CN103997902A - 用木聚糖酶补充的饲料组分 - Google Patents

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Abstract

一种用超嗜热和超热稳定的木聚糖酶补充的动物饲料。

Description

用木聚糖酶补充的饲料组分
技术领域
本发明涉及用超热稳定和超嗜热木聚糖酶补充的动物饲料。
背景技术
木聚糖酶已用作饲料添加剂多年。事实上一些但不是全部木聚糖酶已显示出提高动物绝对体重增加(BWG)和供给饲料的饲料转化率(FCR)中的一者或二者。
饲料中使用的木聚糖酶可例如允许营养学家降低饮食中的能量需求而不影响动物的畜牧学表现。
木聚糖酶增加生料(raw ingredient)的可代谢或净能量，从而增加饮食的总可代谢或净能量含量。畜牧学表现可因此在不是很贵的饮食中保持有较少的原能量(raw energy)(较低脂肪/油脂；较多纤维)。
关系到木聚糖酶的使用的可能好处是更好地释放饲料细胞壁内捕集的(微)养分。此类捕集是由于对动物消化有抵抗的非淀粉多糖的存在。
为了起作用，用作饲料添加剂的木聚糖酶应在接近于动物胃肠道发现的条件的pH和温度下是稳定的和活性的。
WO95/29997描述了热稳定木聚糖酶并提及它们包含在动物饲料中。热稳定性被定义为在95℃有一分钟抵抗力，结合随后在40℃下水解小麦阿拉伯木聚糖(阿糖基木聚糖)溶液的能力。然而，五分钟的加热处理之后，公开的木聚糖酶明显失去其活性。
许多种类和菌种的栖热袍菌(Thermotoga)已被描述来生产一种或更多超嗜热和热稳定的木聚糖内切酶。喜温海洋杆菌(Thermotoga maritima)产生两种热稳定木聚糖内切酶，命名为XynA和XynB。XynA和XynB存在为具有约120和40kDa表观分子量的蛋白质。最适pH(XynA和XynB分别为pH6.2和pH5.4)下最大活性对于XynA在约92℃且对于XynB在约105℃测得(Winterhalter and Liebl,1995,Appl.Env.Microbiol.,61,1810-1815)。
发明内容
本发明第一方面是用包含超嗜热和超热稳定木聚糖酶的组分(composition)补充的动物饲料。
优选地，在所述组分中存在的木聚糖降解(xylanolytic)活性的最适(optimum)温度高于80℃，更优选高于85℃，还更优选高于90℃。
优选地，存在于这种组分中的木聚糖降解活性在最适温度与在40℃下的活性比率(活性比值，ratio of activity)高于10，更优选高于20。
有利的是，存在于这种组分中的超过70％的木聚糖降解活性对90℃下加热30分钟有抵抗力。
更优选地，超嗜热和超热稳定木聚糖酶与选自由以下组成的组的木聚糖酶具有超过80％的同一性和/或超过90％的相似性：SEQ.ID.NO:1、SEQ.ID.NO:2、SEQ.ID.NO:3、SEQ.ID.NO:4、SEQ.ID.NO:5，SEQ.ID.NO:l、SEQ.ID.NO:2、SEQ.ID.NO:3、SEQ.ID.NO:4和SEQ.ID.NO:5的氨基酸21-332且可能地该动物饲料包括0.08至40mg/kg之间的所述超嗜热和超热稳定(纯)木聚糖酶。
可能地该动物饲料为液体且优选并包括0.08至40mg/l之间的超嗜热和超热稳定(纯)木聚糖酶。
可替换地，该动物饲料选自由青贮(青贮饲料，silage)、颗粒饲料和粉状饲料(mash feed)组成的组。
优选地，动物饲料包括至少50％(干重)植物材料，其更优选选自由谷物、豆类(豆类植物，legumes)、甜菜糖蜜(beet molasse)、马铃薯渣(potato pulps)和花生饼粉(peanut meal)组成的组。
优选地，动物饲料包括至少5％(干重)蛋白质和/或至少2％(干重)脂肪。
相关方面是动物饲料，其包括0.08至40mg/kg(干重)之间的多肽，该多肽与选自由以下组成的组的多肽具有超过80％的同一性和/或超过90％的相似性：SEQ.ID.NO:1、SEQ.ID.NO:2、SEQ.ID.NO:3、SEQ.ID.NO:4、SEQ.ID.NO:5，SEQ.ID.NO:1、SEQ.ID.NO:2、SEQ.ID.NO:3、SEQ.ID.NO:4和SEQ.ID.NO:5的氨基酸21-332。
另一相关方面是动物饲料用于在动物中提高体重增加(body weightgain)和/或饲料转化率(feed conversion ratio)的(非治疗)应用，优选非反刍脊椎动物或甲壳类动物(crustacean)且更优选鱼、猪或家禽。
另一个相关方面是动物饲料的生产方法，其包括以下步骤：
a)选择包含半纤维素的饲料：
b)添加包含超嗜热和超热稳定木聚糖酶的组分。
优选地，存在于该方法步骤b)所添加的组分中的超过70％的木聚糖降解活性对在90℃加热所述组分30分钟有抵抗力和/或存在于这种组分中的木聚糖降解活性的最适温度高于80℃(优选高于85℃，更优选高于90℃)。
具体实施方式
本发明人已发现将超嗜热(和超热稳定)木聚糖酶添加到饲料中，结果提高了动物的饲料转化率。
虽然超嗜热木聚糖(内切)酶的最适工作温度比动物的肠道温度高得多，发明人已发现这些酶提高体重增加和/或饲料转化率，甚至与通常使用的饲料木聚糖(内切)酶相比也是如此。更具体地，发明人甚至已发现超嗜热(和超热稳定)的木聚糖酶比嗜热(和热稳定)的木聚糖酶显示更好的结果。
在动物用补充超嗜热和超热稳定木聚糖酶的粉状饲料喂养的情况中，对比用非补充粉状饲料喂养的动物和用已补充主要在37-50℃具有活性的木聚糖酶的粉状饲料喂养的动物，动物绝对体重增加(BWG)和饲料转化率(FCR)均被提高。
FCR是指动物消耗的饲料量相对于其重量增加之间的比率。较低的FCR率表示较高的饲料利用效率。
在使用超嗜热和超热稳定木聚糖酶的情况下这些结果与在37℃测量的极低的木聚糖降解活性形成对比。
本发明第一方面是用(和/或包括)包含超嗜热(即，(总)木聚糖降解活性的最适温度高于80℃，优选高于90℃或95℃和/或在最适温度和40℃时的活性比率高于10或甚至高于15或20)和超热稳定木聚糖酶(即，该组分的(总)木聚糖降解活性对热失活(变性)非常有抵抗力，如超过70％的活性抵抗在90℃加热30分钟在油浴中含有木聚糖酶的添加剂)补充的饲料(动物饲料)。
饲料可包括0.08mg/kg饲料和40mg/kg饲料之间的超嗜热和超热稳定木聚糖酶，更优选在0.2mg/kg饲料和20mg/kg饲料之间，还更优选在0.4mg/kg饲料和16mg/kg饲料之间的(纯)酶。
优选地，饲料包括10DXU/kg饲料和5000DXU/kg饲料之间的超嗜热和超热稳定木聚糖酶，更优选在25DXU/kg饲料和2500DXU/kg饲料之间，还更优选在50DXU/kg饲料和2000DXU/kg饲料之间。
在本发明上下文中，除非明确提及其他值，一个单位的木聚糖酶(DXU)被定义为每分钟从pH6且70℃的3％桦木木糖溶液释放1微摩尔还原糖(表示为木聚糖)需要的酶量。
相关方面是包含超嗜热和超热稳定木聚糖酶的饲料添加剂(动物饲料添加剂)。
在本发明上下文中，“超热稳定木聚糖酶”是指一种木聚糖酶，其中超过70％的(总)木聚糖降解活性(存在于该组分中)对90℃加热(该组分)30分钟有抵抗力(能够抵抗和/或能够在以后保持)。术语“总木聚糖降解活性”是指添加到动物饲料的超嗜热和超热稳定木聚糖酶的木聚糖降解活性，且还指不太优选存在于组分中的其他(污染物)木聚糖酶的活性，如在本发明中所公开的。
优选地，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至直到100％的存在于该饲料中和/或在该饲料添加剂中的(总)木聚糖降解活性能够在30分钟(或45分钟或1小时)90℃(或95℃)加热(该饲料和/或该饲料添加剂)后得到保持。
优选地，存在于添加到本发明饲料的组分中的(总)木聚糖降解活性的最适温度(温度最适条件)高于80℃，更优选高于85℃、90℃，或甚至高于95℃。
优选地，存在于添加到本发明饲料(包括超嗜热和超热稳定木聚糖酶)的组分中的(总)木聚糖降解活性在最适温度(如，80℃、85℃、90℃、95℃、或甚至约100℃)和在40℃(或37℃)下的活性比率高于10，更优选高于20。
在本发明上下文中，术语“具有木聚糖降解活性的酶”、“木聚糖内切酶”、或“木聚糖酶”是指能够水解含木糖的多糖中连接木糖残基的内部糖基键的酶(例如重组的、至少部分纯化的木聚糖酶或，次优选地，酶的混合物)。此类糖基键可为例如此类多糖的β-D-吡喃木糖基-1,4-β-D吡喃木糖基单元中的β-1,4-糖基键。
具有木聚糖降解活性的优选的酶为木聚糖内切酶(EC.3.2.1.8.)。
具有木聚糖降解活性的优选的酶是来自糖苷水解酶家族10的木聚糖内切酶。
具有木聚糖降解活性(超嗜热和超热稳定木聚糖酶)的最优选的酶有喜温海洋杆菌菌种衍生的酶，且还更优选XynB(SEQ.ID.NO:1)或其接近的变体(close variant)(如SEQ.ID.NO:2-5)，或包括相同序列(SEQ.ID.NO:1-5)最保守区域，优选其中该最保守区域包含糖苷水解酶家族10木聚糖酶基序(糖苷水解酶家族10木聚糖酶基序的保守部分跨越SEQ.ID.NO:1-5的21-332区域，或从这些SEQ.ID.NO:1-5的氨基酸21到末尾氨基酸344、346或347)或与这些SEQ.ID.NO:1-5或这些SEQ.ID.NO:1-5的21-332区域(或21到末尾氨基酸344、346或347)共享显著的同一性(或相似性)。添加的具有木聚糖降解活性(超嗜热和超热稳定木聚糖酶)的酶还可为包含SEQ.ID.NO:1-5的融合蛋白或包含与这些SEQ.ID.NO:1-5或与这些SEQ.ID.NO:1-5的21-332区域共享显著同一性(或相似性)肽的融合蛋白。
“显著同一性”在本发明上下文中是指至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％。优选地，同一性越过(列举)序列(或片段)的全长测量，如越过SEQ.ID.NO:1-5的全长或越过由SEQ.ID.NO:1-5的氨基酸21-332(或氨基酸21到末尾氨基酸)组成的肽的全长。“显著相似性”在本发明上下文中是指至少85％相似性，优选至少90％，更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％。优选地，相似性越过(列举)序列(或片段)的全长测量，如越过SEQ.ID.NO:1-5的全长或越过由SEQ.ID.NO:1-5的氨基酸21-332(或氨基酸21到末尾氨基酸)组成的肽的全长。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关系用参数“同一性”或“相似性”描述。为了实现本发明的目的，两个氨基酸序列之间的相似(或同一)度如WO2010/0142697中使用如在EMBOSS程序包的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法确定，优选版本3.0.0或更新的。使用的可选参数为10的空格罚分(gap open penalty)，0.5的扩展罚分(gapextension penalty)，和EBLOSUM62(EBLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记“最长同一性”(使用-nobrief选项获得)的Needle输出被用作百分比同一性且如下计算：(相同残基×100)/(比对长度-比对中缺口总数)。标记“最长相似性”(使用-nobrief选项获得)的Needle输出被用作百分比相似性且如下计算：(相似残基×100)/(比对长度-比对中缺口总数)。
在制备饲料过程中木聚糖酶(和/或包含超嗜热和超热稳定木聚糖酶的组分)被有利地作为固体制剂如粉状或颗粒或作为液体添加。
粒化处理通常包括在高温下的步骤，如蒸汽喷射。
相反，可不使用加热步骤(如，超过50℃)生产动物饲料，例如对于不粒化的饲料。
本发明的相关方面是(动物)饲料(和/或(饲料)预混合料)，其包括每kg0.08mg至400mg之间(优选在0.2mg/kg至40mg/kg之间，更优选在0.4mg/kg至20mg/kg之间)的多肽，该多肽与选自由SEQ.ID.NO:1、SEQ.ID.NO:2、SEQ.ID.NO:3、SEQ.ID.NO:4、SEQ.ID.NO:5，SEQ.ID.NO:1、SEQ.ID.NO:2、SEQ.ID.NO:3、SEQ.ID.NO:4和SEQ.ID.NO:5的氨基酸21-332(或从氨基酸21到末尾氨基酸344、346或347)组成的组的多肽具有超过75％(优选超过80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％)的同一性(或相似性)，所述多肽优选为超热稳定的并优选具有超嗜热木聚糖酶活性。
优选地，本发明的(动物)饲料包括至少50％(干重)的植物材料，最优选至少55％或甚至至少60％。
优选地，该植物材料选自由谷物、豆类植物、甜菜糖蜜、马铃薯渣和花生饼粉组成的组，且还可包括如谷物和豆类植物的混合物。
优选地(或此外)，本发明的饲料(包括至少50％植物材料)包括至少5％(干重)蛋白质，更优选至少10％、至少15％或甚至至少20％蛋白质。
优选地(或此外)，本发明的饲料(包括至少50％植物材料和/或至少5％蛋白质)包括至少2％(干重)脂肪，更优选至少5％或甚至至少8％脂肪。
优选地，本发明的饲料选自由青贮、颗粒饲料和粉状饲料组成的组。
本发明的另一个相关方面是用超嗜热和超热稳定木聚糖酶(和/或使用本发明的动物饲料添加剂，和/或使用本发明的超嗜热和超热稳定木聚糖酶)补充的饲料(和/或使用(饲料)预混合料和/或使用饲料添加剂)用于提高体重增加和/或(生长的)动物的饲料转化率(且最优选不用于生产过度病态的重量增加)的(非治疗)应用。
用于(非治疗)提高体重给增加(BWG)和/或(生长的)动物的饲料转化率(FCR)的优选的(超嗜热和超热稳定)木聚糖酶具有超过70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至高过99％的(总)木聚糖降解活性，该活性对90℃(或95℃)加热1小时有抵抗力。
可替换地，或此外，用于(非治疗)提高体重给增加(BWG)和/或(生长的)动物的饲料转化率(FCR)的优选的(超嗜热和超热稳定)木聚糖酶来自糖苷水解酶家族10(glycoside hydrolases Family10)。
用于(非治疗)提高体重增加(BWG)和/或(生长的)动物的饲料转化率(FCR)的最优选的木聚糖酶来自栖热袍菌(Thermotoga)，且仍优选与SEQ.ID.NO:1-5或与SEQ.ID.NO:1-5的21-332片段共享显著同源性(相似性)，或包含与SEQ.ID.NO:1-5的21-332片段共享显著同源性(相似性)的多肽(如融合蛋白)。
在本发明上下文中，“动物”优选是指非人类动物和/或不具有(明显)病理(病状)和/或不具有与重量不足(weight deficit)相关的病理的动物。
本发明的动物优选为非反刍动物和/或为单胃动物(mono-gastricanimal)。
更优选地，动物选自由猪、家禽、鱼和甲壳类动物组成的组，还更优选的是猪和/或家禽。
酶的来源和制备
栖热袍菌的许多物种和菌株已被描述用来生产一种或更多超嗜热和热稳定木聚糖内切酶。喜温海洋杆菌产生两种热稳定木聚糖内切酶，命名为XynA和XynB。XynA和XynB存在为具有约120和40kDa表观分子量的蛋白质。最适pH(XynA和XynB分别为pH6.2和pH5.4)下最大活性对于XynA在约92℃且对于XynB在约105℃测得(Winterhalter and Liebl,1995,Appl.Env.Microbiol.,61,1810-1815)。WO93/1917描述了从喜温海洋杆菌、新阿波罗栖热袍菌和温泉栖热袍菌(T.thermarum)获得木聚糖酶的过程。
已公开来自栖热袍菌木聚糖酶的许多菌株和物种的木聚糖内切酶的DNA和蛋白质序列。这些木聚糖酶可通过与喜温海洋杆菌XynA和XynB的序列同源性分为两种类型。
没有任何文献描述了使用分离的栖热袍菌木聚糖酶如XynB作为饲料添加剂，至少没有任何文献公开非常高的温度最适条件和在40℃几乎无活性。
木聚糖酶可从不同来源获得。木聚糖酶在适合的培养基中已生长选择的栖热袍菌菌株后可被分离/纯化。
木聚糖酶可通过培养表达编码相应蛋白质(如，XynB)的基因的重组菌株获得。
合适的基因可在编码来自栖热袍菌RQ2(GenBank：ACB09229.1)的内切-1,4-β-木聚糖酶、来自Thermotoga naphthophila RKU-10(GenBank：ADA66795.1)的内切-1,4-β-木聚糖酶、来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)(GenBank：CAA90235.1)的木聚糖酶、来自栖热袍菌FjSS2-B.1(GenBank：AAA90913.1)的内切-1,4-β-木聚糖酶、或来自喜温海洋杆菌MSB8(GenBank：AAD35164.1-图1-SEQ ID NO1)的内切-1,4-β-木聚糖酶B的基因中选择。
此外，显示活性(热活性)和热稳定性在上述范围内的最适温度的这些酶的变体可通过修改这些基因的编码序列获得。
序列修改可包括但不限于氨基酸取代(替换)、缺失和/或插入。优选的序列修改是保守的取代(如，BLASTp分析后标记为阳性)。
优选变体酶(variant enzyme)与喜温海洋杆菌MSB8XynB具有至少80％氨基酸序列同一性，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，或与喜温海洋杆菌MSB8XynB具有至少90％氨基酸序列相似性，更优选至少93％、94％、95％，甚至更优选至少98％。
重组木聚糖酶可在任何合适的宿主生物体中表达。特别适合的宿主是细菌、酵母和真菌。优选的细菌宿主是大肠杆菌和杆菌(枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、…)或链霉菌(天蓝色链霉菌、变铅青链霉菌、…)的菌株。
优选的酵母宿主是酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)的菌株。优选的真菌宿主是曲霉(构巢曲霉、黑曲霉、…)、青霉和木霉的菌株。
木聚糖酶可进一步以表达相应酶的转基因植物和/或种子的形式或从转基因动物获得。
木聚糖酶可通过在用于木聚糖酶的生长和表达的合适培养基中培养栖热袍菌或重组微生物菌种制备。优选菌种在发酵罐中培养。
培养后，木聚糖酶可作为培养上清液或细胞提取物回收。上清液或细胞提取物优选被进一步纯化以获得半纯化或纯化制剂。合适的纯化方法包括但不限于离心、微孔过滤、超过滤、沉淀、色谱法、…。
木聚糖酶可以液体或干燥(粉末)制剂提供。液体制剂优选通过添加合适的组分如盐(NaCl)或甘油稳定。粉末制剂可例如通过喷雾干燥或冷冻干燥获得。木聚糖酶可被涂覆(coat)。
酶活性确定
许多方法可用来确定液体制剂中木聚糖内切酶的酶活性。特别合适的是使用木聚糖内切酶水解作为底物的木聚糖的方法。水解反应释放还原性糖，通过与二硝基水杨酸(DNS)反应导致典型颜色显现。色彩强度在570nm处直接与样品中的木聚糖酶活性成比例，条件是底物浓度保持充足(即，降解不超过10％和/或在测试中保持底物的饱和浓度)。
木聚糖酶的一个DXU被定义为每分钟从3％(W:V)桦木木聚糖溶液且在pH670℃的100mM柠檬酸磷酸缓冲液中释放1微摩尔还原性糖(如木糖等价物)的酶量。反应在0.8ml(0.7ml底物+0.1ml稀释的木聚糖酶)体积中进行15分钟。温育后，反应通过加入1ml DNS试剂(组分：NaOH400mM，3,5-二硝基水杨酸40mM，酒石酸钾钠1M)终止。混合物随后在95℃保持15分钟，接着冷却到25℃5分钟。最后，在570nm相对于对照测定吸光度。
为了根据还原性糖的生成评定木聚糖酶活性(DXU/ml)，木糖标准曲线用代替酶稀释制剂的木糖制备。所有底物温育和随后的测量一式三份地进行。
木聚糖内切酶最适活性温度&热稳定性确定
木聚糖酶活性的温度依赖性使用上述二硝基水杨酸(DNS)还原性糖方法的变型进行分析。DNS法在酶/底物混合物上在20至100℃温度范围内的油浴中温育进行。该方法的所有其他参数保持不变。
温度稳定性通过在50至100℃温度范围的浴中通过预温育酶制剂来监控。样品在0、10、30、60(和90)分钟后取得并在冰浴中冷却10分钟。残留活性用上述方法一式三份地测定。
饲料组分
动物饲料(包括青贮饲料)可包括谷物，如小麦、大麦、黑麦(裸麦，rye)、玉米、稻米、高粱、斯佩耳特小麦(spelt)、黑小麦或燕麦，或谷物副产品如麦麸、大麦稿杆、玉米穗轴、燕麦粉(oat milling)、粗小麦粉(wheatmiddling)、小麦麸质饲料(wheat glutenfeed)、稻米胚芽、或玉米糠，或其他植物材料如大豆或其他豆类、油菜籽、羽扇豆、豌豆、木薯粉、甜菜糖蜜、马铃薯渣、花生饼粉。优选的谷物是小麦、大麦和黑麦。
优选地，本发明的动物饲料组分包含至少一种植物蛋白质或蛋白质源。植物蛋白质或蛋白质源的实例为大豆，和谷物，如大麦、玉米、燕麦、稻米、黑麦、高粱和小麦。
本发明的动物饲料组分有利地包含0-80％玉米；和/或0-80％高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％大麦；和/或0-30％燕麦；和/或0-40％大豆粉；和/或0-10％鱼粉；和/或0-20％乳清。
本发明的动物饲料组分(组合物)有利地包含额外的饲料成分或添加剂如酶、益生元(prebiotics)、有益菌种(probiotics)、矿物质和微量元素、维生素和维生素原、植物(vegetable，蔬菜)、微生物或动物蛋白、氨基酸、它们的盐和类似物、淀粉、纤维、碳水化合物和糖或甜味剂、油和油粕粉、植物或动物脂肪、染料或其他着色剂、乳化和稳定剂、增稠和胶凝剂、粘结剂、防结块剂和凝结剂、防腐剂、酸度调节剂、类胡萝卜素和叶黄素、脲及其衍生物、消化性增强剂、肠道菌群稳定剂、球虫抑制剂和其他药物。
优选的额外的酶选自由肌醇六磷酸酶(phytase)、淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶、半纤维素酶和(不太优选的)(其他)木聚糖酶组成的组。
优选的矿物质选自由盐(氯化物、硫酸盐、氟化物、碳酸盐、氧化物、…)、钙、磷、镁、钾、钠、锰、锌、镍、钼、铜、铁、硒、钴和碘组成的组。
优选的维生素选自由维生素A、胡萝卜素、抗坏血酸、维生素D、D3、E、K、B1硫胺(维生素b1)、B6吡哆醇(维生素b6)、生物素、胆碱、叶酸、烟酸、泛酸、B2核黄酸(维生素b2)、氰钴维生素(氰钴胺)、…组成的组。
合适的蛋白质选自植物、微生物或动物蛋白组成的组。
合适的氨基酸选自由蛋氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苯基丙氨酸、络氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸组成的组。
合适的微生物属于但不限于曲霉属、杆菌属、双歧杆菌属、肠球菌属、乳酸菌属、乳球菌属、明串珠菌属、片球菌属、酵母属、链球菌属。
其他可能添加剂可被使用，且可例如在依照条例(EC)N°1831/2003附录3a&4-附件：添加剂目录，和其更新材料的欧盟饲料添加剂注册表(Community Register of Feed Additives)中发现。
饲料加工(生产)
动物饮食可被加工为粉状饲料(非颗粒)或颗粒饲料。通常，混合碾碎的饲料原料(feed-stuff)并根据考虑动物种类的说明书添加足够量的必需维生素和矿物质。
本发明的组分可以固体或液体酶配方(制剂，formulation)的形式，或以饲料添加剂的形式，如预混合料(premix)添加。
固体组分通常在混合步骤前或混合步骤过程中加入；且液体组分通常在粒化步骤后加入。
然而，超热稳定和超热活性液体酶组分还可在粒化步骤前加入。
饲料中本发明木聚糖酶的剂量可使用现有技术中已知的试差法优化。不同木聚糖酶可具有不同的最适剂量范围。
附图说明
图1示出来自喜温海洋杆菌MSB8的木聚糖酶XynB的氨基酸序列。信号肽有下划线。
图2示出连续纯化步骤后回收的考马斯蓝染色的木聚糖内切酶SDS-聚丙烯酰胺凝胶。图2a：XynAΔNC；图2b：XynB。
图3示出温度对木聚糖内切酶XynAΔNC和XynB活性的影响。最大活性已被设定为100％。
图4示出预温育后在不同温度木聚糖内切酶的残留活性。
实施例
实施例1：栖热袍菌木聚糖内切酶的制备
来自喜温海洋杆菌的木聚糖酶XynA和XynB的催化区(催化域)的克隆
根据公开的栖热袍菌xynA(GenBank/GenPeptTM编号Z46264)和xynB(GenBank/GenPeptTM编号AAD35164)的基因序列，全部xynB基因和对应于xynA基因(xynAΔNC)的催化区的DNA片段按照经典程序从喜温海洋杆菌MSB8(DSM3109/ATCC43589)的基因组DNA进行PCR扩增。
PCR产品使用供应商推荐的程序被克隆至pGEM-T载体系统I(Promega)中，并用来转化大肠杆菌超感受态细胞。蓝白筛选允许选择携带PCR片段的白色菌落。纯化的质粒制剂(Nucleospin质粒，Macherey-Nagel)在ALF DNA测序器(Pharmacia Biotech)上测序。插入片段的测序使用通用引物T7和RP以及对应于内部DNA序列的引物进行。获得的序列与公开的序列(xynA GenBank/GenPeptTM编号为Z46264且xynB编号为AAD35164)相同。
对应于组件型(modular)XynA(XynAΔNC)衍生的催化区的DNA片段和完整xynB基因被亚克隆到pET22b(+)克隆载体(Novagen)中。得到的重组质粒被转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Stratagene)。重组菌株的温育和来自喜温海洋杆菌的木聚糖酶XynAΔNC和XynB的生产
15ml携带木聚糖酶基因的大肠杆菌BL21(DE3)细胞的5小时预培养物(37℃)在10000g离心1分钟且颗粒再悬浮在含有200μg/ml氨苄青霉素的900ml Terrific肉汤(12g/L胰化蛋白胨(Difco)，24g/L酵母提取物(Difco)，4ml/l甘油，12.54g/l K2HPO4，2.31g/l KH2PO4)的3升摇瓶中。在37℃和250rpm温育培养物直到550nm处吸光度达到3&4之间，之后用1mM异丙基-1-硫代-β-吡喃半乳糖苷来诱导酶的表达。
在37℃温育15小时后通过以下方式收获细胞：在4℃18000g离心30分钟，再悬浮在含有10mM NaCl的50mM BICINE中，在预冷细胞破碎仪((Constant Systems Ltd.，Warwick，英国)中在28Kpsi破碎并在40,000g离心30分钟。从粗制细胞裂解液中通过用0.2％硫酸鱼精蛋白(Calbiochem)处理并在40,000g离心30分钟除去染色体DNA。接着将25个单位的核酸酶(benzonase)(Merck，Darmstadt，德国)加入到溶液中。
重组木聚糖酶XynAΔNC和XynB的回收
在大肠杆菌中表达的来自喜温海洋杆菌的XynAΔNC和XynB的粗制酶制剂已通过在Proflux系统(Millipore)UF聚醚砜Biomax膜(截止点＝5kDa)上再循环液体制剂通过超过滤加以浓缩。浓缩的酶溶液在无菌过滤系统上过滤，包括具有不同截止点的许多步骤和最后的绝对过滤器(截止点＝0.22μM)(Millipore)。
浓缩的液体酶使用在此处其被喷在载体(小麦粉)上的流体床干燥Procell实验室系统(Glatt)干燥，提供低尘颗粒酶制剂。
重组木聚糖酶XynAΔNC和XynB的纯化
XynAΔNC使用三步骤过程纯化。粗制提取物用色谱缓冲液(Tris-HCl20mM pH8.0)透析2500×并装载到Q HP XK16/20(GE Healthcare)上，该Q HP XK16/20为强阴离子交换柱，并用线性梯度(0-1M NaCl)洗提。接着半纯化的制剂用色谱缓冲液(Tris-HCl20mM pH8.0)透析2500×并装载到Sephacryl S-100HR120ml XK16/70(GE Healthcare)，该SephacrylS-100HR120ml XK16/70为尺寸排阻色谱柱。汇集活性流分，用色谱缓冲液(Tris-HCl20mM pH8.0)透析2500×并装载到Mono-Q GL5/50(GEHealthcare)上，该Mono-Q GL5/50为强阴离子交换柱，并用线性梯度(0-1M NaCl)洗提。汇集纯化的流分且其纯度已在SDS-PAGE(图2a)上检查。
XynB使用两步骤过程纯化。大部分宿主蛋白通过热处理酶制剂(30分钟75℃)并随后离心(12000×g4℃)而除去。上清液用色谱缓冲液(Bis-Tris20mM pH6.2)透析2500×，装载在Q-Sepharose FF(GEHealthcare)离子交换柱上并用线性梯度(0-1M NaCl)洗提。重组木聚糖酶的纯度已在SDS-PAGE(图2b)上检查。
重组酶的表征
XynAΔNC和XynB的木聚糖酶活性在不同温度使用上述测试条件确定。最大活性分别为70℃和90-95℃(图3)。
重组酶的稳定性使用上述程序评估。结果(图4)显示XynAΔNC在60℃温育60分钟后保持其活性的30％。XynB在90℃温育60分钟后保持其活性的100％。
实施例2：动物饲料中喜温海洋杆菌木聚糖酶(XynAΔNC和XynB) 的使用
试验使用雄性或雌性肉鸡(broiler)(Belgabroed)进行。年龄从1到42天，它们关在地面鸡圈中并提供补充或没有补充外源木聚糖酶的市售的肉鸡饲料。年龄1天时，动物(768只禽类-384只雄性/384只雌性)随机分散在24个32只禽类/鸡圈，0.8m3/鸡圈的鸡圈(4种治疗×2种性别×3次重复)。年龄14天时，动物分配到48个16只禽类的鸡圈(4种治疗×2种性别×6次重复)。每个鸡圈提供有2个饮水喷头和1个饲料盘。温度开始时是35℃，接着每天降低0.5℃；22天时，温度保持在22℃。光照方案为第一周期23小时30分钟光照和30分钟黑暗，且第二周期18小时光照和6小时黑暗。禽类在第1天接种鸡新城疫病(Newcastledisease)疫苗(在孵化室)并在第14天接种甘保罗(Gumboro)+鸡新城疫病疫苗(通过饮用水)。
本试验包括四种治疗。对基于小麦的饮食(表1)，不加入酶(对照)，或以推荐剂量10UI/kg饲料(阳性对照)补充的等于500DXU的喜温海洋杆菌XynAΔNC/kg饲料的量或等于400DXU的喜温海洋杆菌XynB/kg饲料的量或枯草芽孢杆菌木聚糖酶(从Beldem-Puratos的一个部门，Groot-Bijgaarden，比利时购买的BelfeedTMB1100MP(E1606)内切-1,4-β-木聚糖酶)。
发明人比较了不同水平的阳性对照(市售木聚糖酶Belfeed)，如50UI/kg饲料，并发现在10UI/kg饲料处两个参数(BWG和FCR)达到平稳状态(plateau)。因此发明人将这个量用于阳性控制。
酶作为液体(XynAΔNC和XynB)或粉末(Belfeed)在将其混合进饮食之前并入预混合料中从而添加到饲料中。饮食以粉状的形式随意地提供给动物。水也是自由饮用。
体重在第1天、14天、42天记录。记录饲料供给并在称重2和3后立刻测量盘中剩余的饲料。
体重增加(BWG)和饲料转化率(FCR)对于年龄1-14天、14-42天和1-42天的周期进行确定。
表1
饲料组分和主要营养物质的含量
生料 含量
小麦 57.20％
大豆粉 18.73％
热处理大豆 13.00％
动物脂肪 4.00％
小麦麸质饲料 2.00％
大豆油 0.467％
NaCl 0.250％
赖氨酸(Biolys) 0.283％
DL-蛋氨酸 0.233％
苏氨酸 0.083％
CaCO3 0.533％
磷酸一钙 0.933％
碳酸氢钠 0.100％
维生素/矿物质预混合料 1.500％
酶他富(Natuphos)预混合料 0.500％
Betacid GM 0.188％
粗制蛋白 20.50％
粗制脂肪 8.50％
粗制灰分 6.00％
粗制纤维 3.00％
蛋氨酸 0.53％
总磷(Phophorus tot.) 0.61％
维生素A 15100UI/kg
维生素D3 3000UI/kg
维生素E 30mg/kg
肌醇六磷酸酶(EC.3.1.3.8)E1600 500FTU/kg
本试验结果呈现在表2中，表2示出两个周期内肉鸡的平均BWG和FCR。
表2
生长和FCR二者对于包含XynAΔNC和XynB的饮食均提高，均在起始周期14d后或总共42d增肥周期后。XynB显示出比XynAΔNC更好的特性。
实施例3：动物饲料中喜温海洋杆菌木聚糖酶(XynB)的使用试验使用雄性或雌性肉鸡(Belgabroed)进行。年龄从1到42天，它们关在地面鸡圈中并提供补充或没有补充外源木聚糖酶的市售的肉鸡饲料。年龄1天时，动物(768只禽类-384只雄性/384只雌性)随机分散在24个32只禽类/鸡圈，0.8m3/鸡圈的鸡圈(4种治疗×2种性别×3次重复)。年龄14天时，动物分配到48个16只禽类的鸡圈(4种治疗×2种性别×6次重复)。每个鸡圈提供有2个饮水喷头和1个饲料盘。温度开始时是35℃，接着每天降低0.5℃；22天时，温度保持在22℃。光照方案为第一周期23小时30分钟光照和30分钟黑暗，且第二周期18小时光照和6小时黑暗。禽类在第1天接种鸡新城疫病(Newcastle disease)疫苗(在孵化室)并在第14天接种甘保罗(Gumboro)+鸡新城疫病疫苗(通过饮用水)。
本试验包括四种治疗。对基于小麦的饮食(表3)，添加以推荐剂量100ppm补充的等于200DXU的XynB/kg饲料的量或等于400DXU的XynB/kg饲料的量或市售的真菌木聚糖酶X(Huvepharma；EC N°E1617)或以推荐剂量10UI/kg饲料或100ppm补充的枯草芽孢杆菌木聚糖酶(从Beldem-Puratos的一个部门，Groot-Bij gaarden，比利时购买的BelfeedTMB1100MP(E1606)内切-1,4-β-木聚糖酶)。
酶作为粉末在将其混合进饮食之前并入预混合料中从而添加到饲料。饮食以粉状形式随意地提供给动物。水也是自由饮用。
体重在第1天、14天、42天记录。记录饲料供给并在称重2和3后立刻测量食槽中剩余的饲料。
体重增加(BWG)和饲料转化率(FCR)对年龄1-14天、14-42天和1-42天的周期进行确定。
表3
饲料组分和主要营养物质的含量
生料 含量
小麦 58.19％
大豆粉 20.16％
热处理大豆 10.00％
动物脂肪 4.00％
油菜籽粉 2.00％
大豆油 1.133％
NaCl 0.233％
赖氨酸(Biolys) 0.283％
DL-蛋氨酸 0.233％
苏氨酸 0.083％
CaCO3 0.500％
磷酸一钙 0.968％
碳酸氢钠 0.134％
维生素/矿物质预混合料 1.500％
酶他富(Natuphos)预混合料 0.500％
氯化胆碱 0.083％
本试验结果呈现在表4中，表4示出两个周期内肉鸡的平均BWG和FCR。
表4
在起始周期14d后或总共42d增肥周期后，生长和FCR二者对于包含XynB酶的饮食均提高。XynB显示出比其他市售的木聚糖酶更好的BWG和FCR。

Claims (19)

1.一种动物饲料，选自由青贮、颗粒饲料和粉状饲料组成的组，所述动物饲料用包含木聚糖酶的组分补充，其中所述木聚糖酶是超嗜热和超热稳定的，其中存在于所述组分中的木聚糖降解活性的最适温度高于80℃，其中存在于所述组分中的超过70％的所述木聚糖降解活性对90℃下加热30分钟有抵抗力，且其中存在于所述组分中的所述木聚糖降解活性在最适温度下与在40℃下的活性比率高于10。
2.根据权利要求1所述的动物饲料，其中存在于所述组分中的所述木聚糖降解活性的所述最适温度为高于85℃，优选高于90℃。
3.根据权利要求1或2所述的动物饲料，其中存在于所述组分中的所述木聚糖降解活性在最适温度下与在40℃下的活性比率高于20。
4.根据前述权利要求中任一项所述的动物饲料，其中存在于所述组分中的所述木聚糖酶活性使用3％(w:v)木聚糖，优选使用3％(w:v)桦木木聚糖作为底物测量。
5.根据前述权利要求中任一项所述的动物饲料，其中存在于所述组分中的所述木聚糖酶活性在15分钟反应后测量。
6.根据前述权利要求中任一项所述的动物饲料，其中所述超嗜热和超热稳定的木聚糖酶与选自由以下组成的组的木聚糖酶具有超过80％的同一性和/或90％的相似性：SEQ.ID.NO:1、SEQ.ID.NO:2、SEQ.ID.NO:3、SEQ.ID.NO:4、SEQ.ID.NO:5、SEQ.ID.NO:l的氨基酸21-332、SEQ.ID.NO:2的氨基酸21-332、SEQ.ID.NO:3的氨基酸21-332、SEQ.ID.NO:4的氨基酸21-332和SEQ.ID.NO:5的氨基酸21-332。
7.根据前述权利要求中任一项所述的动物饲料，其中所述超嗜热和超热稳定的木聚糖酶与选自由以下组成的组的木聚糖酶具有超过99％的同一性：SEQ.ID.NO:1、SEQ.ID.NO:2、SEQ.ID.NO:3、SEQ.ID.NO:4、SEQ.ID.NO:5、SEQ.ID.NO:l的氨基酸21-332、SEQ.ID.NO:2的氨基酸21-332、SEQ.ID.NO:3的氨基酸21-332、SEQ.ID.NO:4的氨基酸21-332和SEQ.ID.NO:5的氨基酸21-332。
8.根据前述权利要求中任一项所述的动物饲料，包括在0.08至40mg/kg之间的所述超嗜热和超热稳定的木聚糖酶。
9.根据前述权利要求中任一项所述的动物饲料，包括至少50％(干重)的植物材料。
10.根据权利要求9所述的动物饲料，其中所述植物材料选自由谷物、豆类、甜菜糖蜜、马铃薯渣和花生饼粉组成的组。
11.根据前述权利要求中任一项所述的动物饲料，包括至少5％(干重)的蛋白质和/或至少2％(干重)的脂肪。
12.一种超嗜热和超热稳定的木聚糖酶的用途，其用于在动物中提高体重增加和/或饲料转化率，其中所述超嗜热和超热稳定的木聚糖酶具有高于80℃的最适温度，其中超过70％的所述超嗜热和超热稳定的木聚糖酶的木聚糖降解活性对90℃下加热30分钟有抵抗力，且其中所述超嗜热和超热稳定的木聚糖酶在最适温度下与在40℃下的活性比率高于10。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述木聚糖酶活性使用3％(w:v)木聚糖，优选使用3％(w:v)桦木木聚糖作为底物测量。
14.根据权利要求12或13所述的用途，其中所述木聚糖酶活性在15分钟反应后测量。
15.根据前述权利要求1至11中任一项所述的动物饲料用于在动物中提高体重增加和/或饲料转化率的用途。
16.根据前述权利要求12至15中任一项所述的用途，其中所述动物为非反刍脊椎动物、或甲壳类动物，且优选鱼、猪或家禽，更优选猪或家禽。
17.一种生产权利要求1至11中任一项所述的动物饲料的方法，包括以下步骤：
a)选择包含半纤维素的饲料；
b)添加包含超嗜热和超热稳定的木聚糖酶的组分，其中存在于所述组分中的超过70％的所述木聚糖降解活性对90℃下加热所述组分30分钟有抵抗力，其中存在于所述组分中的所述木聚糖降解活性的最适温度高于80℃，且其中存在于所述组分中的所述木聚糖降解活性在最适温度下与在40℃下的活性比率高于10。
18.根据权利要求17所述的方法，其中存在于所述组分中的所述木聚糖酶活性使用3％(w:v)木聚糖，优选使用3％桦木木聚糖作为底物测量。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中存在于所述组分中的所述木聚糖酶活性在15分钟反应后测量。
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