proceso para .la preparación de un zumo de frutas, un polipéptido de la invención se puede agregar de manera preferible durante la maceracion o la despectinización.

Dado que la formación de la turbidez frecuentemente ocurre en bebidas acidas tal como por ejemplo cerveza, vino y zumo de frutas, se. utiliza de manera preferible un polipéptido de la invención que tiene una actividad específica de prolilo en un valor de pH entre 7. Más de manera preferible, las proteasas específicas a prolilo que tienen una actividad específica a prolijo máxima en un valor pH por debajo de 7 se utilizan en el método de acuerdo con la invención .

Como es típico para las actividades de las enzimas, la actividad de las proteasas específicas para el prolilo es dependiente del pH. En una realización preferida del método de acuerdo con la invención, se agrega una proteasa a la bebida que tiene una actividad específica de prolilo máxima en un pH que corresponde al pH de la bebida agregado. Las bebidas preferidas son bebidas que contienen proteínas. En otra realización preferida, la bebida contiene proteínas y polifenoles. Las bebidas preferidas son bebidas que tienen un valor de pH por debajo de 7.

Una proteasa específica de prolina puede comprender por lo menos aproximadamente 5 unidades por gramo de proteína de la enzima que va a ser utilizada, de manera preferible aproximadamente 10 unidades/g, más de manera preferible aproximadamente 25 unidades/g y aun más de manera preferible aproximadamente 50 unidades/g.

De acuerdo con una realización de la invención, el uso de un polipéptido de la invención puede permitir que se reduzca el tiempo necesario para la estabilización de una bebida tal como la cerveza (cuando se compara con un proceso en el que rio se utiliza una proteasa específica de prolina) . Por ejemplo, el periodo de estabilización se puede acortar en menos de aproximadamente 7 días. De manera preferible éste es menor de 6, 5, 4 o 3 días. Más de manera preferible, éste se acorta a menos de 2 o 1 día.

Más de manera preferible, la fase de estabilización se puede acortar a tal un grado que en la escala de producción, la duración de la estabilización se reduce el equivalente del periodo requerido para enfriar la cerveza de la fase de maduración a la temperatura deseada, por ejemplo la temperatura deseada para filtración y/o envase de la cerveza. Este periodo se llama convencionalmente el periodo de enfriamiento. Acortar el periodo de estabilización al tiempo requerido para enfriar la cerveza bajo la temperatura deseada, es altamente ventajoso ya que luego de la duración de la fase de estabilización sólo depende en la capacidad disponible de enfriamiento.

La cerveza de la fase de maduración se enfria tradicionalmente a una temperatura de aproximadamente hasta -2°C y que incluye aproximadamente 0°C. Sin embargo, el uso de una proteasa específica de prolina de acuerdo con la invención permite que la fase de estabilización no sólo sea acortada, sino que también sea desarrollada a una temperatura mayor del uso convencional. Tradicionalmente, existen procesos de estabilización que se llevan a cabo a temperaturas mayores, pero estos procesos toman mucho más tiempo, por ejemplo 6 semanas y más. Por lo tanto, en otra realización de la invención, el periodo de estabilización, que puede típicamente ser un periodo de estabilización acortado como se definió anteriormente, se desarrolla en una cerveza de manera preferible enfriada a más de aproximadamente 2°C, más de manera preferible a más de aproximadamente 3°C, 4°C, 5°C o 6°C o aún más de manera preferible a más de aproximadamente 7°C o aproximadamente 8°C' y más de manera preferible a la temperatura deseada se utiliza para envasar, es decir para llenar una botella o barril.

La temperatura deseada para el envase puede diferir de proceso a proceso, pero se lleva a cabo de manera preferible a una temperatura de hasta y que incluye 8°C, de manera preferible alrededor de 7°C, con el fin de obtener el nivel deseado de dióxido de carbono disuelto en la cerveza. En un proceso en donde la cerveza sólo se enfría bajo la temperatura requerida para envasar, se requiere considerablemente menos energía que en el proceso conocido en la técnica.

En una realización preferida de acuerdo con la invención, la fase de estabilización se puede reducir al periodo requerido para enfriar la cerveza desde la temperatura al final de la fase de maduración a la temperatura deseada para el envase, por lo tanto omitiendo el periodo de estabilización en frío convencional.

De acuerdo con la invención, por lo tanto, se puede enfriar la cerveza a más de aproximadamente 2°C, más de manera preferible a más de aproximadamente 3°C, 4°C, 5°C o 6°C, aún más de manera preferible a más de aproximadamente 7°C o 8°C y más de manera preferible a la temperatura deseada utilizada para empaque. La cerveza luego se puede envasar directamente, es decir, en esta realización, la cerveza no se mantiene durante cualquier periodo a la temperatura a la que se ha enfriado.

En la invención, las etapas de procesamiento adicional se pueden llevar a cabo para alcanzar la clarificación adicional y/o estabilidad si se requiere. De hecho, si se usa una fase de estabilización corta se utiliza que lo corresponde al periodo requerido para enfriar la cerveza a la temperatura deseada para envase, y puede ser deseable tratar la cerveza con PVPP y/o gel de sílice por ejemplo. Esto puede ayudar a asegurar la estabilidad de vida útil extendida.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incorporan aquí como referencia al mismo grado como si cada publicación individual o solicitud de patente es específicamente e individualmente indicada para ser incorporada como referencia.

Los siguientes Ejemplos ilustran la invención: EJEMPLOS Materiales & Métodos Los péptidos cromogénicos : todos los péptidos sintéticos se proporcionan por Pepscan Presto (Almere, The Netherlands) .

El método espectrofotométrico para determinar la actividad de proteasa especifica a prolilo: la solución de sustrato es una solución 2 mM de N-carbobenzoxi-glicina-prolina-p-nitro aríilida (Z-Gly-Pro-pNA; p.m. 426.43; Bachem) hecha en ácido cítrico 0.1 M/0.2 M, amortiguador de fosfato de disodio pH 5.0 que contiene 40 % dedioxano. Se agrega 1 mL del amortiguador de pH 5.0, 250 µ? de la solución de sustrato seguido por 100 µ? de la solución de enzima (cantidades de volumen más grandes o más pequeñas de solución de enzima se deben compensar mediante la solución amortiguadora) . La mezcla de reacción se incuba a 37°C y la liberación de pNA se sigue al medir el incremento de la absorbancia en 410 nm.

Definición de la actividad: 1 unidad de la proteasa específica de prolina es la actividad de enzima que libera ?µp??? de pNA de Z-Gly-Pro-pNA en 1 minuto bajo condiciones de reacción descritas. Con el fin de calcular concentraciones se utiliza un coeficiente de extinción molar (E) de 8,800 -l.

SDS-PAGE: todos los materiales utilizados por SDS-PAGE y la tintura se compra de Invitrogen (Carlsbad, CA, US) . Se preparan muestras utilizando el amortiguador SDS de acuerdo con instrucciones del fabricante y se separan en 12% de geles Bis -Tris utilizando el sistema de amortiguador MES-SDS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se desarrolla tinción utilizando el tinte Simply Blue Safe (Collodial Coomassie G250) .

Ejemplo 1 Clonación y expresión del gen proteasa específica de prolina ZFX La cepa Penicillium chrysogenum CBS 455.95 se hace crecer durante 3 días en 30 grados Celsius en PDB (caldo de cultivo de dextrosa de patata, Difco) y ADN cromosómico se aisla del micelio utilizando el paquete Q-Biogene (catálogo nr. 6540-600; Omnilabo International BV, Breda, the Netherlands) , utilizando las instrucciones del proveedor. Este ADN cromosómico se utiliza para la amplificación de la secuencia de codificación del gen proteasa específico a prolina utilizando PCR.

Para amplificar específicamente el gen proteasa específico a prolina ZFX del ADN cromosómico de la cepa Penicillium chrysogenum CBS 455.95, se diseñan dos cebadores PCR. Las secuencias cebadoras se obtienen parcialmente de una secuencia que se encuentra en el ADN genómico de Penicillium chrysogenum CBS 455.95 y se describe en la SEQ ID NO: 1. Encontramos que esta secuencia tiene <50% de identidad con gen proteasa específico a prolina de secuencias de Aspergillus niger. Describimos aquí por primera vez la expresión eficiente y caracterización de una proteasa Penicillium específica de prolina secretada. La secuencia de proteína de la proteína proteasa específica de prolina completa, que incluye pre- y pro- secuencias potenciales se describe en la SEQ ID NO: 3.

ZFX-dir 5'-CACTTAATTAACTCATAGGCATCATGCATTTCTCAACTGTGGTTAAG (SEQ ID NO: 4) ZFX-rev 5 ' -TTAGGCGCGCCTCGCAAGCTGATACGAAAGGG (SEQ ID NO: 5) El primer cebador PCR, directo (ZFX-dir) contiene la secuencia codificante ZJW de 24 nucleotidos partiendo del^ codón de inicio ATG, precedido por una secuencia de 23 nucleotidos que incluye un sitio de restricción Pací (SEQ ID NO: 4). El segundo cebador, inverso (ZFX-rev) contiene nucleotidos de la cepa complementaria inversa de la región de la dirección 3' de la secuencia que codifica ZFX precedido por un sitio de restricción AscI (SEQ ID NO: 5) . Utilizando estos cebadores somos capaces de amplificar un fragmento de tamaño de 1.9 kb con ADN cromosómico de la cepa Penicillium chrysogenum CBS 455.95 como la plantilla. El fragmento de tamaño de 1.9 kb así obtenido se aisla, se digiere con Pací y AscI y se purifica. El fragmento Pací / AscI que comprende las secuencias ZFX codificantes se intercambia con el fragmento PacI/AscI phyA del vector de expresión pGBFIN-5 (WO 99/32617) . El plásmido resultante es el vector de expresión ZFX nombrado pGBFINZFX (ver Figura 1) , en donde el gen ZFX se acopla funcionalmente al promotor glaA de Aspergillus niger. El vector de expresión pGBFINZFX se lineariza mediante digestión con Notl, que remueve todas las secuencias derivadas de E. coli del vector de expresión. El ADN digerido se purifica utilizando fenol: cloroformo: isoamilalcohol (24:23:1) extracción y precipitación con etanol . Estos vectores se utilizan para transformar Aspergillus niger CBS513.88. Un proceso de transformación de Aspergillus niger se describe extensivamente en WO 98/46772. También se describe cómo seleccionar transformantes en placas agar de medio selectivo que contienen acetamida como, fuente de nitrógeno solo, y para seleccionar integrantes multicopia objetivo. De manera preferible, los transformantes A. niger que contienen múltiples copias del cásete de expresión se seleccionan para generación adicional del material de muestra. Para el vector de expresión se purifican transformantes pGBFINZFX 30 A. niger; primero al colocar transformantes individuales en placas de medio selectivo seguido por colocar una colonia única en placas PDA (agar de dextrosa de papa:. PDB + 1.5% agar) . Las esporas de los transformantes individuales se recolectan después de crecimiento durante 1 semana a 30 grados Celsius. Las .esporas se almacenan refrigeradas y se utilizan para la inoculación del medio líquido.

Las cepas transformantes A. Níger se utilizan para la generación del material de muestra al cultivar las cepas en cultivos de matraz de agitación. Un método útil para el cultivo de las cepas A. niger y la separación del micelio del caldo de cultivo se describe en WO 98/46772. El medio de cultivo es en CSM-MES (150 g maltosa, 60 g Soytone (Difco) , 15 g (NH4)2S04, 1 g NaH2P04.H20, 1 g MgS04.7H20, 1 g L-arginina, 80 mg Tween-80, 20 g MES pH6.2 por litro de medio). Muestras de 5 mi se toman de cultivos duplicados en el día 4-8 de la fermentación, se centrifugan durante 10 min a 5000 rpm en un Hereaus labofuge RF y se almacenan los sobrenadantes a -20°C hasta análisis adicional.

Esto llega a ser claro que los transformantes que contienen el vector pGBFINZFX tiene una secreción sorprendentemente eficiente de una proteína de peso molecular evidente de aproximadamente 65 kDa cuando se analiza con SDS-PAGE. Ya que esto es casi idéntico al peso molecular que se predice de la secuencia de proteína de ZFX, presumimos que después de la remoción de la secuencia de señal casi ninguna glucosilación tiene lugar cuando la proteasa específica de prolina ZFX Penicillium chrysogenum se secreta de Aspergillus niger.

Se pueden utilizar cepas seleccionadas para aislamiento y purificación de una gran cantidad de proteasa específica de prolina Penicillium, cuando la fermentación y el procesamiento en la dirección 3' se escalan. Esta enzima se puede utilizar para análisis adicional, y para el uso en diversas aplicaciones industriales.

Ejemplo 2 La enzima codificada por el gene ZFX es una proteasa específica de prolina El caldo de fermentación de un transformante A. niger seleccionado se recupera después que se filtra el líquido y luego se filtra estéril utilizando un filtro Millipore de 0.22 micrómetros. El líquido claro luego se concentra utilizando una unidad de ultrafiltración Pellicon (Millipore, Bedford, MA, USA) . Para purificar la actividad de la enzima codificada por el gen ZFX, el líquido concentrado luego se somete a cromatografía de intercambió de anión utilizando Q-sepharose FF XK (GE Healthcare Bio-Sciences , Diegem, Belgium) . Para este fin, el líquido concentrado se equilibra con 20 mM de citrato de sodio, pH 6.4 y se aplica a la columna equilibrada en el mismo amortiguador. La elución de columna tiene lugar en veinte volúmenes de columna utilizando un gradiente lineal de 0 a 1 mol/1 NaCl en el amortiguador de aplicación. Las fracciones eludidas se someten a SDS-PAGE y tinción (ver la sección de Materiales & Métodos) . Se agrupan aquellas fracciones que muestran una banda de proteína correspondiente con un peso molecular de aproximadamente 65 kDa, se dializan y de nuevo se someten al mismo procedimiento cromatográfico y se agrupan. La preparación resultante contiene sólo una banda de protéína única como se juzga por SDS-PAGE y tinción.

Para confirmar la actividad proteolítica de la proteína purificada, se llevan a cabo incubaciones con una pieza completa de péptidos cromogénicos sintéticos de la Fórmula Z-Ala-Ala-X-pNA (Z: benciloxicarbonilo ; pNA: para-nitroanilida; X: cualquiera de todos los 20 residuos de aminoácido) . Los sustratos individuales primero se disuelven en DMSO y luego se diluyen en la concentración deseada de aproximadamente 3 milimol/1 en 0.1 mol/1 de acetato de sodio pH 4.0 o en 0.1 mol/1 de amortiguador tris-HCl pH 7.0. Después de la adición de la enzima, el ensayo de la actividad se desarrolla en una placa de microtítulo (MTP) utilizando un lector Tecan Genios MTP que corre con el software Magellan (Tecan, Salzburg, Vienna) .

De acuerdo con los resultados obtenidos, sólo el péptido Z-Ala-Ala-Pro-pNA se divide eficientemente demostrando que el Penicillium se deriva de la enzima ZFX cuando se sobreexpresa en A. niger de hecho es una proteasa específica de prolina. La caracterización adicional de la enzima utilizando el péptido Z-Ala-Ala-Pro-pNA disuelto en los amortiguadores Na-citrato- ES , MES-NaOH y Tris-HCl revelan que, después de 60 minutos de incubación a 37 grados C, la actividad proteolítica óptima se agota alrededor de pH 4.5.

Ejemplo 3 Proteasa específica de prolina ZFX tiene una temperatura óptima alrededor de 37°C Con el fin de probar la temperatura óptima de la proteasa específica de prolina de Penicillium, la enzima sobre expresada ZFX, se purifica cromatográficamente como se describe en el Ejemplo 2, se incuba de nuevo con el péptido Z-Ala-Ala-Pro-pNA. Una mezcla de reacción que contiene 440 microlitros 0.1mol/l Na-citrato pH 5.0, 50 microlitros del péptido cromogénico en una concentración de 15 milimol/1 y 10 microlitros de la solución de enzima purificada, se incuba durante 70 minutos en diferentes temperaturas. Luego la reacción se detiene al agregar 0.5 mi 2% (p/pj de solución Tris y la densidad óptica a 405 nm se mide para cuantificar la actividad enzimática acumulada bajo estas circunstancias. Los resultados obtenidos (ver Figura 3) claramente demuestran una temperatura óptima de la actividad proteolítica alrededor de 37 °C.

Ejemplo 4 La enzima ZFX se inactiva completamente luego de pasteurización Una de las aplicaciones industriales de la proteasa específica de prolina de A. niger es su uso para prevenir la formación de turbidez por congelamiento en la cerveza. En esta solicitud, la actividad de enzima se debe perder durante la pasteurización de la cerveza. En vista de la temperatura relativamente baja óptima de la enzima ZFX, probamos si la enzima ZFX sobreviviría o no a las condiciones de pasteurización típica de la cerveza.

A diferencia de utilizar la cerveza, se utiliza cerveza "reconstituida" para esta prueba. La razón para esto es nuestra observación de que el cambio de color resultante de una división exitosa del péptido Pro-pNA unido se enturbia por el color presente en la cerveza. Por lo tanto, la enzima ZFX se disuelve en una dosificación industrialmente relevante en 50 milimol/1 de amortiguador a-acetato pH 4.5 que contiene 5 % de etanol . Después de someter la cerveza al tratamiento de pasteurización usual de 20 minutos a 60°C, el líquido se enfría a 37°C. Luego el péptido Z-Ala-Ala-Pro-pNA se agrega a . una concentración final de 3 milimol/1 para detectar cualquier actividad proteolítica específica de. prolina residual. Aún después de tiempos de incubación prolongados no se incrementa , en OD 405 se puede registrar ilustrando que la enzima ZFX derivada de Penicillium se inactiva completamente mediante el tratamiento de pasteurización que se aplica.

Claims (27)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la invención como antecede, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que tiene actividad proteasa específica de prolina que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO : 2, o una variante del mismo o un fragmento de cualquiera de los mismos.

2. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, que tiene por lo menos aproximadamente 60%, 65% 70% 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 3.

3. Un fragmento de polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, que tiene por lo menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud.

4. Un polipéptido que tiene actividad proteasa específica de prolina que comprende un dominio funcional de un polipéptido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

5. Un polinucleótido que comprende: (a) la secuencia de nucieótidos como se establece en la SEQ' ID NO:.1 y/O SEQ ID NO: 2; (b) una secuencia de nucieótidos que híbrida selectivamente con un polinucleótido que es el complemento inverso de la SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 ; (c) una secuencia de nucieótidos que tiene por lo menos aproximadamente 50% de identidad de secuencia con la secuencia de nucieótidos de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2 ; (d) un fragmento de una secuencia de nucieótidos como se define en (a) , (b) o (c) que tiene por lo menos 100 nucieótidos ; (e) una secuencia que se degenera como un resultado del código genético a una secuencia como se define en uno cualquiera de (a) , (b) , (c) o (d) ; o (f) una secuencia de nucieótidos que es el complemento inverso de una secuencia de nucieótidos como se define en (a) , (b) , (c) , (d) o (e) .

6. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5 que híbrida bajo condiciones altamente severas con un polinucleótido que es el complemento inverso de la SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 2.

7. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

8. Un polinucleótido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es una secuencia .de AD .

9. Un polipéptido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un polinucleótido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 5 u 8 que se obtiene de un hongo.

10. Un polipéptido o polinucleótido de conformidad con la reivindicación 9 que se obtiene de Penicillium chrysogenum.

11. Un vector que incorpora una secuencia de polinucleótido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10.

12. Un vector de conformidad con la reivindicación 11 en donde el vector es un vector de expresión, por ejemplo donde la secuencia de polinucleótido se liga operablemente con una secuencia reguladora, que permite la expresión de la secuencia de polinucleótido en una célula.

13. Un vector de conformidad con la reivindicación 12 en donde la célula es una célula fúngica filamentosa.

14. Una célula que comprende un polipéptido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 9 o 10, un polinucleótido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 o un vector de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.

15. Un método para la preparación de un polipéptido que tiene actividad de proteasa específica de prolina, cuyo método comprende cultivar una célula de conformidad con una 5 cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 bajo condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido y, opcionalmente , recuperar el polipéptido expresado.

16. Un polipéptido obtenido por un método de conformidad con la reivindicación 15. '10

17. Una composición que comprende: (i) un polipéptido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 9, 10 ó 16; y, opcionalmente, (ii) una proteasa que es diferente del polipéptido en (i) .

18. Un método para la preparación de un hidrolizado de 15 proteína, método que comprende poner en contacto un sustrato de proteína con un polipéptido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 9, 10 ó 16 ó una composición de conformidad con la reivindicación 17,

19. Uso de un polipéptido de conformidad con una 20 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 9, 10 ó 16 o una composición de conformidad con la reivindicación 17 en la preparación de un hidrolizado de proteína.

20. Un hidrolizado de proteína obtenido por un método de conformidad con la reivindicación 18.

21. Un producto alimenticio o alimento o bebida que comprende un hidrolizado de proteína de conformidad con la reivindicación 20.

22. Un método para la preparación de un producto alimenticio o alimento o una bebida cuyo método comprende incorporar un polipéptido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 9, 10 ó 16 o una composición de conformidad con la reivindicación 17 durante la preparación del producto de alimento, el producto alimenticio o bebida.

23. Un método de conformidad con la reivindicación 22, en donde el método previene o reduce la turbidez en una bebida.

24. Un método de conformidad con la reivindicación 22 ó 23, en donde el alimento resultante o el producto alimenticio no comprende sustancialmente epítopos relacionados con enfermedad celíaca.

25. Uso de un polipéptido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 9, 10 ó 16 o una composición de conformidad con la reivindicación 17 en la preparación de un producto alimenticio o alimento o una bebida.

26. Un producto alimenticio o alimento o bebida que se puede obtener por un método de conformidad con la reivindicación 22.

27. Un polipéptido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4~, 10 ó 16 para uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno psiquiátrico o un trastorno ligado a enfermedad celíaca.