RU2636040C1 - Штаммы-продуценты ферментов и способ получения мультиэнзимной композиции протеолитического и гемицеллюлолитического действия, предназначенной для применения в кормопроизводстве - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к производству ферментных препаратов, которые могут быть использованы в кормовой отрасли. Предложены штаммы мицеллиальных грибов: Penicillium canescens ВКМ F-4643D – продуцент комплексного ферментного препарата, включающего кислую протеазу, лейцинаминопептидазу, эндо-ксиланазу и β-глюканазу, отличающегося повышенной активностью по гемоглобину, L-лейцин-пара(4)-нитроанилиду, ксилану и бета-глюкану, Penicillium canescens BKM F-4668D – продуцент комплексного ферментного препарата, включающего сериновую протеазу, эндо-ксиланазу и β-глюканазу, отличающиеся повышенной активностью по казеинату натрия, ксилану и бета-глюкану. Также предложены способ получения комплексного ферментного препарата и способ повышения питательной ценности кормовых рационов животных. Способ получения ферментов предусматривает выращивание Penicillium canescens ВКМ F-4643D и Penicillium canescens BKM F-4668D на питательных средах, отделение культуральной жидкости от биомассы методом пресс-фильтрации. Из культуральной жидкости получают ультраконцентрат с наполнителем методом распылительной сушки. Высушенные ферментные препараты смешивают между собой в соотношении 1:1 с получением мультиэнзимной композицией, которой обрабатывают зерновой корм животных. Группа изобретений позволяет повысить питательную ценность кормовых рационов животных. 4 н.п. ф-лы, 3 табл., 4 пр.

Description

Èçîáðåòåíèå îòíîñèòñÿ ê îáëàñòè áèîòåõíîëîãèè, à èìåííî ê ïðîèçâîäñòâó ôåðìåíòíûõ ïðåïàðàòîâ, è ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíî â êîðìîâîé îòðàñëè.

В кормопроизводстве широко применяются ферментные препараты (ФП) гидролитического действия с целью повышения эффективности использования кормовых ресурсов [1, 2, 3]. Внесение в рационы сельскохозяйственных животных и птицы ферментов, способных гидролизовать полимеры растительного сырья, позволяет заменять дорогостоящие компоненты кормов более дешевыми, âíîñèòü øðîòû è æìûõè ìàñëè÷íûõ êóëüòóð â êà÷åñòâå äîïîëíèòåëüíîãî èñòî÷íèêà áåëêà, ñïîñîáñòâóåò повышению продуктивности животных, óëó÷øåíèþ èõ ôèçèîëîãè÷åñêîãî ñîñòîÿíèÿ çà ñ÷åò ïîâûøåíèÿ óñâîÿåìîñòè êîðìîâ è ñòàáèëèçàöèè ìèêðîôëîðû êèøå÷íèêà [3, 4]. Наиболее актуально использование экзогенных ферментов в кормах для моногастричных животных, птицы, а также для некоторых групп æâà÷íûõ æèâîòíûõ: òåëÿò, äîéíûõ êîðîâ è äð. [5–9].

Известно, что одним из основных показателей питательной ценности корма является содержание усвояемого белка [10]. Однако в литературе приводятся противоречивые данные об эффективности применения протеаз в кормопроизводстве. По данным ряда авторов, внесение протеаз способствовало повышению степени конверсии кормов, увеличению привесов, обеспечивало нормализацию микрофлоры ЖКТ [10.107, 5]. Другие исследователи не отмечали существенных преимуществ использования протеолитических ферментов [12, 13]. Это связано с тем, что эффективность применения протеаз зависит от состава рациона, вида и возраста животных, специфичности действия используемых ферментов, дополнительного внесения ферментов, гидролизующих некрахмальные полисахариды (НКП) [5]. Наибольшая эффективность использования протеолитических ферментов наблюдается в кормах, обогащенных дополнительным источником белка, например, в виде сои и продуктов ее переработки (шротов и жмыхов). Известно, что до 70% соевого белка составляют термоустойчивые антипитательные белки глицинин и β-конглицинин, проявляющие антигенные свойства, не устраняемые в процессе традиционной обработки соевых шротов и трудногидролизуемые собственными ферментами ЖКТ животных и птицы. Глицинин и β-конглицинин ограничивают использование соевых продуктов в кормах для определенных групп животных, в частности, в рационах молодых животных с неразвитым желудочно-кишечным трактом (телята, молочные поросята) [2, 14]. Для устранения антипитательного действия термостабильных белков сои применяют обработку протеолитическими ферментами [2, 15].

Коммерческие ФП кормовых протеаз представлены, главным образом, сериновыми протеазами, полученными на основе бактериальных штаммов - продуцентов. Сериновые протеазы интенсивно гидролизуют широкий спектр белковых субстратов, в том числе антипитательные белки в предобработанных соевых субстратах [2, 16]. Наиболее известным препаратом протеолитического действия, предназначенным для кормопроизводства, является Ronozyme ProAct. Действующим компонентом препарата является сериновая протеаза с повышенной термостабильностью и устойчивостью при низких значениях рН, синтезируемая генетически модифицированным штаммом Bacillus licheniformis [16].

Существенным недостатком сериновых протеаз, ограничивающим их использование в пищевой отрасли и снижающим эффективность их применения в кормопроизводстве, является образование горьких пептидов, ухудшающих органолептические свойства полученных продуктов. Для снижения горечи белковых гидролизатов в пищевой промышленности широко используют пептидазы, главным образом, лейцинаминопептидазу [17–19]. Также белковые гидролизаты без горечи получают в результате ограниченного протеолиза субстратов некоторыми аспартатными протеазами грибного происхождения (аспергиллопепсин, пенициллопепсин), гидролизующими белок с образованием крупных пептидов [20]. Таким образом, для повышения степени переваримости белка в кормах без ухудшения органолептических свойств целесообразно использовать комплекс протеаз и пептидаз.

Однако получение комплекса протеаз для кормопроизводства на основе отдельно бактериальных и грибных штаммов, культивируемых по индивидуальным технологическим схемам, экономически нецелесообразно. Наиболее перспективным вариантом является получение комплекса протеаз, обеспечивающих необходимую степень гидролиза сложных белковых субстратов в растительном сырье для получения продуктов с повышенной кормовой ценностью и удовлетворительными органолептическими свойствами, используя единую технологическую схему. Известно, что грибные штаммы способны продуцировать грибные сериновые протеазы, обладающие свойствами, аналогичными бактериальным [21]. В связи с этим, рациональным решением представляется культивирование грибных продуцентов и получение на их основе комплексного ФП с необходимым соотношением сериновых, аспартатных протеаз и пептидаз.

В кормопроизводстве широко используют ФП, содержащие ферменты, гидролизующие НКП, так как основным компонентом большинства кормов для сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы являются злаковые культуры с высоким содержанием НКП. В зерновом сырье белок находится в связанном состоянии с гемицеллюлозами (представленных, преимущественно, арабиноксиланами), поэтому применение ксиланаз, эффективно гидролизующих арабиноксилан с образованием пребиотических олигосахаридов, способствует существенному увеличению питательной ценности кормов за счет повышения доступности белка и интенсивного высвобождения легкоусвояемых продуктов гидролиза белка и гемицеллюлозы.

Использование гемицеллюлаз приводит к снижению вязкости перевариваемой массы, повышает доступность питательных компонентов для действия пищеварительных ферментов, высвобождает сахара, необходимые для роста молочнокислых бактерий, способствует нормализации микрофлоры кишечника, увеличивает энергетическую ценность и усвояемость кормов [5, 22, 23]. Для рационов на основе ячменя и овса обычно используют β-глюканазы, а для рационов на основе пшеницы предпочтительны ксиланазы. Ввиду комплексной структуры НКП зерновых культур наилучший эффект достигается при совместном использовании ксиланазы и β-глюканазы [5].

Ввиду сложного компонентного состава сырья, в кормопроизводстве предпочтительно используют комплексные ФП протеаз и карбогидраз, высокоэффективные за счет синергизма действия основных компонентов ферментативного комплекса [5, 24]. Учитывая высокую стоимость ФП, важным критерием является рентабельность использования комплексных препаратов в кормопроизводстве.

На российском рынке кормов представлены следующие основные комплексные ФП, в состав которых входят протеазы: Авизим 1202 [25], содержащий β-глюканазу и β-ксиланазу из разных штаммов Trichoderma longibrachiatum и протеазу B. subtilis, Авизим 1502Х [26] и 1505X [27], представляющие собой комплексные ФП α-амилазы B. amyloliquefaciens, протеазы B. subtilis и ксиланазы T. reesei; Porzyme 8300® и Porzyme tp100 [28, 29], содержащие ксиланазу T. longibrachiatum и протеазу B. subtilis (DuPont Danisco, Copenhagen, Denmark); Кемзайм W [30] и NutriKEM dry [31], содержащие ксиланазу T. viride, β-глюканазу Aspergillus aculeatus, целлюлазы T. reesei, протеазу и α-амилазу B. amyloliquelaciens (Kemin Europa N.V., Бельгия); Фидбест-VGPro [32], содержащий ксиланазу, β-глюканазу, пектиназу грибного происхождения и протеазу B. subtilis (ООО «Сиббиофарм», Россия). Все комплексные ФП получены на основе смешивания ферментов произведенных различными продуцентами: протеазы – на основе бактериальных штаммов, ферменты для гидролиза НКП – на основе грибных продуцентов. Использование двух и более продуцентов и, соответственно, различных технологических линий для получения компонентов одного комплексного ФП существенно удорожает стоимость конечного продукта. Экономически целесообразно получать комплексные препараты на основе одного продуцента или по крайней мере одного вида микроорганизмов с использованием одной технологической линии. Для промышленного производства комплексных ФП предпочтительными источниками являются мицелиальные грибы, благодаря высокой продуктивности и способности к синтезу ферментов при выращивании на дешевых ферментационных средах. Кроме того, для отделения биомассы грибов используется более простая схема по сравнению с бактериальными штаммами, что существенно удешевляет процесс получения концентрированных препаратов [33, 34].

Известен генетически-модифицированный штамм T. reesei, способный продуцировать кислую аспартатную протеазу аспергиллопепсин I и сопутствующие ферменты, гидролизующие НКП. На основе данного штамма производится ФП Fermgen для обработки зерна в производстве алкогольных напитков, для приготовления нецитрусовых соков, для обессмоливания мембран при производстве апельсинового сока [35–37]. Однако из-за более низкой реакционной активности по отношению к трудногидролизуемым белковым субстратам в сравнении с сериновыми протеазами, кислые грибные протеазы практически не используют для обработки соевых белков. Поэтому ФП Fermgen не целесообразно использовать для обработки смешанного зернобобового сырья в кормопроизводстве.

В пищевой промышленности широко применяется ФП Флавозим (Flavourzyme Novozymes A/S), получаемый на основе штамма A. oryzae – продуцента комплекса грибных экзо- и эндопептидаз [38]. Ключевыми ферментами протеолитического комплекса являются пептидазы, содержание грибной сериновой протеазы невысоко, поэтому данный ФП, как правило, применяют для снижения горечи пептидов, образующихся в результате действия бактериальной сериновой протеазы [39]. Помимо протеолитического комплекса, в состав препарата Флавозим входит α-амилаза [38]. ФП Флавозим, как правило, не используется в кормопроизводстве ввиду высокой стоимости и отсутствия в комплексе ферментов, способных гидролизовать НКП.

В России единственными продуцентами комплекса грибных протеаз являются штаммы A. oryzae 12 и A. oryzae 107, полученные на основе A. oryzae 387 (ВКПМ F-683). Штаммы продуцируют комплекс грибных эндо- и экзопептидаз, а также сопутствующие гидролитические ферменты амилолитического и гемицеллюлолитического комплекса [40, 41]. Широкому внедрению производства ФП на основе указанных штаммов препятствует низкий уровень протеолитической и гемицеллюлолитической активности продуцентов [40].

Техническая задача, на решение которой направлено данное изобретение, состоит в получении на основе родственных штаммов Penicillium canescens комплексного ФП, включающего грибные протеазы эндо- и экзодействия, эндо-ксиланазу, эндо-β-глюканазу и комплекс сопутствующих карбогидраз для применения в кормопроизводстве при обработке смешанных рационов.

Технический результат от предлагаемого изобретения состоит в повышении кормовой ценности смешанных рационов для сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы при использовании нового комплексного ФП, содержащего протеазы эндо- и экзодействия, эндо-ксиланазу, эндо-глюканазу и комплекс сопутствующих карбогидраз.

Сущность изобретения заключается в получении новых штаммов-продуцентов:

- P. canescens ВКМ F-4643D, который при выращивании на ферментационных средах на основе соевой шелухи и кукурузного экстракта, обеспечивает получение ФП комплексного действия, включающего кислую протеазу, лейцинаминопептидазу, эндо-1,4-β-ксиланазу, эндо-1,4-β-глюканазу с активностями в КЖ 12000 HUT/мл, 30 LAPU/мл (рН 6,0, 40°С), 120 и 54 ед/мл, соответственно, и комплекс сопутствующих карбогидраз: ксилоглюкан, β-галактозидазу, α-L-арабинофуранозидазу, арабиноксилан арабинофураногидролазу, α-галактозидазы А и С;

- P. canescens BKM F-4668D, который при выращивании на аналогичных ферментационных средах с добавлением 2% соевой муки в качестве индуктора синтеза сериновых протеаз, обеспечивает получение ФП комплексного действия, включающего грибную сериновую протеазу, эндо-1,4-β-ксиланазу, эндо-1,4-β-глюканазу с активностями в КЖ 820, 180 и 55 ед/мл, соответственно, и комплекс сопутствующих карбогидраз: ксилоглюкан, β-галактозидазу, α-L-арабинофуранозидазу, арабиноксилан арабинофураногидролазу, α-галактозидазы А и С.

Способ получения ФП предусматривает глубинное культивирование штаммов – продуцентов P. canescens BKM F-4643D и P. canescens BKM F-4668D на соответствующих средах с последующим концентрированием, сушкой и смешиванием в соотношении 1:1. Изобретение позволяет получать ФП с высокой активностью протеаз: пенициллопепсина, грибной сериновой протеазы и лейцинаминопептидазы, эндо-1,4-β-ксиланазы, ксилоглюкан эндо-1,4-β-глюканазы. Полученный ФП характеризуется высокой стабильностью, эффективностью при обработке зернобобовых кормовых смесей и низкой себестоимостью по сравнению с комплексными ФП, полученными при смешивании ФП, полученных на основе бактериальных и грибных продуцентов в результате культивирования по отдельным технологическим схемам. Применение нового комплексного ФП позволит повысить кормовую ценность смешанных рационов на основе зерновых и бобовых культур.

Изобретение обеспечивает получение высокоактивного комплексного ФП кислой и сериновой протеаз, лейцинаминопептидазы, эндо-1,4-β-ксиланазы, ксилоглюкан эндо-1,4-β-глюканазы и комплекса сопутствующих карбогидраз (β-галактозидазу, α-L-арабинофуранозидазу, арабиноксилан арабинофураногидролазу, α-галактозидазы А и С) в результате глубинного культивирования штаммов P. canescens BKM F-4643D и P. canescens BKM F-4668 D на недорогих ферментационнных средах на основе соевой шелухи и кукурузного экстракта, с добавлением соевой муки, в качестве индуктора сериновой протеазы.

Изобретение реализуется следующим образом.

Авторами настоящего изобретения были получены:

1) штамм P. canescens BKM F-4643D, обеспечивающий получение ФП комплексного действия, включающего кислую аспартатную протеазу, лейцинаминопептидазу, эндо-1,4-β-ксиланазу и ксилоглюкан эндо-1,4-β-глюканазу с активностями 12000 HUT/мл, 30 LAPU/мл, 120 и 54 ед/мл КЖ, соответственно, и комплекс сопутствующих карбогидраз: β-галактозидазу, α-L-арабинофуранозидазу, арабиноксилан арабинофураногидролазу, α-галактозидазы А и С; Данный штамм депонирован в ВКМ под номером F-4643D;

2) штамм P. canescens BKM F-4668D, обеспечивающий получение ФП комплексного действия, включающего грибную сериновую протеазу, эндо-1,4-β-ксиланазу и ксилоглюкан эндо-1,4-β-глюканазу с активностями 820, 180 и 55 ед/мл культуральной жидкости, соответственно, и комплекс сопутствующих карбогидраз: β-галактозидазу, α-L-арабинофуранозидазу, арабиноксилан арабинофураногидролазу, α-галактозидазы А и С.Данный штамм депонирован в ВКМ под номером F-4668D.

Штаммы P. canescens BKM F-4643D и P. canescens BKM F-4668D получены из исходного штамма P. canescens ВКПМ F-178 путем трансформации и селекции.

Культурально-морфологические и микроскопические особенности штаммов:

Среда Чапека с дрожжевым автолизатом (CYA), 26°С. Диаметр колонии 40-45 мм, отчетливо радиально складчатая, средней плотности, ростовая зона плотная, шириной 1,5-2,0 мм. Мицелий белый, конидиальная зона голубовато-серая, конидиогенез обильный. Экссудат и растворимый пигмент отсутствуют. Обратная сторона палевая, буроватая до темно-коричневой.

Среда Мальц-агар (МА). 26°С. Диаметр колонии 30 - 35 мм, отчетливо радиально складчатая, средней плотности, ростовая зона плотная, шириной 1,5 - 2,0 мм. Мицелий белый, пушистый, конидиальная зона голубовато-серая, конидиогенез средний. Экссудат и растворимый пигмент отсутствуют. Обратная сторона палевая, в центре слегка оранжевая.

Среда Чапека с глицерином (GN25), 26°С. Диаметр колонии 16-20 мм, отчетливо радиально складчатая, средней плотности, ростовая зона плотная, шириной 1,5-2,0 мм. Мицелий белый, прижатый, конидиальная зона голубовато-серая, конидиогенез слабый. Экссудат и растворимый пигмент отсутствуют. Обратная сторона светлая.

Среда Чапека с дрожжевым автолизатом (CYA), 5°С. Нет роста.

Среда Чапека с дрожжевым автолизатом (CYA), 37°С. Нет роста.

Конидиеносцы двухъярусные, терминальные, фуркатные, шероховатые, длиной более 150 мкм, шириной 3–4 мкм. Метулы шероховатые, 10–18x2,5–3,5 мкм, фиалиды ампуллиформные, 7–8х2,2–2,5 мкм, конидии округлые, иногда овальные, гладкие, 2,2-3,0x2,0-3.0 мкм. Температурный оптимум роста – 28–30°С, pH 4,5–6,0. Аэробы.

Штамм P. canescens BKM F-4643D отличается от исходного штамма способностью к биосинтезу кислой протеазы и лейцинаминопептидазы при глубинном культивировании на жидких средах.

Штамм P. canescens BKM F-4668D отличается от исходного штамма способностью к биосинтезу грибной сериновой протеазы при глубинном культивировании на жидких средах.

Для получения комплексного ФП чистые культуры P. canescens BKM F-4643D и P. canescens BKM F-4668D выращивают на агаризированной среде следующего состава (мас.%): дрожжевой экстракт – 0,5; глюкоза – 1,0; дигидрофосфат калия – 1,0; агар-агар – 2,0; начальное значение рН 6,0–6,2 в течение 6–7 сут при температуре (29±1)°С.

При глубинном культивировании P. canescens BKM F-4643D используют следующие компоненты (мас.%): соевую шелуху – 4,5; кукурузный экстракт – 5,0; дигидрофосфат натрия – 2,5; начальное значение рН среды 4,0–4,2.

Питательную среду, содержащую соевую шелуху, кукурузный экстракт, дигидрофосфат натрия и воду, инокулируют штаммом P. canescens BKM F-4643D и выращивают в оптимальных для него условиях (температура 28-30°С; продолжительность 144 ч) при непрерывной аэрации.

Культивирование штамма P.canescens BKM F-4668D проводили в аналогичных условиях, но в состав ферментационной среды вводили 2% соевой муки для индукции синтеза сериновой протеазы.

После окончания выращивания штаммов-продуцентов КЖ отделяют от биомассы методом пресс-фильтрации. Концентрированные ФП получают из КЖ методом распылительной сушки стабилизированных ультраконцентратов с наполнителем. Комплексный ФП получают смешиванием полученных концентрированных ФП в соотношении 1:1.

В предлагаемом изобретении для определения активности пенициллопепсина в ФП использован аналитический метод определения гемоглобиновых единиц в тирозиновом эквиваленте (HUT), основанный на ферментативном гидролизе гемоглобина в течение 30 мин при рН 4,7 и 40°С, с последующим осаждением непрогидролизованного субстрата трихлоруксусной кислотой и определением в фильтрате количества растворенного гемоглобина спектрофотометрически. За единицу протеолитической активности принимается такое количество гидролизата, которое при абсорбции на 275 нм равно 1,10 мкг/мл тирозина в 0,006Н растворе HCl [42].

Для определения активности лейцинаминопептидазы использовали метод, который основан на действии аминопептидазы на субстрат L-лейцин-пара(4)-нитроанилид с высвобождением пара-нитроанилина, окрашенного в желтый цвет вещества [43].

Для определения активности щелочной сериновой протеазы в ФП использовали метод ФОЛП, который основан на способности ФП катализировать расщепление белка до пептидов и аминокислот и выражается числом единиц протеазы в 1 г (мл) препарата. За единицу протеолитической активности принято такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г белка (казеина) в строго определенных стандартных условиях: температура 40°С, концентрация водородных ионов (рН) 10,5 и время гидролиза 1 ч [44].

Метод определения ксиланазной и β-глюканазной активностей основан на измерении скорости образования восстанавливающих сахаров (ВС) методом Шомоди-Нельсона при гидролизе полисахаридных субстратов (ксилана из древесины березы и β-глюкана ячменя, соответственно). За единицу активности принимается такое количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль ВС в минуту при рН 5.0 и 50ºC [45].

Получаемый ФП содержит комплекс ферментов (грибные протеазы: кислая аспартатная, сериновая, лейцинаминопептидаз; эндо-1,4-β-ксиланазу, эндо-1,4-β-глюканазу и комплекс сопутствующих карбогидраз: β-галактозидазу, α-L-арабинофуранозидазу, арабиноксилан арабинофураногидролазу, α-галактозидазы А и С), эффективно воздействующий на белки, а также на НКП, в широком диапазоне рН 3,0–7,0.

Преимуществом нового комплексного ФП является синергетический эффект воздействия специфичных ферментов, входящих в его состав, на основные полимеры зернового и бобового сырья в кормовых рационах, что позволит существенно повысить усвояемость и энергетическую ценность кормов за счет снижения вязкости перевариваемой массы и повышения доступности питательных компонентов для действия пищеварительных ферментов, устранит антипитательное воздействие основных соевых белков, будет способствовать нормализации микрофлоры кишечника.

Применение нового комплексного ФП существенно повысит рентабельность применения комплексных препаратов в кормопроизводстве за счет снижения себестоимости ФП, получаемого на основе родственных штаммов, культивируемых по единой технологической схеме и обеспечивающих получение препарата с оптимальным сочетанием основных ферментов протеолитического и гемицеллюлолитического комплекса.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Культивирование штамма P. canescens BKM F-4643D в ферментере объемом 10 м³, оснащенном барботерами для подачи воздуха в аппарат и турбинной мешалкой. Получение инокулята и культивирование проводят на ферментационной среде следующего состава (мас.%): соевая шелуха – 4,5, кукурузный экстракт – 5,0, KH₂PO₄ – 2,5. В качестве пеногасителя перед стерилизацией вносят 0,1% Лапрола. Ферментер засевают 10% вегетативного посевного материала, выращенного в инокуляторе объемом 1 м³ при 28–30ºС в течение 25 ч. Температура культивирования – 28±0,2°C; рН естественный (4,0–4,2 в начале ферментации, 6,0–6,1 в конце ферментации). Через каждые 24 ч отбирают пробы КЖ и после удаления биомассы определяют активности целевых ферментов.

В КЖ на 144 ч роста максимальная активность пенициллопепсина составляет 12000 HUT/мл, лейцинаминопептидазы 30 LAPU/мл, активность ксиланазы – 120 ед/мл, активность β-глюканазы – 54 ед/мл.

Штамм P. canescens BKM F-4668D культивируют аналогичным образом, но в ферментационную среду вносят 2% соевой муки для индукции биосинтеза сериновой протеазы. В КЖ на 144 ч роста максимальная активность сериновой протеазы составляет 820 ед/мл, активность ксиланазы – 180 ед/мл, активность β-глюканазы – 55 ед/мл.

Пример 2. Из КЖ штаммов, полученных в соответствии с примером 1, получают концентрированные комплексные ФП методом распылительной сушки стабилизированного ультраконцентрата с наполнителем. В качестве стабилизатора используют хлорид натрия, в качестве наполнителя – крахмал. Мультиэнзимную композицию (МЭК) получают путем смешивания двух ФП в соотношении 1:1. Характеристики полученных комплексных ФП представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Характеристика ФП, полученных на основе штаммов P. canescens BKM F-4643D и BKM F-4668D

ФП	Белок, мг/мл(г)	ПС, HUT/мл(г) рН 4,7, 30°С	ФОЛП ед./мл(г) рН 10,5, 40°С	LAP, ед./мл(г) рН 6,0, 40°С	КсА, ед./мл(г) рН 5,0, 50°С		β-глюканаза ед./мл(г) рН 5,0, 50°С
КЖ P.canescens BKM F- 4643D	13,9	12 000	<0,1	30	120		54
Пенициллопепсин концентрированный ФП		75	73 000	<0,1	340	700	240
КЖ P.canescens BKM F- 4668D		12	н.о.	820	<0,1	180	55
Оризин концентрированный ФП		72	н.о.	3 500	<0,1	1000	250
Комплексный ФП МЭК		73	43 000	1 800	170	860	245

Пример 3. Эффективность МЭК, полученной в соответствии с примером 2, оценивают при гидролизе зернобобовой кормовой смеси в сравнении с препаратом Ronozyme ProAct (DSM, Польша). Гидролиз смеси, содержащей ячмень (30%), пшеницу (35%), кукурузу (10%), соевую муку (20%) и подсолнечный жмых (5%), проводят в течение 3 ч при концентрации субстрата 33%, дозировке препаратов 1 мг ФП/г субстрата, при 40ºС, без постоянного перемешивания. Через 3 ч гидролиза полученные гидролизаты инкубируют при 90ºС в течение 10 мин для инактивации ферментов и центрифугируют при 10750 g в течение 5 мин. Эффективность гидролиза оценивают по содержанию общего растворимого белка и концентрации восстанавливающих сахаров (ВС) в полученных супернатантах (табл.2).

Таблица 2. Содержание общего растворимого белка и восстанавливающих сахаров после обработки зернобобовой кормовой смеси различными ФП

ФП	Белок, мг/ г	ВС, мг/г
Комплексный ФП - МЭК	32	51
Ronozyme ProAct	31	36
Контроль, без ФП	18	36

Применение МЭК, полученного из КЖ новых рекомбинантных штаммов P. canescens BKM F-4643D и BKM F-4668D, при обработке зернобобовой кормовой смеси в течение 3 ч обеспечивает увеличение растворимого белка и ВС по сравнению с контролем на 78% и 42%, соответственно.

За счет действия гемицеллюлаз эффективность новой МЭК при обработке зернобобовой кормовой смеси по выходу ВС превышает эффективность ФП Ronozyme ProAct на 42%, при равной степени гидролиза белка. Кроме данного преимущества - высокой гидролитической активности по НКП, МЭК по сравнению с Ronozyme ProAct является коммерчески более доступным ФП.

Пример 4. Проводят испытания in vivo по влиянию новой мультиэнзимной композиции, полученной в соответствии с примером 2, на продуктивность и физиологическое состояние свиней при откорме (ФГБНУ ВНИИТиН). Для опыта по принципу аналогов формируют 2 группы молодняка крупной белой породы со средней живой массой 55 кг (таблица 3). Все животные обеспечивают одинаковыми условиями содержания.

Таблица 3 – Схема откорма свиней

№№	Группа	Кол-во животных	Живая масса при постановке, кг	Продолжительность, кормодни	Условия кормления
1	Контрольная	10	55	90	Основной рацион
2	Опытная	10	55	90	Основной рацион +200 г/т МЭК

Основным рационом кормления животных является сухой комбикорм из смешанного сырья: ячмень (35%), пшеница (35%), горох (15%), подсолнечный жмых (12%), фосфат кормовой обесфторенный (1%), мел кормовой (0,8%). Кормление осуществляется два раза в сутки по принятому распорядку дня (потребление воды не ограничено).

В ходе опыта проводят наблюдения за поедаемостью кормов, поведением и физиологическим состоянием животных, изучают энергию роста подопытного молодняка, среднесуточные приросты и конверсию кормов. Для оценки качества получаемой свиноводческой продукции изучают показатели, характеризующие качество мяса и шпика, состояние внутренних органов.

При использовании МЭК в количестве 200 г/т среднесуточный прирост живой массы увеличивается на 56 г или 10,0%, что свидетельствует о лучшем усвоении корма у животных.

Показатели мясной продуктивности у свиней, получавших в рационе МЭК, выше по убойному выходу туш на 1,0%. Толщина шпика и площадь «мышечного глазка» соответствуют нормам беконного откорма свиней (требования ГОСТа Р 5322 – 2008 – Свиньи для убоя). Свинина опытной и контрольной групп имеет признаки свинины, отвечающие стандартам NOR по показателям рН, влагосвязывающей способности и интенсивности окраски мяса. Анализ химического состава мяса и шпика подопытных животных показывает высокую пищевую ценность. В мясе содержится 4,13% жира, 22,14% белка, в шпике 90,4% жира и 3,26% белка. Эти показатели отвечают товарным и вкусовым качествам мяса и характеризуют высокую энергетическую ценность шпика.

Таким образом, внесение МЭК в комбикорма повышает доступность и переваримость питательных веществ корма; способствует нормализации микрофлоры кишечника за счет снижения количества непереваренного белка; повышает продуктивность животных; улучшает экономических показатели, что открывает перспективу для широкого использования новых ФП в качестве новой кормовой добавки в животноводстве.

Предложенный способ позволяет получить комплексный ФП, содержащий комплекс грибных протеаз эндо- и экзодействия, ксиланазу, а также β-глюканазу. Это не только снижает стоимость производства ФП по сравнению с получением их в отдельности, но и повышает кормовую ценность рационов на основе зерновых и бобовых культур. Использование такого ФП в кормопроизводстве позволит повысить продуктивность животных, будет способствовать улучшению их физиологического состояния, сохранности поголовья, облегчит соблюдение санитарно-гигиенических норм их содержания.

Список литературы

1. Khattak F.M. Enzymes in poultry nutrition / F.M. Khattak, T.N. Pasha, Z. Hayat, A. Mahmud // J. Anim. Pl. Sci. – 2006. – V. 16(1-2). – P. 1-7.

2. Fischer M. Limiting factors for the enzymatic accessibility of soybean protein. Ph.D. Thesis. Wageningen University, The Netherlands, 2006.

3. Chotinski D. The use of enzymes to improve utizatuion of nutrient in poultry diets // Notes. – V. 429. – P. 435.

4. Bedford M.R. Exogenous enzymes in monogastric nutrition – their current value and future benefits / M.R. Bedford // Animal Feed Science and Technology. – 2000. – V. 86. – P. 1-13.

5. Bedford M.R. Enzymes in farm animal nutrition / M.R. Bedford, G.G. Partridge. – UK: CAB International, 2010. – 319 p.

6. Asmare B. Biotechnological Advances for Animal Nutrition and Feed Improvement / B. Asmare // World Journal of Agricultural Research. – 2014. – V. 2 (3). – P. 115-118.

7. Yang W.Z. Effects of an Enzyme Feed Additive on Extent of Digestion and Milk Production of Lactating Dairy Cows / W.Z. Yang, K.A. Beauchemin, L.M. Rode // J Dairy Sci. – 1999. – V. 82. – P. 391–403.

8. Titi H.H. Evaluation of Feeding a Fibrolytic Enzyme to Lactating Dairy Cows on Their Lactational Performance during Early Lactation / H.H. Titi // Asian-Aust. J. Anim. Sci. – 2003. – V. 16(5). – P. 677-684.

9. El-kady R.I. Effect of Exogenous Enzymes on the Growth Performance and Digestibility of Growing Buffalo Calves / R.I. El-kady, I.M. Awadalla, M.I. Mohamed, M. Fadel, H.H. Abd el-Rahman // Int. J. Agri. Biol. – 2006. – V. 8(3).

10. McDonald P., Edwards R.A., Greenhalgh J.F.D., Morgan C.A., Sinclair L.A., Wilkinson R.G. Animal Nutrition. – 7th ed. – Harlow: Prentice Hall/Pearson, 2011. – 712 p.

11. Kalmendal R., Tauson R. Effects of a xylanase and protease, individually or in combination, and an ionophore coccidiostat on performance, nutrient utilization, and intestinal morphology in broiler chickens fed a wheat-soybean meal-based diet // Poult. Sci. – 2012. – V. 91. – P.1387-1393.

12. O’Shea, C. J., P. O. Mc Alpine, P. Solan, T. Curran, P. F. Varley, A. M. Walsh, J. V. O. Doherty. The effect of protease and xylanase enzymes on growth performance, nutrient digestibility, and manure odour in grower–finisher pigs // Animal Feed Science and Technology. – 2014. – V.189. – P. 88-97.

13. Rada V., Foltyn M., Lichovníková M., & Musilová A. Effects of protease supplementation of low protein broiler diets on growth parameters and carcass characteristic // MENDELNET. – 2013. – P. 268-272.

14. Peisker M. Manufacturing of soy protein concentrate for animal nutrition. In: Brufau J. (ed.). Feed manufacturing in the Mediterranean region. Improving safety: From feed to food. – Zaragoza: CIHEAM, 2001. – P. 103-107.

15. M. Barać, S. Stanojević, S. Jovanović and M. Pešić: Soy protein modification – A REVIEW. // Acta Periodica Technologica (APTEFF). 2004. – V. 35. – P. 3-16.

16. Smith A. Using proteases in broiler diets - careful selection is key // International Poultry Production. – 2011. – V.19(7). – P. 15-17.

17. Raji Rahulan, Kiran S. Dhar, K. Madhavan Nampoothiri, Ashok Pandey. Characterization of leucine amino peptidase from Streptomyces gedanensis and its applications for protein hydrolysis // Process Biochemistry. 2012. – V. 47. – P. 234–242.

18. Shie-Jea Lin, Li-Lin Chen, Chiou-Yen Wen and Wen-Shen Chu. Extracellular leucine aminopeptidase produced by Aspergillus oryzae LL1 and LL2 // African Journal of Microbiology. – 2010. – V. 4(3). – P. 158-168.

19. R. Raksakulthai and N.F. Haard, Exopeptidases and their application to reduce bitterness in food: a review // Food Science and Nutrition. – 2003. – V. 43(4). – P. 401–445.

20. Source Book of Enzymes / J.S. White D.C. White. – Inc, United States: Taylor Francis, 1997. – 1328 p.

21. Morya V. K., Yadav S., Kim E. K. & Yadav D. In silico characterization of alkaline proteases from different species of Aspergillus // Appl. Biochem. Biotechnol. – 2012. – V. 166. – P. 243–257.

22. Asmare B. Effect of common feed enzymes on nutrient utilization of monogastric animals / B. Asmare // IJBMBR. – 2014. – V. 5(4). – P. 27-34.

23. Choct M. Enzymes for the feed industry: past, present and future / M. Choct // World’s Poultry Science Journal. – 2006. – V. 62. – P. 5-16.

24. Alam M.J. Effect of Exogenous Enzyme in Diet on Broiler Performance / M.J. Alam, M.A.R. Howlider, M.A.H. Pramanik, M.A. Haque // International Journal of Poultry Science. – 2003. – V. 2 (2). – P. 168-173.

25. «Инструкция по применению Авизим 1202 для повышения переваримости питательных веществ в рационах на основе ячменя и овса (не более 30%), пшеницы, тритикале и ржи для сельскохозяйственной птицы всех возрастов и технологических групп». Регистрационный номер ПВИ-2-1,5/01708.

26. Du Plessis, Raymond Edrich; Van Rensburg, Jansen Carbohydrase and protease supplementation increased performance of broilers fed maize-soybean-based diets with restricted metabolizable energy content // South African Journal of Animal Science. – 2014. – V. 44 (3). – P. 262 – 270.

27. European Food Safety Authority (EFSA). Scientific Opinion on the safety and efficacy of Avizyme 1505 (endo-1,4- beta-xylanase, subtilisin and alpha-amylase) as feed additive for laying hens // EFSA Journal. – 2011. – V. 9(1). – P. 1949 – 1961.

28. Garcia-Rusiz, A.I. et al. Effect of protein source and enzyme supplementation on ileal protein digestibility and fattening performance in rabbits // Spanish Journal of Agricultural Research. – 2006. – V. 4(4). – P. 297-303.

29. Menezes-Blackburn D. and Greiner R. Enzymes Used in Animal Feed: Leading Technologies and Forthcoming Developments, in Functional Polymers in Food Science: From Technology to Biology / Eds G. Cirillo, U. G. Spizzirri and F. Iemma. – NJ: John Wiley & Sons Inc., 2015.

30. «Инструкция по применению Кемзайма W концентрированного сухого для повышения переваримости питательных веществ в рационах свиней и сельскохозяйственных птиц». Рег. номер: ПВИ-2-3.3/01536.

31. «Инструкция по применению Нутрикема сухого для повышения переваримости питательных веществ в рационах свиней и птиц на основе пшеницы, ячменя, шротов и жмыхов». Рег. номер: ПВИ -2-3.6/01872.

32. «Инструкция по применению кормовой добавки Фидбест VGPro для повышения переваримости и усвояемости питательных веществ в рационах сельскохозяйственных птиц с повышенным уровнем жмыхов и шротов масличных культур и семян зернобобовых культур». Рег. номер: ПВР-2-5.16/03280.

33. Souza P.M., Assis Bittencourt M.L., Caprara C.C., Freitas M., Almeida R.P.C., Silveira D., Fonseca Y.M., Filho E.X.F., Junior A.P., Magalhães P.O. A biotechnology perspective of fungal proteases // Brazilian Journal of Microbiology. – 2015. – V. 46. №2. – P. 337-346.

34. Singh S., Singh S., Bali V., Sharma L., Mangla J. Production of Fungal Amylases Using Cheap, Readily Available Agriresidues, for Potential Application in Textile Industry // BioMed Research International. – 2014. – V. 2014. – P. 1-9.

35. Acid fungal protease enzyme preparation derived from Trichoderma reesei. Expressing the acid fungal protease gene from T. reesei. Is generally recognized as safe for use in food processing notification. Submitted by Genencor, a Danisco Division. March 26, 2010.

36. Патент США. 2009. №7563607.

37. Патент США. 2012. №8288517.

38. Michael Merz, Thomas Eisele, Pieter Berends, Daniel Appel, Swen Rabe, Imre Blank, Timo Stressler, and Lutz Fischer. Flavourzyme, an Enzyme Preparation with Industrial Relevance: Automated Nine-Step Purification and Partial Characterization of Eight Enzymes // Journal of Agricultural and Food Chemistry. – 2015. – V. 63 (23). – P. 5682-5693.

39. Y.S. Ma, L.T. Wang, X.H. Sun, B.C. Ma, J.W. Zhang, F.Q. Gao C.L. Liu, "Study on Hydrolysis Conditions of Flavourzyme in Soybean Polypeptide Alcalase Hydrolysate", Advanced Materials Research. – 2013. – V. 652-654. – P. 435-438.

40. Ïàòåíò ÐÔ. 2005. ¹2277777.

41. Ïàòåíò ÐÔ. 2008. ¹2315097.

42. Proteolytic activity, fungal (HUT), FOOD CHEMICALS CODEX. 4^th Ed., National Academy Press, 1996, P.812-813.

43. SIGMA QUALITY CONTROL TEST PROCEDURE. Enzymatic Assay of LEUCINE AMINOPEPTIDASE, MICROSOMAL (EC 3.4.11.2).

44. ГОСТ 20264.2-88. Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности. С.8–10.

45. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.А. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. – М.: МГУ, 1995. – 144 с.

Claims (4)

1. Штамм мицелиального гриба Penicillium canescens ВКМ F-4643-D-продуцент комплексного ферментного препарата, включающего кислую протеазу, лейцинаминопептидазу, эндо-ксиланазу и β-глюканазу.

2. Штамм мицелиального гриба Penicillium canescens ВКМ F-4668-D-продуцент комплексного ферментного препарата, включающего сериновую протеазу, эндо-ксиланазу и β-глюканазу.

3. Способ получения комплексного ферментного препарата, обладающего активностью кислой протеазы, лейцинаминопептидазы, сериновой протеазы, эндо-ксиланазы и β-глюканазы, включающий культивирование штаммов Penicillium canescens ВКМ F-4643D и Penicillium canescens ВКМ F-4668D на питательных средах, отделение культуральной жидкости от биомассы методом пресс-фильтрации, получение стабилизированного ультраконцентрата с наполнителем, где в качестве стабилизатора используют хлорид натрия, а в качестве наполнителя - крахмал, концентрирование методом распылительной сушки и смешивание полученных ферментных препаратов в соотношении 1:1.

4. Способ повышения питательной ценности кормовых рационов, заключающийся в обработке кормов на основе смешанного зернобобового сырья ферментным препаратом, полученным способом по п. 3.