MX2014005617A - Una composicion de pienso suplementado con una xilanasa. - Google Patents

Abstract

Un pienso para animales suplementado con xilanasa hipertermófila y altamente termoestable.

Description

UNA COMPOSICIÓN DE PIENSO SUPLEMENTADO CON UNA XILANASA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un pienso para animales suplementado con una xilanasa altamente termoestable y termófila.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las xilanasas se han venido utilizando como aditivos en piensos desde hace varios años. De hecho se ha demostrado que algunas xilanasas, aunque no todas, mejoran la ganancia de peso corporal absoluta (GPC), el índice de conversión alimenticia (ICA) o ambos, de un pienso determinado.

Las xilanasas utilizadas en los piensos pueden, por ejemplo, permitir a los nutricíonistas reducir las necesidades de energía en las dietas sin afectar al rendimiento zootécnico de los animales.

Las xilanasas aumentan la energía metabolizable o neta de las materias primas y por lo tanto aumentan el contenido en energía metabolizable total o neta de las dietas. Por lo tanto, se puede mantener el rendimiento zootécnico con menos energía bruta en dietas más baratas (menos grasa/aceite; más fibra).

Un posible beneficio vinculado al uso de la xilanasa es una mejor liberación de (micro)nutrientes atrapados dentro de las paredes celulares del alimento. Tal atrapamiento es debido a la presencia de polisacáridos no amiláceos que son resistentes a la digestión por parte del animal.

Para ser eficaces, las xilanasas que se utilizan como aditivos para piensos deben ser a la vez estables y activas a un pH y una temperatura cercanas a las condiciones del tracto gastrointestinal del animal.

WO T5/299T7 describe las xilanasas termoestables y menciona su incorporación en los piensos para animales. La termoestabilidad se define como la resistencia a un minuto a 95 °C, junto con la capacidad para hidrolizar posteriormente una solución de arabinoxilano de trigo a 40°C. Sin embargo, después de un tratamiento con calor durante cinco minutos, las xilanasas descritas pierden significativamente su actividad.

Se ha descrito la capacidad de varias especies y cepas de Thermotoga para producir una o varias endoxilanasas hipertermófilas y termoestables. Thermotogamarítima produce dos endoxilanasas termoestables, designadas como XynA y XynB. XynA y XynB existen como proteínas con masas moleculares aparentes de alrededor de 120 y 40 kDa. La máxima actividad a pH óptimo (pH 6,2 y pH 5,4 para XynA y XynB, respectivamente) se mide aproximadamente a 92 °C para XynA y a aproximadamente 105 °C para XynB (Winterhalter y Liebl, 1995, Appl. Env. Microbiol., 61 , 1810-1815).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un primer aspecto de la presente invención es un pienso para animales suplementado con una composición que contiene una xilanasa hipertermófila y altamente termoestable.

Preferiblemente, la temperatura óptima de actividad xilanolítica presente en dicha composición es superior a 80 °C, más preferiblemente superior a 85 °C, aún más preferiblemente superior a 90 °C.

Preferiblemente, la tasa de actividad xilanolítica presente en esta composición a la temperatura óptima y a 40 °C es superior a 10, más preferiblemente mayor que 20.

Ventajosamente, más del 70% de la actividad xilanolítica presente en esta composición es resistente a 30 minutos de calentamiento a 90 °C.

Más preferiblemente, la xilanasa hipertermófila y altamente termoestable tiene más de 80% de identidad y/o más de 90% de similitud con una xilanasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, aminoácidos 21-332 de la SEQ ID NO:1 , de la SEQ ID NO:2, de la SEQ ID NO:3, de la SEQ ID NO:4 y de la SEQ ID NO:5 y, posiblemente, este pienso animal contiene entre 0.08 y 40 mg/kg de dicha xilanasa hipertermófila y altamente termoestable (pura).

Posiblemente, este pienso para animales es líquido y, preferiblemente, contiene entre 0.08 y 40 mg/l de la xilanasa hipertermófila y altamente termoestable (pura).

Alternativamente, este pienso para animales se selecciona del grupo que consiste en ensilados, piensos granulados y harinas.

Preferiblemente, el pienso para animales contiene al menos 50% (en peso seco) de materia vegetal, seleccionada más preferiblemente del grupo que consiste en cereales, legumbres, melaza de remolacha, pulpa de patata y harina de cacahuete.

Preferiblemente, el pienso para animales contiene al menos 5% (peso seco) de proteína y/o al menos 2% (peso seco) de grasa.

Un aspecto relacionado es un pienso para animales que contiene entre 0.08 y 40 mg/kg (en peso seco) de un polipéptido que tiene más de 80% de identidad y/o más de 90% de similitud con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, aminoácidos 21 a 332 de la SEQ ID NO:1 , de la SEQ ID NO:2, de la SEQ ID NO:3, de la SEQ ID NO:4 y de la SEQ ID NO:5.

Otro aspecto relacionado es el uso (no terapéutico) del pienso para animales para mejorar la ganancia de peso corporal y/o el índice de conversión alimenticia de animales que sean preferiblemente vertebrados no rumiantes o crustáceos y más preferiblemente peces, cerdos o aves de corral.

Otro aspecto relacionado es un método para producir el pienso para animales que comprende las etapas de: a) selección de un pienso que contiene hemicelulosa; b) adición de una composición que contiene xilanasa hipertermófila y altamente termoestable.

Preferiblemente, más del 70% de la actividad xilanolítica presente en la composición añadida en la etapa b) de este método es resistente a 30 minutos de calentamiento de dicha composición a 90 X y/o la temperatura óptima de actividad xilanolítica presente en esta composición es superior a 80 °C (preferiblemente superior a 85 °C, más preferiblemente superior a 90 °C).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los inventores han observado que la adición de una xilanasa hipertermófila (y altamente termoestable) a un pienso mejora la tasa de conversión alimenticia en los animales.

Aunque la temperatura óptima de actividad de las (endo)xilanasas hipertermófilas es mucho más alta que la temperatura del tracto intestinal del animal, los inventores han descubierto que estas enzimas mejoran la ganancia de peso corporal y/o el índice de conversión alimenticia, incluso cuando se comparan con las (endo)xilanasas comúnmente usadas en piensos. Más particularmente, los inventores han observado que incluso las xilanasas que son hipertermófilas (y altamente termoestables) dan mejores resultados que las xilanasas termófilas (y termoestables).

Tanto la ganancia de peso corporal absoluta (GPC) como el índice de conversión alimenticia (ICA) de los animales mejoraron en el caso de los animales alimentados con harinas suplementadas con xilanasa hipertermófila y altamente termoestable, en comparación con los animales alimentados con harinas no suplementadas y los alimentados con harinas suplementadas con una xilanasa principalmente activa a 37-50 °C.

La ICA es la relación entre las cantidades de alimento consumido por un animal y su aumento de peso. Un valor más bajo de ICA es indicativo de una utilización más eficiente del alimento.

Estos resultados contrastan, en el caso de la xilanasa hipertermófila y altamente termoestable utilizada, con la actividad xilanasa extremadamente baja medida a 37 °C.

Un primer aspecto de la presente invención es un pienso (pienso para animales) suplementado con (y/o que contiene) una composición que incluye una xilanasa hipertermófila (es decir, la temperatura óptima de la actividad xilanolítica (total) es superior a 80 °C, preferiblemente superior a 90 °C o 95 °C y/o la tasa de actividad a la temperatura óptima y a 40 X es superior a 10 o incluso superior a 15 o 20) y altamente termoestable (es decir, la actividad xilanolítica (total) de esta composición es muy resistente a la inactivación por calor (desnaturalización), de modo que más del 70% de la actividad resiste a 30 minutos de calentamiento a 90 °C del aditivo que contiene la xilanasa en un baño de aceite).

El pienso puede contener entre 0.08 mg/kg de pienso y 40 mg/kg de pienso de xilanasa hipertermófila y altamente termoestable, más preferiblemente entre 0.2 mg/kg de pienso y 20 mg/kg de pienso, aún más preferiblemente entre 0.4 mg/kg de pienso y 16 mg/kg de pienso de la enzima (pura).

Preferiblemente, el pienso contiene entre 10 DXU/kg de pienso y 5000 DXU/kg de pienso de xilanasa hipertermófila y altamente termoestable, más preferiblemente entre 25 DXU/kg de pienso y 2500 DXU/kg de pienso, aún más preferiblemente entre 50 DXU/kg de pienso y 2000 DXU/kg de pienso.

En el contexto de la presente invención, una unidad de xilanasa (Danisco xylanase unit, DXU) se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 pmol de azúcar reductor (expresado como xilosa) por minuto a partir de una solución al 3% de xilano de madera de abedul a pH 6 y a 70 °C, a menos que se mencionen explícitamente otros valores.

Un aspecto relacionado es un aditivo para piensos (aditivo de piensos para animales) que contiene una xilanasa hipertermófila y altamente termoestable.

En el contexto de la presente invención, "xilanasa altamente termoestable" se refiere a una xilanasa en la que más del 70% de la actividad xilanolítica (total) (presente en esta composición) es resistente a (capaz de resistir a y/o capaz de mantenerse después de) 30 minutos de calentamiento (de esta composición) a 90 °C. El término "actividad xilanolítica general" se refiere a la actividad xilanolítica de la xilanasa hipertermófila y altamente termoestable y también a la de otras xilanasas (contaminantes) que menos preferiblemente estén presentes en la composición, añadidas al pienso de los animales, como se describe en la presente invención.

Preferiblemente, al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o incluso hasta el 100% de la actividad xilanolítica (total) presente en este pienso y/o en este aditivo para piensos es capaz de mantenerse después de 30 minutos (o 45 minutos o 1 hora) de calentamiento (de este pienso y/o de este aditivo para piensos) a 90 °C (o a 95 °C).

Preferiblemente, la temperatura óptima para la actividad xilanolítica (total) presente en la composición añadida al pienso de la presente invención es superior a 80 °C, más preferiblemente mayor que 85 °C, 90 °C o incluso superior a 95 °C.

Preferiblemente, la tasa de actividad xilanolítica (total) presente en la composición añadida al pienso de la presente invención (que contiene la xilanasa hipertermófila y altamente termoestable) a una temperatura óptima (por ejemplo: 80 °C, 85 °C, 90 °C, 95 °C o incluso aproximadamente 100 °C) y a 40 °C (o 37 °C) es mayor que 10, más preferiblemente mayor que 20.

En el contexto de la presente invención, el término "enzima con actividad xilanolítica", "endoxilanasa" o "xilanasa" se refiere a una enzima (por ejemplo, una xilanasa recombinante, al menos parcialmente purificada o, menos preferiblemente a una mezcla de enzimas) capaz de hidrolizar enlaces glucosídicos internos entre los residuos de xilosa de los polisacáridos que contienen xilosa. Tales enlaces glucosídicos pueden ser, por ejemplo, enlaces glucosídicos beta 1-4 de las unidades beta-D-xilopiranosil-1.4-bet.a-D- xilopiranosil de tales polisacáridos.

Las enzimas preferidas con actividad xilanolítica son endoxilanasas (EC 3.2.1.8.)· Las enzimas preferidas con actividad xilanolítica son endoxilanasas de la familia 10 de las glicósido hidrolasas.

Entre las enzimas preferidas con actividad xilanolítica (xilanasas hipertermófilas y altamente termoestables) se encuentran las enzimas derivadas de una cepa de Thermotoga marítima y más preferiblemente XynB (SEQ ID NO:1) o variantes próximas a ella (por ejemplo SEQ ID NO:2-5) o que comprendan la región más conservada de las mismas secuencias (SEQ ID NO: 1-5), preferiblemente donde esta región más conservada incluye la secuencia xilanasa de las glicósido hidrolasas de la familia 10 (una parte conservada de la secuencia xilanasa de las glicósido hidrolasas de la familia 10 se extiende sobre las regiones 21-332 de las SEQ ID NO: 1-5 o desde el aminoácido 21 hasta el último aminoácido 344, 346 o 347 de estas SEQ ID NO: 1-5) o poseer una identidad significativa (o similitud) con estas SEQ ID NO: 1-5 o las regiones 21-332 (o 21 hasta el último aminoácido 344, 346 o 347) de estas SEQ ID NO: 1-5. La enzima o enzimas con actividad xilanolítica (xilanasas hipertermófilas y altamente termoestables) añadidas también pueden ser proteínas de fusión que comprendan la SEQ ID NO: 1-5 o que contengan un péptido que tenga una identidad significativa (o similitud) con estas SEQ ID NO: 1-5 o con las regiones 21 a 332 de estas SEQ ID NO: 1-5.

"Identidad significativa" en el contexto de la presente invención significa al menos 75% de identidad, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o incluso al menos 99%. Preferiblemente, la identidad se mide sobre la longitud completa de la (ya citada) secuencia (o fragmento), como es la longitud completa de las SEQ ID NO: 1-5 o la longitud completa del péptido que consiste en los aminoácidos 21-332 (o desde el aminoácido 21 hasta el último aminoácido) de las SEQ ID NO: 1-5. "Similitud significativa" en el contexto de la presente invención significa al menos 85% de similitud, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o incluso al menos 99%. Preferiblemente, la similitud se mide sobre la longitud completa de la (ya citada) secuencia (o fragmento), como es la longitud completa de las SEQ ID NO:1-5 o la longitud completa de péptido que consiste en los aminoácidos 21-332 (o desde el aminoácido 21 hasta el último aminoácido) de las SEQ ID NO:1-5.

La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos está descrita por el parámetro "identidad" o "similitud". Para los objetivos de la presente invención, el grado de similitud (y de identidad) entre dos secuencias de aminoácidos se determina como en WO 2010/0142 697 utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch como se aplica en el programa Needle del paquete EMBOSS, preferiblemente en la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales utilizados son penalización de espacio abierto de 10, penalización de extensión de espacio de 0.5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). El resultado de Needle etiquetado como "identidad más larga" (obtenido mediante la opción -nobrief) se utiliza como porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera: (residuos idénticos x 100)/(longitud de la alineación - número total de huecos en la alineación). El resultado de Needle etiquetado como "similitud más larga" (obtenido mediante la opción -nobrief) se utiliza como porcentaje de similitud y se calcula de la siguiente manera: (residuos similares x 100)/(longitud de la alineación - número total de huecos en la alineación) Las xilanasas (y/o la composición que contiene la xilanasa hipertermófila y altamente termoestable) se añaden ventajosamente durante la preparación del pienso, que es una preparación sólida como una harina o un pienso granulado, o una preparación líquida.

El proceso de granulación por lo general incluye etapas a alta temperatura, como la inyección de vapor.

Por el contrario, el pienso para animales se puede producir sin etapas de calentamiento (ej.: por encima de los 50 °C), por ejemplo, los piensos no granulados.

Un aspecto relacionado de la presente invención es un pienso (para animales) y/o una mezcla previa (de pienso) que contiene por kg entre 0.08 mg y 400 mg (preferiblemente entre 0.2 mg/kg y 40 mg/kg, más preferiblemente entre 0.4 mg/kg y 20 mg/kg) de un polipéptido con más de 75% (preferiblemente más de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o incluso 100%) de identidad (o similitud) con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, aminoácidos 21 a 332 (o desde el aminoácido 21 hasta el último aminoácido 344, 346 o 347) de la SEQ ID ??. , de la SEQ ID NO:2, de la SEQ ID NO:3, de la SEQ ID NO:4 y de la SEQ ID NO:5, siendo dicho polipéptido preferiblemente altamente termoestable y preferiblemente con actividad xilanasa hipertermófila.

Preferiblemente, el pienso (para animales) de la presente invención contiene al menos 50% (en peso seco) de materia vegetal, más preferiblemente al menos 55% o incluso al menos 60%.

Preferiblemente, esta materia vegetal se selecciona del grupo que consiste en cereales, legumbres, melaza de remolacha, pulpa de patata y harina de cacahuete y también puede ser una mezcla de los mismos, como cereales y legumbres.

Preferiblemente (o además), el pienso de la presente invención (que contiene al menos 50% de materia vegetal) contiene al menos 5% (peso seco) de proteína, más preferiblemente al menos 10%, al menos 15% o incluso al menos 20% de proteína.

Preferiblemente(o además), el pienso de la presente invención (que contiene al menos 50% de materia vegetal y/o al menos 5% de proteína) contiene al menos 2% (peso seco) de grasa, más preferiblemente al menos 5% o incluso al menos 8% de grasa.

Preferiblemente, el pienso de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en ensilados, piensos granulados y harinas.

Otro aspecto relacionado de la presente invención es el uso (no terapéutico) de un pienso (y/o el uso de una mezcla previa (de pienso) y/o el uso de un aditivo para piensos), complementado con una xilanasa hipertermófila y altamente termoestable (y/o el uso del aditivo para piensos para animales de la presente invención y/o el uso de la xilanasa hipertermófila y altamente termoestable de la presente invención) para mejorar la ganancia de peso corporal y/o el índice de conversión alimenticia de un animal (en crecimiento) (y más preferiblemente para no producir un aumento excesivo y patológico de peso).

La xilanasa preferida (hipertermófila y altamente termoestable) para mejorar (no terapéuticamente) la ganancia de peso corporal (GPC) y/o el índice de conversión alimenticia (ICA) de un animal (en crecimiento) tiene más de 70%, 75%, 80%, 85% 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o incluso más de 99% de actividad xilanolltica (total) resistente a 1 hora de calentamiento a 90 °C (o 95 °C).

Alternativamente, o además, las xilanasas preferidas (hipertermófilas y altamente termoestables) utilizadas para mejorar (no terapéuticamente) la ganancia de peso corporal (GPC) y/o el índice de conversión alimenticia (ICA) de un animal (en crecimiento) son glicósido hidrolasas de la familia 10.

Las xilanasas más preferidas utilizadas para mejorar (no terapéuticamente) la ganancia de peso corporal (GPC) y/o el índice de conversión alimenticia (ICA) de un animal (en crecimiento) son de Thermotoga y todavía más preferiblemente tienen una significativa homología (similitud) con las SEQ ID NO:1-5 o con el fragmento 21-332 de las SEQ ID NO:1-5 o contienen (como proteína de fusión) un péptido con una significativa homología (similitud) con el fragmento 21-332 de las SEQ ID NO:1-5.

En el contexto de la presente invención, "animales" se refiere preferentemente a animales no humanos y/o son animales sin patologías (aparentes) y/o sin patologías relacionadas con un déficit de peso.

Los animales de la presente invención son preferentemente animales no rumiantes y/o son animales monogástricos.

Más preferiblemente, los animales se seleccionan del grupo que consiste en cerdos, aves de corral, peces y crustáceos, aún más preferiblemente son cerdos y/o aves de corral.

Origen v preparación de la enzima Se ha descrito que varias especies y cepas de Thermotoga producen una o más endoxilanasas hipertermófilas y termoestables. Thermotoga marítima produce dos endoxilanasas termoestables, denominadas XynA y XynB. XynA y XynB son proteínas con masas moleculares aparentes de alrededor de 120 y 40 kDa. La máxima actividad a pH óptimo (pH 6.2 y pH 5.4 para XynA y XynB, respectivamente) se ha medido a aproximadamente 92 °C para XynA y a aproximadamente 105 °C para XynB (Winterhalter y Liebl, 1995, Appl. Env. Microbiol., 61 , 1810-1815). W093/19171 describe un proceso para obtener xilanasas de Thermotoga marítima, T. neapolitana y T. thermarum.

Se han publicado secuencias de ADN y proteínas de endo-xilanasas de varias cepas y especies de Thermotoga. Estas xilanasas pueden agruparse en dos tipos por homología de secuencia con XynA y XynB de T. marítima.

En ninguna de las referencias, al menos en ninguna de las referencias en las que se recoge una temperatura óptima muy elevada y casi ninguna actividad a 40 °C, se describe el uso de una xinalasa aislada de Thermotoga, como XynB, como aditivo para piensos.

Las xilanasas se pueden obtener de diferentes fuentes. Las xilanasas pueden aislarse/purificarse a partir del cultivo en un medio adecuado de una cepa Thermotoga seleccionada.

Las xilanasas se pueden obtener mediante el cultivo de una cepa recombinante que exprese un gen que codifique para la proteína correspondiente (por ejemplo, XynB).

Los genes adecuados se pueden elegir entre aquellos que codifican para la endo-1 ,4-beta-xilanasa de Thermotoga sp. RQ2 (GenBank: ACB09229.1), la endo-1 ,4-beta-xilanasa de Thermotoga naphthophila RKU-10 (GenBank: ADA66795.1), la xilanasa de Thermotoga neapolitana (GenBank: CAA90235.1), la endo-1 ,4-beta-xilanasa de Thermotoga sp. FjSS3-B.1 (GenBank: AAA90913.1) o la endo- ,4-beta-xilanasa B de Thermotoga marítima MSB8 (GenBank: AAD35164.1 - Figura 1 - SEQ ID NO:1).

Además, se pueden obtener variantes de estas enzimas que muestran una temperatura óptima de actividad (termoactividad) y una termoestabilidad dentro de los intervalos descritos anteriormente, mediante la modificación de la secuencia codificante de estos genes.

Entre las modificaciones de la secuencia se encuentran, entre otras, sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos. Las modificaciones de la secuencia preferidas son sustituciones conservadoras (por ejemplo, que resulten positivas tras un análisis BLASTp).

Preferiblemente, las variantes enzimáticas tienen al menos 80% identidad en la secuencia de aminoácidos con XynB de Thermotoga marítima MSB8, más preferiblemente al menos 90%, incluso más preferiblemente al menos 95% o al menos 90% de similitud en la secuencia de aminoácidos con XynB de Thermotoga marítima MSB8, más preferiblemente al menos 93%, 94%, 95%, incluso más preferiblemente al menos 98%.

La xilanasa recombinante puede expresarse en cualquier organismo hospedador adecuado. Son especialmente adecuados las bacterias, levaduras y hongos. Son preferibles cepas de Escherichia coli y Bacillusfsubtilis, licheniformis, amyloliquefaciens, megaterium...) o Streptomyces (coelicolor, lividans,...).

Las levaduras preferidas como hospedadoras son cepas de Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastorís o Yarrowia lipolytica. Los hongos preferidos como hospedadores son cepas de Aspergillus (nidulans, niger,...), Penicillium y Trichoderma.

Las xilanasas se pueden obtener también a partir de una planta y/o semilla transgénica que exprese la enzima correspondiente o de un animal transgénico.

La xilanasa se puede preparar mediante el cultivo de Thermotoga o de la cepa microbiana recombinante en un medio adecuado para el crecimiento y la expresión de la xilanasa. Preferiblemente, las cepas se cultivan en termentadores.

Tras el cultivo, la xilanasa puede recuperarse como un sobrenadante o un extracto de células del cultivo. El sobrenadante o extracto de células preferiblemente se purifica para obtener una preparación purificada o semipurificada. Los métodos de purificación adecuados son, entre otros, centrifugación, microfiltración, ultrafiltración, precipitación, cromatografía, etc.

Las xilanasas pueden proporcionarse en preparación líquida o seca (polvo). Las preparaciones líquidas se estabilizan preferentemente mediante la adición de un componente adecuado, como sal (NaCI) o glicerol. Las preparaciones en polvo se pueden obtener por ejemplo mediante atomización o liofilización. Las xilanasas pueden estar recubiertas.

Determinación de la actividad enzimática Existen varios métodos para determinar la actividad enzimática de las endoxiianasas en preparaciones líquidas. Es particularmente adecuado un método que utiliza la propiedad de las endoxiianasas de hidrolizar xilano como sustrato. La reacción de hidrólisis libera azúcares reductores que dan un color típico por reacción con ácido dinitrosalicílico (DNS). La intensidad del color a 570 nm es directamente proporcional a la actividad de la xilanasa de la muestra, siempre que la concentración de sustrato permanezca suficiente (es decir, no más del 10% de degradación y/o que la concentración de saturación del sustrato se mantenga durante toda la prueba).

Una DXU de xilanasa se define como la cantidad de enzima que libera 1 micromol de azúcares reductores (como equivalentes de xilosa) por minuto a partir de una solución al 3% (peso.volumen) de xilano de madera de abedul en tampón citrato-fosfato 100 mM a pH 6 y a 70 °C. La reacción se lleva a cabo durante 15 minutos en un volumen de 0.8 mi (0.7 mi de sustrato + 0.1 mi de xilanasa diluida). Después de la incubación, la reacción se termina mediante la adición de 1 mi de reactivo DNS (composición: NaOH 400 mM, ácido 3,5- dinitrosalicílico 40 mM, ta rt rato de sodio y potasio 1 M). La mezcla se mantiene a continuación a 95 °C durante 15 min y después se enfría a 25 °C durante 5 min. Por último, se mide la absorbancia a 570 nm frente a un control.

Para evaluar la actividad de la xilanasa (DXU/ml) en términos de la formación de azúcares reductores, se prepara una curva estándar de xilosa con xilosa en lugar de la preparación de enzima diluida. Todas las incubaciones del sustrato y las mediciones posteriores se realizan por triplicado.

Determinación de la temperatura óptima de actividad v termoestabilidad de las endoxilanasas La dependencia de la temperatura de la actividad xilanasa se analiza con una variante del método descrito anteriormente de formación de azúcares reductores con ácido dinitrosalicllico (DNS). El método DNS se lleva a cabo con mezclas de enzima/sustrato incubadas en un baño de aceite a temperaturas que oscilan entre 20 y 100 °C. Todos los demás parámetros del método se mantienen iguales.

La estabilidad de la temperatura se monitoriza mediante la incubación previa de las preparaciones de enzima en un baño a temperaturas que oscilan entre 50 y 100 °C. Después se toman muestras de 0, 10, 30, 60 (y 90) minutos y se enfrían en un baño de hielo durante 10 min. La actividad residual se mide por triplicado con el método descrito anteriormente.

Composición del pienso Los piensos para animales (incluidos los ensilados) pueden contener cereales como trigo, cebada, centeno, maíz, arroz, sorgo, espelta, triticale o avena, o productos derivados de cereales como el salvado de trigo, paja de cebada, mazorcas de maíz, avena molida, harinillas de trigo, pienso de gluten de trigo, germen de arroz o salvado de maíz, u otras materias vegetales como la soja u otras legumbres, colza, altramuces, guisantes, harina de tapioca, melaza de remolacha, pulpa de patata o harina de cacahuete. Son cereales preferidos el trigo, la cebada y el centeno.

Preferiblemente, la composición de piensos para animales de la invención contiene al menos una protelna o fuente de proteína vegetal. Son ejemplos de proteínas o fuentes de proteínas vegetales la soja y cereales tales como la cebada, el maíz, la avena, el arroz, el centeno, el sorgo y el trigo.

La composición del pienso para animales de la invención contiene ventajosamente 0-80% de maíz y/o 0-80% de sorgo y/o 0-70% de trigo y/o 0-70% de cebada y/o 0-30% de avena y/o 0-40% de harina de soja y/o 0-10% de harina de pescado y/o 0-20% de suero de leche.

La composición de pienso para animales de la invención contiene ventajosamente ingredientes o aditivos adicionales para piensos tales como enzimas, prebióticos, probióticos, minerales y oligoelementos, vitaminas y provitaminas, proteínas animales, vegetales o microbianas, aminoácidos, sus sales y sus análogos, almidón, fibras, carbohidratos y azúcares o edulcorantes, aceites y harinas oleaginosas, grasas vegetales o animales, colorantes, agentes emulsionantes y estabilizantes, espesantes y gelificantes, aglutinantes, antiaglomerantes y coagulantes, conservantes, reguladores de la acidez, carotenoides y xantofilas, urea y sus derivados, digestivos, estabilizadores de la flora intestinal, coccidiostáticos y otras sustancias medicamentosas.

Las enzimas adicionales preferidas se seleccionan del grupo que consiste en fítasas, amilasas, celulasas, glucanasas, proteasas, mananasas, pectinasas, hemicelulasas y (menos preferiblemente) (otras) xilanasas.

Los minerales preferidos se seleccionan del grupo que consiste en sales (cloruros, sulfatos, fluoruros, carbonatos, óxidos,...), calcio, fósforo, magnesio, potasio, sodio, manganeso, zinc, níquel, molibdeno, cobre, hierro, selenio, cobalto y yodo.

Las vitaminas preferidas se seleccionan del grupo que consiste en vitamina A, caroteno, ácido ascórbico, vitaminas D, D3, E, K, B1 o tiamina, B6 piridoxina, biotina, colina, ácido fólico, niacina, ácido pantoténico, vitamina B2 o riboflavina, cianocobalamina, etc.

Las proteínas adecuadas se seleccionan del grupo que consiste en proteínas vegetales, microbianas o animales.

Los aminoácidos adecuados se seleccionan del grupo que consiste en metionina, cisteína, Usina, treonina, tríptófano, isoleucina, leucina, valina, histidina, arginina, glicina, serina, fenilalanina, tirosina, ácido aspártico, ácido glutámico y prolina.

Son microorganismos adecuados los pertenecientes, entre otros a Aspergillus, Bacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Saccharomyces, Streptococcus.

Se pueden utilizar otros aditivos que figuran, por ejemplo, en el Registro Comunitario de Aditivos para Alimentación Animal de conformidad con el Reglamento (CE) N 0 1831/2003 - Apéndices 3a y 4 - Anexo: Lista de aditivos y sus actualizaciones.

Fabricación de piensos Se pueden fabricar piensos para animales como harinas (no en gránulos) o como piensos granulados. Por lo general, los piensos molidos se mezclan y a ellos se añaden cantidades suficientes de vitaminas y minerales esenciales de acuerdo con las especificaciones para la especie animal de que se trate.

La composición de la invención se puede añadir como una formulación sólida o líquida de la enzima, o bajo la forma de un aditivo para piensos, tales como una premezcla.

La composición sólida se añade normalmente antes o durante la etapa de mezclado y la líquida se añade normalmente después de la etapa de granulación.

Sin embargo, la composición líquida de enzima altamente termoestable y altamente termoactiva también puede añadirse antes de la etapa de granulación.

La dosificación de la xilanasa de la invención en el pienso se puede optimizar usando métodos de ensayo y error como se conoce en la técnica. Diferentes xilanasas pueden tener diferentes intervalos de dosificación óptimos.

PREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de la xilanasa XynB de Thermotoga marítima MSB8. El péptido señal aparece subrayado.

Las Figuras 2A y 2B muestran geles de SDS-poliacrilamida teñidos con azul de Coomassie de las endoxiianasas recuperadas después de las sucesivas etapas de purificación. Figura 2A: XynAANC; Figura 2B: XynB.

La Figura 3 muestra el efecto de la temperatura sobre la actividad de las endoxiianasas XynAANC y XynB. La actividad máxima se ha fijado en 100%.

Las Figuras 4A y 4B muestran la actividad residual de las endoxiianasas después de la incubación previa a diversas temperaturas.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Preparación de las endoxiianasas de Thermotoga.

Clonación de los dominios catalíticos de las xilanasas Xvna v XvnB de Thennotoaa marítima Sobre la base de las secuencias publicadas de los genes de Thermotoga XynA (GenBank/GenPept™ registro Z46264) y XynB (GenBank/ GenPept™ registro AAD35164), todo el gen XynB y el fragmento de ADN correspondiente al dominio catalítico del gen XynA de (xyn NC) se amplificaron mediante PCR a partir del ADN genómico de Thermotoga marítima MSB8 (DSM3109/ATCC43589) siguiendo protocolos clásicos.

Los productos de PCR se clonaron en el Sistema I del vector pGEM-T (Promega), utilizando el procedimiento recomendado por el proveedor, y se utilizaron para transformar células de E. coli DH5a® ultracompetentes. La discriminación azul-blanco permitió seleccionar las colonias blancas que llevan el fragmento de PCR. Se secuenciaron preparaciones del plásmido purificado (plásmido Nucleospin, Macherey-Nagel) en un secuenciador de ADN ALF (Pharmacia Biotech). La secuenciación del fragmento insertado se llevó a cabo usando los cebadores universales T7 y RP, así como cebadores correspondientes a secuencias de ADN internas. Las secuencias obtenidas eran idénticas a las secuencias publicadas (Gen Bank/Gen Pept™, números de registro Z46264 para XynA, y AAD35164 para XynB).

El fragmento de ADN correspondiente al dominio catalítico derivado del XynA modular (XynAANC) y el correspondiente al gen XynB completo se subclonaron en el vector de clonación pET 22b(+) (Novagen). Los plásmidos recombinantes resultantes se transformaron en células de E. coli BL21 (DE3) (Stratagene).

Cultivo de las cepas recombinantes y producción de las xilanasas XvnAANC vXvnB de Thermotoaa marítima Se centrifugaron 15 mi de un cultivo previo durante 5 horas (37 °C) de células de la E. coli BL21 (DE3) portadoras de los genes de xilanasa a 10.000 g durante 1 minuto y el sedimento se resuspendió en 900 mi de caldo Terrific (12 g/l de Bacto-triptona (Difco), 24 g/l de extracto de levadura (Difco), 4 ml/l de glicerol, 12.54g/l de K2HP04, 2.31 g/l de KH2P04) con ampicilina 200pg/ml en un matraz de 3 litros con agitación. Los cultivos se incubaron a 37 °C y 250 rpm hasta alcanzar una absorbancia a 550 nm de entre 3 y 4, tras lo cual se indujo la expresión de la enzima con isopropil-1 -tio-ß-galactopiranósido 1 mM.

Después de 15 horas de incubación a 37 °C, las células se recogieron por centrifugación a 18.000 g durante 30 minutos a 4 °C, se resuspendieron en BICINE 50 mM con NaCI 10 mM, se fragmentaron en un disruptor de células precongeladas (Constant Systems Ltd., Warwick, Reino Unido) a 28Kpsi y se centrifugaron a 40,000 g durante 30 minutos. Se retiró el ADN cromosómico de los lisados celulares en bruto por tratamiento con sulfato de protamina al 0.2% (Calbiochem) y centrifugación a 40,000 g durante 30 minutos. A continuación se añadieron a la solución 25 unidades de benzonasa (Merck, Darmstadt, Alemania).

Recuperación de las xilanasas recombinantes XvnAANC vXvnB Las preparaciones enzimáticas brutas de XynAANC y de XynB de Thermotoga marítima expresadas en Escheríchia coli se concentraron por ultrafiltración mediante recirculación de las preparaciones líquidas en una membrana de UF de polietersulfona (tamaño de corte = 5 kDa) de Biomax en un sistema Proflux (Millipore). Las soluciones de enzimas concentradas se filtraron en un sistema de filtración estéril, que incluye varios pasos con diferentes cortes y, finalmente, un filtro absoluto (corte = 0.22 µ?) (Millipore).

Las enzimas líquidas concentradas se secaron en un secador de lecho fluido ProCell LabSystem (Glatt), donde se pulverizaron sobre un vehículo (harina de trigo), lo que dio como resultado una preparación de enzima granulada con escasa formación de polvo.

Purificación de las xilanasas recombinantes XvnAANC vXvnB XynAANC se purificó mediante un procedimiento de tres pasos.

El extracto bruto se dializó 2500x frente a tampón cromatográfico (Tris-HCI 20 mM pH 8.0), se cargó en una columna de intercambio aniónico fuerte Q HP XK 16/20 (GE Healthcare) y se diluyó con un gradiente lineal (NaCI 0 - 1 M). Después, la preparación semi-purificada se dializó 2500x frente a tampón cromatográfico (Tris-HCI 20 mM pH 8.0) y se cargó en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Sephacryl S-100 HR 120 mi XK 16/70 (GE Healthcare). Las fracciones activas se reunieron, se dializaron 2500x frente a tampón cromatográfico (T ris-HCI 20 mM pH 8.0), se cargaron en una columna de intercambio aniónico fuerte Mono-Q GL 5/50 (GE Healthcare) y se diluyeron con un gradiente lineal (NaCI 0 - 1 M). Las fracciones purificadas se agruparon y su pureza se verificó en SDS -PAGE (figura 2A).

XynB se purificó mediante un procedimiento de dos pasos. La mayoría de las proteínas hospedadoras se eliminó por tratamiento térmico de la preparación enzimática (30 min a 75 °C) seguido de centrifugación (12,000 g a 4 °C). El sobrenadante se dializó 2500x frente a tampón cromatográfico (Bis-Tris 20 mM pH 6.2), se cargó en una columna de intercambio iónico Q-Sepharose FF (GE Healthcare) y se diluyó con un gradiente lineal (NaCI 0 - 1 M). La pureza de la xilanasa recombinante se comprobó en SDS -PAGE (figura 2B).

Caracterización de las enzimas recombinantes La actividad xilanasa de xynAANC y XynB se determinó a diferentes temperaturas usando las condiciones de análisis descritas. Las actividades máximas fueron a 70 °C y 90-95 °C, respectivamente (figura 3). Se evaluó la estabilidad de las enzimas recombinantes usando el protocolo antes descrito. Los resultados (figuras 4A y 4B) mostraron que XynAANC mantiene el 30% de su actividad después de la incubación a 60 °C durante 60 min. XynB mantiene el 100% de su actividad después de la incubación a 90 °C durante 60 min.

EJEMPLO 2 Uso de las xilanasas de Thermotoga marítima (XvnAANC y XvnB) en piensos para animales Se llevó a cabo un ensayo con pollos de engorde machos o hembras (Belgabroed). Desde el día 1 al 42 de vida se mantuvieron en corrales con suelo y se alimentaron con un pienso comercial para pollos de engorde suplementado o no con xilanasas exógenas. Con 1 día de vida, los animales (768 aves - 384 machos/384 hembras) se distribuyeron al azar en 24 corrales (4 tratamientos x 2 sexos x 3 repeticiones) de 32 aves/corral, 0.8 m3/corral. Con 14 días de vida, fueron distribuidos en 48 corrales (4 tratamientos x 2 sexos x 6 repeticiones) de 16 aves. Cada corral contaba con 2 bebederos y una bandeja de alimentación. La temperatura era de 35 °C al inicio y luego se redujo 0,5 °C por día; a los 22 días, la temperatura se mantuvo a 22 °C. El esquema de luz fue de 23 h 30 min de luz y 30 minutos de oscuridad en el primer período y 18 h de luz y 6 h de oscuridad durante el segundo período. Las aves fueron vacunadas contra la enfermedad de Newcastle el día 1 (en incubadora) y contra la enfermedad de Gumboro + Newcastle el día 14 (con el agua de bebida).

Se consideraron cuatro tratamientos en este ensayo. A una dieta a base de trigo (Tabla 1), no se añadió enzima (control) o bien se añadió una cantidad equivalente a 500 DXU de XynAANC de Thermotoga mantima/Kg de pienso o una cantidad equivalente a 400 DXU de XynB de Thermotoga maritima/kg de pienso o una xilanasa de Bacillus subtilis (Belfeed™ B1100MP (E1606), una endo-1 ,4-beta-xilanasa comercializada por Beldem - una división de Puratos, Groot -Bijgaarden, Bélgica) a la dosis recomendada de 10 Ul/kg de pienso (control positivo).

Los inventores compararon diferentes niveles del control positivo (la xilanasa comercial Belfeed), tales como 50 Ul/kg de pienso y encontraron que ambos parámetros (GPC y ICA) alcanzaban una meseta a 10 Ul/kg de pienso. Por tanto, los inventores utilizaron esta cantidad para el control positivo.

Las enzimas se añadieron al pienso en forma de líquidos (XynAANC y XynB) o en polvo (Belfeed) en una premezcla previa a su mezcla con el pienso. Las dietas se ofrecieron ad libitum a los animales en forma de una harina. El agua también estaba a libre disposición.

Se registró el peso corporal los días 1 , 14 y 42. Se registró el suministro de pienso y se midió el pienso que quedaba en la bandeja inmediatamente después del pesaje 2 y 3.

Se determinó la ganancia de peso corporal (GPC) y el índice de conversión alimenticia (ICA) durante los períodos de 1-14 días, 14-42 días y 1-42 días de vida.

TABLA 1 Composición del pienso y contenido en ios principales nutrientes Los resultados de este ensayo figuran en la Tabla 2, que muestra la media de GPC e ICA de los pollos de engorde en dos períodos.

TABLA 2 El crecimiento y el ICA mejoraron con las dietas que contenían XynAANC y XynB, después de los 14 días del período de inicio o después del período total de engorde de 42 días. XynB demostró un mejor rendimiento que XynAANC.

EJEMPLO 3 Uso de las xilanasas de Thermotoaa marítima (XynB) en los piensos para animales Se llevó a cabo un ensayo con pollos de engorde machos o hembras (Belgabroed). Desde el día 1 al 42 de vida se mantuvieron en corrales con suelo y se alimentaron con un pienso comercial para pollos de engorde suplementado o no con xilanasas exógenas. Con 1 día de vida, los animales (768 aves - 384 machos/384 hembras) se distribuyeron al azar en 24 corrales (4 tratamientos x 2 sexos x 3 repeticiones) de 32 aves/corral, 0.8 m'/corral. Con 14 días de vida, fueron distribuidos en 48 corrales (4 tratamientos x 2 sexos x 6 repeticiones) de 16 aves. Cada corral contaba con 2 bebederos y una bandeja de alimentación. La temperatura era de 35 °C al inicio y luego se redujo 0.5 °C por día; a los 22 días, la temperatura se mantuvo a 22 °C. El esquema de luz fue de 23 h 30 min de luz y 30 minutos de oscuridad en el primer período y 18 h de luz y 6 h de oscuridad durante el segundo período. Las aves fueron vacunadas contra la enfermedad de Newcastle el día 1 (en incubadora) y contra la enfermedad de Gumboro + el día 14 (con el agua de bebida).

Se consideraron cuatro tratamientos en este ensayo. A una dieta a base de trigo (Tabla 3), se añadió una cantidad equivalente a 200 DXU de XynB/kg de pienso o una cantidad equivalente a 400 DXU de XynB/kg de pienso o una xilanasa fúngica comercializada Hostazym® X (Huvepharma; EC ??1617) a la dosis recomendada de 100 ppm o una xilanasa de Bacillus subtilis (Belfeed™ B1100MP (E1606), una endo-1 ,4-beta-xilanasa comercializada por Beldem - una división de Puratos, Groot -Bijgaarden, Bélgica) a la dosis recomendada de 10 Ul/kg de pienso o 100 ppm.

Las enzimas se añadieron al pienso en forma de polvo incorporado en una premezcla previa a la mezcla con la dieta. Las dietas se ofrecieron ad libitum a los animales en forma de harina. El agua también estaba a libre disposición.

Se registró el peso corporal los días 1, 14 y 42. Se registró el suministro de pienso y se midió el pienso que quedaba en la bandeja inmediatamente después del pesaje 2 y 3.

Se determinóla ganancia de peso corporal (GPC) y el índice conversión alimenticia (ICA) durante los períodos de 1-14 días, 14-42 días y 1-42 días de vida.

TABLA 3 Composición del pienso v contenido en los principales nutrientes Los resultados de este ensayo figuran en la Tabla 4, que muestra la media de GPC y de ICA de los pollos de engorde en dos períodos TABLA 4 El crecimiento y el ICA mejoraron significativamente con las dietas que contenían las enzimas XynB, después de los 14 días del período de inicio o después del período total de engorde de 42 días. XynB demostró una mejor GPC e ICA que otras xilanasas comerciales.

Claims (19)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un pienso para animales seleccionado del grupo que consiste en ensilados, piensos granulados y harinas, dicho pienso para anímales está suplementado con una composición que contiene una xilanasa, en donde dicha xilanasa es hipertermófila y altamente termoestable, en donde la temperatura óptima de la actividad xilanolítica presente en dicha composición es mayor que 80 "C, en donde más de 70% de la actividad xilanolítica presente en dicha composición es resistente a 30 minutos de calentamiento a 90 °C y con una tasa de actividad de la actividad xilanolítica presente en dicha composición a temperatura óptima y a 40 °C es superior a 10.

2. - El pienso para animales de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la temperatura óptima de la actividad xilanolítica presente en dicha composición es mayor que 85 °C, preferiblemente superior a 90 °C.

3. - El pienso para animales de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado además porque la tasa de actividad de la actividad xilanolítica presente en dicha composición a una temperatura óptima y a 40 °C es superior a 20.

4. - El pienso para animales de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la actividad xilanasa presente en dicha composición se mide usando xilano al 3% (peso:volumen), preferiblemente xilano de madera de abedul al 3% (peso:volumen), como sustrato.

5. - El pienso para animales de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la actividad de xilanasa presente en dicha composición se mide después de 15 minutos de reacción.

6. - El pienso para animales de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la xilanasa hipertermófila y altamente termoestable tiene más de 80% de identidad y/o 95% de similitud con una xilanasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, aminoácidos 21 a 332 de la SEQ ID NO:1 , de la SEQ ID NO:2, de la SEQ ID NO:3, de la SEQ ID NO:4 y de la SEQ ID NO:5.

7.- El pienso para animales de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la xilanasa hipertermófila y altamente termoestable tiene más de 99% de identidad con una xilanasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, aminoácidos 21 a 332 de la SEQ ID NO:1 , de la SEQ ID NO:2, de la SEQ ID NO:3, de la SEQ ID NO:4 y de la SEQ ID NO:5.

8.- El pienso para animales de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque contiene entre 0.08 y 40 mg/kg de dicha xilanasa hipertermófila y altamente termoestable.

9.- El pienso para animales de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque contiene al menos 50% (en peso seco) de materia vegetal.

10.- El pienso para animales de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la materia vegetal se selecciona del grupo que consiste en cereales, legumbres, melaza de remolacha, pulpa de patata y harina de cacahuete.

11. - El pienso para animales de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque contiene al menos 5% (peso seco) de proteínas y/o al menos 2% (peso seco) de grasa.

12. - El uso de una xilanasa hipertermófila y altamente termoestable, para mejorar la ganancia de peso corporal y/o el índice de conversión alimenticia en un animal, siendo la temperatura óptima de dicha xilanasa hipertermófila y altamente termoestable superior a 80 °C, siendo más del 70% de la actividad xilanolitica de dicha xilanasa hipertermófila y altamente termoestable resistente a 30 minutos de calentamiento a 90 °C y siendo la tasa de actividad a temperatura óptima y a 40 °C de dicha xilanasa hipertermófila y altamente termoestable superior a 10.

13.- El uso de la reivindicación 12, en donde la actividad xilanasa se amide usando xilano al 3% (peso:volumen), preferiblemente xilano de madera de abedul al 3%, como sustrato.

14.- El uso de las reivindicaciones 12 o 13, en donde la actividad xilanasa se amide después de una reacción durante 15 minutos.

15.- El uso del pienso para animales de cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 11 para mejorar la ganancia de peso corporal y/o el índice de conversión alimenticia en un animal.

16.- El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes 12 a 15, en donde el animal es un vertebrado no rumiante o un crustáceo y preferiblemente un pez, un cerdo o un ave de corral, más preferiblemente un cerdo o un ave de corral.

17.- Un método para producir el pienso para animales de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 11 , caracterizado además porque comprende los pasos de: a) selección de un pienso que contiene hemicelulosa; b) adición de una composición que contiene xilanasa hipertemnófila y altamente termoestable, en donde más del 70% de la actividad xiianolítica presente en dicha composición es resistente a 30 minutos de calentamiento de dicha composición a 90 °C, en donde la temperatura óptima de la actividad xiianolítica presente en dicha composición es superior a 80 °C y en donde la tasa de actividad de la actividad xiianolítica presente en dicha composición a una temperatura óptima y a 40 °C es superior a 10.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la actividad xilanasa presente en dicha composición se mide usando xilano al 3% (peso:volumen), preferiblemente xilano de madera de abedul al 3%, como sustrato.

19.- El método de conformidad con las reivindicaciones 17 o 18, caracterizado además porque la actividad xilanasa presente en dicha composición se mide después de una reacción durante 15 minutos.