TR201404579A2 - Yem katkısı olarak kullanılmak üzere ksilanaz enzimi üretimi ve bu enzimden toz preparat ve kaplanmış ürün elde edilmesi yöntemi. - Google Patents
Yem katkısı olarak kullanılmak üzere ksilanaz enzimi üretimi ve bu enzimden toz preparat ve kaplanmış ürün elde edilmesi yöntemi. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201404579A2 TR201404579A2 TR2014/04579A TR201404579A TR201404579A2 TR 201404579 A2 TR201404579 A2 TR 201404579A2 TR 2014/04579 A TR2014/04579 A TR 2014/04579A TR 201404579 A TR201404579 A TR 201404579A TR 201404579 A2 TR201404579 A2 TR 201404579A2
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- xylanase
- enzyme
- production
- preparation
- feed
- Prior art date
Links
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 title claims abstract description 338
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 268
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 268
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 84
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 106
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 102
- 239000000843 powder Substances 0.000 title claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 69
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 58
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 50
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 42
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 38
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 38
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 35
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 claims description 33
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- 229910021532 Calcite Inorganic materials 0.000 claims description 21
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 18
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 16
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 14
- 239000013587 production medium Substances 0.000 claims description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 10
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 10
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 239000007931 coated granule Substances 0.000 claims description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 claims description 6
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 claims description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 17
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 257
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 106
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 97
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 55
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 55
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 53
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 50
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 31
- 239000000047 product Substances 0.000 description 30
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 25
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 22
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 18
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 17
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 16
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 15
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 15
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 14
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 14
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 14
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- 244000292604 Salvia columbariae Species 0.000 description 10
- 235000012377 Salvia columbariae var. columbariae Nutrition 0.000 description 10
- 235000001498 Salvia hispanica Nutrition 0.000 description 10
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 10
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 10
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 235000014167 chia Nutrition 0.000 description 10
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 10
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 10
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 9
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 9
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 9
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 8
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 8
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 6
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 6
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 6
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 6
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 6
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 6
- 101150091506 xynA gene Proteins 0.000 description 6
- 241000635201 Pumilus Species 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- WDMUXYQIMRDWRC-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,4-dinitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C([N+]([O-])=O)=C1O WDMUXYQIMRDWRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108010001817 Endo-1,4-beta Xylanases Proteins 0.000 description 4
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 241000272534 Struthio camelus Species 0.000 description 4
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 4
- 235000019730 animal feed additive Nutrition 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 4
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 3
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 3
- 239000004368 Modified starch Substances 0.000 description 3
- UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N [5-[3,5-dihydroxy-2-(1,3,4-trihydroxy-5-oxopentan-2-yl)oxyoxan-4-yl]oxy-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl (e)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoate Chemical compound OC1C(OC(CO)C(O)C(O)C=O)OCC(O)C1OC1C(O)C(O)C(COC(=O)\C=C\C=2C=CC(O)=CC=2)O1 UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 229920000617 arabinoxylan Polymers 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 3
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 3
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 3
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710088758 23kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 2
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 2
- AYGMEFRECNWRJC-UHFFFAOYSA-N Asparagusic acid Natural products OC(=O)C1CSSC1 AYGMEFRECNWRJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 101100157016 Aspergillus niger (strain CBS 513.88 / FGSC A1513) xlnC gene Proteins 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 description 2
- 101710130006 Beta-glucanase Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N D-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 2
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 2
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001480714 Humicola insolens Species 0.000 description 2
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 2
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 101100317617 Paenibacillus sp. (strain JDR-2) xynA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001131 Pulp (paper) Polymers 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 241000203780 Thermobifida fusca Species 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021536 Zeolite Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000001240 acylated distarch phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000037208 balanced nutrition Effects 0.000 description 2
- 235000019046 balanced nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 2
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 2
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011247 coating layer Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 2
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- YERABYSOHUZTPQ-UHFFFAOYSA-P endo-1,4-beta-Xylanase Chemical compound C=1C=CC=CC=1C[N+](CC)(CC)CCCNC(C(C=1)=O)=CC(=O)C=1NCCC[N+](CC)(CC)CC1=CC=CC=C1 YERABYSOHUZTPQ-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 2
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 2
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 235000021232 nutrient availability Nutrition 0.000 description 2
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 2
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000003921 particle size analysis Methods 0.000 description 2
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000000467 phytic acid Substances 0.000 description 2
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 238000003498 protein array Methods 0.000 description 2
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 2
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 2
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 2
- 229940039780 wheat preparation Drugs 0.000 description 2
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 2
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 1
- NJNFCDQQEIAOIF-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxy-2-methylsulfanylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(CCN)C(SC)=C1OC NJNFCDQQEIAOIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000143940 Colias Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000223198 Humicola Species 0.000 description 1
- 244000035744 Hura crepitans Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 244000193174 agave Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000070969 koal Species 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 101150059159 proA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000011962 puddings Nutrition 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
Landscapes
- Fodder In General (AREA)
Abstract
Bu buluş yem katkısı olarak kullanılan ksilanaz enzimi ve yeni mikroorganizmalar ve bunlardan elde edilen yeni bakteriyel ksilanaz preparatlan ve bunların hazırlanması yöntemi ile ilgilidir.
Description
TARIFNAME
YEM KATKISI OLARAK KULLANILMAK ÜZERE KSILANAZ ENZIMI
ÜRETIMI VE BU ENZIMDEN TOZ PREPARAT VE KAPLANMIS ÜRÜN
ELDE EDILMESI YÖNTEMI
Teknik Alan
Bu bulus yem katkisi olarak kullanilan ksilanaz enzimi ve yeni mikroorganizmalar
ve bunlardan elde edilen yeni bakteriyel ksilanaz preparatlari ve bunlarin
hazirlanmasi yöntemi ile ilgilidir.
Önceki Teknik
Sindirim kanalinda yem yapi taslarinin parçalanmasi, ara madde degisimindeki
vücut maddelerinin yapimi ve parçalanmasinda enzimlere mutlaka gereksinim
duyulmaktadir. Bu yüzden kanatli hayvanlarin verim yeteneklerinin enzimlerin
besleyici etkinligi yardimiyla düzeltilmesi saglanmaktadir. Enzimler beslemede
yem elzem yapi taslarini arttirmaktadirlar. Enzimler proteinli maddeler
olduklarindan sicaklik ve ortamin pH”ina karsi duyarlidirlar. Teknigin bilinen
durumunda farkli pH, sicaklikta islevsel ve stabil olan pek çok enzim
tanimlanmaktadir. Yemdeki besleyici özellikte olmayan yapilara (örnegin fitik asit)
karsi ve yapisinda olmayan polisakkaritlerin sindirimi için enzimlerden
yararlanilmaktadir. Kullanilacak enzimin seçimi yemin kompozisyonuna göre
yapilmaktadir. Pozitif enzimatik yikim ile; enerji kazanimi, proteinden yararlanma
ve amino asitlerin kullanimi iyilesmektedir. Bu amaçla mikroorganizma kaynakli
farkli özellikte enzimler üretilmekte ve üretilen bu enzimler yem katkisi olarak da
kullanilmaktadir.
Endo-1,4-beta ksilanaz aktivitesine sahip enzim; 1,4-beta ksilanin
ksilooligosakkaritlere dönüsümünde etkili olup, örnegin yemdeki temel pentozan
bilesiklerinin sindiriminde rol oynamaktadir.
Ksilanaz katkili yem ile beslenmede, bagirsak Vizkositesinde azalma, arabinoksilan
polimer zincirlerinin kirilmasi sonucu enerji yararlanilabilirliginde artis
saglanmaktadir. Ayrica polisakkarit hücre duvari bütünlügünün bozulmasi sonucu
kapsüle edilmis besin maddelerinin (çogunlukla protein, nisasta ve yag) açiga
çikarilmasinin da besin madde yararlamlabilirliginin artirilmasinda önemli rol aldigi
bildirilmektedir. Bugday esasli yemlere ksilanaz enzimi ilavesi ile bitkisel
hammaddelerdeki arabinoksilamn yararli hale geçirilmesi saglandigindan yemden
yararlanma degerini iyilestirmektedir. Ksilanaz ilavesi ile ince bagirsak viskozitesi
ve dolayisiyla diski yapiskanligi azalmakta, diskinin kuru maddesi yükselmektedir.
Sonuç olarak kirli yumurta sayisinda azalma ve altlik kalitesinde iyilesme
olmaktadir.
Ksilanaz enzimi; Baci'llus türleri dahil, ki bunlar güvenli mikroorganizmalar olarak
kabul edilmislerdir, bazi bakteriler ve funguslar tarafindan hücre disina salinan bir
enzimdir. Ksilanaz enzimi (EC 3.2.1.8) ticari olarak büyük çaplarda hali hazirda
üretilmekte ve söz konusu enzimin yaygin olarak yem, gida, kagitçilik,
biyodönüsüm prosesleri ve biyoenerji amaçli kullanimlari bulunmaktadir. Ksilanaz
yalniz ya da diger enzimler ile birlikte bitkisel ya da mikrobiyal hücre duvarinin
yikiminda (degredasyonunda) kullanilmaktir.
Ksilanaz enzimi mikroorganizma veya bitki kökenli olabilmekte, bu nedenle de çok
çesitlilik göstermektedir. Bakterilerden (ör. Bacillus türleri) ya da diger
mikroorganizmalardan (ör. Aspergi'llus türleri, T richoderma türleri, Humi'cola
türleri) kullanilarak fermentasyon ile üretilmis, enzim preparatlari bulunmaktadir.
Bunlar dogal kaynaklardan veya klonlanmis genlerinden üretilerek olmaktadir.
Ksilanaz enzimi üzerine basta Birlesik Devletler, Avrupa ülkeleri, Çin, Japonya,
daha az Hindistan ve Kore olmak üzere bazi patent korumalari mevcuttur. Bu
patentler incelendiginde; çogunlugunda ksilanaz ile yem formülü için patent
alindigi, birkaçinda enzimin genetik yapisindan hareketle sicakliga ya da
inhibitörlere karsi korumali sekilde ksilanazin gelistirildigi görülmektedir.
Patentlerde yem rasyonunda kullanilmaya elverisli ksilanazlar mevcut olmasina
ragmen bu ksilanazlar üretim yöntemleri ve enzim özellikleri açisindan bulus
konusu yöntemde bahsedilen ksilanazdan farklidir.
Mevcut teknikte enzim üretimi ile ilgili yer alan patent dokümanlarinin bazilarindan
asagida bahsedilmektedir.
US7638613 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda genis asidik ve bazik pH
araliginda çalisabilen ve bir Bacillus susuna ait ksilanazim üreten yeni
organizmalardan bahsedilmis olup, ksilanazin ekspresyonunun saglandigi
ekspresyon ve integresyon vektörleri patent korumasi kapsamindadir. Bu ksilanazin
lignoselülozik kagit hamurunun biyoagartma islemlerine uygun oldugu
belirtilmektedir.
WO91/ 18978 sayili uluslararasi patent dokümaninda ksilanaz enzimi ve üretimi ile
ilgili olarak; ATCC 21783 numarasi ile kayitli Bacillus ci'rculans kökenli ksilanaz
selülozik materyallerin agartilmasinda kullanimindan bahsedilmektedir.
NZ236708 sayili Yeni Zelanda patent dokümaninda Baci'llus stearothermophilus
ksilanazi koruma altina alinmis olup bu ksilanazin odun pulpundan ligninin
uzaklastinlmasi islemine tabi tutulmasi için uygun oldugu belirtilmektedir.
WO9203540 sayili uluslararasi patent dokümaninda Bacillus pumilus ksilanazi
koruma altina alinmis olup söz konusu ksilanazin lignoselulozik pulplarin
parçalanmasi islemine tabi tutulmasi için uygun oldugu belirtilmistir.
Escherichia coliaye transfer edilen rekombinant ksilanaz enzim üretimi yönteminden
bahsedilmektedir.
JP60075286 sayili Japon patent dokümaninda rekombinant plazmit araciligi ile
ksilanaz elde edilen diger bir örnek Baci'llus orjinli ksilanazin üretiminden
bahsedilmektedir. B pumilus IPO susunun ksilanaz geni, B subtilis Mlll3 kökenli
pUB vektörüne aktarilarak ksilanaz üretici plazmit elde edilmektedir.
USS306633 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda Baci'llus subti'li's DSM
7147 susundan elde edilen bakteriyel ksilanaz geni ve bu enzimin ekmek ve firin
mamülleri yapimi için uygun bir enzim olarak kullamlabileceginden
bahsedilmektedir.
USS457045 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda Bacillus pumi'lus DSM
6124 susundan elde edilen ksilanazdan bahsedilmekte olup söz konusu ksilanazin
kagit sektöründe lignoselulozik pulplarin parçalanmasi için uygun oldugu
belirtilmektedir.
WO92/ l 757 3 sayili uluslararasi patent dokümaninda kagit, hamur ve hayvan yemine
uygun Humicola insolens DSM 1800 susundan elde edilen ksilanaz, rekombinant
DNA dizisi ve ksilanaz içeren formülden bahsedilmektedir. .
U85612055 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda yem katkisi olarak
ksilanazdan ve bununla hazirlanan yemin T richoderma kökenli oldugu ksilanazdan
bahsedilmektedir. Söz konusu patent dokümaninda açiklanan bulus tahil içerikli
yemde kullanilmasi gereken ksilanaz ve beta-glukanazin birlikte nasil uygulanmasi
gerektigini açiklamaktadir.
US6083733 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda açiklanan bulus 80°C ya
da üzerinde çalisabilen isiya karsi kararli ksilanaz ve bu ksilanazin Yeni
Zelanda”daki bir sicak su kaynagindan izole edilmis anaerobik bakteri orjinli
enzimiyle ilgilidir. Söz konusu enzimin çalisma pH°1 9.0 ve üzeri olarak
açiklanmaktadir. Dolayisiyla kagit, kagit hamuru (paper and pulp) ve agartma
(bleaching) yöntemlerine uygun ve G-tipi bir ksilanaz oldugu belirtilmektedir.
USS866408 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda T richoderma kökenli
ksilanazlar, sicaklik ve alkali özellik açisindan modifikasyon ile ilgili
gelistirilmelerden bahsedilmektedir. Söz konusu patent dokümaninda açiklanan
bulusta Baci'llus circulans ve Thermomonospora fusca ksilanazina ait kimerik
yapilarin hazirlanmasindan ve enzimin kagit agartmasinda kullanima uygun
oldugundan bahsedilmektedir.
U86140095 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda kagit ve kagit hamuru
üretim yöntemlerine uygun ksilanaz Kenya”daki bir gölden izole edilen ve alkalifilik
özellik gösteren Baci'llus ,tan dogal ve rekombinant yolla üretilmektedir. Söz konusu
enzimlerin çalisma kosullari pH 9.0 ve 70°C”dir Enzimi hücre kültürü
süpematantina salan Baci'llus ailesinden DSM 8751 numarali mikroorganizma ve
enzimi, rekombinant olarak da üretebilen mikrobiyal konakçisi ve enzimin ifade
edildigi vektörler patent kapsamindadir.
klonlanan ksilanaz geninin hücre disina sekresyonundan bahsedilmektedir. pCX311
plazmiti ve bunu tasiyan mikroorganizma ve bu mikroorganizmanin kültür metodu
da söz konusu Birlesik Devletler patent dokümaninda açiklanmaktadir.
EP1263941 sayili Avrupa patent dokümaninda mutant ksilanazlarin bitki materyal
proseslerinde kullanimindan bahsedilmektedir.
US7527957 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda bir ya da daha fazla amino
asit modifikasyonu ile Baci'llus subtz'li's ksilanazinin inhibitörlerine duyarliliginin
degisimi yönünden gelistirilmesinden bahsedilmektedir. Hayvan yeminde bugday
formülasyonuna katilan enzimin aktivitesinde inhibitörler problem teskil ettiginden,
ksilanazi inhibitörlerine karsi duyarsizlastirrna söz konusu patent dokümaninda
belirtilen farkli amino asitler üzerinde yapilan yönlendirilmis mutasyon ile
saglanmaktadir.
Hayvan yemi, deterjan, gidalar gibi çesitli alanlarda kullanilabilecek sivi enzim
solüsyonlarini hamur haline getirerek ekstrüzyon ile kurutma, püskürtmeli kurutucu
veya akiskan yatakta kurutulmasi birçok patente konu olmustur. Püskürtmeli
kurutucu ile kurutulan ürünlerde ince toz yapisi nedeniyle tozuma problemi ile
karsilasilmistir. US7691438 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda enzim
preparatlari akiskan yatakta granül haline getirilerek tozuma problemi giderilmistir.
Bunun için enzim granülleri 115-180°C hava giris sicakliginda kurutulmustur. Yine,
hayvan yemi için enzim granülü üretimi konusundaki EP1695633 sayili Avrupa
patent dokümaninda farkli uygulamalarin aktivite üzerine etkisi belirlenmis ve
aktivite degerleri piyasada mevcut ürünler ile karsilastirilmistir. Enzim içeren kor,
akiskan yatak kullamlarak 30-120°C araliginda kaplanmistir. Söz konusu patent
dokümaninda açiklanan bulus konusu enzim granüllerinin kurutulmasi sirasinda ise
giris hava bagil nemi sogutucu sistemli çalisan bir kondansatör ile %qun altina
düsürülerek kurutma islemi termostabil bir enzimle çalisildigindan 40-60°C,de
gerçeklestirilmistir. Isiya karsi duyarli enzimler için minimum aktIVIte kaybi ile
granül ürün elde edilmesi için bagil nemi azaltilmis hava alternatif yöntemde oda
sicakligindaki kuru hava ile de kurutma ve kaplama isleminin yapilmasi mümkün
olabilmektedir.
USZOO2/Ol7344l sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda açiklanan bulusta
enzim granülasyonu için tasiyici malzeme olarak su tutma kapasitesi yüksek zeolit,
silikatlar, bentonit, diatome toprak gibi malzemelerin kullanimindan
bahsedilmektedir. Kalsit (kalsiyum karbonat) çogunlukla deterjan
kompozisyonlarinda dolgu maddesi, yapi gelistirici olarak (EPO267043) ya da
deteij anlara katilan enzim granüllerinin kaplanmasi asamasinda kaplama katmamnin
Birlesik Devletler patent dokümaninda yem katkisi olarak gelistirilen fitaz enzim
granülleri kalsit inorganik tasiyici olarak kullanilmakta, baglayicilar (suda
çözünebilen polimerler), stabilize edici tuzlar ve enzim solüsyonu konsantresi ile
birlikte hamur olusturmak için mikserde karistirilmakta ve elde edilen hamur düsük
basinçta ekstrüzyona tabi tutulmaktadir. Ekstrüderden geçirilen hamur parçalara
ayrildiktan sonra, akiskan yatak kurutucuda kurutulmaktadir. Kurutma sonrasinda,
granüller kaplama malzemesinin püskürtülmesi ile akiskan yatakta kaplanmaktadir.
Kaplanmis ksilanaz enzim granülü için ise söz konusu patent dokümaninda tasiyici
madde olarak kalsit kullanilmis ve islem basamaklari kisaltilarak granülasyon ve
kaplama islemi akiskan yatak kurutma cihazinda ardi ardina gerçeklestirilmistir.
Teknigin bilinen durumunda yer alan patent dokümanlarinda çesitli tuzlar
kullanilarak kurutma sirasinda enzimlerin stabilitesi arttirilmistir. Örnegin;
EP0758018 sayili Avrupa patent dokümaninda stabilizatör olarak kullanilan farkli
tuz dozlarinin kurutma, depolama ve peletleme sonrasinda enzim aktivitesi üzerine
etkisinden bahsedilmektedir. Hayvan yemlerinde kullanilan enzimlerin termo-
dokümanlarinda enzimlerin üretiminde kullamlan farkli kaplama malzemelerinden
(hidrofobik yaglar, PVA, PEG 6000, PE solüsyonlari, yag+antikeklestirici kaplama,
vb.) ve kaplama oranlarindan bahsedilmektedir. Söz konusu patent dokümanlarinda
kaplanmis enzimlerin peletleme sirasinda maruz kaldiklari sicaklik uygulamasi
sonrasinda aktivitelerindeki degisim birbirleriyle kiyaslanmaktadir.
Birlesik Devletler patent dokümanlarinda enzimlerin peletleme sonrasinda
biyoyararlanim düzeyleri hayvan agirligi (animal body weight, g) degerleri
ölçülerek degerlendirilmistir.
Bulusun Kisa Açiklamasi
Bu bulusun amaci yem katkisi olarak kullanilmak üzere ksilanaz enzimi üretimi ve
bu enzimden toz preparat ve kaplanmis ürün elde edilmesi yöntemi
gerçeklestirmektir.
Bu bulusun amaci yerel yeni bir izolat olan dogal Bacillus pumi'lus YMNX25
susunun hücre disina salgiladigi ksilanaz enziminin susunun saf kültüründen
ekonomik ortamda pilot ölçekte üretilmesini saglayan bir yöntem gerçeklestirmektir.
Bu bulusun baska bir amaci deposit edilen dogal sustan ksilanaz aktivitesine sahip
genin klonlanmasi ve ekspresyonunun gerçeklestirilmesini saglayan bir yöntem
gerçeklestirmektir.
Bulusun Ayrintili Açiklamasi
Bu bulusun amacina ulasmak için gerçeklestirilen “Bir Yöntem” ekli sekillerde
gösterilmis olup bu sekillerden;
Sekil 1. Ksilanazi kodlayan YMNxynA nükleotid dizisi ve kodladigi amino asitler
(Sinyal peptidinin alti çizilerek belirtilmistir).
Sekil 2. YMNxynA amino asit dizisinin diger Bacillus pumi'lus ksilanaz amino asit
dizileri ile homolojisi.
Sekil 3a. Baci'llus pumi'lus YMNx25”ten üretilen ksilanaz enziminin optimal pH
profili
Sekil 3b. Baci'llus pumilus YMNx25,ten üretilen ksilanaz enziminin optimum
sicaklik profili
Sekil 4. Bacillus pumilus YMNx25,den saflastirilan ksilanaz enziminin %12 SDS-
PAGE elektroforez analizi ve kolon sonrasinda elde edilen ksilanazin SDS-PAGE
zimogrami
Sekil 5. pEX25 plasmidinde biotin etiketli ksilanaz gen bölgesi ve promoter bölgesi
Sekil 6. Klonlanan YMNxynA ksilanazimn üç boyutlu modeli.
Sekil 7. pEX25/HB
Western Blot ve (c) Zimogram Analizleri
Bu bulus; kanatli yemlerinde kullanima uygun ksilanazin, B pumi'lus YMNX25
soyunun hücre kültürü süpematindan elde edilmesini ve forrnülasyonu, ayrica
ksilanaz enzimine ait genetik yapilari ve geni tasiyan plazmitten ksilanazin biyotinli
anlatimi saglayan transformant Escheri'chi'a coli' HB101(pEX25) ile üretilmesi
yöntemi ile ilgilidir.
Bulus konusu Bacillus pumilus YMNx25 kültüründen ksilanaz enzim preparati
üretim yöntemi;
Baci'llus pumi'lus YMNx25 ”nin ön kültürünün hazirlanmasi,
üretim için besi ortaminin hazirlanmasi,
hazirlanan üretim ortaminin biyoreaktöre aktarilmasi,
üretim ortaminin biyoreaktör içerisinde sterilize edilmesi,
üretimin biyoreaktörde süspanse hücre karisiminin homojen tutulabilmesi için
karistirma isleminin uygulanmasi,
karistirilan süspanse hücre karisimimn havalandirilmasi ve
sicaklik artisinin disaridan soguk uygulanmasiyla kontrol edilmesi adimlarini
içermektedir.
Bulus konusu yöntemde kullamlan Baci'llus pumi'lus YMNX25 susu Türkiyeiden
fasulye topragindan izole edilen Bacillus izolatinin 5 g/l pepton, l g/l maya
24 saat inkübe edilerek ön kültürleri hazirlanmistir. %2.5 hacim/hacim inokülasyon
ile 37 °C üretim sicakliginda, 250 rpm°de 12 saat üretimin sonuçlarina bagli olarak
maksimum ksilanaz aktivitesi veren enzim üreticisi Bacillus pumilus izolatinin
ribosomal RNA gen dizisi çikarilarak, ksilanaz üretici sus tür düzeyinde
tanimlanmistir ve bu sus NCBI gen bankasinda Baci'llus pumi'lus YMNx25 soyu
olarak, JN660083.1 numarasi ile kayit ettirilmistir. lzolatin saf kültürü Budapeste
Ticaret Antlasmasi olan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH (DSMZ)“e deposit edilmistir (Deposit no: DSM 26298).
Ksilanazin hidrolitik aktivitesi substrat olarak Birchwood ksilan kullamlarak
Dinitrosalisilik Asit (DNS) Yöntemi ile [Bernfeld, P., Methods in Enzymology,
(1992).] belirlenmistir. Aktivite tayininde substrat olarak Birchwood ksilan
(Sigma-X0502) kullanilmistir (%1 ksilan hazirlamak için 1 g ksilan 60°C”deki
50mM pH 5.3 sodyum sitrat tamponda çözülerek isiticili manyetik karistirici
üzerinde kaynama noktasina kadar isitilmis, sogumaya birakilan substrat çözeltisi
gece boyunca sürekli olarak karistirilmaya birakilmis ve sonrasinda hacmi 100
mliye tamamlanarak alikotlar halinde -20°C”de saklanmistir). Ksilanaz aktivitesi
tayini Bailey ve ark. (1992) protokolü izlenerek ölçülmüstür. Bu amaçla 1.8 ml
Birchwood ksilan substrat solüsyonu 50°Ciye gelene kadar isitilmis, 200 ul örnek
eklenerek 5 dakika 50°C su banyosunda bekletilmistir. Sonrasinda 3 ml 3,5-
dinitrosalisilik asit (DNS) çözeltisi eklenerek örnekler 15 dakika kaynar su
banyosunda inkübe edilmis ve inkübasyon sonunda örnekler buz içerisinde
sogutulmustur. 540 nm dalga boyunda spektrometrik okuma yapilmistir. Bir ünite
ksilanaz aktivitesi; 50°C”de, pH 5.3,de dakikada 1 mikromol ksiloz üreten enzim
miktari olarak tanimlanmis ve hesaplanmistir.
U/m/dk cinsinden hesaplanmistir.
Enzim Aktivitesi (U/mI/dk) = ..........................
W Açiga çikan ksiloz miktari (OD540 / Standart grafikten elde edilen egim; mikromol
ksiloz), VE' Enzim hacmi, SF seyreltme faktörü, V' Reaksiyon çözeltisi hacmi, t:
Reaksiyon süresi
Üretim sonunda hücreler santrilîijlenerek pellet haline getirilmis, kültür üst sivisi
enzim saflastirmasi ve karakterizasyonu çalismalarinda kullanilmak üzere +4°C°de
saklanmistir. lOkDa'luk ultrafiltrasyon filtre kullanilarak konsantre edilmis örnek
DEAE-selüloz anyon degistirici kolona (25x2.5 cm çap) yüklenerek SOmM pH:5.3
Na-sitrat tampon ile 15 m1/ saat akis hizinda elüe edilmistir. 5”er ml halinde toplanan
fraksiyonlarin her birinde 280 nmide degerleri protein miktari ölçülmüstür. Ksilanaz
aktivitesi yukarida belirtildigi sekilde ölçülüp hesaplanmistir (Tablo 1).
Aktivite Protein Verim Saflastirma
(U/ml/dk) Aktivite (mg/m1) Protein Aktivite (%) Katsayisi
(46 ml)
(10 ml)
Baci'llus pumilus YMNX25 susundan saflastirilan ksilanaz enziminin molekül
agirligim belirlemek amaciyla yapilan %12 SDS-PAGE elektroforez çalismalarinda,
kolon sonrasinda elde edilen enzim çözeltisinin Coomassie boyama sonucu tek bant
oldugu gözlenmistir ve enzimin molekül agirliginin 22.62 kDa agirliginda oldugu
tespit edilmistir (Sekil 4).
Bacillus pumi'lus YMNX25,den üretilen ham ve saf ksilanaz enziminin optimum pH
degerinin belirlenmesi için 200 ul uygun oranlarda 50mM pH 2-10 araligindaki
farkli pHalardaki sodyum sitrat tamponla seyreltilmis enzim çözeltisi, yine ayni
araliktaki pH tamponlarda çözünmüs substrat çözeltisinin 1.8 mlsi ile karistirilmis
ve ksilanaz aktivite tayini yapilmistir. pH°in Bacillus pumi'lus YMNX25”ten
saflastirilan ksilanaz enzimi aktivitesi üzerine etkisini belirlemek için pH 2,den pH
°a kadar genis bir aralikta aktivite tayini yapilmis ve optimum pH araligi ham ve
saf enzimde 6-9 olarak belirlenmistir (Sekil 3a).
Bacillus pumi'lus YMNx25°den üretilen ham ve saf ksilanaz enziminin optimum
sicaklik degerinin belirlenmesi için 200 ul uygun oranlarda 50 mM pH 5.3 Na-sitrat
tamponla seyreltilmis enzim çözeltisi, substrat çözeltisinin 1.8 m1”i ile karistirilmis
ve 30-80°C araliginda inkübe edilerek ksilanaz aktivite tayini yapilmistir. Baci'llus
pumi'lus YMNX25°ten saflastirilan ksilanaz enzimi aktivitesi üzerine sicakligin
etkisini belirlemek için 30°C,den 80°C°ye kadar genis bir aralikta aktivite tayini
yapilmis ve optimum sicaklik araligi ham ve saf enzimde 60°C olarak belirlenmistir
(Sekil 3b).
Bulus konusu ksilanaz enzimi yukarida da belirtilen teknigin bilinen durumunda yer
alan diger Baci'llus ksilanazlarindan farkli özelliklere sahiptir. Örnegin, USöl8038
sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda açiklanan bulusta Baci'llus pumi'lus”tan
elde edilen PRL B12 enziminin molekül agirligi 22,534 kDa, optimum sicakligi
olup, optimum sicakligi 60°C, pH 6-9idur.
Pilot ölçek üretim prosesi seri üretime uygun ve düsük maliyetli olmasi adina
Bacillus pumilus YMNX25 kullanilarak ham sivi enzim preparati üretimi için;
yüksek aktivite ile ksilanaz enzimi salgilayan Baci'llus pumi'lus YMNX25 inokülant
olarak kullanilmistir. Fermentasyonlarda Bacillus pumilus kültüründen
havalandirmali kosullarda ksilanaz üretimi için 1-2.5 g/L Bugday kepegi, 5-9g/L
kullamlmistir (pH 6.8-8.8). Hazirlanan üretim ortami biyoreaktöre aktarilip, üretim
ortanii biyoreaktör içinde basmçli buhar kullanilarak 121°C sicaklikta sterilize
edilmistir. Üretim, steril sartlarda karistirmali biyoreaktörde 26-37OC sicaklikta
havalandirmali ve kesikli üretim modelinde gerçeklestirilmistir. Islem süresince
herhangi bir sapmanin aninda tespit edilebilmesi için üretim parametrelerinden
sicaklik, pH ve karistirma hizi (rpm) izlenmistir. Sicaklik ve pH degisimleri ilgili prob
baglantilari ile takip edilerek gerekli ekipmanlar ile sabit tutulmustur. Üretim prosesi
sona erdiginde üretim sonrasi islemlerin ilk basamaginda ekonomik üretim ortami
.000 g hizinda kati-sivi separatöre aktarilmis ve kati (Bacillus pumi'lus ve üretim
ortaminin ayrilan bilesenleri) ve sivi (ham ksilanaz) içerigin birbirinden aynlmasi ile
üretim sonrasi islemler uygulanmistir.
Kati sivi ayirim sonrasinda ham ksilanaza ultrafiltrasyon (UF) islemi uygulanmistir.
UF isleminde kullamlan membran 10.000 Da7dur. Islem tamamlandiktan sonra
kurutma islemi için ön hazirlik basamagma geçilmistir ve sivinin kuru madde degeri
yükseltilmistir.
Kuru madde degeri yükseltilmis ksilanaz enzim preparati püskürtmeli kurutucuda
kurutulmustur. Püskürtmeli kurutucu ayni yönlü çalisan dagiticilidir. Kurutucu hava
araligindadir.
Bulus konusu yöntemde ksilanazin kurutma ve kapli granül elde edilme isleminde
teknigin bilinen durumunda yer alan patent dokümanlarinda açiklanan buluslardan
farkli olacak sekilde;
(a) Tasiyici madde olarak kullanilan inorganik malzeme kalsit üzerine stabilizatör
tuz ilave edilen enzim solüsyonu direkt olarak püskürtülerek islem basamaklari
kisaltilmistir,
(b) Enzimin sicaklik hassasiyetinden dolayi kurutma islemini daha düsük sicaklikta
yapabilmek için nem tutucu sistem ile kurutma havasinin bagil nemi %10,dan daha
az olacak sekilde düsürülmüstür.
Kaplanmis ksilanaz granüllerin hazirlanisi islem detaylari asagida verilmistir.
°C,de % ile
karistirildiktan sonra akiskan yatak kurutucuda (GLATT, Procell) 400-500g kalsit
(d90=370 um) üzerine püskürtülerek kurutulmustur. Kurutma sicakligi Tgirls =60-
80°C, Tumn =47-50°C araligindadir. Kurutma islemi bagil nemi %10°un altina
düsürülmüs kuru hava ile yapildigindan, aktivite kaybini minimize etmek amaciyla
isiya karsi daha duyarli enzimler için kurutma ve kaplama islemleri, oda
sicakligindaki hava ile de gerçeklestirilebilir. Kurutma islemi sonrasi, kati enzim
granülleri agirlikça %5 kaplama olacak sekilde, prejelatinize modifiye patates
nisastasi (PJN) ile akiskan yatak kurutucuda kaplanmistir. Kaplama sirasinda Turan
Söz konusu kaplama uygulamasinda elde edilen ksilanaz enzimi, kalsit yerine
tasiyici olarak maltodextrin (MD, Ganadex M20) kullanilarak granül formuna
getirilmis ve üzeri PVA ile agirlikça %5 kaplama olacak sekilde akiskan yatak
kumtucuda kaplanmistir. Kaplanmis granüllerin aktivitesi 226 U/g°dir.
Denemelerde tasiyici olarak kullanilan kalsit (White Dolomite-Calcite, Product
No:111) Altinaylar Yapi Mikronize San. Tic. Ve Ltd. Sti.”den, prejelatinize
modifiye nisasta (Emjel EP 820C, E 1414) Emsland Group, Almanya°dan temin
edilmistir.
Farkli malzemelerle kurutulmus ve kaplanmis ürünlerin ksilanaz enzim solüsyonu
aktivitesine kiyasla verim degerleri Tablo 2'de verilmistir.
Yöntem Kaplanmis ksilanaz Kaplanmis Kaplama sonrasi kalan
enzim granülleri granüllerin enzim aktiviteleri (verim,
aktivitesi (U / g) %)
Kaplama : PJN
Tasiyici : MD
2 Kaplama : PVA 226 46
Kaplama isleminden sonra minimum aktivite kaybi olan kaplanmis ürünlerde
(Yöntem l) yapilan parçacik boyut analiz sonuçlari Tablo 3”te verilmistir.
Yöntem Parçacik Boyutu (um)
(10,9 (10,1 d0,9/0,i
Peletlenmis ürünlerde homojen dagilim saglamak amaci ile kaplanmis granüller
0.425mm°lik elekten elendikten sonra pelet yapiminda kullanilmistir.
Kaplanmis granüller hayvan denemelerinde kullanilmak üzere tavuk yemlerine
katilmis ve yemler pastörize (85-87°C7de 3-4dk) edildikten sonra peletleme islemine
(70-76°C,de 2-3dk) tabi tutulmustur.
Akiskan yatak kurutucuda Tablo 23de verilen iki farkli yöntemle kaplanmis ksilanaz
enzim granüllerinin yumurta tavuklarinin ince bagirsak viskozite degerleri
üzerindeki etkileri arastirilmistir. Deneme 60 gün sürdürülmüs olup, her grup için
adet tavuk olmak üzere toplam 80 adet tavuk kullanilmistir. Kaplama isleminin
pastörizasyon ve peletleme sirasinda uygulanan isil islemlere karsi, bulus konusu
granül ksilanaz aktivitesini korudugu gözlenmistir. Bulus konusu ksilanaz (PVA:
tavuklarin ince bagirsak viskozite degerlerinin kiyaslanabilir düzeyde oldugu,
istatistiksel açidan gruplar arasinda önemli fark olmadigi görülmektedir.
Bugday esasli yemlere bulus konusu ksilanaz enzimi ilavesi, ilk 14 günlük yas
döneminde canli agirlik kazancim ve yemden yararlanma oranini önemli düzeyde
iyilestirmistir (Tablo 4). Bu gelismeler yasamlarinin ilk dönemlerinde sindirim
sistemi endojen enzim üretim kapasitesi yetersiz olan etlik civcivlerde, yeme
eksojen enzim ilavesinin zorunlu ve yararli oldugunu gösterir niteliktedir. Prejel
nisasta ile kaplanmis ksilanaz enzim granülü, piyasada kullanilmakta olan ksilanaz
enzimi ile incelenen tüm performans kriterleri yönünden mukayese edilebilir
özelliktedir.
Canli agirligi (g)
Besleme tipi
1. gün 14.gün 21.gün 42.gün
Bugday + Piyasada kullanilmakta b b
olan ksilanaz
Bu'da + Bulu konusu ka lanmi
ksilanaz (Kalsit + PJN)
Ayrica, etlik piliçlerin 42 günlük yasta ince bagirsagindan alinan içerigin viskozitesi
(2.3lcP) ve pHisi (5.9) piyasada kullanilmakta olan ksilanazla alinan sonuçlarla
( benzerlik göstermektedir.
Kaplama islemi peletleme sicakliginin olumsuz etkisini azaltmis ve sindirim sistemi
kosullarinda aktivitenin korunmasi açisindan faydali olmustur. Bunun yani sira.
kaplanan ve granül hale getirilen enzimlerin yeme karistirma sirasinda tozuma
yapmadigindan kullaniminin daha kolay oldugu gözlemlenmistir. Ayrica, bulus
konusu olan ksilanaz diger yem enzimleri ile birlikte karisim olarak kullanildiginda
dahi birim yumurta üretimi daha az yem tüketilerek gerçeklestirilmistir.
Mevcut teknolojide var olan ve yemlere katilmis olan diger Bacillus ksilanazlari ile
karsilastirildiginda, bu bulustaki dogal ksilanaz, optimum pH araligi ve optimum
sicakligi ile farklidir. Yem katkisi olarak kullanildiginda peletleme sicakligina
dayanikli ve bagirsakta çözünmekte oldugundan formülasyonda iyi bir performans
göstermekte ve bagirsak pH,inda stabil kalmaktadir. Bu enzimin ayni zamanda
biyoyararliliga sahip oldugu görülmektedir. Bu bulustaki ksilanaz basta kanatli yemi
olmak üzere, hayvan yemi katkisi enzimi olarak kullanima uygun bir enzimdir
Bulusun alternatif bir uygulamasinda, klonlanan ksilanaz gen ekspresyonu IPTG ile
uyarilmasi sonunda konakçi E.coli' hücresinde ksilanaz, daha kolay ve kisa bir
fermentasyon süresi ile ve biyotinli ve serbest halde olarak üretilmekte ve hücre
pelletinden ham ksilanaz elde edilmektedir.
Bulusun alternatif bir uygulamasinda Rekombinant Escherichia coli HB l Ol(pEX25)
kültüründen ksilanaz enzim preparati üretim yöntemi;
dogal Bacillus pumi'lus YMNx25 bakterisinden YMNxynA geninin moleküler
olarak klonlanmasi,
izole edilen YMNxynA geninin piyasada mevcut bir plazmite aktarilmasi ile
olusturulan pTX25.l ara vektörüne aktarilarak önce replike olabilen ve baska bir
vektöre klonlanmasina uygun bir plazmit elde edilmesi,
elde edilen bu ara plazmitin Escheri'chi'a coliinin XL-l Blue susuna tasinmasi ve
çogaltilmasi,
pTX25.l ara plazmitindeki YMNxynA geninin piyasada mevcut olan biyotinli
rekombinant ksilanaz üretimini saglayan bir anlatim vektörüne tasinarak pEX25
ksilanaz enzim anlatim plazmitinin elde edilmesi,
elde edilen bu expresyon plazmitinin Escherichia coli' bakterisinin HBlOl susuna
tasinmasi ve yem katkisi olarak kullanilmaya uygun ksilanaz enziminin üretilmesi
adimlarini içermektedir.
Bulusun alternatif bir uygulamasi olan Rekombinant Escherichia coli'
HB101(pEX25) kültüründen ksilanaz enzim preparati üretim yönteminde ilk olarak
Bacillus pumilus YMNx25 bakterisinden ksilanaz geni klonlanmakta ve nükleotid
dizisi belirlenmektedir. Söz konusu yöntemde genomik DNA eldesi Luria Broth
(LB) besi yerinde büyütülen B. pumilus YMNX25 izolatinin (Genbank accession
number: `lN kullanilarak
Fenol: Kloroform: Izoamil alkol ekstraksiyonlari ve izopropanol çöktürmesi ile
gerçeklestirilmektedir. Elde edilen genomik DNA ksilanaz geninin in vitro
sentezlenebilmesi için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanilmaktadir. Ksilanaz
enziminin sentezinden sorumlu olan xynA geninin çogaltilmasi, TA klonlamasina ve
ekspresyon vektörüne tasinabilmesine olanak saglayacak yapida tasarlanan ve
genomdan xynA geninin çogaltilmasini saglayan asagida dizileri verilen dejenere F7
ve R4 isimli primer çifti ile PZR yöntemi kullanilarak gerçeklestirilmektedir.
Polimeraz zincir reaksiyonu kromozomal DNA7dan 130 mg ve her bir primerden 2.5
uM konsantrasyondan katilarak toplam 50 ul son hacimde gerçeklestirilmistir.
Reaksiyon kosullari olarak 95°Csde 3 dakika denatürasyon, 55°C`de 1 dakika
baglanma, 72°C°de 1 dakika uzama ile 35 döngü ve 72°C”de 30 dakika bir döngü ile
uzama seklinde gerçeklestirilmistir.
Daha sonra ksilanaz enziminin protein kodlayici gen bölgesine karsilik gelen,
yaklasik 700 hp uzunlugundaki genomik parça önce bir alt klonlama vektörü olan
pTZ57R/T (Fermentasýa klonlanmaktadir. Ligasyon ürünü, konakçi hücre olarak
Escherichi'a coli' XL-l Blue hücrelerine aktarilmistir. Aday transformantlardan
plazmit izolasyonu yapilarak insört varliginin anlasilmasi için NotI ile Bglll
restriksiyon endonükleaz kesimi yapilmistir. YMNxynA nükleotid dizisi klasik
dizilme yönteminin (Sanger et al.,l977) yeni bir versiyonu olan otomatik dizi analiz
sistemi ile GenomeLab DTCS Quick Start Kit (Beckman Coulter Ref. 608120)
kullanilarak gerçeklestirilmis, elde edilen diziler SCDC Biology WorkBench
arayüzü kullanilarak düzenlenmistir. pTZ57R/T ara vektörüne klonlanan Bacillus
pumi'lus YMNxynA genine ait rekombinant plazmit pTX25.1 olarak adlandirilmistir.
Dizi analizi sonucunda ksilanaz kodlayan xynA genotipi elde edilmistir (Sekil 1).
Dizilemede kullanilan asagidaki primerler vektöre ait olan primerlerdir.
Dizi# 3 (M13/pUCSequencingPrimer): 5, GTAAAACGACGGCCAGT 3”
Dizi# 4 (Ml3/pUCReverseSequencingPrimer): S” CAGGAAACAGCTATGAC 3,
Dizi #5 (PinPointVector SequencingPrimer): 5° CGTGACGCGGTGCAGGGCG 3”
Dizi #6 (SPösequencingPrimer): 5” TATTTAGGTGACACTATAG 3”
Otomatik dizileme sonucu elde edilen ve GenBank (Accession number: JQ625342)
kaydi yapilan nükleotid dizisi (Accession number: JQ625342) bu patent
dokümamnda YMNxynA olarak amlacaktir. Söz konusu patent dokümaninda bahsi
geçen ksilanaz amino asit dizisi, otomatik dizileme sonucu elde edilen nükleotid
dizisinden translasyon ile elde edilmektedir. Öncül (precursor) protein halinde
sentezlenen ksilanaz 228 amino asit içerir, bu amino asitlerin dagilimi Tablo 5”de
verilmistir.
Ksilanaz dizisindeki ilk 27 amino asitlik kisim sinyal peptidini olusturmaktadir.
Sinyal peptidinin ayrilmasi ile elde edilen 201 amino asitlik kisim ergin ksilanaz
olarak tanimlanmaktadir (Sekil 1).
Sembol Amino Asit Sayi % (Moleküler agirlikta)
N Asparaj in 17 7.5
Y Tirozin 16 7.0
T Threonin 21 9.2
S Serin l 7 7.5
1 Izolösin 12 5.3
W Triptofan 6 2.6
R Arjinin 12 5.3
Q Glutamin 7 3.1
D Aspartik asit 7 3.1
E Glutamik asit 9 3.9
F Fenilalanin 10 4.4
P Prolin 6 2.6
M Metiyonin 7 3.1
H Histidin 5 22
C Sistein 2 0.9
B Asparaj in ya da aspartik asit 0
Z Glutamin ya da glutamik asit O 0
Bulustaki B. pumilus YMNX25 bakterisinden klonlanan YMNxynA ksilanaz geninin
nükleotid ve aminoasit dizisi (Sekil 1) ile diger patent ve makalelerde veya
GenBankh bulunan B pumilus orjinli ksilanazlardan farki bulunmaktadir. Gen
dizisinin aminoasit dizisine çevrilmesi ile elde edilen bilgilere göre; enzim öncül
protein halinde sentezlenmekte ve toplamda 228 amino asit içermektedir, ilk 27
amino asit sinyal dizisini olusturmakta, translate olan 201 amino asit bulunmaktadir.
YMNxynA ksilanaz amino asit dizisinin çoklu dizi hizalamasi (multiple alignment)
yapildiginda amino asit dizilerine ulasilabilen dokuz farkli Bacillus pumilus endo-
beta ksilanazlari ile %87-99 arasinda homoloji gösterdigi görülmektedir (Sekil 2).
Amino asit dizilerinden enzimin üç boyutlu yapisi bu bulusta modellenmistir ve
henüz dizilerine ulasilan diger Baci'llus pumi'lus ksilanazlari için literatürde bir
model çalismasi rapor edilmis olmadigindan, ayni aileden Bacillus subti'lus'a ait
PDB kodlu IIGO modeli temel alinarak bu bulusta klonlanan genin kodladigi
ksilanaz için homoloji modellemesi (MQE kullanilarak) ile tersiyer yapi
olusturulmus ve bu elde edilen model Sekil 6°da gösterilmektedir.
Ksilanaz enzimi görevini bitki materyalindeki karmasik karbonhidratlarin hidrolizi
için yerine getirirken sahip oldugu kendine özgü amino asit dizilerinin translasyonu
ile ortaya çikan bu üç boyutlu yapi sayesinde yapmaktadir. Elde edilen YMNxynA
nükleotid, protein dizisi ve olusturulan üç boyutlu modeli, bu ksilanazin ileride
yönlendirilmis evrim ve/veya tesadüfi mutasyonlar ile gelistirilmesi için temel
olusturmaktadir.
Klonlanan ksilanazin moleküler agirligi yukarida belirtilen amino asit dizisi
kullanilarak hesaplanmistir. Hesaplamalara göre enzimin moleküler agirligi
prekürsör için 25.735 kDa, olgun enzim için ise 22.69 kDa°dur. Klonlanan
ksilanazin izoelektrik noktasi yine yukarida belirtilen amino asit dizisi kullanilarak
hesaplanmistir. Tahmini izoelekti'ik noktasi denature haldeki proteinin net yükünü
belirtmektedir. Buna göre ksilanazin denature haldeki tahmini izoelekrik noktasi
8.83,tür.
Söz konusu yöntemde dogal Bacillus pumilus YMNx25 bakterisinden YMNxynA
geninin moleküler olarak klonlanmasinin ardindan izole edilen YMNxynA geninin
piyasada mevcut bir plazmite aktarilmasi ile olusturulan pTX25.l ara vektörüne
aktarilarak önce replike olabilen ve baska bir vektöre klonlanmasina uygun bir
plazmit elde edilmektedir.
Bu bulusta ekspresyon vektörü olarak Promega (Madison, Wisconcin, USA)
tarafindan üretilen PinPointTM Xa3 vektörü kullanilmistir. Ksilanazin vektöre
sokulmasi için, PinPointTM Xa3 ekspresyon vektörü insertün uçlari ile uyumlu Bglll
ve NotI enzimleri ile kesilmistir. 687 hp olan insert, YMN ksilanaz geni sinyali ve
ergin dizisini kodlayan kismi ile birlikte çikarilmak üzere ilgili restriksiyon
bölgelerinden (BglII ve NotI) kesilerek alt klonlama vektörü pTX25.l”den
çikartilmistir. Pinpoint Xa3 vektörünün omurga bölümleri ekspres edilecek yapisal
dizi ile kombine edilmistir. Plazmit vektör Escheri'chia coli' için uygun olan
seçilebilir markör (isaretleyici) gen olarak amfisilin içermektedir. Biyotin ve sinyalli
füzyon proteini, ksilanaz enziminin fonksiyonelligini etkileyeceginden bulusun
rekombinant ekspresyon ürünlerinde optimal biyolojik aktivite vermesi için uygun
konakçi seçilmistir. Rekombinant yapi transformasyon ile bulusun polipeptidinin
ekspres edilecegi konakçi organizma olarak seçilen, proteazlari aktif Escherichia
coli' HBlOl (Genotip: F-, proA2 hsdSZO recAl ara-14 lacYl galK2 rpsL20 supE44
xyl-S mtl-l) susuna aktarilmistir. Trasformantlar ampisilinli LB besi ortaminda
inoküle edildikten sonra plazmit izolasyonunun ardindan insörtü veren BglIl-Notl
restriksiyon enzimi kesimleri ve DNA dizilemesi yapilarak incelenmistir. Ksilanaz
okuma çerçevesi pEX25 plazmitinde baslama ve sonlandirma kodonlari dahil
dogrulanmistir. Rekombinant olarak olusturulan Escherichia coli' HBlOl(pEX25)
transformanti DSMZ,e deposit edilmistir (Deposit no: DSM26299).
pEX25 plazmitinden elde edilen polipeptit ksilanaz aktivitesine sahip parçayi
içermektedir. Bu polipeptidin N-ucunda heterolog amino asit dizileri yer almaktadir.
Heterolog dizi hücre disi protein hedeflemeyi etkileyen lider dizi (sinyal peptidi) ve
vektörden gelen biyotin tagini içermektedir. Füzyon protein dizisi içinde proteolitik
bölünme bölgesi bulunmaktadir (Sekil 5).
Ksilanazin amino ucunda biyotin etiketi (13 kDa) ve ondan önce genin öncül sinyal
dizisi ( bulundugundan olusturulan plazmit tasiyan hücreler bu ekspresyon
konakçisinda ksilanazin ekspresyonunun uyarilmasi amaciyla IOOuM IPTG ile
indüklendiginde, 38.7 kDa biyotinli ksilanaz Escheri'chia coli°de heterolog sistemde
ekspres edilmektedir. Olusturulan rekombinant plazmit seçilen konakçida aktif`
ksilanaz üretmektedir.
Olusturulan rekombinant pEX25 plazmitinin Escheri'chia coli HBlOl ,de uyarilmasi
ile N terminalinde heterolog aminoasit dizilerini ihtiva eden ksilanazin anlatiminin
tespiti adina, indüklenme sonrasindaki üretim hücreler patlatilarak elde edilen
protein ekstraktlarinda SDS-PAGE ile gözlenmistir. Biyotinli proteinlerin varligi
Western Blot ile incelenmistir.
Biyotinli ksilanaz üretimi için, pEX25/HB101 rekombinant susu 2uM biyotin ve
100ug/ml ampisilin içeren LB besi ortamina ekilmis ve 37°C çalkalamali
inkübatörde 150 rpm hizla gece boyu çalkalanarak büyütülmüstür. 100 ml LB-
Ampisilin-biyotin içeren besiyerine bu ön kültürden asilama yapilmistir (1:50
hacim/hacim). Bir saatlik 37°C 150 rpm inkübasyon süresi sonunda son
konsantrasyonu IOOuM IPTG olacak sekilde uyarilmis ve 5 saat süre ile 37°C1de
40C°de) toplanan hücreler 50 mM Tris-HCl (pH:7.5), 50 mM NaCl ve %5 gliserol
çözülerek 5 dakika 95°C”de isitilmis ve araliklarla kisa vorteks yapilarak hücreler
parçalanmistir. Parçalanan hücreler santrifüj ile ayrilmis ve ksilanazin da oldugu
hücre içi ekstrati analiz için kullamlmistir.
Western Blot analizleri yari-kuru transblot sistemi kullanilarak yapilmistir (BioRad,
California, USA). Üst sividaki total proteinler SDS-PAGE elektroforezi ile
ayristirilmistir. Bu islemden sonra total proteinler PVDF (Sigma Aldrich, Cat.
P2938) membran üzerine transfer edilerek biyotin ile avidinli Streptavidin-Alkalin
Fosfatazlin birbirine baglanmasi saglanmistir. Western Blot analizlerinin sonuçlari
Sekil 7B'de gösterilmektedir. Escheri'chia coli' HB101(pEX25) hücrelerinde
biyotinle birlikte ekspres olan ksilanaz, 39 kDa bant olarak tespit edilmistir.
Ksilanaz aktiviteli peptidin varligi ise zimogram ile incelenmistir. Zimogram analizi
Ratanakhanokchai ve ark. (1999)”dan modifiye edilen metoda göre yapilmistir.
Protein örnekleri %1 ksilan içeren %15 ,lik SDS poliakrilamit jele yüklenmis, 120
voltta 2 saat yürütülerek elektroforez edilmistir. Elektroforez sonrasinda ksilanli jel
edilmistir. Jel, Triton-X 100 döküldükten sonra sitrat tamponuyla (pH 5.3) yikanmis
ve 50°C'de 2 saat bu reaksiyon tamponunda birakilmistir. SmM NaOH+%
Kongo kirmizisi (lM NaCl de çözünmüs) ile jel boyanmistir Sinyal peptidinden
konakçimn proteazlari ile ayrilmis olan yaklasik 23 kDa°lik proteinde aktivite
gözlenmistir (Sekil 7C).
Bulus konusu yöntemde daha sonra rekombinant ksilanazin fermentörde üretimi
gerçeklesmektedir. Escherichia coli HBlOl(pEX25) hücrelerinin 10 litrelik
fermentörde büyütülmesi için biyotin takviyeli ve antibiyotikli LB besi ortami
kullanilmistir. Fermentörde kullanilacak ön kültür için amfisilin içeren LB besi
yerine platelerden seçilen Escheri'chia coli HB101(pEX25) kolonilerinden ekim
yapilarak gece boyu inkübe edilmesi saglanmistir. Ertesi gün, gece boyu kültür ile
inkübasyona birakilrnistir. Besi yerlerine son konsantrasyonu 100 mg/ml olacak
sekilde amfisilin ve son konsantrasyonu 2 uM olacak sekilde biyotin eklenmistir.
Üçüncü gün ise hazirlanan kültürler fermentör inokulumu olarak kullanilmistir.
Ikinci gün gece boyu sterilizasyonu tamamlanmis olan fermentörden blank
alindiktan sonra antibiyotik, biyotin ve 400 ml inokulum eklenerek fermentasyon
0D 09-] araliginda oldugunda son konsantrasyonu 100 uM olacak sekilde IPTG
eklenerek indükleme yapilmistir. Plazmitin indüklenmesine bagli olarak hücre
içinde ksilanaz biyotin etiketi ile 5 saat sonunda hücre içinde yeterince
santriiîij edilmistir. Üst sivi atilarak, toplanan hücreler saf su ile yikanmis ve pelletin
kaybolmamasi için 12000 rpm”de 4OC°de 15 dakika santriüij edilerek toplanmistir.
Yikama sonrasinda yas pelletteki hücreler 50 mM Tris (pH 7.5) ve 50 mM NaCl
tamponda çözülüp sonike edilmistir. Sonikasyon için 100-150 ml arasi süspanse
hücreler 8-10 amperde, 15 açik 15 kapali 40 döngü ile parçalanmistir. Toplanan
örnekler 11000 rpmide 4°C°de 10 dakika santrifüj edilerek süpernatantta toplanan
hücre içi proteinler ham halinde elde edilmistir. Elde edilen sivi preparat, liyofilize
edilmis ve aktivitesi 25 U/mg olan liyofilize toz preparat elde edilmistir. Bu elde
edilen liyofilize prepattaki biotin miktari 10 ug biotin/ 100 gr preparat olarak
ölçülmüstür.
Bu bulusta; ksilanaz enziminin heterolog sistem olarak ekspresyon vektörünün
aktarildigi Escheri'chi'a coli'den, enzimin uyarilma ile kisa sürede ham olarak elde
edilmesi saglanmaktadir. Ksilanaz, sinyali ile beraber ekspresyon vektörüne
yerlestirildiginden (Ksilanaz geni sinyali ile beraber vektördeki biyotin tag dizisine
baglanmis oldugundan), plazmitin aktarildigi konakçi olarak özellikle proteaz aktif
bir Escherichi'a coli seçilmistir. HB101 soyundan ksilanaz bir saflastirma adimina
gerek olmadan ham hücre preparatindaki ksilanaz biyotinli parçadan hücre
proteazlari ile ayrilmaktadir. Enzim biyotinsiz aktif olarak serbest kalmaktadir.
Böylece saflastirmaya gerek olmadan yeterli miktarda aktif ksilanaz Escherichia
coli' HB 1 01(pEX25) fermantasyonu sonrasinda kisa sürede elde edilmektedir.
Escheri'chi'a coli°de proses olabilen biyotinli ksilanaz varyanti, konakçi susu HBlOl
Escherichia coli°ye ait proteazlar tarafindan bu polipeptidin önündeki sinyal dizisini
koparmakta ve biyotin etiketli kisim ayrilmakta, ksilanaz polipeptidi Escherichi'a
coliinin hücre preparatlarinda aktif sekilde bulunmaktadir.
Konakçinin proteazina ilaveten, istenildiginde disaridan eklenecek spesifik bir
proteaz uygulamasi ile üretilen ham ksilanazin miktari arttirilabilir ve dolayisi ile
elde edilen aktivite iki katina çikanlabilmektedir.
Bunun uygulamasi için Escherichia coli' HB101(pEX25)9de uyarilma ile elde edilen
etiketli (tagli) ksilanaz in vitro olarak factor Xa proteazi ile isleme tabi tutulmustur.
Bu in vitro denemede ham hücre preparatina ekstra spesifik proteaz ilavesi
durumunda g yas pellet için 54000 U aktivite elde edilmistir.
Teknigin bilinen durumunda yer alan uygulamalarda biyotin ile rekombinant
ksilanazin üretim yöntemi ve bu sekilde bir heterolog sistemden ham ksilanazin
rekombinant olarak elde edilmesi yöntemi ve bu ksilanaz ile birlikte biotin de içeren
hücre ekstratlarinin yem katkisi olarak kullanilmasi yer almamaktadir.
Bulus konusu yöntemle elde edilen ksilanaz içeren Escherichi'a coli' “de üretilmis
liyofilize rekombinat enzim preparati kanatli yemine eklenerek rekombinant
biyotinli ksilanaz preparati yumurtaci tavuklarda test edilmistir.
Escherichia coli HBlOl(pEX25)”den elde edilen YMNxynA geriin kodladigi
ksilanaz, ksilanazin yemden yararlanmada etkisinin belirlenmesi adina, ksilanaz
enziminin rekombinant formunun yumurta tavuklarindaki etkileri Tablo 6°da verilen
deneme planina göre yürütülmüstür.
Gruplar
(MK) Misir kontrol yemi (2750 kcal/kg normal ME)
(BNK) % 60 bugday negatif kontrol (2620 kcal/kg düsük ME) l
(RK) 360 U/kg rekombinant ksilanaz + düsük ME (2620 kcal/kg)
Rekombinant ksilanaz mikro karistiricida, razmol ve kalsitle 1800 devir/dakikada 3
dakika karistirilarak ön karisim haline getirilmis ve deneme karma yemleri
hazirlanirken ön karisim halinde yeme ilave edilmistir. Deneme karma yemleri 300
kg/saat kapasitede, kirici-karistirici yem makinesinde, toz formda hazirlanmistir.
Arastirmada, her tavuk bireysel kontrol edildiginden bir tekerrür sayilmis, her grupta
, toplam 30 adet tavuk kullanilmistir. Arastirma 60 gün devam ettirilmistir.
Deneme gruplarinda ölüm olmazken, deneme sonu canli agirlik ortalamalari
arasinda farklilik tespit edilmemistir (P>0.05). Misir kontrol grubu (MK), düsük
metabolik enerjili bugdaya dayali (BNK) ve rekombinant ksilanaz (RK) ilavesinin
yapildigi gruplarla karsilastirildiginda, performans parametreleri bakimindan önemli
farkliliklarin olmadigi belirlenmistir (P>0.05). Istatistiksel olarak önemli farklilik
çikmasa da sayisal olarak düsük enerjili bugday grubunun (BNK) misir kontrol
grubuna göre günlük 8 g daha fazla yem tükettigi görülmektedir. Yem tüketiminde
ise ksilanaz ilavesi ile azalma egilimi görülmektedir (Tablo 7).
105:'
Deneme Yemden
sonu Yumurta Yumurta Yumurta Yem yararlanma
Gruplar canli verimi, agirligi, kütlesi, tüketimi, orani, g
agirlik, g %/tavuk/gün g/yumurta g/tavuk/gün g/tavuk/gün yem/g
yumurta
Deneme muameleleri arasinda kirik-çatlak ve kirli yumurta orani, kabuk
mukavemeti ve kalinligi, sekil indeksi, ak yüksekligi, haugh birimi ortalamalari
bakimindan önemli farkliliklar tespit edilmemistir (P>0.05) (Tablo 8). MK
grubunun yumurta sarisi RYCF a ve b degerlerinin bugdaya dayali deneme
gruplarindan önemli düzeyde daha yüksek, L degerinin ise daha düsük oldugu tespit
renk maddeleri
pigmentasyonun daha fazla olmasi dogaldir. Bugdaya dayali yemlere ksilanaz
edilmistir. Misirm içerdigi dolayisiyla yumurta sarisi
ilavesi bu denemede renk özelliklerini önemli düzeyde degistirmemistir (Tablo 9).
Kirik- Kirli
Kabuk Kabuk Ak
çatlak yumurta Sekil Haugh
Gruplar mukavemeti, kalinligi, yüksekligi, ' _ _
yumurta orani, indeksi birimi
Newton mm mm 3
Gruplar RYCF L A B
Yeme Escheri'chi'a coli' HB101(pEX25)7de plazmit kontrolünde üretilmis
rekombinant ksilanaz ilavesi (RK) yemdeki ve ince bagirsaktaki ksilanaz aktivitesini
BNK grubuna göre sayisal olarak artinnistir. Misir kontrol (MK) grubundaki
tavuklarin ince bagirsak viskozite (dudenum+ileum) degerleri enzimli veya enzimsiz
bugday agirlikli yemlerle yemlenen tavuklarinkinden önemli düzeyde daha düsüktür
(P<0.01). Bugday agirlikli yemlere rekombinant ksilanaz enzim ilavesi ince
bagirsak viskozite degerini enzimsize göre önemli düzeyde düsürmüstür (P<0.01)
Ince bagirsak Ince bagirsak
viskozite, toplam
ksilanaz
Gruplar _ . (cP, 100 rpm ksilanaz
aktivite,
de) aktivitesi,
Bulus konusu bu alternatif klonlama ile biyotinli ksilanaz üretilmesi yönteminde
elde edilen plazmid bir bakteriye aktarildigi için konakçi olan Escherichia coli'
HB101(pEX25) soyu genetik olarak yeniden yapilandinlmistir. Escherichia coli'
bakterisinde üretilmis olan, ksilanaz ve biyotin peptidi içeren ham hücre
preparatinin test edildigi yumurta tavugu denemeleri sonuçlarina göre rekombinant
ksilanaz ürününün yumurta tavuklarinda enzim preparati ilavesi sonrasinda ince
bagirsak viskozitesinde olumlu düzelme, yem ve ince bagirsak enzim aktivitelerinde
sayisal artislar tespit edilmistir. Performans ve yumurta kalitesi özellikleri normal
düzeyde gözlenmistir.
Bulus, ksilanaz genin, bir endüstriyel izolat olan Bacillus pumilus YMNX25”in saf
kültüründen izolasyonunu, klonlanarak tanimlanmasini ve bu genin kodladigi ve
moleküler agirligi 23 kDa olan ksilanaz enzimin yeniden yapilandirilan bir
plazmidten anlatimi da saglar ve ksilanazin hayvan yem katkisi için yararli bir
bilesim seklinde üretilmesine iliskindir. DNA klonlama teknojisi ile yapilandirilan
sistemden ksilanaz ile biotinli peptid içeren ham preparat elde edilebilmekte, yem
katkisi olarak kullanimini da kapsamaktadir. YMNxynA olarak adlandirilan ksilanaz
geninin Baci'llus pumzlus YMNX25 susundan eldesi, moleküler klonlama yöntemi ile
bir vektöre aktarilmasi, rekombinant plazmitten uyarici ile daha kisa süreçte N-
terminal ucunda in vivo biotinlenen amino asit sekansina sahip olarak anlatimi ve
füzyon proteinin Escherichi'a coli 'den bir kombine yem preparati olarak elde
edilmesini tanimlar. Uyarilma sonrasinda enzim, biotinli peptit olarak Escheri'chi'a
coli' HBlOl (pEX25)°de 3-5 saatte elde edilmektedir. Ksilanaz ve biotinli peptid°ten
olusan kombine ürünün yem rasyonunda kullanilmasi bulus kapsammdadir. Enzime
ait gen dizisi ve elde edilen rekombinant plazmit ileride bu ksilanazin gelistirilmesi
amaçli kullanilmaya elverislidir.
Yem katkisi olarak kullanim adina ksilanazi prokaryotik hücrelerde ekspres eden
yeni bir plasmid hazirlanmis ve transformanti elde edilmistir. Böylece klonlanan
ksilanaz yukarida belirtildigi sekilde heterolog olarak prokaryatik konakçida da
üretilmistir. Elde edilen biotinli peptid ve ksilanaz, kombine yeni bir ürün olarak;
bugday temelli diyetlerde kullanima yararli, dengeli beslenme için ekolojik yem
karmalarina katilmaya uygun yem karmalarina katilacak bir preparat olup, devekusu
dahil kanatlilarin beslenmesine uygun ve özellikle stresli kosullarinda kullanim
adina hazirlanan rasyon için yararli olup ayrica at beslemede de istege bagli bir yem
katkisi olarak elverislidir. Basta monogastrik hayvan (etlik ve yumurtaci tavuk,
devekusu, bildircin, ördek, kaz ve balik yemleri dahil) yemlerine katilan bitkisel
kökenli yemlerdeki ksilanin 1,4 beta baginin parçalanmasi için ve yeme ilave biotin
de sagladigindan alternatif yem yapimina uygundur. Biotince zengin bir yem
verilmesi gerektiginde besleyiciye ekonomik bir yöntem saglar. Bugday ile yem
hazirlanmasi yem maliyetinde önemli bir tasarruf saglamakta, ayrica ksilanazh
preparat ile biotin de saglayan bir yem karmasi hazirlanmasina olanak tanidigindan
3...»
B. pmiliis M49u981.1
B. natilus XOUGGDJ
B. pmilus 15526092
B. pmilus 1383713!)
3. pmilus HIISSEIQSJ.
B. pmi'lus MSMTBJ
B. pmiliis ZP_03055362
B. pmiliis &11217111
mm 60625342
3. miliis AFZZOSZBJ
B. pmiliis AFHOSBIJ
E. mail::: XOOGGUJ
B. ptmilus AYSZGOSZ
B. pimilus &887130
8. piiiilus &21567794
B. pmilus ZP_03055362
B. pmilus 29421711J
13. pmilus WOSZBJ
B. pmilus M490981.1
B. puiilus XDOGGDJ
B. pinilus 113526092.
B. pmilus MUSSTTBJ
B. pmilus ZP_93055362
B. pumiiiis !34211114
W 312625342
B. pimilus AFIISDQBIJ
B. puding XDOGGDJ
B. pimilus 33526092
B. Willis AYBS7130
. mil::: MWTEJ
B. pulilus ZP_03055362
B. pmilus E0421717.1
B. pmilns ARZDSZGJ
B. pmiliis AFQSOSBIJ
B. pmi'ius xaossui
B. pmiliis A1526092
B. pmiilus &1887130
B. pmiius &4536195J
B. puiilus ZP_O3055362
B. pmilus 504217111
8. pmi'ins ::rizasini
WM-WMIGLILIITAW
MMIRHILTAWAMI
WeWMIGLIIEEVPAEARI
WWMIGMHEWMKI
MMIGMRIAVPAM
wv-WLMIGMILIAVMEI
MWWIWPSIIGIMWS
mmmmmnmmssimmmmsvms
MWWMPSIIGMWWSWS
WWWPSIIGMMWS
MMMYDIMFSIIGIATWWS
+ kolon ksilanaz
rude ksilanaz
07._________L
Sekil 3b
ngêuxnoîx 380.22& 022%
1 7 _ q _ _ _
00 5 A. 2
sicakhk(°C)
sicaklik (“C)
7.1 \ ;5;
Iiiia W W nisani& mum:::
27 &Da ...4.
TARIFNAME
YEM KATKISI OLARAK KULLANILMAK ÜZERE KSILANAZ ENZIMI
ÜRETIMI VE BU ENZIMDEN TOZ PREPARAT VE KAPLANMIS ÜRÜN
ELDE EDILMESI YÖNTEMI
Teknik Alan
Bu bulus yem katkisi olarak kullamlan ksilanaz enzimi ve yeni mikroorganizmalar
ve bunlardan elde edilen yeni bakteriyel ksilanaz preparatlari ve bunlarin
hazirlanmasi yöntemi ile ilgilidir.
Önceki Teknik
Sindirim kanalinda yem yapi taslarinin parçalanmasi, ara madde degisimindeki
vücut maddelerinin yapimi ve parçalanmasinda enzimlere mutlaka gereksinim
duyulmaktadir. Bu yüzden kanatli hayvanlarin verim yeteneklerinin enzimlerin
besleyici etkinligi yardimiyla düzeltilmesi saglanmaktadir. Enzimler beslemede
yem elzem yapi taslarini arttirmaktadirlar. Enzimler proteinli maddeler
olduklarindan sicaklik ve ortamin pH°ina karsi duyarlidirlar. Teknigin bilinen
durumunda farkli pH, sicaklikta islevsel ve stabil olan pek çok enzim
tanimlanmaktadir. Yemdeki besleyici özellikte olmayan yapilara (örnegin fitik asit)
karsi ve yapisinda olmayan polisakkaritlerin sindirimi için enzimlerden
yararlanilmaktadir. Kullanilacak enzimin seçimi yemin kompozisyonuna göre
yapilmaktadir. Pozitif enzimatik yikim ile; enerji kazanimi, proteinden yararlanma
ve amino asitlerin kullanimi iyilesmektedir. Bu amaçla mikroorganizma kaynakli
farkli özellikte enzimler üretilmekte ve üretilen bu enzimler yem katkisi olarak da
kullanilmaktadir.
Endo-l,4-beta ksilanaz aktivitesine sahip enzim; 1,4-beta ksilanin
ksilooligosakkaritlere dönüsümünde etkili olup, örnegin yemdeki temel pentozaii
bilesiklerinin sindiriminde rol oynamaktadir.
Ksilanaz katkili yem ile beslenmede, bagirsak vizkositesinde azalma, arabinoksilan
polimer zincirlerinin kirilmasi sonucu enerji yararlanilabilirliginde artis
saglanmaktadir. Ayrica polisakkarit hücre duvari bütünlügünün bozulmasi sonucu
kapsüle edilmis besin maddelerinin (çogunlukla protein, nisasta ve yag) açiga
çikarilmasinin da besin madde yararlanilabilirliginin artirilmasinda önemli rol aldigi
bildirilmektedir. Bugday esasli yemlere ksilanaz enzimi ilavesi ile bitkisel
hammaddelerdeki arabinoksilanin yararli hale geçirilmesi saglandigindan yemden
yararlanma degerini iyilestirmektedir. Ksilanaz ilavesi ile ince bagirsak viskozitesi
ve dolayisiyla diski yapiskanligi azalmakta, diskinin kuru maddesi yükselmektedir.
Sonuç olarak kirli yumurta sayisinda azalma ve altlik kalitesinde iyilesme
olmaktadir.
Ksilanaz enzimi; Bacillus türleri dahil, ki bunlar güvenli mikroorganizmalar olarak
kabul edilmislerdir, bazi bakteriler ve iunguslar tarafindan hücre disina salinan bir
enzimdir. Ksilanaz enzimi (EC 3.2.1.8) ticari olarak büyük çaplarda hali hazirda
üretilmekte ve söz konusu enzimin yaygin olarak yem, gida, kagitçilik,
biyodönüsüm prosesleri ve biyoenerji amaçli kullanimlari bulunmaktadir. Ksilanaz
yalniz ya da diger enzimler ile birlikte bitkisel ya da mikrobiyal hücre duvarinin
yikiminda (degredasyonunda) kullanilmaktir.
Ksilanaz enzimi mikroorganizma veya bitki kökenli olabilmekte, bu nedenle de çok
çesitlilik göstermektedir. Bakterilerden (ör. Baci'llus türleri) ya da diger
mikroorganizmalardan (ör. Aspergi'llus türleri, Trichoderma türleri, Humicola
türleri) kullanilarak fermentasyon ile üretilmis, enzim preparatlari bulunmaktadir.
Bunlar dogal kaynaklardan veya klonlanmis genlerinden üretilerek olmaktadir.
Ksilanaz enzimi üzerine basta Birlesik Devletler, Avrupa ülkeleri, Çin, Japonya,
daha az Hindistan ve Kore olmak üzere bazi patent korumalari mevcuttur. Bu
patentler incelendiginde; çogunlugunda ksilanaz ile yem formülü için patent
alindigi, birkaçinda enzimin genetik yapisindan hareketle sicakliga ya da
inhibitörlere karsi korumali sekilde ksilanazin gelistirildigi görülmektedir.
Patentlerde yem rasyonunda kullanilmaya elverisli ksilanazlar mevcut olmasina
ragmen bu ksilanazlar üretim yöntemleri ve enzim özellikleri açisindan bulus
konusu yöntenide bahsedilen ksilanazdan farklidir.
Mevcut teknikte enzim üretimi ile ilgili yer alan patent dokümanlarimn bazilarindan
asagida bahsedilmektedir.
US763 8613 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda genis asidik ve bazik pH
araliginda çalisabilen ve bir Bacillus susuna ait ksilanazini üreten yeni
organizmalardan bahsedilmis olup, ksilanazin ekspresyonunun saglandigi
ekspresyon ve integresyon vektörleri patent korumasi kapsamindadir. Bu ksilanazin
lignoselülozik kagit hamurunun biyoagartma islemlerine uygun oldugu
belirtilmektedir.
WO91/ 18978 sayili uluslararasi patent dokümaninda ksilanaz enzimi ve üretimi ile
ilgili olarak; ATCC 21783 numarasi ile kayitli Bacillus circulans kökenli ksilanaz
selülozik materyallerin agartilmasinda kullanimindan bahsedilmektedir.
NZZ36708 sayili Yeni Zelanda patent dokümaninda Bacillus stearothermophilus
ksilanazi koruma altina alinmis olup bu ksilanazin odun pulpundan ligninin
uzaklastirilmasi islemine tabi tutulmasi için uygun oldugu belirtilmektedir.
WO9203540 sayili uluslararasi patent dokümaninda Bacillus pumz'lus ksilanazi
koruma altina alinmis olup söz konusu ksilanazin lignoselulozik pulplarin
parçalanmasi islemine tabi tutulmasi için uygun oldugu belirtilmistir.
KR930010769 sayili Kore patent dokümaninda alkalofilik Baci'llusîan seçilip
Escherichi'a coli°ye transfer edilen rekombinant ksilanaz enzim üretimi yönteminden
bahsedilmektedir.
JP60075286 sayili Japon patent dokümaninda rekombinant plazmit araciligi ile
ksilanaz elde edilen diger bir örnek Baci'llus orjinli ksilanazin üretiminden
bahsedilmektedir. B. pumilus IPO susunun ksilanaz geni, B subnli's MIl 13 kökenli
pUB vektörüne aktarilarak ksilanaz üretici plazmit elde edilmektedir.
USS306633 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda Bacillus subtilz's DSM
7147 susundan elde edilen bakteriyel ksilanaz geni ve bu enzimin ekmek ve firin
mamülleri yapimi için uygun bir enzim olarak kullanilabileceginden
bahsedilmektedir.
USS457045 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda Bacillus pumilus DSM
6124 susundan elde edilen ksilanazdan bahsedilmekte olup söz konusu ksilanazin
kagit sektöründe lignoselulozik pulplarin parçalanmasi için uygun oldugu
belirtilmektedir.
WO92/1 75 73 sayili uluslararasi patent dokümaninda kagit, hamur ve hayvan yemine
uygun Humicola insolens DSM 1800 susundan elde edilen ksilanaz, rekombinant
DNA dizisi ve ksilanaz içeren formülden bahsedilmektedir. .
U85612055 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda yem katkisi olarak
ksilanazdan ve bununla hazirlanan yemin T richoderma kökenli oldugu ksilanazdan
bahsedilmektedir. Söz konusu patent dokümaninda açiklanan bulus tahil içerikli
yemde kullanilmasi gereken ksilanaz ve beta-glukanazin birlikte nasil uygulanmasi
gerektigini açiklamaktadir.
da üzerinde çalisabilen isiya karsi kararli ksilanaz ve bu ksilanazin Yeni
Zelandaadaki bir sicak su kaynagindan izole edilmis anaerobik bakteri orjinli
enzimiyle ilgilidir. Söz konusu enzimin çalisma pH7i 9.0 ve üzeri olarak
açiklanmaktadir. Dolayisiyla kagit, kagit hamuru (paper and pulp) ve agartma
(bleaching) yöntemlerine uygun ve G-tipi bir ksilanaz oldugu belirtilmektedir.
U85866408 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda T richoderma kökenli
ksilanazlar, sicaklik ve alkali özellik açisindan modifikasyon ile ilgili
gelistirilmelerden bahsedilmektedir. Söz konusu patent dokümaninda açiklanan
bulusta Bacillus ci'rculans ve Thermomonospora fusca ksilanazina ait kimerik
yapilarin hazirlanmasindan ve enzimin kagit agartmasinda kullanima uygun
oldugundan bahsedilmektedir.
U86140095 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda kagit ve kagit hamuru
üretim yöntemlerine uygun ksilanaz Kenya” daki bir gölden izole edilen ve alkalifilik
özellik gösteren Bacillus ,tan dogal ve rekombinant yolla üretilmektedir. Söz konusu
enzimlerin çalisma kosullari pH 9.0 ve 70°C°dir. Enzimi hücre kültürü
süpernatantina salan Baci'llus ailesinden DSM 8751 numarali mikroorganizma ve
enzimi, rekombinant olarak da üretebilen mikrobiyal konakçisi ve enzimin ifade
edildigi vektörler patent kapsamindadir.
US4624922 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda Baci'llus sp. Cl25iden
klonlanan ksilanaz geminin hücre disina sekresyonundan bahsedilmektedir. pCX311
plazmiti ve bunu tasiyan mikroorganizma ve bu mikroorganizmanin kültür metodu
da söz konusu Birlesik Devletler patent dokümaninda açiklanmaktadir.
EP1263941 sayili Avrupa patent dokümaninda mutant ksilanazlarin bitki materyal
proseslerinde kullanimindan bahsedilmektedir.
US7527957 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda bir ya da daha fazla amino
asit modifikasyonu ile Bacillus subti'li's ksilanazinin inhibitörlerine duyarliliginin
degisimi yönünden gelistirilmesinden bahsedilmektedir. Hayvan yeminde bugday
forrnülasyonuna katilan enzimin aktivitesinde inhibitörler problem teskil ettiginden,
ksilanazi inhibitörlerine karsi duyarsizlastirma söz konusu patent dokümaninda
belirtilen farkli amino asitler üzerinde yapilan yönlendirilmis mutasyon ile
saglanmaktadir.
Hayvan yemi, deterjan, gidalar gibi çesitli alanlarda kullanilabilecek sivi enzim
solüsyonlarini hamur haline getirerek ekstrüzyon ile kurutma, püskürtmeli kurutucu
veya akiskan yatakta kurutulmasi birçok patente konu olmustur. Püskürtmeli
kurutucu ile kurutulan ürünlerde ince toz yapisi nedeniyle tozuma problemi ile
karsilasilmistir. US7691438 sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda enzim
preparatlari akiskan yatakta granül haline getirilerek tozuma problemi giderilmistir.
Bunun için enzim granülleri 115-180°C hava giris sicakliginda kurutulmustur. Yine,
hayvan yemi için enzim granülü üretimi konusundaki EP1695633 sayili Avrupa
patent dokümaninda farkli uygulamalarin aktivite üzerine etkisi belirlenmis ve
aktivite degerleri piyasada mevcut ürünler ile karsilastirilmistir. Enzim içeren kor,
akiskan yatak kullanilarak 30-120°C araliginda kaplanmistir. Söz konusu patent
dokümaninda açiklanan bulus konusu enzim granüllerinin kurutulmasi sirasinda ise
giris hava bagil nemi sogutucu sistemli çalisan bir kondansatör ile %lÜ°un altina
düsürülerek kurutma islemi termostabil bir enzimle çalisildigindan 40-60“C3de
gerçeklestirilmistir. Isiya karsi duyarli enzimler için minimum aktivite kaybi ile
granül ürün elde edilmesi için bagil nemi azaltilmis hava alternatif yöntemde oda
sicakligindaki kuru hava ile de kurutma ve kaplama isleminin yapilmasi mümkün
olabilmektedir.
enzim granülasyonu için tasiyici malzeme olarak su tutma kapasitesi yüksek zeolit,
silikatlar, bentonit, diatome toprak gibi malzemelerin kullanimindan
bahsedilmektedir. Kalsit (kalsiyum karbonat) çogunlukla deterjan
kompozisyonlarinda dolgu maddesi, yapi gelistirici olarak (EPO267043) ya da
deterjanlara katilan enzim granüllerinin kaplanmasi asamasinda kaplama katmaninin
Birlesik Devletler patent dokümaninda yem katkisi olarak gelistirilen fitaz enzim
granülleri kalsit inorganik tasiyici olarak kullanilmakta, baglayicilar (suda
çözünebilen polimerler), stabilize edici tuzlar ve enzim solüsyonu konsantresi ile
birlikte hamur olusturmak için mikserde karistirilmakta ve elde edilen hamur düsük
basinçta ekstrüzyona tabi tutulmaktadir. Ekstrüderden geçirilen hamur parçalara
ayrildiktan sonra, akiskan yatak kurutucuda kurutulmaktadir. Kurutma sonrasinda,
granüller kaplama malzemesinin püskürtülmesi ile akiskan yatakta kaplanmaktadir.
Kaplanmis ksilanaz enzim granülü için ise söz konusu patent dokümaninda tasiyici
madde olarak kalsit kullanilmis ve islem basamaklari kisaltilarak graiiülasyon ve
kaplama islemi akiskan yatak kurutma cihazinda ardi ardina gerçeklestirilmistir.
Teknigin bilinen durumunda yer alan patent dokümanlarinda çesitli tuzlar
kullanilarak kurutma sirasinda enzimlerin stabilitesi arttirilmistir. Örnegin;
EP0758018 sayili Avrupa patent dokümaninda stabilizatör olarak kullanilan farkli
tuz dozlarinin kurutma, depolama ve peletleme sonrasinda enzim aktivitesi üzerine
etkisinden bahsedilmektedir. Hayvan yemlerinde kullanilan enzimlerin termo-
dokümanlarinda enzimlerin üretiminde kullamlan farkli kaplama malzemelerinden
(hidrofobik yaglar, PVA, PEG 6000, PE solüsyonlari, yag+antikeklestirici kaplama,
vb.) ve kaplama oranlarindan bahsedilmektedir. Söz konusu patent dokümanlarinda
kaplanmis enzimlerin peletleme sirasinda maruz kaldiklari sicaklik uygulamasi
sonrasinda aktivitelerindeki degisim birbirleriyle kiyaslanmaktadir.
Birlesik Devletler patent dokümanlarinda enzimlerin peletleme sonrasinda
biyoyararlanim düzeyleri hayvan agirligi (animal body weight, g) degerleri
ölçülerek degerlendirilmistir.
Bulusun Kisa Açiklamasi
Bu bulusun amaci yem katkisi olarak kullanilmak üzere ksilanaz enzimi üretimi ve
bu enzimden toz preparat ve kaplanmis ürün elde edilmesi yöntemi
gerçeklestirmektir.
Bu bulusun amaci yerel yeni bir izolat olan dogal Bacillus pumi'lus YMNx25
susunun hücre disina salgiladigi ksilanaz enziminin susunun saf kültüründen
ekonomik ortamda pilot ölçekte üretilmesini saglayan bir yöntem gerçeklestirmektir.
Bu bulusun baska bir amaci deposit edilen dogal sustan ksilanaz aktivitesine sahip
genin klonlanmasi ve ekspresyonunun gerçeklestirilmesini saglayan bir yöntem
gerçeklestirmektir.
Bulusun Ayrintili Açiklamasi
Bu bulusun amacina ulasmak için gerçeklestirilen “Bir Yöntem” ekli sekillerde
gösterilmis olup bu sekillerden;
Sekil 1. Ksilanazi kodlayan YMNxynA nükleotid dizisi ve kodladigi amino asitler
(Sinyal peptidinin alti çizilerek belirtilmistir).
Sekil 2. YMNxynA amino asit dizisinin diger Bacillus pumilus ksilanaz amino asit
dizileri ile honiolojisi.
Sekil 3a. Bacillus pumi'lus YMNx25”ten üretilen ksilanaz enziininin optimal pH
profili
Sekil 3b. Baci'llus pumi'lus YMNX259ten üretilen ksilanaz enziminin optimum
sicaklik profili
Sekil 4. Bacillus pumi'lus YMNx25°den saflastirilan ksilanaz enziminin %12 SBS-
PAGE elektroforez analizi ve kolon sonrasinda elde edilen ksilanazin SDS-PAGE
zimogrami
Sekil 5. pEX25 plasmidinde biotin etiketli ksilanaz gen bölgesi ve promoter böigesi
Sekil 6. Klonlanan YMNxynA ksilanazinin üç boyutlu modeli.
Sekil 7. pEX25/HB
Western Blot ve (c) Zimogram Analizleri
Bu bulus; kanatli yemlerinde kullanima uygun ksilanazin, B. pumilus YMNx25
soyunun hücre kültürü süpernatindan elde edilmesini ve formülasyonu, ayrica
ksilanaz enzimine ait genetik yapilari ve geni tasiyan plazmitten ksilanazin biyotinli
anlatimi saglayan transformant Escheri'chia coli' HB101(pEX25) ile üretilmesi
yöntemi ile ilgilidir.
Bulus konusu Bacz'llus pumi'lus YMNx25 kültüründen ksilanaz enzim preparati
üretim yöntemi;
Bacillus pumilus YMNx25 ”nin ön kültürünün hazirlanmasi,
üretim için besi ortaminin hazirlanmasi,
hazirlanan üretim ortaminin biyoreaktöre aktarilmasi,
üretim ortaminin biyoreaktör içerisinde sterilize edilmesi,
üretimin biyoreaktörde süspanse hücre karisiminin homojen tutulabilmesi için
karistirma isleminin uygulanmasi,
karistirilan süspanse hücre karisiminin havalandirilmasi ve
sicaklik artisinin disaridan soguk uygulanmasiyla kontrol edilmesi adimlarini
içermektedir.
Bulus konusu yöntemde kullanilan Bacillus pumi'lus YMNx25 susu Türkiyeiden
fasulye topragindan izole edilen Bacillus izolatinin 5 g/l pepton, 1 g/l maya
KZHPO4 içeren üretim ortaminda pH 7.0,da, 37 °C üretim sicakliginda, 160 rpm”de
24 saat inkübe edilerek Ön kültürleri hazirlanmistir. %25 hacim/hacim inokülasyon
ile 37 °C üretim sicakliginda, 250 rpm7de 12 saat üretimin sonuçlarina bagli olarak
maksimum ksilanaz aktivitesi veren enzim üreticisi Bacillus pumi'lus izolatinin
ribosomal RNA gen dizisi çikarilarak, ksilanaz üretici sus tür düzeyinde
tanimlanmistir ve bu sus NCBI gen bankasinda Bacillus pumi'lus YMNx25 soyu
olarak, JN660083.1 numarasi ile kayit ettirilmistir. Izolatin saf kültürü Budapeste
Ticaret Antlasmasi olan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH (DSMZ)“e deposit edilmistir (Deposit no: DSM 26298).
Ksilanazin hidrolitik aktivitesi substrat olarak Birchwood ksilan kullanilarak
Dinitrosalisilik Asit (DNS) Yöntemi ile [Bernfeld, P., Methods in Enzymology,
(1992).] belirlenmistir. Aktivite tayininde substrat olarak Birchwood ksilan
(Sigma-XOSOZ) kullanilmistir (%1 ksilan hazirlamak için 1 g ksilan 60°C7deki
50mM pH 5.3 sodyum sitrat tamponda çözülerek isiticili manyetik karistirici
üzerinde kaynama noktasina kadar isitilmis, sogumaya birakilan substrat çözeltisi
gece boyunca sürekli olarak karistirilmaya birakilmis ve sonrasinda hacmi 100
mliye tamamlanarak alikotlar halinde -200Cide saklanmistir). Ksilanaz aktivitesi
tayini Bailey ve ark. (1992) protokolü izlenerek ölçülmüstür. Bu amaçla 1.8 ml
Birchwood ksilan substrat solüsyonu 50°C'ye gelene kadar isitilmis, 200 ul örnek
eklenerek 5 dakika 50°C su banyosunda bekletilmistir. Sonrasinda 3 ml 3,5-
dinitrosalisilik asit (DNS) çözeltisi eklenerek örnekler 15 dakika kaynar su
banyosunda inkübe edilmis ve inkübasyon sonunda örnekler buz içerisinde
sogutulmustur. 540 nm dalga boyunda spektrometrik okuma yapilmistir. Bir ünite
ksilanaz aktivitesi; 50°Cide, pH 5.3”de dakikada 1 mikromol ksiloz üreten enzim
miktari olarak tanimlanmis ve hesaplanmistir.
Indirgenen sekerler ksiloz ile hazirlanan standart egriden asagidaki formül ile
U/m/dk cinsinden hesaplanmistir.
W Açiga çikan ksiloz miktari (OD540 / Standart grafikten elde edilen egim; mikromol
ksiloz), VE: Enzim hacmi, SF seyreltme faktörü, V Reaksiyon çözeltisi hacmi, t:
Reaksiyon süresi
Üretim sonunda hücreler santn'füjlenerek pellet haline getirilmis, kültür üst sivisi
enzim saflastirmasi ve karakterizasyonu çalismalarinda kullanilmak üzere +4°Cide
saklanmistir. lOkDa”luk ultrafiltrasyon filtre kullanilarak konsantre edilmis örnek
DEAE-selüloz anyon degistirici kolona (25x2.5 cm çap) yüklenerek 50mM pH:5 .3
Na-sitrat tampon ile 15 ml/saat akis hizinda elüe edilmistir. 5`er ml halinde toplanan
fraksiyonlarin her birinde 280 nmide degerleri protein miktari ölçülmüstür. Ksilanaz
aktivitesi yukarida belirtildigi sekilde ölçülüp hesaplanmistir (Tablo 1).
Toplam Toplam Spesifik
Aktivite Protein Verim Sallastirma
(U/ml/dk) Aktivite (mg/ml) Protein Aktivite (%) Katsayisi
(46 ml)
(10 ml)
Baci'llus pumi'lus YMNX25 susundan satlastirilan ksilanaz enziminin molekül
agirligini belirlemek amaciyla yapilan %12 SDS-PAGE elektroforez çalismalarinda,
kolon sonrasinda elde edilen enzim çözeltisinin Coomassie boyama sonucu tek bant
oldugu gözlenmistir ve enzimin molekül agirliginin 22.62 kDa agirliginda oldugu
tespit edilmistir (Sekil 4).
Baci'llus pumi'lus YMNx253den üretilen ham ve saf ksilanaz enziminin optimum pH
degerinin belirlenmesi için 200 1.1.1 uygun oranlarda SOmM pH 2-10 araligindaki
farkli pHilardaki sodyum sitrat tamponla seyreltilmis enzim çözeltisi, yine ayni
araliktaki pH tamponlarda çözünmüs substrat çözeltisinin 1.8 ml”i ile karistirilmis
ve ksilanaz aktivite tayini yapilmistir. pHiin Bacillus pumilus YMNX25>ten
saflastirilan ksilanaz enzimi aktivitesi üzerine etkisini belirlemek için pH Z'den pH
*a kadar genis bir aralikta aktivite tayini yapilmis ve optimum pH araligi ham ve
saf enzimde 6-9 olarak belirlenmistir (Sekil 3a).
Baci'llus pumi'lus YMNx25”den üretilen ham ve saf ksilanaz enziminin optimum
sicaklik degerinin belirlenmesi için 200 nl uygun oranlarda 50 mM pH 5.3 Na-sitrat
tamponla seyreltilmis enzim çözeltisi, substrat çözeltisinin 1.8 ml”i ile karistirilmis
ve 30-80°C araliginda inkübe edilerek ksilanaz aktivite tayini yapilmistir. Bacz'llus
pumi'lus YMNX257ten saflastirilan ksilanaz enzimi aktivitesi üzerine sicakligin
etkisini belirlemek için 30°C°den 80°Ciye kadar genis bir aralikta aktivite tayini
yapilmis ve optimum sicaklik araligi ham ve saf enzimde 60°C olarak belirlenmistir
(Sekil 3b).
Bulus konusu ksilanaz enzimi yukarida da belirtilen teknigin bilinen durumunda yer
alan diger Bacillus ksilanazlarindan farkli özelliklere sahiptir. Örnegin, US618038
sayili Birlesik Devletler patent dokümaninda açiklanan bulusta Baci'llus pumi'lusstan
elde edilen PRL Bl2 enziminin molekül agirligi 22,534 kDa, optimum sicakligi
olup, optimum sicakligi 60°C, pH 6-99dur.
Pilot ölçek üretim prosesi seri üretime uygun ve düsük maliyetli olmasi adina
Bacillus pumi'lus YMNx25 kullanilarak ham sivi enzim preparati üretimi için;
yüksek aktivite ile ksilanaz enzimi salgilayan Bacillus pumilus YMNx25 inokülant
olarak kullanilmistir. Ferrnentasyonlarda Baci'llus pumi'lus kültüründen
havalandirmali kosullarda ksilanaz üretimi için 1-2.5 g/L Bugday kepegi, 5-9g/L
kullanilmistir (pH 6.8-8.8). Hazirlanan üretim ortami biyoreaktöre akrarilip, üretim
ortami biyoreaktör içinde basinçli buhar kullanilarak 121°C sicaklikta sterilize
edilmistir. Üretim, steril sartlarda karistirmali biyoreaktörde 26-370C sicaklikta
havalandirmali ve kesikli üretim modelinde gerçeklestirilmistir. Islem süresince
herhangi bir sapmanin aninda tespit edilebilmesi için üretim parametrelerinden
sicaklik, pH ve karistirma hizi (rpm) izlenmistir. Sicaklik ve pH degisimleri ilgili prob
baglantilari ile takip edilerek gerekli ekipmanlar ile sabit tutulmustur. Üretim prosesi
sona erdiginde üretim sonrasi islemlerin ilk basamaginda ekonomik üretim ortami
.000 g hizinda kati-sivi separatöre aktarilmis ve kati (Baci'llus pumilus ve üretim
ortaminin ayrilan bilesenleri) ve sivi (ham ksilanaz) içerigin birbirinden ayrilmasi ile
üretim sonrasi islemler uygulanmistir.
Kati sivi ayirim sonrasinda ham ksilanaza ultrafiltrasyon (UF) islemi uygulanmistir.
UF isleminde kullanilan membran 10.000 Da”dur. Islem tamamlandiktan sonra
kurutma islemi için ön hazirlik basamagina geçilmistir ve sivinin kuru madde degeri
yükseltilmistir.
Kuru madde degeri yükseltilmis ksilanaz enzim preparati püskürtmeli kurutucuda
kurutulmustur. Püskürtmeli kurutucu ayni yönlü çalisan dagiticilidir. Kurutucu hava
araligindadir.
Bulus konusu yöntemde ksilanazin kurutma ve kapli granül elde edilme isleminde
teknigin bilinen durumunda yer alan patent dokümanlarinda açiklanan buluslardan
farkli olacak sekilde;
(a) Tasiyici madde olarak kullanilan inorganik malzeme kalsit üzerine stabilizatör
tuz ilave edilen enzim solüsyonu direkt olarak püskürtülerek islem basamaklari
kisaltilmistir,
(b) Enzimin sicaklik hassasiyetinden dolayi kurutma islemini daha düsük sicaklikta
yapabilmek için nem tutucu sistem ile kurutma havasinin bagil nemi %lO,dan daha
az olacak sekilde düsürülmüstür.
Kaplanmis ksilanaz granüllerin hazirlanisi islem detaylari asagida verilmistir.
karistirildiktan sonra akiskan yatak kurutucuda (GLATT, Procell) 400-500g kalsit
(d90=370 um) üzerine püskürtülerek kurutulmustur. Kurutma sicakligi Tgins =60-
80°C, Tüm“ =47-50°C araligindadir. Kurutma islemi bagil nemi %107un altina
düsürülmüs kuru hava ile yapildigindan, aktivite kaybini minimize etmek amaciyla
isiya karsi daha duyarli enzimler için kurutma ve kaplama islemleri, oda
sicakligindaki hava ile de gerçeklestirilebilir. Kurutma islemi sonrasi, kati enzim
granülleri agirlikça %5 kaplama olacak sekilde, prejelatinize modifiye patates
nisastasi (PJN) ile akiskan yatak kurutucuda kaplanmistir. Kaplama sirasinda Turan
Söz konusu kaplama uygulamasinda elde edilen ksilanaz enzimi, kalsit yerine
tasiyici olarak maltodextrin (MD, Ganadex M20) kullanilarak granül formuna
getirilmis ve üzeri PVA ile agirlikça %5 kaplama olacak sekilde akiskan yatak
kurutucuda kaplanmistir. Kaplanmis granüllerin aktivitesi 226 U/ g7dir.
Denemelerde tasiyici olarak kullanilan kalsit (White Dolomite-Calcite, Product
No:111) Altinaylar Yapi Mikronize San. Tic. Ve Ltd. Sti.”den, prejelatinize
modifiye nisasta (Emjel EP 820C, E 1414) Emsland Group, Almanyadan temin
edilmistir.
Farkli malzemelerle kurutulmus ve kaplanmis ürünlerin ksilanaz enzim solüsyonu
aktivitesine kiyasla verim degerleri Tablo 27de verilmistir.
Yöntem Kaplanmis ksilanaz Kaplanmis Kaplama sonrasi kalan
enzim granülleri granüllerin enzim aktiviteleri (verim,
aktivitesi (U/g) %)
Kaplama : PJN
Tasiyici : MD
2 Kaplama : PVA 226 46
Kaplama isleminden sonra minimum aktivite kaybi olan kaplanmis ürünlerde
(Yöntem l) yapilan parçacik boyut analiz sonuçlari Tablo 3°te verilmistir.
Yöntem Parçacik Boyutu (um)
(10,9 (10,1 dog/0,1
Peletlenmis ürünlerde homojen dagilim saglamak amaci ile kaplanmis granüller
O.425mm°lik elekten elendikten sonra pelet yapiminda kullanilmistir.
katilmis ve yemler pastörize (85-87°C°de 3-4dk) edildikten sonra peletleme islemine
(70-76°C”de 2-3dk) tabi tutulmustur.
Akiskan yatak kurutucuda Tablo 2ide verilen iki farkli yöntemle kaplanmis ksilanaz
enzim granüllerinin yumurta tavuklarinin ince bagirsak viskozite degerleri
üzerindeki etkileri arastirilmistir. Deneme 60 gün sürdürülmüs olup, her grup için
adet tavuk olmak üzere toplam 80 adet tavuk kullanilmistir. Kaplama isleminin
pastörizasyon ve peletleme sirasinda uygulanan isil islemlere karsi, bulus konusu
granül ksilanaz aktivitesini korudugu gözlenmistir. Bulus konusu ksilanaz (PVA:
tavuklarin ince bagirsak viskozite degerlerinin kiyaslanabilir düzeyde oldugu,
istatistiksel açidan gruplar arasinda önemli fark olmadigi görülmektedir.
Bugday esasli yemlere bulus konusu ksilanaz enzimi ilavesi, ilk 14 günlük yas
döneminde canli agirlik kazancini ve yemden yararlanma oranini önemli düzeyde
iyilestirmistir (Tablo 4). Bu gelismeler yasamlarinin ilk dönemlerinde sindirim
sistemi endojen enzim üretim kapasitesi yetersiz olan etlik civcivlerde, yeme
eksojen enzim ilavesinin zorunlu ve yararli oldugunu gösterir niteliktedir. Prejel
nisasta ile kaplanmis ksilanaz enzim granülü, piyasada kullanilmakta olan ksilanaz
enzimi ile incelenen tüm performans kriterleri yönünden mukayese edilebilir
özelliktedir.
Canli agirligi (g)
Besleme tipi
1. gün l4.gün 2l.gün 42.gün
Bugday + Piyasada kullanilmakta b b
olan ksilanaz
Bu“da + Bulu konusu ka lanmi
ksilanaz (Kalsit + PJN)
Ayrica, etlik piliçlerin 42 günlük yasta ince bagirsagindan alinan içerigin Viskozitesi
(2.3 lcP) ve pH°si (5.9) piyasada kullanilmakta olan ksilanazla alinan sonuçlarla
( benzerlik göstermektedir.
Kaplama islemi peletleme sicakliginin olumsuz etkisini azaltmis ve sindirim sistemi
kosullarinda aktivitenin korunmasi açisindan faydali olmustur. Bunun yani sira,
kaplanan ve granül hale getirilen enzimlerin yeme karistirma sirasinda tozuma
yapmadigindan kullaniminin daha kolay oldugu gözlemlenmistir. Ayrica, bulus
konusu olan ksilanaz diger yem enzimleri ile birlikte karisim olarak kullanildiginda
dahi birim yumurta üretimi daha az yem tüketilerek gerçeklestirilmistir.
Mevcut teknolojide var olan ve yemlere katilmis olan diger BacilZus ksilanazlari ile
karsilastirildiginda, bu bulustaki dogal ksilanaz, optimum pH araligi ve optimum
sicakligi ile farklidir. Yem katkisi olarak kullanildiginda peletleme sicakligina
dayanikli ve bagirsakta çözünmekte oldugundan formülasyonda iyi bir performans
göstermekte ve bagirsak pH°inda stabil kalmaktadir. Bu enzimin ayni zamanda
biyoyararliliga sahip oldugu görülmektedir. Bu bulustaki ksilanaz basta kanatli yemi
olmak üzere, hayvan yemi katkisi enzimi olarak kullanima uygun bir enzimdir.
Bulusun alternatif bir uygulamasinda, klonlanan ksilanaz gen ekspresyonu lPTG ile
uyarilmasi sonunda konakçi Ecoli hücresinde ksilanaz, daha kolay ve kisa bir
fermentasyon süresi ile ve biyotinli ve serbest halde olarak üretilmekte ve hücre
pelletinden ham ksilanaz elde edilmektedir.
Bulusun alternatif bir uygulamasinda Rekombinant Escherichia coli HB 1 01(pEX25)
kültüründen ksilanaz enzim preparati üretim yöntemi;
dogal Baci'llus pumilus YMNX25 bakterisinden YMNxynA geninin moleküler
olarak klonlanmasi,
izole edilen YMNxynA geninin piyasada mevcut bir plazmite aktarilmasi ile
olusturulan pTX25.1 ara vektörüne aktarilarak önce replike olabilen ve baska bir
vektöre klonlanmasina uygun bir plazmit elde edilmesi,
elde edilen bu ara plazmitin Escherichi'a coli”nin XL-l Blue susuna tasinmasi ve
çogaltilmasi,
pTX25.1 ara plazmitindeki YMNxynA geninin piyasada mevcut olan biyotinli
rekombinant ksilanaz üretimini saglayan bir anlatim vektörüne tasinarak pEX25
ksilanaz enzim anlatim plazmitinin elde edilmesi,
elde edilen bu expresyon plazmitinin Escherichi'a coli' bakterisinin HBlOl susuna
tasinmasi ve yem katkisi olarak kullanilmaya uygun ksilanaz enziminin üretilmesi
adimlarini içermektedir.
Bulusun alternatif bir uygulamasi olan Rekombinant Escherichia coli
HB101(pEX25) kültüründen ksilanaz enzim preparati üretim yönteminde ilk olarak
Baci'llus pumilus YMNX25 bakterisinden ksilanaz geni klonlanmakta ve nükleotid
dizisi belirlenmektedir. Söz konusu yöntemde genomik DNA eldesi Luria Broth
(LB) besi yerinde büyütülen B. pumi'lus YMNx25 izolatinin (Genbank accession
number: JN kullanilarak
Fenol: Klorofomi: Izoamil alkol ekstraksiyonlari ve izopropanol çöktürmesi ile
gerçeklestirilmektedir. Elde edilen genomik DNA ksilanaz geninin in vitro
sentezlenebilmesi için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanilmaktadir. Ksilanaz
enziminin sentezinden sorumlu olan xynA geninin çogaltilmasi, TA klonlamasina ve
ekspresyon vektörüne tasinabilmesine olanak saglayacak yapida tasarlanan ve
genomdan xynA geninin çogaltilmasini saglayan asagida dizileri verilen dejenere F7
ve R4 isimli primer çifti ile PZR yöntemi kullanilarak gerçeklestirilmektedir.
Polimeraz zincir reaksiyonu ktomozomal DNA°dan 130 ng ve her bir primerden 2.5
uM konsantrasyondan katilarak toplam 50 ul ,son hacimde gerçeklestirilmistir.
Reaksiyon kosullari olarak 95°C,de 3 dakika denatürasyon, 550C9de 1 dakika
uzama seklinde gerçeklestirilmistir.
Daha sonra ksilanaz enziminin protein kodlayici gen bölgesine karsilik gelen,
yaklasik 700 hp uzunlugundaki genomik parça önce bir alt klonlama vektörü olan
pTZS7R/T (Fermentas)°a klonlanmaktadir. Ligasyon ürünü, konakçi hücre olarak
Escherichia coli' XL-l Blue hücrelerine aktarilmistir. Aday transformantlardan
plazmit izolasyonu yapilarak insört varliginin anlasilmasi için NotI ile BglII
restriksiyon endonükleaz kesimi yapilmistir. YMNxynA nükleotid dizisi klasik
dizilme yönteminin (Sanger et al.,l977) yeni bir versiyonu olan otomatik dizi analiz
sistemi ile GenomeLab DTCS Quick Start Kit (Beckman Coulter Ref. 608120)
kullamlarak gerçeklestirilmis, elde edilen diziler SCDC Biology WorkBench
arayüzü kullanilarak düzenlenmistir. pTZ57R/T ara vektörüne klonlanan Baci'llus
pumilus YMNxynA genine ait rekombinant plazmit pTX25.1 olarak adlandirilmistir.
Dizi analizi sonucunda ksilanaz kodlayan xynA genotipi elde edilmistir (Sekil 1).
Dizilemede kullanilan asagidaki primerler vektöre ait olan primerlerdir.
Dizi # 3 (Ml3/pUCSequencingPrimer): 5” GTAAAACGACGGCCAGT 3”
Dizi# 4 (M13/pUCReverseSequencingPrimer): 5” CAGGAAACAGCTATGAC 3,
Dizi #5 (PinPointVector SequencingPrimer): 5” CGTGACGCGGTGCAGGGCG 3,
Dizi #6 (SPösequencingPrimer): 5° TATTTAGGTGACACTATAG 3°
Otomatik dizileme sonucu elde edilen ve GenBank (Accession number: JQ625342)
kaydi yapilan nükleotid dizisi (Accession number: JQ625342) bu patent
dokümaninda YMNxynA olarak anilacaktir. Söz konusu patent dokümaninda bahsi
geçen ksilanaz amino asit dizisi, otomatik dizileme sonucu elde edilen nükleotid
dizisinden translasyon ile elde edilmektedir. Öncül (precursor) protein halinde
sentezlenen ksilanaz 228 amino asit içerir, bu amino asitlerin dagilimi Tablo 5”de
verilmistir.
Ksilanaz dizisindeki ilk 27 amino asitlik kisim sinyal peptidim olusturmaktadir.
Sinyal peptidinin ayrilmasi ile elde edilen 201 amino asitlik kisim ergin ksilanaz
olarak tanimlanmaktadir (Sekil 1).
Sembol Amino Asit Sayi % (Moleküler agirlikta)
N Asparajin 17 7.5
Y Tirozin 16 7.0
T Threonin 21 9.2
7 G Glisin 24 10.5
W Triptofan 6 2.6
R Aij inin l 2 5 .3
Q Glutamin 7 3.1
D Aspartik asit 7 3.]
E Glutamik asit 9 3 .9
F Fenilalanin 10 4.4
P Prolin 6 2.6
M Metiyonin 7 3.1
H Histidin 5 22
C Sistein 2 0.9
B Asparajin ya da aspartik asit 0
Z Glutamin ya da glutamik asit 0 O
Bulustaki B. pumi'lus YMNx25 bakterisinden klonlanan YMNxynA ksilanaz geninin
nükleotid ve aminoasit dizisi (Sekil 1) ile diger patent ve makalelerde veya
GenBank,ta bulunan B pumi'lus orjinli ksilanazlardan farki bulunmaktadir. Gen
dizisinin aminoasit dizisine çevrilmesi ile elde edilen bilgilere göre; enzim öncül
protein halinde sentezlenmekte ve toplamda 228 amino asit içermektedir, ilk 27'
amino asit sinyal dizisini olusturmakta, translate olan 201 amino asit bulunmaktadir.
YMNxynA ksilanaz amino asit dizisinin çoklu dizi hizalamasi (multiple aligrLment)
yapildiginda amino asit dizilerine ulasilabilen dokuz farkli Bacz'llus pumi'lus endo-
beta ksilanazlari ile %87-99 arasinda homoloji gösterdigi görülmektedir (Sekil 2).
Amino asit dizilerinden enzimin üç boyutlu yapisi bu bulusta modellenmistir ve
henüz dizilerine ulasilan diger Bacillus pumilus ksilanazlari için literatürde bir
model çalismasi rapor edilmis olmadigindan, ayni aileden Baci'llus subtilush ait
PDB kodlu IIGO modeli temel alinarak bu bulusta klonlanan genin kodladigi
ksilanaz için homoloji modellemesi (MOE kullanilarak) ile tersiyer yapi
olusturulmus ve bu elde edilen model Sekil 6`da gösterilmektedir.
Ksilanaz enzimi görevini bitki materyalihdeki karmasik karbonhidratlarin hidrolizi
için yerine getirirken sahip oldugu kendine özgü amino asit dizilerinin translasyonu
ile ortaya çikan bu üç boyutlu yapi sayesinde yapmaktadir. Elde edilen YMNxynA
nükleotid, protein dizisi ve olusturulan üç boyutlu modeli, bu ksilanazin ileride
yönlendirilmis evrim ve/veya tesadüfi mutasyonlar ile gelistirilmesi için temel
olusturmaktadir.
Klonlanan ksilanazin moleküler agirligi yukarida belirtilen amino asit dizisi
kullanilarak hesaplanmistir. Hesaplamalara göre enzimin moleküler agirligi
ksilanazm izoelektrik noktasi yine yukarida belirtilen amino asit dizisi kullanilarak
hesaplanmistir. Tahmini izoelektrik noktasi denature haldeki proteinin net yükünü
belirtmektedir. Buna göre ksilanazin denature haldeki tahmini izoelekrik noktasi
8.837tür.
Söz konusu yöntemde dogal Bacillus pumi'lus YMNx25 bakterisinden YMNxynA
geninin moleküler olarak klonlanmasinin ardindan izole edilen YMNxynA geninin
piyasada mevcut bir plazmite aktarilmasi ile olusturulan pTX25.l ara vektörüne
aktarilarak önce replike olabilen ve baska bir vektöre klonlanmasina uygun bir
plazmit elde edilmektedir.
Bu bulusta ekspresyon vektörü olarak Promega (Madison, Wisconcin, USA)
tarafindan üretilen PinPointTM Xa3 vektörü kullanilmistir. Ksilanazin vektöre
sokulmasi için, PinPointTM Xa3 ekspresyon vektörü insertün uçlari ile uyumlu Bng
ve NotI enzimleri ile kesilmistir. 687 hp olan insert, YMN ksilanaz geni sinyali ve
ergin dizisini kodlayan kismi ile birlikte çikarilmak üzere ilgili restriksiyon
bölgelerinden (BglII ve Notl) kesilerek alt klonlama vektörü pTX25.1,den
çikartilmistir. Pinpoint Xa3 vektörünün omurga bölümleri ekspres edilecek yapisal
dizi ile kombine edilmistir. Plazmit vektör Escherichia coli' için uygun olan
seçilebilir markör (isaretleyici) gen olarak amfisilin içeimektedir. Biyotin ve sinyalli
iüzyon proteini, ksilanaz enziminin fonksiyonelligini etkileyeceginden bulusun
rekombinant ekspresyon ürünlerinde optimal biyolojik aktivite yemesi için uygun
konakçi seçilmistir. Rekombinant yapi transforrnasyon ile bulusun polipeptidinin
ekspres edilecegi konakçi organizma olarak seçilen, proteazlari aktif Escheri'chia
colz' HBlOl (Genotip: F-, proAZ hsdSZO recAl ara-14 lacYl galKZ rpsL20 supE44
xyl-5 mtl-l) susuna aktarilmistir. Trasformantlar arnpisilinli LB besi ortaminda
inoküle edildikten sonra plazmit izolasyonunun ardindan insörtü veren BglIl-Notl
restriksiyon enzimi kesimleri ve DNA dizilemesi yapilarak incelenmistir. Ksilanaz
okuma çerçevesi pEX25 plazmitinde baslama ve sonlandirma kodonlari dahil
dogrulanmistir. Rekombinant olarak olusturulan Escherichia coli HB101(pEX25)
transformanti DSMZ”e deposit edilmistir (Deposit no: DSM26299).
pEX25 plazmitinden elde edilen polipeptit ksilanaz aktivitesine sahip parçayi
içeimektedir. Bu polipeptidin N-ucunda heterolog amino asit dizileri yer almaktadir.
Heterolog dizi hücre disi protein hedeflemeyi etkileyen lider dizi (sinyal peptidi) ve
vektörden gelen biyotin tagini içermektedir. Füzyon protein dizisi içinde proteolitik
bölünme bölgesi bulunmaktadir (Sekil 5).
Ksilanazin amino ucunda biyotin etiketi (13 kDa) ve ondan önce genin öncül sinyal
dizisi ( bulundugundan olusturulan plazmit tasiyan hücreler bu ekspresyon
konakçisinda ksilanazin ekspresyonunun uyarilmasi amaciyla 100uM IPTG ile
indüklendiginde, 38.7 kDa biyotinli ksilanaz Escherichia coli”de heterolog sistemde
ekspres edilmektedir. Olusturulan rekombinant plazmit seçilen konakçida aktif
ksilanaz üretmektedir.
Olusturulan rekombinant pEX25 plazmitinin Escherichi'a coli HB1017de uyarilmasi
ile N terminalinde heterolog aminoasit dizilerini ihtiva eden ksilanazin anlatiminin
tespiti adina, indüklenme sonrasindaki üretim hücreler patlatilarak elde edilen
protein ekstraktlarinda SDS-PAGE ile gözlenmistir. Biyotinli proteinlerin varligi
Western Blot ile incelenmistir.
Biyotinli ksilanaz üretimi için, pEX25/HB101 rekombinant susu ZuM biyotin ve
100ug/ml ampisilin içeren LB besi ortamina ekilmis ve 37°C çalkalamali
inkübatörde 150 rpm hizla gece boyu çalkalanarak büyütülmüstür. 100 ml LB-
Ampisilin-biyotin içeren besiyerine bu ön kültürden asilama yapilmistir (1:50
hacim/hacim). Bir saatlik 37°C 150 rpm inkübasyon süresi sonunda son
konsantrasyonu IOOuM IPTG olacak sekilde uyarilmis ve 5 saat süre ile 37°C”de
4°C°de) toplanan hücreler 50 mM Tris-HCl (pH:7.5), 50 mM NaCl ve %5 gliserol
çözülerek 5 dakika 95°C°de isitilmis ve araliklarla kisa vorteks yapilarak hücreler
parçalanmistir. Parçalanan hücreler santritîij ile ayrilmis ve ksilanazin da oldugu
hücre içi ekstrati analiz için kullanilmistir.
Western Blot analizleri yari-kuru transblot sistemi kullanilarak yapilmistir (BioRad,
California, USA). Üst sividaki total proteinler SDS-PAGE elektroforezi ile
ayristirilmistir. Bu islemden sonra total proteinler PVDF (Sigma Aldrich, Cat.
P2938) membran üzerine transfer edilerek biyotin ile avidinli Streptavidin-Alkalin
Fosfatazlin birbirine baglanmasi saglanmistir. Western Blot analizlerinin sonuçlari
Sekil 7B°de gösterilmektedir. Escheri'chi'a colz' HBlOl(pEX25) hücrelerinde
biyotinle birlikte ekspres olan ksilanaz, 39 kDa bant olarak tespit edilmistir.
Ksilanaz aktiviteli peptidin varligi ise zimogram ile incelenmistir. Zimogram analizi
Ratanakhanokchai ve ark. (1999)”dan modifiye edilen metoda göre yapilmistir.
Protein örnekleri %1 ksilan içeren %15°lik SDS poliakrilamit jele yüklenmis, 120
voltta 2 saat yürütülerek elektroforez edilmistir. Elektroforez sonrasinda ksilanli jel
edilmistir. Jel, Triton-X 100 döküldükten sonra sitrat tamponuyla (pH 5.3) yikanmis
ve 50°C'de 2 saat bu reaksiyon tamponunda birakilmistir. 5rnM NaOH+%
Kongo kirmizisi (lM NaCl de çözünmüs) ile jel boyanmistir Sinyal peptidinden
konakçimn proteazlari ile ayrilmis olan yaklasik 23 kDa°lik proteinde aktivite
gözlenmistir (Sekil 7C).
Bulus konusu yöntemde daha sonra rekombinant ksilanazin fermentörde üretimi
gerçeklesmektedir. Escherichi'a coli HB101(pEX25) hücrelerinin 10 litrelik
fermentörde büyütülmesi için biyotin takviyeli ve antibiyotikli LB besi ortami
kullanilmistir. Fermentörde kullanilacak ön kültür için amfisilin içeren LB besi
yerine platelerden seçilen Escherichia coli HB101(pEX25) kolonilerinden ekim
yapilarak gece boyu inkübe edilmesi saglanmistir. Ertesi gün, gece boyu kültür ile
inkübasyona birakilmistir. Besi yerlerine son konsantrasyonu 100 mg/ml olacak
sekilde amfisilin ve son konsantrasyonu 2 tiM olacak sekilde biyotin eklenmistir.
Üçüncü gün ise hazirlanan kültürler fermentör inokulumu olarak kullanilmistir.
alindiktan sonra antibiyotik, biyotin ve 400 m1 inokulum eklenerek fermentasyon
0D 0.9-1 araliginda oldugunda son konsantrasyonu 100 uM olacak sekilde IPTG
eklenerek indükleme yapilmistir. Plazmitin indüklenmesine bagli olarak hücre
içinde ksilanaz biyotin etiketi ile 5 saat sonunda hücre içinde yeterince
santriûij edilmistir. Üst sivi atilarak, toplanan hücreler saf su ile yikanmis ve pelletin
kaybolmamasi için 12000 rpmlde 40C”de 15 dakika santrifüj edilerek toplanmistir.
Yikama sonrasinda yas pelletteki hücreler 50 mM Tris (pH 7.5) ve 50 mM NaCl
tamponda çözülüp sonike edilmistir. Sonikasyon için 100-150 ml arasi süspanse
hücreler 8-10 amperde, 15 açik 15 kapali 40 döngü ile parçalanmistir. Toplanan
örnekler 11000 rpm'de 4OC”de 10 dakika santrifüj edilerek süpernatantta toplanan
hücre içi proteinler ham halinde elde edilmistir. Elde edilen sivi preparat, liyofilize
edilmis ve aktivitesi 25 U/mg olan liyofilize toz preparat elde edilmistir. Bu elde
edilen liyofilize prepattaki biotin miktari 10 ug biotin/ 100 gr preparat olarak
ölçülmüstür.
Bu bulusta; ksilanaz enziminin heterolog sistem olarak ekspresyon vektörünün
aktarildigi Escherichi'a coliiden, enzimin uyarilma ile kisa sürede ham olarak elde
edilmesi saglanmaktadir. Ksilanaz, sinyali ile beraber ekspresyon vektörüne
yerlestirildiginden (Ksilanaz geni sinyali ile beraber vektördeki biyotin tag dizisine
baglanmis oldugundan), plazmitin aktarildigi konakçi olarak özellikle proteaz aktif
bir Escheri'chia coli' seçilmistir. HBlOl soyundan ksilanaz bir saflastirma adimin&
gerek olmadan ham hücre preparatindaki ksilanaz biyotinli parçadan hücre
proteazlari ile aynlmaktadir. Enzim biyotinsiz aktif olarak serbest kalmaktadir.
Böylece sailastirmaya gerek olmadan yeterli miktarda aktif ksilanaz Escherichia
coli HBlOl(pEX25) ferrnantasyonu sonrasinda kisa sürede elde edilmektedir.
Escheri'chi'a coli°de proses olabilen biyotinli ksilanaz varyanti, konakçi susu HBlOl
Escherichi'a coli°ye ait proteazlar tarafindan bu polipeptidin önündeki sinyal dizisini
koparmakta ve biyotin etiketli kisim ayrilmakta, ksilanaz polipeptidi Escheri'chi'a
coli”nin hücre preparatlarinda aktif sekilde bulunmaktadir.
Konakçinin proteazina ilaveten, istenildiginde disaridan eklenecek spesifik bir
proteaz uygulamasi ile üretilen ham ksilanazin miktari arttirilabilir ve dolayisi ile
elde edilen aktivite iki katina çikarilabilmektedir.
Bunun uygulamasi için Escherichia coli HBlOl(pEX25)°de uyarilma ile elde edilen
etiketli (tagli) ksilanaz in vitro olarak factor Xa proteazi ile isleme tabi tutulmustur.
Bu in vitro denemede ham hücre preparatina ekstra spesifik proteaz ilavesi
durumunda g yas pellet için 54000 U aktivite elde edilmistir.
Teknigin bilinen durumunda yer alan uygulamalarda biyotin ile rekombinant
ksilanazin üretim yöntemi ve bu sekilde bir heterolog sistemden ham ksilanazin
rekombinant olarak elde edilmesi yöntemi ve bu ksilanaz ile birlikte biotin de içeren
hücre ekstratlarimn yem katkisi olarak kullanilmasi yer almamaktadir.
Bulus konusu yöntemle elde edilen ksilanaz içeren Escherichza coli' “de üretilmis
liyofilize rekombinat enzim preparati kanatli yemine eklenerek rekombinant
biyotinli ksilanaz preparati yumurtaci tavuklarda test edilmistir.
Escherichia coli HBIOl(pEX25)”den elde edilen YMNxynA genin kodladigi
ksilanaz, ksilanazin yemden yararlanmada etkisinin belirlenmesi adina, ksilanaz
enziminin rekombinant formunun yumurta tavuklarindaki etkileri Tablo 6,da verilen
deneme planina göre yürütülmüstür.
Gruplar
(MK) Misir kontrol yemi (2750 kcal/kg normal ME)
(BNK) % 60 bugday negatif kontrol (2620 kcal/kg düsük ME)
(RK) 360 U/kg rekombinant ksilanaz + düsük ME (2620 koal/kg)
Rekombinant ksilanaz mikro karistiricida, razmol ve kalsitle 1800 devir/dakikada 3
dakika karistirilarak ön karisim haline getirilmis ve deneme karma yemleri
hazirlanirken ön karisim halinde yeme ilave edilmistir. Deneme karma yemleri 300
kg/saat kapasitede, kirici-karistirici yem makinesinde, toz formda hazirlanmistir.
Arastirmada, her tavuk bireysel kontrol edildiginden bir tekerrür sayilmis, her grupta
, toplam 30 adet tavuk kullamlmistir. Arastirma 60 gün devam ettirilmistir.
Deneme gruplarinda ölüm olmazken, deneme sonu canli. agirlik ortalamalari
arasinda farklilik tespit edilmemistir (P>0.05). Misir kontrol grubu (MK), düsük
metabolik enerjili bugdaya dayali (BNK) ve rekombinant ksilanaz (RK) ilavesinin
yapildigi gruplarla karsilastirildiginda, performans parametreleri bakimindan önemli
farkliliklarin olmadigi belirlenmistir (P>0.05). Istatistiksel olarak önemli farklilik
çikmasa da sayisal olarak düsük enerjili bugday grubunun (BNK) misir kontrol
grubuna göre günlük 8 g daha fazla yem tükettigi görülmektedir. Yem tüketiminde
ise ksilanaz ilavesi ile azalma egilimi görülmektedir (Tablo 7).
Deneme Yemden
sonu Yumurta Yumurta Yumurta Yem yararlanma
Gruplar canli verimi, agirligi, kütlesi, tüketimi, orani, g
agirlik, g %/tavuk/gün g/yumurta g/tavuk/gün g/tavuk/gün yem/ g
yumurta
Deneme muameleleri arasinda kirik-çatlak ve kirli yumurta orani, kabuk
mukavemeti ve kalinligi, sekil indeksi, ak yüksekligi, haugh birimi ortalamalari
bakimindan önemli farkliliklar tespit edilmemistir (P>0.05) (Tablo 8). MK
grubunun yumurta sarisi RYCF a ve b degerlerinin bugdaya dayali deneme
gruplarindan önemli düzeyde daha yüksek, L degerinin ise daha düsük oldugu tespit
yumurta
pigmentasyonun daha fazla olmasi dogaldir. Bugdaya dayali yemlere ksilanaz
edilmistir. Misirin içerdigi renk maddeleri dolayisiyla sarisi
ilavesi bu denemede renk özelliklerini önemli düzeyde degistirmemistir (Tablo 9).
Kirik- Kirli
Kabuk Kabuk Ak
çatlak yumurta Sekil Haugh
Gruplar mukavemeti, kalinligi, yüksekligi, . . .
yumurta orani, indeksi birimi
Newton mm mm
Gruplar RYCF L A B
Yeme Escherichia coli HB101(pEX25)°de plazmit kontrolünde üretilmis
rekombinant ksilanaz ilavesi (RK) yemdeki ve ince bagirsaktaki ksilanaz aktivitesini
BNK grubuna göre sayisal olarak artirmistir. Misir kontrol (MK) grubundaki
tavuklarin ince bagirsak viskozite (dudenum+ileum) degerleri enzimli veya enzimsiz
bugday agirlikli yemlerle yemlenen tavuklarinkinden önemli düzeyde daha düsüktür
(P<0.01). Bugday agirlikli yemlere rekombinant ksilanaz enzim ilavesi ince
bagirsak Viskozite degerini enzimsize göre önemli düzeyde düsürmüstür (P<0.01)
Ince bagirsak Ince bagirsak
Viskozite, toplam
ksilanaz
Gruplar _ _ (cP, 100 rpm ksilanaz
aktivite,
de) aktivitesi,
Bulus konusu bu alternatif klonlama ile biyotinli ksilanaz üretilmesi yönteminde
elde edilen plazmid bir bakteriye aktarildigi için konakçi olan Escheri'chia coli'
HB101(pEX25) soyu genetik olarak yeniden yapilandirilmistir. Escherz'chi'a coli'
bakterisinde üretilmis olan, ksilanaz ve biyotin peptidi içeren ham hücre
preparatinin test edildigi yumurta tavugu denemeleri sonuçlarina göre rekombinant
ksilanaz ürününün yumurta tavuklarinda enzim preparati ilavesi sonrasinda ince
bagirsak viskozitesinde olumlu düzelme, yem ve ince bagirsak enzim aktivitelerinde
sayisal artislar tespit edilmistir. Performans ve yumurta kalitesi özellikleri normal
düzeyde gözlenmistir.
Bulus, ksilanaz genin, bir endüstriyel izolat olan Bacillus pumi'lus YMNx25°in saf
kültüründen izolasyonunu, klonlanarak tanimlanmasim ve bu genin kodladigi ve
moleküler agirligi 23 kDa olan ksilanaz enzimin yeniden yapilandirilan bir
plazmidten anlatimi da saglar ve ksilanazin hayvan yem katkisi için yararli bir
bilesim seklinde üretilmesine iliskindir. DNA klonlama teknojisi ile yapilandirilan
sistemden ksilanaz ile biotinli peptid içeren ham preparat elde edilebilmekte, yem
katkisi olarak kullammini da kapsamaktadir. YMNxynA olarak adlandirilan ksilanaz
geninin Bacillus pumilus YMNx25 susundan eldesi, moleküler klonlama yöntemi ile
bir vektöre aktarilmasi, rekombinant plazmitten uyarici ile daha kisa süreçte N-
terminal ucunda in vivo biotinlenen amino asit sekansina sahip olarak anlatimi ve
füzyon proteinin Escherichi'a coli”den bir kombine yem preparati olarak elde
edilmesini tanimlar. Uyarilma sonrasinda enzim, biotinli peptit olarak Escherz'chi'a
coli' HB101 (pEX25)°de 3-5 saatte elde edilmektedir. Ksilanaz ve biotinli peptid”ten
olusan kombine ürünün yem rasyonunda kullanilmasi bulus kapsamindadir. Enzime
ait gen dizisi ve elde edilen rekombinant plazmit ileride bu ksilanazin gelistirilmesi
amaçli kullanilmaya elverislidir.
Yem katkisi olarak kullanim adina ksilanazi prokaryotik hücrelerde ekspres eden
yeni bir plasmid hazirlanmis ve transformanti elde edilmistir. Böylece klonlanan
ksilanaz yukarida belirtildigi sekilde heterolog olarak prokaryatik konakçida da
üretilmistir. Elde edilen biotinli peptid ve ksilanaz, kombine yeni bir ürün olarak;
bugday temelli diyetlerde kullanima yararli, dengeli beslenme için ekolojik yem
karmalarina katilmaya uygun yem karmalarina katilacak bir preparat olup, devekusu
dahil kanatlilarin beslenmesine uygun ve özellikle stresli kosullarinda kullanim
adina hazirlanan rasyon için yararli olup ayrica at beslemede de istege bagli bir yem
katkisi olarak elverislidir. Basta monogastrik hayvan (etlik ve yumurtaci tavuk,
devekusu, bildircin, ördek, kaz ve balik yemleri dahil) yemlerine katilan bitkisel
kökenli yemlerdeki ksilanin 1,4 beta bagimn parçalanmasi için ve yeme ilave biotin
de sagladigindan alternatif yem yapimina uygundur. Biotince zengin bir yem
verilmesi gerektiginde besleyiciye ekonomik bir yöntem saglar. Bugday ile yem
hazirlanmasi yem maliyetinde önemli bir tasarruf saglamakta, ayrica ksilanazli
preparat ile biotin de saglayan bir yem karmasi hazirlanmasina olanak tanidigindan
ISTEMLER
1. Ksilanaz enzimini hücre disina salgilayan topraktan izole edihnis yerel dogal
izolat olan Bacillus pumilus YMNX25 soyunun kültüründen ksilanaz enzim
preparati hazirlanmasini saglayan;
Bacz'llus pumilus YMNx25 ”nin ön kültürünün hazirlanmasi,
üretim için besi ortaminin hazirlanmasi,
hazirlanan üretim ortamimn biyoreaktöre aktarilmasi,
üretim ortaminin biyoreaktör içerisinde sterilize edilmesi,
üretimin biyoreaktörde süspanse hücre karisiminin homojen tutulabilmesi
için karistirma isleminin uygulanmasi,
karistirilan süspanse hücre karisiminm havalandirilmasi ve
sicaklik artisinin disaridan soguk uygulanmasiyla kontrol edilmesi adimlari
ile karakterize edilen bir yöntem.
. Kültürden ksilanaz üretimi için ekonomik üretim ortaminin; 1-2.5 g/L
MgSO4.7H20 içermesi, baslangiç üretim ortami pH degeri 5.5 olan bu besi
ortaminin pH degerinin 6.8-8.8 araliginda olmasi ve karistirmali
biyoreaktörde üretimin kesikli modda 26-390C sicaklikta gerçeklestirilmesi
ile karakterize edilen Istem ladeki gibi bir yöntem.
. Üretilen Baci'llus pumz'lus kültürünün üretim ortamindan ayrilmasinda kati
sivi ayirma islemi gerçeklestirilmesi ile karakterize edilen Istem 1 veya
2”deki gibi bir yöntem.
. Elde edilen ham ksilanaz enzim preparatinin belirlenen molekül büyüklügü
araliginda membranlardan basinç altinda ultrafiltrasyon sisteminden
geçirilerek konsantre edilmesi ile karakterize edilen yukaridaki istemlerden
herhangi birindeki gibi bir yöntem.
. Baci'llus pumilus YMNx25 kültüründen elde edilebilen, moleküler
büyüklügü yaklasik 23 kDa olan, optimum sicakligi 60°C olan ve pH 6-9
araliginda olan yukaridaki istemlerde bahsedilen yöntemlerden herhangi
birine göre üretilen bir bakteriyel ksilanaz.
. Bacillus pumilus YMNx25 kültüründen yem katkisi olarak kullanilacak toz
formda ksilanaz enzimi üretilmesini saglayan;
konsantre edilen ham enzim preparatinin sivinin kuru madde degerinin
ksilanaz stabilizatörü (sodyum klorür) ilave edilerek, %17-20 kuru madde
degerine yükseltilmesi,
stabilizör ilave edilmis ksilanaz preparatinin ayni yönlü dagiticisi olan
çikis sicakligi araliginda kurutulmasi adimlari ile karakterize edilen bir
yöntem.
. Baci'llus pumilus YMNX25 kültüründen yem katkisi olarak kullamlan ve
stabilitesi yüksek kaplanmis granül formda ksilanaz enzimi üretilmesini
saglayan;
konsantre edilen ham enzim preparatina maksimum %25 sodyum klorür ve
maksimum %20 sodyum sülfat içeren stabilizatör ilave edilerek kuru madde
degerinin %329ye yükseltilmesi,
akiskan yatak sistemine giren havanin bagil neminin nem tutucu sistemle
kalsit- do 90=300-400um veya malto dekstrin-MD olan tasiyici malzemenin
akiskan yatak kurutma haznesine beslenmesi,
stabilizatör ilave edilmis ksilanaz preparatinin, akiskan yatak kurutucuda
alttan püskürtülerek, nemi alinmis kuru hava ile ürün sicakliginin 50°C”yi
geçmeyecek sekilde kurutulmasi,
granül ksilanaz enziminin modifiye nisasta, PVA, PEG gibi uygun kaplama
malzemeleri kullanarak nemi alinmis kuru hava ile ürün sicakliginin 60°C”yi
geçmeyecek sekilde kurutulmasi adimlari ile karakterize edilen bir yöntem.
8. Rekombinant Escherichi'a colz' HB101(pEX25) kültüründen bir heterolog
sistemde daha hizli ve biyotinle birlikte ksilanaz enzim preparati üretilmesini
saglayan;
dogal Baci'llus pumilus YMNX25 bakterisinden YMNxynA geminin
moleküler olarak klonlanmasi,
izole edilen YMNxynA geninin piyasada mevcut bir plazmite aktarilmasi ile
olusturulan pTX25.l ara vektörüne aktarilarak önce replike olabilen ve baska
bir vektöre klonlanmasina uygun bir plazmit elde edilmesi,
Ma plazmitin Escheri'chia colisnin XL-l Blue susuna
tasinmasi ve çogaltilmasi,
pTX25.l ara plazmitindeki YMNxynA geninin piyasada mevcut olan
biyotinli rekombinant ksilanaz üretimini saglayan bir anlatim vektörüne
tasinarak pEX25 ksilanaz enzim anlatim plazmitinin elde edilmesi,
elde edilen bu expresyon plazmitinin Escheri'chi'a coli bakten'sinin HBlOl
susuna tasinmasi ve yem katkisi olarak kullanilmaya uygun ksilanaz
enziminin üretilmesi adimlari ile karakterize edilen bir yöntem.
Claims (1)
- ISTEMLER . Ksilanaz enzimini hücre disina salgilayan topraktan izole edilmis yerel dogal izolat olan Baci'llus pumilus YMNX25 soyunun kültüründen ksilanaz enzim preparati hazirlanmasini saglayan; Baci'llus pumi'lus YMNX25,nin ön kültürünün hazirlanmasi, üretim için besi ortaminin hazirlanmasi, hazirlanan üretim ortaminin biyoreaktöre aktarilmasi, üretim ortaminin biyoreaktör içerisinde sterilize edilmesi, üretimin biyoreaktörde süspanse hücre karisimimn homojen tutulabilmesi için karistirma isleminin uygulanmasi, karistirilan süspanse hücre karisiminin havalandirilmasi ve sicaklik artisinin disaridan soguk uygulanmasiyla kontrol edilmesi adimlari ile karakterize edilen bir yöntem. . Kültürden ksilanaz üretimi için ekonomik üretim ortaminin; 1-2.5 g/L MgSO4.7H20 içermesi, baslangiç üretim ortami pH degeri 5.5 olan bu besi ortaminin pH degerinin 6.8-8.8 araliginda olmasi ve karistirmali biyoreaktörde üretimin kesikli modda 26-390C sicaklikta gerçeklestirilmesi ile karakterize edilen Istem ladeki gibi bir yöntem. . Üretilen Baci'llus pumilus kültürünün üretim ortamindan ayrilmasinda kati sivi ayirma islemi gerçeklestirilmesi ile karakterize edilen Istem 1 veya 27deki gibi bir yöntem. . Elde edilen ham ksilanaz enzim preparatinin belirlenen molekül büyüklügü araliginda membranlardan basinç altinda ultrafiltrasyon sisteminden geçirilerek konsantre edilmesi ile karakterize edilen yukaridaki istemlerden herhangi birindeki gibi bir yöntem. . Bacillus pumilus YMNX25 kültüründen elde edilebilen, moleküler büyüklügü yaklasik 23 kDa olan, optimum sicakligi 60°C olan ve pH 6-9 araliginda olan yukaridaki istemlerde bahsedilen yöntemlerden herhangi birine göre üretilen bir bakteriyel ksilanaz. . Baci'llus pumiius YMNX25 kültüründen yem katkisi olarak kullanilacak toz formda ksilanaz enzimi üretilmesini saglayan; konsantre edilen ham enzim preparatinin sivinin kuru madde degerinin ksilanaz stabilizatörü (sodyum klorür) ilave edilerek, %17-20 kuru madde degerine yükseltilmesi, stabilizör ilave edilmis ksilanaz preparatinin ayni yönlü dagiticisi olan çikis sicakligi araliginda kurutulmasi adimlari ile karakterize edilen bir yöntem. . Baci'llus pumilus YMNX25 kültüründen yem katkisi olarak kullanilan ve stabilitesi yüksek kaplanmis granül formda ksilanaz enzimi üretilmesini saglayan; konsantre edilen ham enzim preparatina maksimum %25 sodyum klorür ve maksimum %20 sodyum sülfat içeren stabilizatör ilave edilerek kuru madde degerinin %32°ye yükseltilmesi, akiskan yatak sistemine giren havanin bagil neminin nem tutucu sistemle kalsit- do 90=300-400p.m veya malto dekstrin-MD olan tasiyici malzemenin akiskan yatak kurutma haznesine beslenmesi, stabilizatör ilave edilmis ksilanaz preparatinin, akiskan yatak kurutucuda alttan püsküitülerek, nemi alinmis kuru hava ile ürün sicakliginin 50°C°yi geçmeyecek sekilde kurutulmasi, granül ksilanaz enziminin modifiye nisasta, PVA, PEG gibi uygun kaplama malzemeleri kullanarak nemi alinmis kuru hava ile ürün sicakliginin 60°C°yi geçmeyecek sekilde kurutulmasi adimlari ile karakterize edilen bir yöntem 8. Rekombinant Escherichia coli HB101(pEX25) kültüründen bir heterolog sistemde daha hizli ve biyotinle birlikte ksilanaz enzim preparati üretilmesini saglayan; dogal Baci'llus pumi'lus YMNX25 bakterisinden YMNxynA geninin moleküler olarak klonlanmasi, izole edilen YMNxynA geninin piyasada mevcut bir plazmite aktarilmasi ile olusturulan pTX25.1 ara vektörüne aktarilarak önce replike olabilen ve baska bir vektöre klonlanmasina uygun bir plazmit elde edilmesi, elde edilen bu ara plazmitin Escheri'chi'a colilnin XL-l Blue susuna tasinmasi ve çogaltilmasi, pTX25.l ara plazmitindeki YMNxynA geninin piyasada mevcut olan biyotinli rekombinant ksilanaz üretimini saglayan bir anlatim vektörüne tasinarak pEX25 ksilanaz enzim anlatim plazmitinin elde edilmesi. elde edilen bu expresyon plazmitinin Escherichia coli bakterisinin HB101 susuna tasinmasi ve yem katkisi olarak kullanilmaya uygun ksilanaz enziminin üretilmesi adimlari ile karakterize edilen bir yöntem.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TR2014/04579A TR201404579A2 (tr) | 2014-04-22 | 2014-04-22 | Yem katkısı olarak kullanılmak üzere ksilanaz enzimi üretimi ve bu enzimden toz preparat ve kaplanmış ürün elde edilmesi yöntemi. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TR2014/04579A TR201404579A2 (tr) | 2014-04-22 | 2014-04-22 | Yem katkısı olarak kullanılmak üzere ksilanaz enzimi üretimi ve bu enzimden toz preparat ve kaplanmış ürün elde edilmesi yöntemi. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201404579A2 true TR201404579A2 (tr) | 2015-11-23 |
Family
ID=67980421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2014/04579A TR201404579A2 (tr) | 2014-04-22 | 2014-04-22 | Yem katkısı olarak kullanılmak üzere ksilanaz enzimi üretimi ve bu enzimden toz preparat ve kaplanmış ürün elde edilmesi yöntemi. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TR (1) | TR201404579A2 (tr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
-
2014
- 2014-04-22 TR TR2014/04579A patent/TR201404579A2/tr unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2657884C (en) | Mannanases | |
| EP2857490B1 (en) | Novel Mannanase Variants | |
| AU2020203266B2 (en) | Protein | |
| CN103997902B (zh) | 用木聚糖酶补充的饲料组分 | |
| CN112654703A (zh) | 用于基于谷类的动物饲料的含木聚糖酶饲料添加剂 | |
| US6602700B1 (en) | Phenolic acid esterases, coding sequences and methods | |
| EP3099792B1 (en) | Methods for improving by-products from fermentation processes using xylanase | |
| CA2880774A1 (en) | Xylanases for solubilising arabinoxylan-containing material | |
| RU2720243C2 (ru) | Глюкозидгидролазы и их применение в предупреждении и/или лечении патогенной инфекции у животного | |
| TR201404579A2 (tr) | Yem katkısı olarak kullanılmak üzere ksilanaz enzimi üretimi ve bu enzimden toz preparat ve kaplanmış ürün elde edilmesi yöntemi. | |
| CN117062909A (zh) | 木聚糖酶变体 |