RU2288267C2 - Способ получения кормового комплексного ферментного препарата (варианты) и штамм penicillium canescens (варианты) - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Кормовой комплексный ферментный препарат с эндо-1,4-β-глюканазной, β-глюканазной, эндо-1,4-β-ксиланазной, фитазной, пектин-лиазной и α-галактозидазной активностью получают при совместном культивировании мультикопийных штаммов гриба Penicillium canescens BKM F-3868 D и ВКМ F-3869 D. Ферментный препарат с эндо-1,4-β-глюканазной, β-глюканазной, эндо-1,4-β-ксиланазной, фитазной, пектин-лиазной активностью получают при совместном культивировании мультикопийных штаммов гриба Penicillium canescens BKM F-3868 D и ВКМ F-3870 D. Для получения ферментного препарата с эндо-1,4-β-глюканазной, β-глюканазной, эндо-1,4-β-ксиланазной активностями культивируют штамм Penicillium canescens BKM F-3868 D, а для получения ферментного препарата с фитазной, пектин-лиазной и α-галактозидазной активностями культивируют штамм Penicillium canescens ВКМ F-3869 D. Ферментный препарат с фитазной и пектин-лиазной активностями получают культивированием штамма Penicillium canescens BKM F-3870 D. Заявленное изобретение позволяет расширить ассортимент ферментных препаратов. 11 н.п. ф-лы, 3 ил.

Description

Изобретение в области биотехнологии относится к микробиологической промышленности и представляет собой способ получения комплексного кормового ферментного препарата с эндо-1,4-β-глюканазной, 1,3/1,4-β-глюканазной, эндо-1,4-β-ксиланазной, фитазной, пектин-лиазной и α-галактозидазной активностью при совместном культивировании двух мультикопийных штаммов гриба Penicillium canescens.

В современном производстве кормов в качестве необходимых кормовых добавок широко применяются ферментные препараты. Ведущая роль принадлежит ферментам, расщепляющим полимерные и другие биоструктуры растительных клеток, которые составляют основу кормовой массы.

Одним из основных некрахмальных полисахаридов, являющихся компонентом растительной клеточной стенки является целлюлоза, которая расщепляется эндо-1,4-β-глюканазой (целлюлазой). В результате действия фермента эндо-1,4-β-глюканазы на клеточную стенку зерна злаковых (пшеницы, ржи, овча, ячменя, кукурузы) улучшается доступ пищеварительных ферментов сельскохозяйственных животных к основным питательным компонентам корма - крахмалу и белкам. Кроме того, этот фермент обладает эндо-1,3/1,4-β-глюканазной (1,3/1,4-β-глюканазной) активностью и гидролизует β-глюкан клеточной стенки зерна злаковых, за счет чего также улучшается доступ пищеварительных ферментов животных к питательным компонентам корма - вследствие уменьшения вязкости кормовой массы, так как облегчается ее прохождение через желудочно-кишечный тракт животных. Кроме того, эндо-1,4-β-глюканазы применяются в текстильной промышленности для обработки поверхности хлопчато-бумажных изделий.

Ксилан является основным компонентом гемицеллюлоз, входящих в состав растительной клеточной стенки зерна злаковых. Роль эндо-1,4-β-ксиланазы как кормовой добавки заключается в гидролизе ксилана, что также улучшает доступ пищеварительных ферментов к питательным компонентам, уменьшает вязкость корма и облегчает его прохождение через желудочно-кишечный тракт. Кроме того, ксиланазы находят применение в целлюлозно-бумажной промышленности в процессах отбеливания целлюлозы.

Фосфор в зерне как злаковых, так и бобовых растений (сои, гороха, люпина и др.), используемых в кормах, находится в связанном, трудно усвояемом сельскохозяйственными животными состоянии, в виде фитина. Роль фитазы, как кормовой добавки, заключается в гидролизе фитина с образованием фосфата и мио-инозитола и, тем самым, - в обогащении корма легко усвояемым сельскохозяйственными животными фосфатом. Гидролиз фитина также приводит к улучшению усвоения животными кальция, железа, марганца, магния и других металлов, катионы которых образуют нерастворимые соединения с фитином.

Пектин является одним из основных некрахмальных полисахаридов зерна бобовых (используемых в кормах животных в качестве источника белка), затрудняющих доступ пищеварительных ферментов к питательным компонентам корма. Роль пектин-лиазы (пектиназы) как кормовой добавки заключается в улучшении доступа пищеварительных ферментов к белковым компонентам корма и увеличении их усвояемости в пищеварительном тракте животных. Кроме того, пектин-лиазы (пектиназы) находят применение в пищевой промышленности для увеличения выхода фруктовых соков и экстрактивных веществ, в осветлении и стабилизации соков и вин.

Для бобовых характерно высокое содержание галактозосодержащих олигосахаридов (стахиозы, раффинозы и др.). Сельскохозяйственные животные не имеют собственной α-галактозидазы и не способны гидролизовать олигосахариды до моносахаридов - галактозосодержащие олигосахариды сбраживаются микрофлорой желудочно-кишечного тракта животных с образованием газообразных продуктов. Это может приводить к нежелательным при кормлении и содержании сельскохозяйственных животных последствиям. Роль α-галактозидазы как кормовой добавки заключается в гидролизе галактозосодержащих олигосахаридов, улучшении их усвояемости и улучшении качества корма.

Для получения указанных ферментов в промышленности используются микробные и грибные продуценты различной видовой принадлежности. Например, для получения эндо-1,4-β-глюканазы используют штаммы Trichoderma reesei и Humicola insolens. Для получения ксиланазы используют штаммы Tr.reesei, Hum.insolens и Thermoascus aurantiacus. Препараты с фитазной активностью получают при использовании грибных штаммов Aspergillus niger, Asp.ficuum и Tr.reesei. При культивировании каждого продуцента используется свой технологический цикл, включающий индивидуальную питательную среду, температурный режим и продолжительность ферментации. Получение комплексного ферментного препарата требует операции смешивания отдельно полученных препаратов с указанными активностями, что усложняет и удорожает конечный продукт. В этой связи возникает задача производства комплексного ферментного препарата с целлюлазной, β-глюканазной, ксиланазной, фитазной, пектиназной и α-галактозидазной активностью при совместном выращивании нескольких штаммов в процессе единого технологического цикла.

Описан способ получения ферментного комплекса, содержащего фитазу, целлюлазу (КМЦ-азу) и ксиланазу, путем культивирования Streptomyces cuspidosporus на среде, содержащей пшеничные отруби и ксилан. Активности фитазы, целлюлазы и ксиланазы составляют 0,43; 0,74 и 105 ед/мл, соответственно [World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2000, 16:(3) 257-263]. Имеются сведения о получении комплексных ферментных препаратов, обладающих целлюлолитической и глюкоамилазной активностями, при совместном культивировании гриба Tr.longibrachiatum и дрожжей Endomycopsis fibuligera [Микробиология, т.55, в.3, 407-412, 1986]. Описан способ получения комплекса целлюлолитических ферментов, содержащего целлобиазу, пектиназу и ксиланазу, путем совместного культивирования грибов Tr.viride и Asp.foetidus [Патент RU 2018534, 1994]. Общим недостатком перечисленных способов являются низкие значения ферментных активностей, получаемых в конечном продукте, так как гены, контролирующие целевые белки, находятся под различным регуляторным контролем, в связи с чем подбор питательной среды и технологических условий, оптимальных для совместной ферментации различных штаммов, является практически неразрешимой задачей. Тем не менее, проблема получения комплексного ферментного препарата при совместном выращивании двух грибных штаммов может быть решена, если использовать в качестве продуцента базовый грибной организм, в котором для синтеза нескольких секретируемых ферментов был использован единый регуляторный механизм.

Задачей заявляемой группы изобретений является разработка способа получения комплексного ферментного препарата с высокой активностью эндо-1,4-β-глюканазы (1,3/1,4-β-глюканазы), эндо-1,4-β-ксиланазы, фитазы, пектин-лиазы и α-галактозидазы при совместном культивировании двух мультикопийных штаммов гриба Penicillium canescens. В одном из этих двух штаммов амплифицирован гетерологичный ген эндо-1,4-β-глюканазы, обладающей 1,3/1,4-β-глюканазной активностью (Eg3, 12 семьи гликозил-гидролаз), который находится под контролем ксиланазного промотора (pxylA), и умножены копии гомологичного гена эндо-1,4-β-ксиланазы (xylA, 10 семьи гликозил-гидролаз), в результате чего регуляция активности умноженных копий гена эндо-1,4-β-глюканазы (обладающей 1,3/1,4-β-глюканазной активностью) и гена эндо-1,4-β-ксиланазы осуществляется по механизму регуляции сильного промотора гомологичного гена ксиланазы. В другом штамме амплифицированы гомологичные гены фитазы (phyA), пектин-лиазы (pelA) и α-галактозидазы (aglA), которые находятся под контролем промотора гомологичного гена β-галактозидазы (pbgaS), в результате чего регуляция активности умноженных копий генов фитазы, пектин-лиазы и α-галактозидазы осуществляется по механизму регуляции сильного промотора гомологичного гена β-галактозидазы. Общим в регуляции этих генов (ксиланазы и β-галактозидазы) является природа активатора, которым является пятичленный сахар арабиноза - продукт расщепления пектина свекловичного жома, арабиноксилана злаковых или других природных арабинозосодержащих субстратов.

В последнее десятилетие получили широкое распространение промышленные мультикопийные грибные суперпродуценты ферментов, у которых амплификация генов, кодирующих секретируемые ферменты, позволила резко увеличить продуктивность штаммов. К известным мультикопийным продуцентам эндо-1,4-β-глюканаз относятся штаммы на основе Tr.longibrachiatum [Clarkson et al. 1995, US Patent 5419778], Tr.reesei [Saloheimo et al., 1994, WO Patent 94/28117] и Hum.insolens [Rasmussen et al., 1991, Patent WO 91/17243]. Известны различные грибные мультикопийные продуценты ксиланаз - Asp.niger [van den Broek et al., 1994, US Patent 5358864], Tr.reesei [Nevalainen et al., 1994, US Patent 5298405], Therm.auranticus [Yu et al., 1990, US Patent 4966850], Hum.insolens [Schulein et al., 1997, US Patent 5610048]. Среди продуцентов фитаз имеются мультикопийные продуценты Tr.reesei [Barendse et al., 1998, Patent WO 98/55599], и грибов рода Aspergillus [van Gorcom et al., 1990, EP 0420358 A1].

Мицелиальный гриб Penicillium canescens (ВКПМ F178) при росте на среде со свекловичным жомом, используемым в качестве источника углеводов (или на средах другого полисахаридного состава), секретирует ряд ферментов карбогидролаз, среди которых в наибольших количествах представлены β-галактозидаза и ксиланаза. Недавно природный штамм Pen. canescens был адаптирован к технологии рекомбинантных ДНК и использован для создания мультикопийных суперпродуцентов β-галактозидазы (Pen.canescens ВКПМ F725) и ксиланазы (Pen.canescens ВКПМ F832) с увеличенной продуктивностью в 7-10 раз по отношению к исходному штамму Pen.canescens F178 [И.В.Николаев, О.Б.Беккер, В.А.Серебряный, А.М.Чулкин, Ю.П.Винецкий. 1999. Биотехнология, №3, стр.3-13; В.А.Серебряный Е.А.Вавилова, А.М.Чулкин, Ю.П.Винецкий. Прикл. биохимия, микробиол., 2002, т.38, №5, стр.495-501]. Для биотехнологии гриб Pen.canescens весьма привлекателен как базовый организм, так как сильные промоторы генов β-галактозидазы и ксиланазы, регуляторные белки и другие компоненты регуляции активности этих генов могут быть использованы при создании промышленных продуцентов других секретируемых ферментов с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Преимуществом использования штамма Pen.canescens как базового организма для продукции нескольких секретируемых ферментов является использование однотипной среды и унифицированного ферментационного процесса. В этой связи возникает возможность получения штаммов Pen.canescens, одновременно продуцирующих два или больше секретируемых фермента путем введения в единый реципиентный штамм соответствующего числа генов этих ферментов под контролем сильных промоторов генов β-галактозидазы и ксиланазы. Недавно было показано, что в штаммах Pen.canescens с амплифицированным геном ксиланазы синтез β-галактозидазы уменьшается, в то время как в штаммах Pen.canescens с умноженным геном β-галактозидазы синтез ксиланазы остается неизменным. Механизм этого явления зависит от взаимодействия специфических трансактиваторов генов β-галактозидазы и ксиланазы, при котором активатор гена β-галактозидазы активен и, соответственно, титруется множественными промоторами амплифицированного гена ксиланазы, а активатор гена ксиланазы в отношении промотора гена β-галактозидазы неактивен [Вавилова Е.А., Винецкий Ю.П. Прикл. биохимия и микробиология 2003, т.39., №2, стр.147-151]. С учетом этого обстоятельства для получения комплексного препарата с эндо-1,4-β-глюканазой, ксиланазной, фитазной, пектин-лиазной и α-галактозидазной активностью для совместного культивирования возможно использовать два штамма Pen.canescens, в одном из которых амплифицированные структурные части генов эндо-1,4-β-глюканазы и эндо-1,4-β-ксиланазы находятся под контролем промотора гена ксиланазы, а в другом - амплифицированные структурные части гомологичных генов фитазы и пектин-лиазы, либо фитазы, пектин-лиазы и α-галактозидазы находятся под контролем промотора гомологичного гена β-галактозидазы.

Разработку способа получения комплексного ферментного препарата, обладающего эндо-1,4-β-глюканазной (1,3/1,4-β-глюканазной активностью), эндо-1,4-β-ксиланазной, фитазной, пектин-лиазной и α-галактозидазной активностью при совместном культивировании двух мультикопийных штаммов гриба Pen.canescens осуществляют путем выполнения нескольких этапов.

Этап 1. Путем клонирования в фаговом векторе выделяют фрагмент ДНК Pen.canescens, кодирующий ген секретируемой фитазы с полной регуляторной областью. Включают этот фрагмент ДНК в структуру векторной молекулы. Получают экспрессионную плазмиду pPrPHY, в которой нуклеотидная последовательность структурного гена фитазы Pen.canescens совмещена с нуклеотидной последовательностью, кодирующей промоторную область и сигнальный пептид гена β-галактозидазы Pen.canescens. Экспрессионной плазмидой pPrPHY с включенным геном фитазы проводят трансформацию штамма-реципиента Pen. canescens PCA(niaD-), осуществляют отбор трансформантов, секретирующих в культуральную жидкость фитазную активность, и проводят ферментацию отобранных трансформантов на среде со свекловичным жомом и пептоном. Среди них отбирают наиболее продуктивный штамм-продуцент фитазы Pen.canescens PHY.

Этап 2. Путем клонирования в фаговом векторе выделяют фрагмент ДНК Pen.canescens, кодирующий ген секретируемой пектин-лиазы с полной регуляторной областью. Далее, как на этапе 1, получают экспрессионную плазмиду pPrPEL, в которой нуклеотидная последовательность структурного гена пектин-лиазы Pen.canescens совмещена с нуклеотидной последовательностью, кодирующей промоторную область и сигнальный пептид гена β-галактозидазы Pen.canescens, проводят трансформацию штамма-реципиента Pen.canescens PCA (niaD-). Проводят ферментацию отобранных трансформантов на среде со свекловичным жомом и пептоном и среди них отбирают наиболее продуктивный штамм-продуцент пектин-лиазы Pen.canescens PEC.

Этап 3. Выделяют фрагмент ДНК Pen.canescens, кодирующий ген секретируемой α-галактозидазы с полной регуляторной областью. Далее, как на этапе 1, получают экспрессионную плазмиду pPrα-GAL, в которой нуклеотидная последовательность структурного гена α-галактозидазы Pen.canescens совмещена с нуклеотидной последовательностью, кодирующей промоторную область и сигнальный пептид гена β-галактозидазы Pen.canescens, и проводят трансформацию штамма-реципиента Pen.canescens PCA (niaD-). Проводят ферментацию отобранных трансформантов на среде со свекловичным жомом и пептоном и среди них отбирают наиболее продуктивный штамм-продуцент α-галактозидазы Pen.canescens AGL.

Этап 4. Получают мультикопийный штамм Pen.canescens - продуцент эндо-1,4-β-глюканазы (обладающей 1,3/1,4-β-глюканазной активностью) и эндо-1,4-β-ксиланазы. Для этой цели используют штамм Pen.canescens R1103 - продуцент эндо-1,4-β-глюканазы Pemcillium verruculosum (Синицына О.А.; канд. дисс. М., 2002), содержащий мультикопийную экспрессионную плазмиду pPrXYL, в которой нуклеотидная последовательность структурного гена эндо-1,4-β-глюканазы Pen.verruculosum совмещена с нуклеотидной последовательностью, кодирующей промоторную область и сигнальный пептид гена эндо-1,4-β-ксиланазы Pen. canescens. Штамм Pen.canescens R1103, секретирующий эндо-1,4-β-глюканазу, обрабатывают мутагеном и получают его (niaD-) мутант, который используют для последующей котрансформации плазмидой pPCXYLA с клонированным гомологичным геном эндо-1,4-β-ксиланазы Pen.canescens, получают серию штаммов Pen.canescens EgX с амплифицированными гомологичными генами эндо-1,4-β-ксиланазы и амплифицированными копиями гетерологичного гена эндо-1,4-β-глюканазы Pen.verruculosum под контролем промотора гена ксиланазы Pen.canescens. Проводят ферментацию отобранных трансформантов на среде со свекловичным жомом и пептоном и среди них отбирают наиболее продуктивные штаммы серии Pen.canescens - продуценты эндоглюканазы (β-глюканазы) и ксиланазы EgX.

Этап 5. Получают мультикопийный штамм Pen.canescens - продуцент фитазы и дектин-лиазы. С помощью мутагенной обработки штамма-продуцента фитазы Pen.canescens PHY получают его мутант Pen.canescens PHY (niaD-). Экспрессионной плазмидой pPrPEL с включенным геном пектин-лиазы проводят трансформацию штамма-реципиента Pen.canescens PHY (niaD-) и осуществляют отбор трансформантов, секретирующих в культуральную жидкость одновременно фитазную и пектиназную активность. Проводят ферментацию отобранных трансформантов на среде со свекловичным жомом и пептоном и среди них отбирают наиболее продуктивные штаммы серии Pen.canescens - продуценты фитазы и пектин-лиазы PhPl.

Этап 6. Получают мультикопийный штамм Pen.canescens - продуцент фитазы, пектин-лиазы и α-галактозидазы. С помощью мутагенной обработки штамма-продуцента фитазы и пектин-лиазы Pen.canescens PhPl получают его мутант Pen.canescens PhPl (niaD-). Экспрессионной плазмидой pPrα-Gal с включенным геном α-галактозидазы проводят трансформацию штамма-реципиента Pen.canescens PhPl (niaD-) и осуществляют отбор трансформантов, секретирующих в культуральную жидкость одновременно фитазную, пектиназную и α-галактозидазную активность. Проводят ферментацию отобранных трансформантов на среде со свекловичным жомом и пептоном и среди них отбирают наиболее продуктивные штаммы серии Pen.canescens - продуценты фитазы, пектиназы и α-галактозидазы PhPlAgl.

Этап 7. Оптимизируют процесс совместной ферментации штамма Pen.canescens серии EgX и штамма Pen.canescens серии PhPl получают препарат культуральной жидкости с высокой активностью эндо-1,4-β-глюканазы (1,3/1,4-β-глюканазы), эндо-1,4-β-ксиланазы, фитазы и пектин-лиазы.

Этап 8. Оптимизируют процесс совместной ферментации штамма Pen.canescens серии EgX и штамма Pen.canescens серии PhPlAgl и получают препарат культуральной жидкости с высокой активностью эндо-1,4-β-глюканазы (1,3/1,4-β-глюканазы), эндо-1,4-β-ксиланазы, фитазы, пектин-лиазы и α-галактозидазы.

При определении активностей ферментов используют следующие методы.

Определение активности эндо-1,4-β-глюканазы (КМЦ-азы): 100 мкл 1% раствора Na-соли КМЦ в 0,1М ацетатного буфера смешивают с 60 мкл 0,1М ацетатного буфера и 40 мкл предварительно разбавленного раствора ферментного препарата (или культуральной жидкости), инкубируют 5 мин при 50°С, останавливают реакцию добавлением 200 мкл реактива Шомоди. Реакционную смесь инкубируют в течение 40 мин в кипящей водяной бане, охлаждают до комнатной температуры, добавляют 200 мкл реактива Нельсона, инкубируют 10 мин при комнатной температуре, добавляют 360 мкл ацетона и 1040 мкл воды и измеряют оптическую плотность раствора на длине волны 610 нм. Концентрацию восстанавливающих сахаров определяют исходя из калибровочного графика, полученного по глюкозе. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое вызывает при действии на КМЦ образование в условиях реакции 1 мкмоля восстанавливающих сахаров за 1 мин [А.П.Синицын, А.В.Гусаков, В.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлезных материалов. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1995].

Определение активности β-глюканазы: 100 мкл 1% раствора β-глюкана овса в воде смешивают с 60 мкл 0,1М ацетатного буфера и 40 мкл предварительно разбавленного раствора ферментного препарата (или культуральной жидкости), инкубируют 5 мин при 50°С, останавливают реакцию добавлением 200 мкл реактива Шомоди. Реакционную смесь инкубируют в течение 40 мин в кипящей водяной бане, охлаждают до комнатной температуры, добавляют 200 мкл реактива Нельсона, инкубируют 10 мин при комнатной температуре, добавляют 1400 мкл воды, центрифугируют и измеряют оптическую плотность раствора на длине волны 610 нм. Концентрацию восстанавливающих сахаров определяют исходя из калибровочного графика, полученного по глюкозе. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое вызывает при действии на β-глюкан образование в условиях реакции 1 мкмоля восстанавливающих сахаров за 1 мин [А.П.Синицын, А.В.Гусаков, В.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлезных материалов. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1995].

Определение активности ксиланазы: 100 мкл 1% раствора березового ксилана в воде смешивают с 60 мкл 0,1М ацетатного буфера и 40 мкл предварительно разбавленного раствора ферментного препарата (или культуральной жидкости), инкубируют 10 мин при 50°С, останавливают реакцию добавлением 200 мкл реактива Шомоди. Реакционную смесь инкубируют в течение 40 мин в кипящей водяной бане, охлаждают до комнатной температуры, добавляют 200 мкл реактива Нельсона, инкубируют 10 мин при комнатной температуре, добавляют 1400 мкл воды, центрифугируют и измеряют оптическую плотность раствора на длине волны 610 нм. Концентрацию восстанавливающих сахаров определяют исходя из калибровочного графика, полученного по глюкозе. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое вызывает при действии на ксилан образование в условиях реакции 1 мкмоля восстанавливающих сахаров за 1 мин [А.П.Синицын, А.В.Гусаков, В.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлезных материалов. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1995].

Определение активность фитазы: 300 мкл 1,4×10-3 М раствора Na-соли фитина в 0,25М ацетатном буфере смешивают с 33 мкл предварительно разбавленного раствора ферментного препарата (или культуральной жидкости), инкубируют 30 мин при 40°С, останавливают реакцию добавлением 10% раствора трихлоруксусной кислоты, добавляют к реакционной смеси 667 мкл свежеприготовленного реагента на фосфат-анион (реагент готовят следующим образом - 3,66 г FeSO₄·7H₂O растворяют в 50 мл раствора молибдата аммония (раствор молибдата аммония готовят растворением 2,5 г молибдата аммония в 8 мл серной кислоты с последующим доведением до 250 мл водой)), инкубируют 30 мин при комнатной температуре и измеряют оптическую плотность раствора на длине волны 750 нм. Концентрацию фосфат-аниона определяют исходя из калибровочного графика, полученного по KH₂PO₄. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое вызывает при действии на фитин образование в условиях реакции 1 мкмоля фосфат-аниона за 1 мин [A.J.Engelen, F.van der Heeft, P.H.Randsdorp, E.L.Smit, Journal of AOAC International, 1994, v.77, No.3, p.760-764].

Определение активности пектин-лиазы: к 0,9 мл 0,24% раствора цитрусового пектина (степень этерефикации 70%) в 0,05М ацетатном буфере, рН 5,0, добавляют 0,1 мл предварительно разбавленного ферментного препарата (культуральной жидкости) и инкубируют при 40° в течение 10 мин, останавливают реакцию добавлением 0,1 мл 1М HCl и измеряют оптическую плотность при 232 нм. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое при действии на пектин в условиях реакции образует 1 мкмоль 4,5-ненасыщенных продуктов реакции за 1 мин [V.M.Taragano, A.M.R.Pilsof Enz. Microbiol. Technol., 1999, v.25, No.3, p.414-420].

Определение активности α-галактозидазы: к 0,9 мл 1 мМ раствора п-НФ-а-Гал (п-нитрофенил-α-галактопиранозида) в 0,1М ацетатном буфере, рН 5,0, добавляют 0,1 мл предварительно разбавленного ферментного препарата (культуральной жидкости) и инкубируют при 40° в течение 10 мин, останавливают реакцию добавлением 0,5 мл 1М раствора Na₂CO₃ и измеряют оптическую плотность при длине волны 400 нм. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое при действии на п-НФ-а-Гал в условиях реакции образует 1 мкмоль п-нитрофенола за 1 мин [А.П.Синицын, А.В.Гусаков, В.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлезных материалов. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1995].

Кормовые ферментные препараты, получаемые с помощью предлагаемого способа, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, в виде жидких концентрированных препаратов, получаемых с помощью ультрафильтрации или упаривания культуральной жидкости, или в виде сухих препаратов, получаемых высушиванием или гранулированием.

Изобретение иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Выделение фрагмента ДНК Pen.canescens, кодирующий ген секретируемой фитазы с полной регуляторной областью путем клонирования в фаговом векторе и получение штамма Pen.canescens - продуцента фитазы.

Для клонирования гена фитазы используют геномный банк Pen.canescens F178 в фаговом векторе EMBL4, полученный ранее [И.В.Николаев, С.М.Епишин, Е.С.Захарова, С.В.Котенко, Ю.П.Винецкий. Молекулярная биология. 1992, т.26, №4, стр.869-875). Для селекции фагового клона с геном фитазы синтезируют радиоактивно-меченый PCR-фрагмент, используя в качестве матрицы ДНК штамма Pen.canescens F178. Для синтеза фрагмента используют олигонуклеотидные праймеры с последовательностью:

PPHYD1 5' CTG TTG ATG GCG GTT ATC AAT GC 3'

PPHYR1 5' GGC GAC ATT GCA TCA TCT CGA С 3'

Последовательность нуклеотидов в праймерах вычисляют на основе консервативных нуклеотидных последовательностей грибных фитаз, имеющихся в GenBank Database. Далее с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтезируют внутренний фрагмент ДНК гена фитазы размером 1 т.п.н. Этот фрагмент клонируют в плазмидном векторе pUC57 и используют для селекции фагового клона с геном фитазы. Для этой задачи проводят молекулярную гибридизацию на нейлоновых фильтрах с ³²Р-меченым ПЦР-фрагментом. Среди фаговых клонов, обнаруживавших позитивный сигнал с радиоактивным зондом, выделяют клон с геном фитазы в фрагменте ДНК размером 12 т.п.н. С помощью рестриктного анализа в выделенном фрагменте картируют ген фитазы. Для субклонирования гена фитазы используют бактериальный вектор - плазмиду pUC57, в которую вставляют фрагмент ДНК с геном фитазы и получают плазмиду pPHYA. Далее состыковывают нуклеотидную последовательность, кодирующую структурную часть гена фитазы Pen.canescens с нуклеотидной последовательностью, кодирующей промоторную область и сигнальный пептид гена β-галактозидазы Pen.canescens, и получают экспрессионную нуклеотидную последовательность (фиг.1). Эту последовательность включают в бактериальный вектор pUC19 и получают экспрессионную плазмиду pPrPHY, с помощью которой проводят котрансформацию штамма-реципиента Pen.canescens PCA (niaD-) плазмидами pSTA(niaD) (Серебряный В.А., Вавилова Е.А., Чулкин А.М., Винецкий Ю.П. Прикл. биохим. микробиол. 2002, т.38, №5, стр. 495-501) и плазмидой pSTA с маркерным геном niaD (Aleksenko A.Y., Makarova N.A., Nikolaev I.V., Clutterbuck A.J. 1995. Curr. Genet. V.28. P.474-478). Далее осуществляют отбор трансформантов, секретирующих фитазную активность.

Отобранные штаммы культивируют на круговой качалке (240 об/мин) при 30°С в колбах на средах со свекловичным жомом (30 г/л), пептоном (50 г/л) и КН₂PO₄ (25 г/л), рН 4,5 и отбирают штамм Pen.canescens PHY-215, который способен накапливать в культуральной жидкости за 120 часов ферментации 450-500 ед/мл фитазной активности.

Пример 2. Выделение фрагмента ДНК Pen.canescens, кодирующий ген секретируемой пектин-лиазы с полной регуляторной областью путем клонирования в фаговом векторе и получение штамма Pen.canescens - продуцента пектин-лиазы.

Выделение гена пектин-лиазы проводят, как это описано в примере 1, с использованием двух пар олигонуклеотидных праймеров PELT2/PELB1 и PELT2/PELB2 с последовательностью:

PELT2 5' CACTGGTGGYGGYRNTGCYACCCCYGTCTACCC 3'

PELB1 5' GTAGTGGTAGCCATCGCAGGTGGCGGAGTA 3'

PELB2 5' ACCGYTGACSATRCGSAGACCCYKGCCCTTGA 3'

Последовательность нуклеотидов в праймерах вычисляют на основе консервативных нуклеотидных последовательностей грибных пектин-лиаз, имеющихся в GenBank Database.

Среди фаговых клонов, обнаруживавших позитивный сигнал с радиоактивным зондом, выделяют клон с геном пектин-лиазы в фрагменте ДНК размером 14 т.п.н. С помощью рестриктного анализа в выделенном фрагменте картируют ген пектин-лиазы. Для субклонирования гена пектин-лиазы используют бактериальный вектор - плазмиду pUC57, в которую вставляют фрагмент ДНК с геном пектин-лиазы и получают плазмиду рРе13Н2. Далее состыковывают нуклеотидную последовательность, кодирующую структурную часть гена пектин-лиазы Pen.canescens с нуклеотидной последовательностью, кодирующей промоторную область и сигнальный пептид гена β-галактозидазы Pen.canescens и получают экспрессионную нуклеотидную последовательность (фиг.2). Эту последовательность включают в бактериальный вектор pUC57 и получают экспрессионную плазмиду pPrPEL, с помощью которой вместе с маркерной плазмидой плазмидами pSTA(niaD) проводят котрансформацию штамма-реципиента Pen.canescens PCA, как в примере 1, и осуществляют отбор трансформантов, секретирующих пектин-лиазную активность.

Отобранные штаммы культивируют на круговой качалке (240 об/мин) при 30°С в колбах на средах со свекловичным жомом (30 г/л), пептоном (50 г/л) и КН₂PO₄ (25 г/л), рН 4,5 и отбирают штамм Pen.canescens PEC-23, который способен накапливать в культуральной жидкости за 120 часов ферментации 200-250 ед/мл пектин-лиазной активности.

Пример 3. Выделение фрагмента ДНК Pen.canescens, кодирующий ген секретируемой α-галактозидазы с полной регуляторной областью путем клонирования в фаговом векторе и получение штамма Pen.canescens - продуцента α-галактозидазы.

Выделение гена α-галактозидазы проводят, как это описано в примере 1-2, с использованием двух пар олигонуклеотидных праймеров αGAL1/αGAL2 и с последовательностью:

αGAL1 5' CACTGGTGGYGGYRNTGCYACCCCYGTCTACCC 3'

αGAL2 5' GTAGTGGTAGCCATCGCAGGTGGCGGAGTA 3'

Последовательность нуклеотидов в праймерах вычисляют на основе консервативных нуклеотидных последовательностей грибных α-галактозидаз, имеющихся в GenBank Database.

Среди фаговых клонов, обнаруживавших позитивный сигнал с радиоактивным зондом, выделяют клон с геном α-галактозидазы в фрагменте ДНК размером 12 т.п.н. С помощью рестриктного анализа в выделенном фрагменте картируют нужный ген. Для субклонирования используют бактериальный вектор - плазмиду pUC57, в которую вставляют фрагмент ДНК с геном α-галактозидазы и получают плазмиду рРеl3Н2. Далее состыковывают нуклеотидную последовательность, кодирующую структурную часть гена α-галактозидазы Pen.canescens с нуклеотидной последовательностью, кодирующей промоторную область и сигнальный пептид гена β-галактозидазы Pen.canescens и получают экспрессионную нуклеотидную последовательность (фиг.3). Эту последовательность включают в бактериальный вектор pUC57 и получают экспрессионную плазмиду pPrα-GAL, с помощью которой вместе с маркерной плазмидой плазмидами pSTA(niaD) проводят котрансформацию штамма-реципиента Pen.canescens PCA, как в примере 1, и осуществляют отбор трансформантов, секретирующих α-галактозидазную активность.

Отобранные штаммы культивируют на круговой качалке (240 об/мин) при 30°С в колбах на средах со свекловичным жомом (30 г/л), пептоном (50 г/л) и КН₂PO₄ (25 г/л), рН 4,5 и отбирают штамм Pen.canescens AGL-3, который способен накапливать в культуральной жидкости за 120 часов ферментации 400-450 ед/мл α-галактозидазной активности.

Пример 4. Получение мультикопийных штаммов Pen.canescens серии EgX-продуцентов эндо-1,4-β-глюканазы, 1,3/1,4-β-глюканазы и эндо-1,4-β-ксиланазы.

Для решения задачи используют штамм Pen.canescens R1103 - мультикопийный продуцент эндо-1,4-β-глюканазы Pen.verroculosum, обладающей также 1,3/1,4-β-глюканазной активностью. Конидии этого штамма обрабатывают нитрозогуанидином до выживаемости порядка 1% и высевают на чашки с селективной средой, содержащей хлорат Na (0,45М) и NH₄CL (10 мМ). Хлорат-резистентные колонии тестируют на средах с NaNO₃ и гипоксантином (5 мМ) и отбирают мутанты с генотипом (niaD-) по отсутствию роста на чашках с NaNO₃. Затем отобранные мутанты культивируют на круговой качалке (240 об/мин) при 30°С в колбах на средах со свекловичным жомом (30 г/л), пептоном (50 г/л) и КН₂PO₄ (25 г/л), рН 4,5. По окончании ферментации культуральную жидкость отделяют от мицелия и твердых остатков среды центрифугированием (10000g, 15 мин), в супернатанте определяют активность эндоглюканазы и ксиланазы и выбирают штамм-реципиент Pen.canescens R1103-3 (niaD-), у которого мутагенная обработка не приводила к уменьшению продукции секретируемых ферментов. Далее путем котрансформации плазмидами pPCXYLA и pSTA(niaD), как в примере 1, в геном полученного реципиентного штамма Pen.canescens R1103-3 (niaD-) включают дополнительные копии гомологичного гена эндо-1,4-β-ксиланазы и создают серию штаммов Pen.canescens EgX с амплифицированными генами ксиланазы и эндоглюканазы под контролем механизма регуляции гена ксиланазы.

Отобранные штаммы культивируют на круговой качалке (240 об/мин) при 30°С в колбах на средах со свекловичным жомом (30 г/л), пептоном (50 г/л) и КН₂PO₄ (25 г/л), рН 4,5 и отбирают штамм Pen.canescens EgX-29, который способен накапливать в культуральной жидкости за 120 часов ферментации 150-200 ед/мл эндо-1,4-β-глюканазы (КМЦ-азы), 200-300 ед/мл β-глюканазы и 1200-1400 ед/мл эндо-1,4-β-ксиланазы.

Пример 5. Получение мультикопийных штаммов Pen.canescens серии PhPl - продуцентов фитазы и пектин-лиазы.

Для решения задачи конидии штамма Pen.canescens PHY-215 -мультикопийного продуцента фитазы обрабатывают нитрозогуанидином и проводят селекцию штамма Pen.canescens PHY-215-1 (niaD-) при условиях, как в примере 1. Далее проводят котрансформацию, как в примере 1, штамма Pen.canescens PHY-215-1 (niaD-) экспрессионной плазмидой рВGРА3 с геном пектин-лиазы под контролем промотора и сигнального пептида β-галактозидазы и маркерной плазмидой pSTA и получают трансформанты серии PhPl.

Отобранные трансформанты культивируют на круговой качалке (240 об/мин) при 30°С в колбах на средах со свекловичным жомом (30 г/л), пептоном (50 г/л) и КН₂PO₄ (25 г/л), рН 4,5 и отбирают штамм Pen.canescens PhPl-33, который способен накапливать в культуральной жидкости за 120 часов ферментации 190-200 ед/мл фитазной активности и 150-200 ед/мл активности пектин-лиазы.

Пример 6. Получение мультикопийных штаммов Pen.canescens серии PhPlAgl - продуцентов фитазы, пектин-лиазы и α-галактозитдазы.

Для решения задачи конидии штамма Pen.canescens PhPl-33 - мультикопийного продуцента фитазы и пектин-лиазы обрабатывают нитрозогуанидином и проводят селекцию штамма Pen.canescens PhPl-33-1 (niaD-) при условиях, как в примере 1. Далее проводят котрансформацию, как в примере 1, штамма Pen.canescens PhPl-33-1 экспрессионной плазмидой pPrα-GAL с геном α-галактозидазы под контролем промотора и сигнального пептида β-галактозидазы и получают трансформанты серии PhPlAgl.

Отобранные трансформанты культивируют на круговой качалке (240 об/мин) при 30°С в колбах на средах со свекловичным жомом (30 г/л), пептоном (50 г/л) и КН₂PO₄ (25 г/л), рН 4,5 и отбирают штамм Pen.canescens PhPlAgl-9, который способен накапливать в культуральной жидкости за 120 часов ферментации 250-300 ед/мл фитазной активности, 100-150 ед/мл активности пектин-лиазы и 300-350 ед/мл активности α-галактозидазы.

Пример 7. Совместная ферментация штамма Pen.canescens EgX-29 и штамма Pen.canescens PhPl-33 в качалочных колбах.

Способ осуществляют при разном соотношении посевного материала штаммов Pen.canescens EgX-29 и Pen.canescens PhPl-33. В качестве посевного материала используют конидии штаммов. В условиях одной ферментации вносят равное количество конидий штамма Pen.canescens EgX-29 и штамма Pen.canescens PhPl-33. В условиях другой ферментации вносят удвоенное количество конидий штамма Pen.canescens EgX-29 по отношению к количеству конидий штамма Pen.canescens PhPl-33, или же удвоенное количество конидий штамма Pen.canescens PhPl-33 по отношению к количеству конидий штамма Pen.canescens EgX-29. Ферментацию осуществляют на круговой качалке (240 об/мин) при 30°С в колбах на средах со свекловичным жомом (30 г/л), пептоном (50 г/л) и КН₂PO₄(25 г/л), рН 4,5.

При засеве равным количеством конидий штамма Pen.canescens Sb EgX-29 и штамма Pen.canescens PhPl-33 в культуральной жидкости за 120 часов ферментации накапливается 110 ед/мл эндо-1,4-β-глюканазной активности (КМЦ-азы), 160 ед/мл β-глюканазной активности, 720 ед/мл эндо-1,4-β-ксиланазной активности, 180 ед/мл фитазной активности и 130 ед/мл пектин-лиазной активности.

При засеве удвоенным количеством конидий штамма Pen.canescens EgX-29 по отношению к количеству конидий штамма Pen.canescens PhPl-33 в культуральной жидкости за 120 часов ферментации накапливается 130 ед/мл эндо-1,4-β-глюканазной активности (КМЦ-азы), 210 ед/мл β-глюканазной активности, 950 ед/мл эндо-1,4-β-ксиланазной активности, 120 ед/мл фитазной активности и 110 ед/мл пектин-лиазной активности.

При засеве удвоенным количеством конидий штамма Pen.canescens PhPl-33 по отношению к количеству конидий штамма Pen.canescens EgX-29 в культуральной жидкости за 120 часов ферментации накапливается 80 ед/мл эндо-1,4-β-глюканазной активности (КМЦ-азы), 150 ед/мл β-глюканазной активности, 550 ед/мл эндо-1,4-β-ксиланазной активности, 220 ед/мл фитазной активности и 180 ед/мл пектин-лиазной активности.

Пример 8. Совместная ферментация штамма Pen.canescens EgX-29 и штамма Pen.canescens PhPlAgl-9 в качалочных колбах.

Способ осуществляют, как в примере 7, при разном соотношении посевного материала штаммов Pen.canescens EgX-29 и Pen.canescens PhPlAgl-9.

При засеве равным количеством конидий штамма Pen.canescens EgX-29 и штамма Pen.canescens PhPlAgl-9 в культуральной жидкости за 120 часов ферментации накапливается 100 ед/мл эндо-1,4-β-глюканазной активности (КМЦ-азы), 140 ед/мл β-глюканазной активности, 670 ед/мл эндо-1,4-β-ксиланазной активности, 150 ед/мл фитазной активности, 130 ед/мл пектин-лиазной активности и 160 ед/мл α-галактозидазной активности.

При засеве удвоенным количеством конидий штамма Pen.canescens EgX-29 по отношению к количеству конидий штамма Pen.canescens PhPlAgl-9 в культуральной жидкости за 120 часов ферментации накапливается 130 ед/мл эндо-1,4-β-глюканазной активности (КМЦ-азы), 190 ед/мл β-глюканазной активности, 890 ед/мл эндо-1,4-β-ксиланазной активности, 140 ед/мл фитазной активности, 120 ед/мл пектин-лиазной активности и 120 ед/мл α-галактозидазной активности.

При засеве удвоенным количеством конидий штамма Pen.canescens PhPlAgl-9 по отношению к количеству конидий штамма Pen.canescens EgX-29 в культуральной жидкости за 120 часов ферментации накапливается 90 ед/мл эндо-1,4-β-глюканазной активности (КМЦ-азы), 160 ед/мл β-глюканазной активности, 570 ед/мл эндо-1,4-β-ксиланазной активности, 190 ед/мл фитазной активности, 160 ед/мл пектин-лиазной активности и 170 ед/мл α-галактозидазной активности.

Пример 9. Совместная ферментация штамма Pen.canescens EgX-29 и штамма Pen.canescens PhPl-33 в 10-литровом ферментере.

Способ осуществляют, как в примере 7, при разном соотношении конидий в посевном материале, но совместное культивирование осуществляют в 10-литровом ферментере типа АНКУМ 2М с рабочим объемом 6 л. Ферментацию осуществляют при 30°С среде со свекловичным жомом (30 г/л), пептоном (50 г/л) и КН₂PO₄ (25 г/л), рН 4,5. Аэрация составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в ферментере.

При засеве равным количеством конидий штамма Pen.canescens EgX-29 и штамма Pen.canescens PhPl-33 (в ферментер одновременно вносят по 10 мл водной суспензии конидий каждого штамма с концентрацией 1-2×10⁸ конидий/мл) в культуральной жидкости за 120 часов ферментации накапливается 120 ед/мл эндо-1,4-β-глюканазной активности (КМЦ-азы), 160 ед/мл β-глюканазной активности, 750 ед/мл эндо-1,4-β-ксиланазной активности, 180 ед/мл фитазной активности и 140 ед/мл пектин-лиазной активности.

При засеве удвоенным количеством конидий штамма Pen.canescens EgX-29 (12,5 мл водной суспензии конидий) по отношению к количеству конидий штамма Pen.canescens PhPl-33 (6,5 мл суспензии конидий) в культуральной жидкости за 120 часов ферментации накапливается 130 ед/мл эндо-1,4-β-глюканазной активности (КМЦ-азы), 220 ед/мл β-глюканазной активности, 970 ед/мл эндо-1,4-β-ксиланазной активности, 130 ед/мл фитазной активности и 120 ед/мл пектин-лиазной активности.

При засеве удвоенным количеством конидий штамма Pen.canescens PhPl-33 (12,5 мл водной суспензии конидий) по отношению к количеству конидий штамма Pen.canescens EgX-29 (6,5 мл водной суспензии конидий) в культуральной жидкости за 120 часов ферментации накапливается 90 ед/мл эндо-1,4-β-глюканазной активности (КМЦ-азы), 160 ед/мл β-глюканазной активности, 570 ед/мл эндо-1,4-β-ксиланазной активности, 210 ед/мл фитазной активности и 190 ед/мл пектин-лиазной активности.

Пример 10. Ферментация мультикопийного штамма Pen.canescens EgX-29 совместно со штаммом-продуцентом Pen.canescens PhPlAgl-9 в 10-литровом ферментере.

Способ осуществляют, как в примере 8, при разном соотношении посевного материала штаммов Pen.canescens EgX-29 и Pen.canescens PhPlAgl-9, но совместное культивирование осуществляют в 10-литровом ферментере типа АНКУМ 2М с рабочим объемом 6 л. Ферментацию осуществляют при 30°С среде со свекловичным жомом (30 г/л), пептоном (50 г/л) и КН₂PO₄ (25 г/л), рН 4,5. Аэрация составляет 1 объем воздуха на 1 объем среды в ферментере.

При засеве равным количеством конидий штамма Pen.canescens EgX-29 и штамма Pen.canescens PhPlAgl-9 (в ферментер одновременно вносят по 10 мл водной суспензии конидий каждого штамма с концентрацией 1-2×10⁸ конидий/мл) в культуральной жидкости за 120 часов ферментации накапливается 110 ед/мл эндо-1,4-β-глюканазной активности (КМЦ-азы), 150 ед/мл β-глюканазной активности, 690 ед/мл эндо-1,4-β-ксиланазной активности, 160 ед/мл фитазной активности, 150 ед/мл пектин-лиазной активности и 180 ед/мл α-галактозидазной активности.

При засеве удвоенным количеством конидий штамма. Pen.canescens EgX-29 (12,5 мл водной суспензии конидий) по отношению к количеству конидий штамма Pen.canescens PhPlAgl-9 (6,5 мл суспензии конидий) в культуральной жидкости за 120 часов ферментации накапливается 140 ед/мл эндо-1,4-β-глюканазной активности (КМЦ-азы), 210 ед/мл β-глюканазной активности, 870 ед/мл эндо-1,4-β-ксиланазной активности, 150 ед/мл фитазной активности, 130 ед/мл пектин-лиазной активности и 150 ед/мл α-галактозидазной активности.

При засеве удвоенным количеством конидий штамма Pen.canescens PhPlAgl-9 (12,5 мл водной суспензии конидий) по отношению к количеству конидий штамма Pen.canescens EgX-29 (6,5 мл водной суспензии конидий) в культуральной жидкости за 120 часов ферментации накапливается 110 ед/мл эндо-1,4-β-глюканазной активности (КМЦ-азы), 180 ед/мл β-глюканазной активности, 610 ед/мл эндо-1,4-β-ксиланазной активности, 220 ед/мл фитазной активности, 180 ед/мл пектин-лиазной активности и 210 ед/мл α-галактозидазной активности.

Пример 11. Получение кормового комплексного ферментного препарата с эндо-1,4-β-глюканазной, 1,3/1,4-β-глюканазной, эндо-1,4-β-ксиланазной, фитазной и пектин-лиазной активностью.

Культуральную жидкость, полученную по способу, как в примере 9, при засеве равным количеством конидий штамма Pen.canescens EgX-29 и штамма Pen.canescens PhPl-33, подвергают ультрафильтрации на полых волокнах с пределом проникновения 10 кДа. Фильтрат лиофильно высушивают и получают комплексный ферментный препарат с активностями: эндо-1,4-β-глюканаза (КМЦ-аза) - 2500 ед/г, β-глюканаза - 3300 ед/г, ксиланаза - 12300 ед/г, фитаза - 3800 ед/г, пектин-лиаза - 3100 ед/г.

Пример 12. Получение кормового комплексного ферментного препарата с эндо-1,4-β-глюканазной, 1,3/1,4-β-глюканазной, эндо-1,4-β-ксиланазной, фитазной, пектин-лиазной и α-галактозидазной активностью.

Культуральную жидкость, полученную по способу, как в примере 10, при засеве равным количеством конидий штамма Pen.canescens EgX-29 и штамма Pen.canescens PhPlAgl-9, подвергают ультрафильтрации на полых волокнах с пределом проникновения 10 кДа. Фильтрат лиофильно высушивают и получают комплексный ферментный препарат с активностями: эндо-1,4-β-глюканаза (КМЦ-аза) - 2300 ед/г, β-глюканаза - 3100 ед/г, ксиланаза - 11200 ед/г, фитаза - 3300 ед/г, пектин-лиаза - 3200, α-галактозидаза - 4500 ед/г.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить кормовой комплексный ферментный препарат, обладающий эндо-1,4-β-глюканазной (1,3/1,4-β-глюканазной активностью), эндо-1,4-β-ксиланазной, фитазной, пектин-лиазной и α-галактозидазной активностью, в унифицированном ферментационном процессе с использованием мультикопийных штаммов гриба Pen.canescens, что устраняет необходимость получения отдельных компонентов комплекса в разных ферментационных процессах и последующего их смешивания.

Claims (11)

1. Способ получения ферментного препарата, отличающийся тем, что получают препарат, обладающий эндо-1,4-β-глюканазной, β-глюканазной, эндо-1,4-β-ксиланазной, фитазной и пектин-лиазной и α-галактозидазной активностью, получаемый при совместном культивировании двух мультикопийных штаммов Penicillium canescens EgX-29 (BKM F-3868 D) продуцента эндо-1,4-β-глюканазы, обладающей β-глюканазной активностью, и эндо-1,4-β-ксиланазы и Penicillium canescens PhPlAgl-9 (BKM F-3869 D) - продуцента фитазы, пектин-лиазы и α-галактозидазы.

2. Способ получения ферментного препарата, отличающийся тем, что получают препарат, обладающий эндо-1,4-β-глюканазной, β-глюканазной, эндо-1,4-β-ксиланазной, фитазной и пектин-лиазной активностью, путем совместного культивирования двух мультикопийных штаммов Penicillium canescens EgX-29 (BKM F-3868 D) - продуцента эндо-1,4-β-глюканазы, обладающей β-глюканазной активностью, и эндо-1,4-β-ксиланазы и Penicillium canescens PhPl-33 (BKM F-3870 D) - продуцента фитазы и пектин-лиазы.

3. Способ получения ферментного препарата, отличающийся тем, что получают препарат, обладающий эндо- 1,4-β-глюканазной, β-глюканазной и эндо-1,4-β-ксиланазной активностью, путем культивирования мультикопийного штамма Penicillium canescens EgX-29 (BKM F-3868 D) - продуцента эндо-1,4-β-глюканазы, обладающей β-глюканазной активностью, и эндо-1,4-β-ксиланазы.

4. Способ получения ферментного препарата, отличающийся тем, что получают препарат, обладающий фитазной, пектин-лиазной и α-галактозидазной активностью, путем культивировании мультикопийного штамма Penicillium canescens PhPlAgl-9 (BKM F-3869 D) - продуцента фитазы, пектин-лиазы и α-галактозидазы.

5. Способ получения ферментного препарата, отличающийся тем, что получают препарат, обладающий фитазной и пектин-лиазной активностью, путем культивировании мультикопийного штамма Penicillium canescens PhPl-33 (BKM F-3870 D) - продуцента фитазы и пектин-лиазы.

6. Штамм гриба Penicillium canescens PHY-215 (BKM F-3866 D) - продуцент фитазы, который содержит амплифицированные копии гомологичного гена фитазы и в котором структурная часть гена, кодирующего фитазу, функционально совмещена с промоторным районом и последовательностью, кодирующей сигнальный пептид β-галактозидазы Penicillium canescens.

7. Штамм гриба Penicillium canescens PEC-23 (BKM F-3852 D) - продуцент пектин-лиазы, который содержит амплифицированные копии гомологичного гена пектин-лиазы, в котором структурная часть гена, кодирующего пектин-лиазу, функционально совмещена с промоторным районом и последовательностью, кодирующей сигнальный пептид β-галактозидазы Penicillium canescens.

8. Штамм гриба Penicillium canescens AGL-3 (BKM F-3871 D) - продуцент α-галактозидазы, который содержит амплифицированные копии гомологичного гена α-галактозидазы и в котором структурная часть гена, кодирующего α-галактозидазу, функционально совмещена с промоторным районом и последовательностью, кодирующей сигнальный пептид β-галактозидазы Penicillium canescens.

9. Штамм гриба Penicillium canescens EgX-29 (BKM F-3868 D) - продуцент эндо-1,4-β-глюканазы, обладающей β-глюканазной активностью, и эндо-1,4-β-ксиланазы, который содержит амплифицированные копии гетерологичного гена эндо-1,4-β-глюканазы Penicillium verruculosum и амплифицированные копии гомологичного гена эндо-1,4-β-ксиланазы и в котором структурная часть генов эндо-1,4-β-глюканазы и эндо-1,4-β-ксиланазы функционально совмещена с промоторным районом и последовательностью, кодирующей сигнальный пептид эндо-1,4-β-ксиланазы Penicillium canescens.

10. Штамм гриба Penicillium canescens PhPl-33 (BKM F-3870 D) - продуцент фитазы и пектин-лиазы, который содержит амплифицированные копии гомологичного гена фитазы и амплифицированные копии гомологичного гена пектин-лиазы, в котором структурные части генов, кодирующих фитазу и пектин-лиазу, функционально совмещены с промоторным районом и последовательностью, кодирующей сигнальный пептид β-галактозидазы Penicillium canescens.

11. Штамм гриба Penicillium canescens PhPlAgl-9 (BKM F-3869 D) - продуцент фитазы, пектин-лиазы и α-галактозидазы, который содержит амплифицированные копии гомологичных генов фитазы, пектин-лиазы и α-галактозидазы и в котором структурные части генов, кодирующих фитазу, пектин-лиазу и α-галактозидазу, функционально совмещены с промоторным районом и последовательностью, кодирующей сигнальный пептид β-галактозидазы Penicillium canescens.

Images