BR112020002927A2 - uso de inoculantes e enzimas para aumentar a liberação de nutrientes em dietas para animais - Google Patents

Abstract

Trata-se de métodos para melhorar a digestibilidade de ração em grãos com alta umidificação e/ou ração em grãos reidratada para animais que compreende a) processar a ração de grão em fragmentos e b) colocar os fragmentos de ração em grão da etapa (a) em contato com pelo menos uma amido hidrolase que é estável e ativa em um pH menor que 5,0, opcionalmente pelo menos uma protease, em combinação com pelo menos um inoculante que compreende pelo menos uma cepa bacteriana.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “USO DE

INOCULANTES E ENZIMAS PARA AUMENTAR A LIBERAÇÃO DE NUTRIENTES EM DIETAS PARA ANIMAIS”. CAMPO

[001] O campo refere-se à nutrição animal e, em particular, ao uso de inoculantes e enzimas para aumentar a liberação de nutrientes em dietas para animais.

ANTECEDENTES

[002] Os micróbios podem ser usados para melhorar a utilização de ingredientes de ração. Por exemplo, os micróbios são amplamente usados como probióticos (também chamados de micro-organismos de alimentação direta) para a saúde humana e nutrição animal. Quando tais micróbios são usados para melhorar a utilização de ingredientes de ração, por exemplo, para pré-tratar a silagem, os mesmos são chamados de “inoculantes”. Os inoculantes de silagem são aditivos que contêm bactérias anaeróbias de ácido lático que são usadas para manipular e intensificar a fermentação. Os benefícios incluem perda de fermentação reduzida da silagem e desempenho animal intensificado.

[003] As bactérias de ácido lático mais comuns em inoculantes comerciais são Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, várias espécies de Pediococcus e outras espécies de Lactobacillus.

[004] Uma outra opção é usar enzimas para aumentar a digestibilidade da ração. Por exemplo, as enzimas que incluem fitase, xilanase, beta-glucanase e protease também foram testadas para aumentar os níveis de nutrientes solúveis por meio da pré-incubação com componentes de ração sob condições anaeróbias (Ton Nu et al., High-moisture airtight storage of barley and triticale: Effect of moisture level and grain processing on nitrogen and phosphorus solubility. Animal Feed Science and Technology 210 (2015) 125 a 137). O tratamento da silagem de milho com alfa-amilase também foi testado

(Leahy et al., Effects of treating corn silage with alpha-amylase and (or) sorbic acid on beef cattle growth and carcass characteristics. J. Anim. Sci. 1990, 68:490 a 497). A celulase e o inoculante foram testados na silagem de alfafa (Nadeau et al., Intake, digestibility, and composition of orchard grass and alfalfa silages treated with cellulase, inoculant, and formic acid fed to lambs. J. Anim. Sci. 2000. 78:2.980 a 2.989)

[005] Embora os inoculantes ou enzimas de silagem tenham sido úteis para melhorar a utilização de nutrientes da ração para animais, ainda há espaço para melhorias. Constatou-se que uma combinação de pelo menos uma amido hidrolase sozinha ou em combinação com pelo menos uma protease e pelo menos um inoculante pode melhorar a utilização de nutrientes da ração para animais.

SUMÁRIO

[006] Em uma modalidade, é descrito um método para melhorar a digestibilidade de ração de grãos com alta umidificação e/ou ração de grãos reidratada para animais que compreende a) processar a ração de grãos em fragmentos de ração de grãos e b) colocar os fragmentos de ração de grãos da etapa (a) em contato com pelo menos uma amido hidrolase que é estável e ativa em um pH menor que 5,0 em combinação com pelo menos um inoculante que compreende pelo menos uma cepa bacteriana.

[007] Em uma segunda modalidade da reivindicação 1, essa amido hidrolase tem, de preferência, um domínio de ligação a amido que faz com que a mesma tenha capacidade para hidrolisar amido bruto. Adicionalmente, a amido hidrolase é selecionada dentre a família de glicosídeo hidrolase 13 e/ou 15.

[008] Em uma terceira modalidade, a amido hidrolase é selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos uma alfa amilase ou pelo menos uma glicoamilase.

[009] Em uma quarta modalidade, o método descrito no presente documento compreende adicionalmente pelo menos uma protease na etapa (b).

[0010] Em uma quinta modalidade, a protease é uma endopeptidase e essa endopeptidase é selecionada dentre o grupo que consiste em metalopeptidases, serina proteases, treonina proteases e proteases aspárticas.

[0011] Em uma sexta modalidade, o pelo menos um inoculante compreende pelo menos uma cepa de lactobacilo.

[0012] Em uma sétima modalidade, a ração de grãos é selecionada dentre o grupo que consiste em silagem de milho, grão de milho, silagem de cevada, grão de cevada, sorgo, silagem de sorgo, sementes oleaginosas ou uma combinação dos mesmos.

[0013] Em uma oitava modalidade, o animal é um ruminante.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0014] A Figura 1 representa miolos de milho com o uso de um moinho Buehler.

[0015] A Figura 2 representa a liberação de nutriente solúvel de glicose por meio da interação de inoculante que contém Lactobacillus e enzimas do milho com umidificação.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0016] Todas as patentes, pedidos de patente e publicações mencionados estão incorporados aqui a título de referência em sua totalidade.

[0017] No presente relatório descritivo, são usados vários termos e abreviações. As seguintes definições se aplicam a não ser que especificamente afirmado de outro modo.

[0018] Os artigos “um”, “uma”, “o” e “a” que antecedem um elemento ou componente devem ser não restritivos em relação ao número de casos (isto é, ocorrências) do elemento ou componente. Portanto “um”, “uma”, “o” e “a” devem ser lidos como incluindo um ou pelo menos um, e a forma de palavra singular do elemento ou componente também inclui o plural a menos que o número deva significar obviamente o singular.

[0019] O termo "que compreende" significa a presença dos recursos, números inteiros, etapas ou componentes determinados conforme referidos nas reivindicações, mas não exclui a presença ou a adição de um ou mais outros recursos, números inteiros, etapas, componentes ou grupos dos mesmos. O termo “que compreende” destina-se a incluir modalidades abrangidas pelos termos “que consiste essencialmente em” e “que consiste em”. De modo similar, o termo “que consiste essencialmente em” destina-se a incluir modalidades abrangidas pelo termo “que consiste em”.

[0020] Onde presentes, todas as faixas são inclusivas e combináveis. Por exemplo, quando uma faixa de “1 a 5” é mencionada, a faixa mencionada deve ser interpretada como incluindo as faixas “1 a 4”, “1 a 3”, “1 a 2”, “1 a 2 e 4 a 5”, “1 a 3 e 5” e similares.

[0021] Conforme usado no presente documento em conexão com um valor numérico, o termo “cerca de” se refere a uma faixa de +/- 0,5 do valor numérico, a menos que o termo seja definido especificamente de outra forma no contexto. Por exemplo, a frase um “valor de pH de cerca de 6” se refere aos valores de pH de 5,5 a 6,5, a menos que o valor de pH seja especificamente definido de outra forma.

[0022] Entende-se que todas as limitações numéricas máximas dadas ao longo deste Relatório Descritivo incluam todas as limitações numéricas inferiores, como se tais limitações numéricas inferiores fossem expressamente escritas no presente documento. Todas as limitações numéricas mínimas dadas ao longo deste Relatório Descritivo incluirão todas as limitações numéricas superiores, como se tais limitações numéricas superiores fossem expressamente escritas no presente documento. Todas as faixas numéricas dadas ao longo deste Relatório Descritivo incluirão todas as faixas numéricas mais estreitas que residam dentro de tal faixa numérica mais ampla, como se tais faixas numéricas mais estreitas fossem todas expressamente escritas no presente documento.

[0023] O termo “glicosídeo hidrolase” é usado de forma intercambiável com “glicosidases”, “glicosil hidrolases” e “amido hidrolases”. As glicosídeo hidrolases auxiliam na hidrólise de ligações glicosídicas em polímeros de açúcar complexos (polissacarídeos). Juntamente com as glicosiltransferases, as glicosidases formam o mecanismo catalítico principal para a síntese e quebra de ligações glicosídicas. As glicosídeo hidrolases são classificadas em EC 3.2.1 como enzimas que catalisam a hidrólise de O- ou S-glicosídeos. As glicosídeo hidrolases também podem ser classificadas de acordo com o resultado estereoquímico da reação de hidrólise: dessa forma, as mesmas podem ser classificadas como enzimas de retenção ou inversão. As glicosídeo hidrolases podem ser também classificadas como exo ou endo atuantes, dependendo de se atua na extremidade (normalmente não redutora) ou no meio, respectivamente, de uma cadeia de oligo/polissacarídeos. As glicosídeo hidrolases podem ser também classificadas por métodos baseados em sequência ou estrutura. As mesmas são tipicamente nomeadas de acordo com o substrato sobre o qual as mesmas atuam.

[0024] O termo “amido” é usado de forma intercambiável com “amylum”. O amido é um carboidrato polimérico que consiste em um grande número de unidades de glicose unidas por ligações glicosídicas e é o carboidrato de armazenamento mais comum em plantas. Dessa forma, “amido” pode se referir a qualquer material compreendido pelos carboidratos polissacarídicos complexos de plantas, compreendidos por amilose e amilopectina com a fórmula (C6H10O5)x, em que X pode ser qualquer número. Em particular, o termo se refere a qualquer material à base de plantas que inclui, porém sem limitação, grãos, gramas, tubérculos e raízes e mais especificamente trigo, cevada, milho, centeio, arroz, sorgo, farelos, mandioca, milhete, batata, batata doce e tapioca.

[0025] Os termos “domínio de ligação de amido (SBD)” ou “módulo de ligação de carboidrato (CBM)” são usados de forma intercambiável no presente documento. Os SBDs podem ser divididos em nove famílias de CBM. Como uma fonte de energia, o amido é degradado por muitas enzimas amilolíticas variadas. Entretanto, apenas cerca de 10% das mesmas têm capacidade para ligar e degradar amido bruto. Essas enzimas possuem normalmente um módulo estrutural de sequência distinto chamado de domínio de ligação de amido que medeia a ligação aos grânulos de amido. O SBD se refere a uma sequência de aminoácidos que se liga preferencialmente a um substrato de amido (polissacarídeo) ou a um maltossacarídeo, alfa-, beta- e gama-ciclodextrina e similares. São normalmente motivos de aproximadamente 100 resíduos de aminoácidos encontrados em cerca de 10% das enzimas amilolíticas microbianas.

[0026] O termo "domínio catalítico" se refere a uma região estrutural de um polipeptídeo que é diferente do CBM e que contém o local ativo para a hidrólise do substrato.

[0027] Os termos “amido granular” e “amido bruto’ são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a amido bruto (não cozido), por exemplo, amido granular que não foi submetido à gelatinização.

[0028] O termo “alfa-amilase” é usado de forma intercambiável com alfa-1,4-D-glucano glucano-hidrolase e glicogenase. As alfa- amilases (E.C. 3.2.1.1) normalmente, mas nem sempre, necessitam de cálcio para funcionar. Essas enzimas catalisam a endo-hidrólise de ligações alfa-1,4-glicosídicas em oligossacarídeos e polissacarídeos.

As alfa-amilases atuam sobre amido, glicogênio e polissacarídeos e oligossacarídeos relacionados de maneira aleatória, liberando grupos redutores na configuração alfa.

[0029] O termo “glicoamilase” (EC 3.2.1.3) é usado de forma intercambiável com glucano 1,4-alfa-glicosidase, amiloglicosidase, gama-amilase, alfa-glicosidase lisossômica, maltase ácida, exo-1,4- alfa-glicosidase, glicose amilase, gama-1,4 glucano gluco-hidrolase, maltase ácida e 1,4-alfa-D-glucano hidrolase. Essa enzima cliva as últimas ligações alfa-1,4-glicosídicas na extremidade não redutora de amilose e amilopectina para produzir glicose. Também cliva as ligações alfa-1,6-glicosídicas.

[0030] O termo “protease” significa um domínio de proteína ou polipeptídeo derivado de um micro-organismo, por exemplo, um fungo, bactéria, ou de uma planta ou animal, e que tem a capacidade para catalisar a clivagem de ligações peptídicas em uma ou mais dentre várias posições de uma cadeia principal de proteína (por exemplo, E.C. 3,4). Os termos "protease", "peptidase" e "proteinase" podem ser usados de forma intercambiável. As proteases podem ser encontradas em animais, plantas, fungos, bactérias, archaea e vírus. Proteólise pode ser obtida através de enzimas atualmente classificadas em seis grupos amplos com base em seus mecanismos catalíticos: aspartil proteases, cisteína proteases, serina proteases semelhantes a tripsina, treonina proteases, proteases glutâmicas e metaloproteases.

[0031] As peptidases podem ser classificadas pela reação catalisada que é uma classificação funcional ou pela estrutura molecular e homologia que é uma classificação MEROPS. Tabela 1. Classificação funcional: Peptidase Tipo Descrição NC-IUBMB Amino- Exo Cliva um aa de N-terminal EC 3,4.11 Dipeptidil- Exo Cliva dois aa de N-terminal EC 3,4.14 Tripeptidil- Exo Cliva três aa de N-terminal EC 3,4.14

Peptidase Tipo Descrição NC-IUBMB Carboxil- Exo Cliva um aa de C-terminal EC 3,4.16-18 Peptidildi- Exo Cliva dois aa de C-terminal EC 3,4.15 Di- Exo Cliva dipeptídeos EC 3,4.13 Endo- Endo Cliva ligações de peptídeo internas EC 3,4.21-25 Oligo- Endo Endo-peptidase que age apenas em peptídeos. EC 3,4.21-25 Tabela 2. Classificação MEROPS Resíduos de aminoácidos principais e cofatores relacionados Famílias MEROPS à quebra de ligação de peptídeo Serina 45 Cisteína 65 Metalo 59 Aspártico 14 Glutâmico 2 Treonina 4 Desconhecido 7 Total 196

[0032] O termo "protease ácida" significa uma protease que tem a capacidade de hidrolisar proteínas sob condições ácidas.

[0033] Os termos "protease aspártica" e "protease de ácido aspártico" são usados de modo intercambiável no presente documento e são um tipo de protease ácida. Proteases aspárticas (EC 3.4.23), também conhecidas como aspartil proteases, usam uma molécula de água ativada ligada a um ou mais resíduos de aspartato catalítico para hidrolisar uma ligação de peptídeo em um substrato de polipeptídeo. Em geral, as mesmas têm dois aspartatos altamente conservados no local ativo e são idealmente ativos em pH ácido.

[0034] A abreviação "AFP" se refere a uma protease fúngica aspártica, isto é, uma protease aspártica de uma fonte de organismo fúngico.

[0035] O termo "metaloprotease" é qualquer protease cujo mecanismo catalítico envolva um metal. A maioria das metaloproteases necessitam de zinco, mas algumas usam cobalto. O íon metálico é coordenado para a proteína através de três ligantes. Os ligantes que coordenam o íon metálico podem variar com histidina, glutamato, aspartato, lisina e arginina. A quarta posição de coordenação é absorvida por uma molécula de água lábil.

[0036] Existem dois subgrupos de metaloproteinases que incluem (a), exopeptidases, metaloexopeptidases (número EC: 3.4.17), e (b), metaloendopeptidases (3.4.24).

[0037] Metaloendopeptidases bem conhecidas incluem proteínas ADAM e metaloproteinases de matriz.

[0038] No banco de dados MEROPS, as famílias peptidase são agrupadas por seu tipo catalítico, o primeiro caractere representando o tipo catalítico: A, aspártico; C, cisteína; G, ácido glutâmico; M, metalo; S, serina; T, treonina; e U, desconhecido. As serina, treonina e cisteína peptidases usam o aminoácido como um nucleófilo e formam um intermediário acil - essas peptidases também podem agir prontamente como transferases. No caso de aspártico, glutâmico e metalopeptidases, o nucleófilo é uma molécula de água ativada. Em muitos casos, a dobra de proteína estrutural que caracteriza o clã ou a família pode ter perdido sua atividade catalítica, ainda retém sua função no reconhecimento e ligação de proteínas.

[0039] O termo “serina protease” se refere a enzimas que clivam ligações de peptídeo em proteínas, em que a serina serve com o aminoácido nucleofílico no local ativo da enzima. Serina proteases estão em duas categorias amplas com base em sua estrutura: as semelhantes à quimiotripsina (semelhantes a tripsina) e as subtilisinas. No sistema de classificação de protease MEROPS, as proteases são distribuídas entre 16 superfamílias e diversas famílias. A família S8 inclui as subtilisinas e a família S1 inclui as enzimas semelhantes a quimiotripsina (semelhantes a tripsina). A subfamília S1E inclui as serina proteases semelhantes à tripsina de organismos Streptomyces,

como Estreptogricinas A, B e C. Os termos “serina protease”, “serina protease semelhante à tripsina” e “protease semelhante à quimotripsina” são usados de forma intercambiável no presente documento.

[0040] O termo “treonina protease” se refere a uma família de enzimas proteolíticas que tem um resíduo de treonina dentro do local ativo.

[0041] Os termos "animal" e "indivíduo" são usados de forma intercambiável no presente documento. Um animal inclui todos os animais não ruminantes (incluindo seres humanos) e ruminantes. Em uma modalidade específica, o animal é um animal não ruminante, tal como um cavalo ou um animal monogástrico. Exemplos de animais monogástricos incluem, porém sem limitação, porcos e suínos, tais como leitões, porcos em crescimento, porcas; aves domésticas, tais como perus, patos, galinha, frangos de corte, galinhas poedeiras; peixe, tal como salmão, truta, tilápia, bagre e carpas; e crustáceos, tais como camarões e camarões grandes. Em uma modalidade adicional, o animal é um animal ruminante incluindo, porém sem limitação, gado, bezerros jovens, cabras, ovelha, girafas, bisão, alce americano, alce indonésio, iaques, búfalo de água, veado, camelos, alpacas, lhamas, antílope, antílope americano e antílope asiático. Os ruminantes têm a capacidade única de converter a forragem grosseira em proteína e energia através dos seus sistemas digestivos microbianos/de enzimas. Em conformidade, os ruminantes desempenham um papel importante na ecologia da terra e na cadeia alimentar.

[0042] A principal diferença entre ruminantes e não ruminantes é que os estômagos dos ruminantes têm quatro compartimentos: rúmen, retículo, omaso e abomaso. Nas primeiras duas câmaras, o rúmen e o retículo, a comida é misturada com saliva e separada em camadas de material sólido e líquido. Os sólidos aglomeram-se para formar a mastigação merícica ou bolo alimentar.

[0043] A mastigação merícica é, então, regurgitada e mastigada para misturar a mesma completamente com saliva e quebrar o tamanho de partícula. A fibra, principalmente a celulose e a hemicelulose, é essencialmente quebrada nessas câmaras por micróbios (principalmente bactérias, bem como alguns protozoários, fungos e leveduras) nos três principais ácidos graxos voláteis (VFAs): ácido acético, propiônico e ácido butírico. A proteína e o carboidrato não estrutural (pectina, açúcares e amidos) também são fermentados.

[0044] Embora o rúmen e o retículo tenham nomes diferentes, representam o mesmo espaço funcional do material de digestão e podem mover-se para a frente e para trás entre eles. Juntas, essas câmaras são chamadas de retículo-rúmen. O material de digestão degradado, que agora está na parte inferior líquida do retículo-rúmen passa em seguida para a câmara seguinte, o omaso, onde a água e muitos dos elementos minerais inorgânicos são absorvidos na corrente sanguínea.

[0045] Após isso, o material de digestão é passado para o verdadeiro estômago, o abomaso. O abomaso é o equivalente direto do estômago monogástrico e o material de digestão é digerido aqui de maneira muito semelhante. O material de digestão é finalmente movido para o intestino delgado, onde ocorre a digestão e absorção de nutrientes. Os micróbios produzidos no retículo-rúmen também são digeridos no intestino delgado. A fermentação continua no intestino grosso da mesma forma que no retículo-rúmen.

[0046] O termo "forragem", como usado neste documento, se refere a um tipo de ração animal e é qualquer produto alimentício agrícola usado especificamente para alimentar gado doméstico, como bovinos, cabras, ovelhas, cavalos, galinhas e porcos. "Forragem" se refere principalmente ao alimento dado aos animais (incluindo plantas cortadas e levadas aos mesmos), em vez daquele que os mesmos angariam para si próprios (chamado de forragem). A forragem também é designada como provisões para animais e inclui feno, palha, silagem, rações comprimidas e peletizadas, óleos e rações mistas, e grãos germinados e leguminosas (como brotos de feijão, malte fresco ou malte utilizado). A maioria da ração para animais vem de plantas, mas alguns fabricantes adicionam ingredientes a rações processadas que são de origem animal.

[0047] O termo "ração” é usado em referência a produtos que são alimentados a animais na criação de gado. Os termos “ração” e “ração para animais” são usados de forma intercambiável.

[0048] O termo ‘ração de grãos”, conforme usado no presente documento, se refere a qualquer grão usado como ração para criação de gado doméstico, com bovinos, aves ou outros animais. Em particular, a ração de grãos se refere às sementes de plantas que são tipicamente alimentadas para animais ruminantes que podem ou não incluir a casca externa, vagem ou casca da semente. Os exemplos incluem, porém sem limitação, cevada, milho, aveia, sorgo, trigo (triticale), centeio e sementes oleaginosas como soja e semente de colza.

[0049] O termo “ração de grãos com alta umidificação” se refere ao grão que tem pelo menos 23% de umidificação. Por exemplo, “milho com alta umidificação” se refere ao milho colhido a 23 por cento ou umidificação maior, armazenado e deixado fermentar em um silo ou outra estrutura de armazenamento e usado como ração para gado.

[0050] O termo “silagem” se refere à ração preservada por um processo de fermentação anaeróbica (por exemplo, silagem de milho, silagem de feno, milho com alta umidificação, etc.). “Ensilado” se refere a materiais vegetais preservados por fermentação anaeróbica e tipicamente armazenados em um saco, reservatório ou silo vertical.

[0051] “Semente oleaginosa”, conforme usado no presente documento, se refere a qualquer semente que contém óleo, noz, miolo ou similares produzidos por uma planta. Todas tais plantas, assim como suas sementes, nozes ou miolos, são contempladas para uso no presente documento. O teor de óleo de grãos pequenos, por exemplo, trigo, é de apenas 1 a 2%; aquele de sementes oleaginosas se situa na faixa de cerca de 20% para soja a mais de 40% para o girassol e semente de colza (canola). As principais fontes mundiais de óleos de semente comestíveis são soja, girassol, semente de colza, algodão e amendoim. Por exemplo, o National Sustainable Agriculture Information Service lista os seguintes como fontes de óleo para usos alimentícios, especiais ou industriais: amêndoas, semente de abricó, abacate, semente de faia, uva-do-monte, groselha negra, borragem, castanha do pará, calêndula, semente de alcarávia, castanha de caju, semente de mamona, semente de frutas cítricas, cravo-da-índia, cacau, café, copra (coco seco), coentro, semente de coco, semente de algodão, fruto do sabugueiro, prímula, semente de uva, amendoim, avelã, semente de cânhamo, jojoba, semente de linho, noz de macadâmia, macis, semente de melão, semente de mostarda, semente de nim, semente de níger, noz moscada, caroço de palma, maracujá, noz-pecã, pistache, semente de papoila, semente de abóbora, semente de colza, semente de framboesa, pimenta vermelha, cinorródio, semente de borracha, semente de cártamo, espinheiro marítimo, semente de gergelim, soja, eufórbio, urtiga, semente de girassol, planta tropho, semente de tomate ou noz.

[0052] “Inoculantes” contêm bactérias selecionadas para dominar a fermentação das culturas no silo. Os inoculantes de silagem são divididos em duas categorias, dependendo de como fermentam um açúcar de planta comum, a glicose. Os homofermentadores produzem apenas ácido lático e incluem algumas espécies de Lactobacillus como

Lactobacillus plantarum, espécies Pediococcus, e espécies Enterococcus. A outra categoria, heterofermentadores, produz ácido lático, ácido acético ou etanol e dióxido de carbono. Lactobacillus buchneri é o melhor exemplo de um heterofermentador.

[0053] Conforme usado no presente documento, o termo "ensaio funcional" se refere a um ensaio que fornece uma indicação da atividade de uma proteína. Em algumas modalidades, o termo se refere a sistemas de ensaio em que uma proteína é analisada acerca de sua habilidade para funcionar em sua capacidade normal. Por exemplo, no caso de uma protease, um ensaio funcional envolve determinar a eficácia da protease em hidrolisar um substrato proteináceo.

[0054] As enzimas aumentam a digestibilidade de rações modernas para animais, o que melhora as razões de ração: grão para ruminantes e animais monogástricos da mesma forma. As enzimas como celulase e hemicelulase melhoram o valor nutritivo das rações à base de silagem e milho/soja. Outras enzimas como alfa-galactosidase aumentam o valor nutricional de polissacarídeos não amidos (NSP). As enzimas podem beneficiar cães e gatos, melhorando a digestibilidade de alimentos para animais e fortalecendo o sistema imunológico.

[0055] Em uma modalidade, é descrito um método para melhorar a digestibilidade de ração de grãos com alta umidificação e/ou ração de grãos reidratada para animais que compreende a) processar a ração de grãos em fragmentos de ração de grãos e b) colocar os fragmentos de ração de grãos da etapa (a) em contato com pelo menos uma amido hidrolase em combinação com pelo menos um inoculante que compreende pelo menos uma cepa bacteriana.

[0056] A ração de grãos pode ser processada em fragmentos com o uso de qualquer meio conhecido pelos versados na técnica.

[0057] Os grãos na maioria dos alimentos atuais são processados de alguma maneira antes de serem alimentados. Embora alguns grãos possam ser alimentados inteiros, o processamento, mesmo que seja apenas a trituração, normalmente torna os nutrientes mais disponíveis para o animal, melhorando assim a digestibilidade e a eficiência alimentar.

[0058] O objetivo principal do processamento de grãos é aumentar a disponibilidade de energia (amido) para melhorar o desempenho do animal. Os métodos de processamento típicos reduzem o tamanho de partícula de grão com ou sem adição de água ou vapor. Alguns métodos comuns de processamento de grãos são descamação a vapor, laminação a seco, colheita e armazenamento com alta umidificação e reconstituição (reidratação).

[0059] Os métodos de processamento de grãos comumente usados incluem, porém sem limitação, meios mecânicos, como trituração, fissura, laminação e crimpagem ou processamento térmico.

[0060] A trituração é feita com o uso de um moinho de martelo ou moinho de rolos. Os moinhos de martelo trituram principalmente pelo impacto de martelos de oscilação livre sobre o grão quando o mesmo cai através da câmara de trituração. Telas com orifícios de tamanho específico circundam a câmara de trituração e, à medida que as partículas de grão se tornam pequenas o suficiente, as mesmas passam através dos orifícios. Os moinhos de rolos têm pares de rolos, geralmente dois ou três pares por moinho, que esmagam o grão à medida que passa entre os rolos. O espaço entre os rolos pode ser ajustado para fornecer vários tamanhos de partícula.

[0061] Os exemplos de ração de grãos incluem, porém sem limitação, silagem de milho, grão de milho, silagem de cevada, grão de cevada, sorgo, silagem de sorgo, sementes oleaginosas ou uma combinação dos mesmos.

[0062] Constatou-se que quando tal ração de grãos fragmentada é colocada em contato com pelo menos uma amido hidrolase que é tanto estável como ativa a um pH menor que 5,0 em combinação com pelo menos um inoculante que compreende pelo menos uma cepa bacteriana a digestibilidade de tal ração é melhorada. De preferência, a amido hidrolase tem um domínio de ligação a amido, em que a dita amido hidrolase pode hidrolisar amido bruto. Adicionalmente, a amido hidrolase é selecionada dentre a família de glicosídeo hidrolase 13 e/ou 15. De preferência, a amido hidrolase pode ser selecionada dentre o grupo que consiste em alfa-amilases e glicoamilases.

[0063] Um domínio de ligação de amido (é um motivo de estrutura possuído por muitas amido hidrolases, incluindo alfa amilases e glicoamilases (Christiansen et al., 2009, The carbohydrate-binding module family 20 – diversity, structure, and function, FEBS J. 276:

5.006 a 5.029). Em um sentido mais amplo, um SBD também pode ser denominado como um módulo de ligação de carboidrato (CBM). Esse motivo de estrutura facilita a hidrólise de amido bruto por meio das amido hidrolases (Janecek et al. 2011, Structural and evolutionary aspects of two families of non-catalytic domains present in starch and glycogen binding proteins from microbes, plants and animals. Enzyme Microb. Technol. 49: 429 a 440.

[0064] A família de glicosídeo hidrolase GH13 é a principal família de glicosídeo hidrolase que age em substratos que contêm ligações de α-glicosídeo.

[0065] A família α-amilase representa um clã GH-H de três famílias de glicosídeo hidrolase GH13, GH70 e GH77. A família GH13 inclui, porém sem limitação, α-amilase (EC 3.2.1.1); oligo-1,6-glicosidase (EC

3.2.1.10); α-glicosidase (EC 3.2.1.20); pululanase (EC 3.2.1.41); ciclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54); α-amilase formadora de maltotetraose (EC 3.2.1.60); isoamilase (EC 3.2.1.68); dextrano glicosidase (EC 3.2.1.70); trealose-6-fosfato hidrolase (EC 3.2.1.93); α- amilase formadora de malto-hexaose (EC 3.2.1.98); α-amilase formadora de maltotriose (EC 3.2.1.116); amilase maltogênica (EC

3.2.1.133); neopululanase (EC 3.2.1.135); malto-oligosiltrealose trealo- hidrolase (EC 3.2.1.141); dextrinase-limite (EC 3.2.1.142); α-amilase formadora de maltopentaose (EC 3.2.1.-); amilosucrase (EC 2.4.1.4); sacarose fosforilase (EC 2.4.1.7); enzima de ramificação (EC

2.4.1.18); ciclomaltodextrina glucanotransferase (CGTase) (EC

2.4.1.19); 4-α-glucanotransferase (EC 2.4.1.25); isomaltulose sintase (EC 5.4.99.11); trealose sintase (EC 5.4.99.16).

[0066] As enzimas da família 15 de glicosídeo hidrolase são enzimas exo-atuantes que hidrolisam os resíduos de extremidade não redutora de α-glicosídeos. Atualmente, a atividade mais comumente caracterizada é a glicoamilase (EC 3.2.1.3), também conhecida como amiloglicosidase, mas as atividades da glicodextranase (EC 3.2.1.70) e α, α-trealose (EC 3.2.1.28) foram descritas. Constatou-se que as glicoamilases fúngicas apresentam alguma flexibilidade de substrato e têm capacidade para degradar não apenas as ligações α-1,4- glicosídicas, mas também as ligações α-1,6-, α-1,3- e α-1,2 a um grau mais baixo.

[0067] As alfa-amilases ativas e estáveis ácidas (EC 3.2.1.1) que podem ser usadas são selecionadas dentre a família de glicosídeo hidrolase GH13. Pode ser mencionada alfa-amilase de Aspergillus kawachii, A. clavatus. Adicionalmente, também podem ser usadas alfa- amilases que têm atividade de hidrólise de amido granular (GSH) ou alfa-amilases que foram manipuladas de maneira recombinante para ter atividade de GSH. Tal atividade de GSH é vantajosa, uma vez que essas enzimas quebram mais do amido, particularmente qualquer amido granular (bruto), que possa estar presente em qualquer ração que contenha melaço e similares. As alfa-amilases que têm atividade

GSH incluem, porém sem limitação, alfa-amilases obtidas a partir de Aspergillus kawachi (por exemplo, AkAA), Aspergillus niger (por exemplo, AnAA), A. clavatus (AcAA), A. terreus (AtAA) e Trichoderma reesei (por exemplo, TrAA).

[0068] As alfa-amilases, AkAA, AcAA e AtAA, têm dois domínios de ligação de carboidrato, um dos quais pertence à família de domínio/módulo de ligação de carboidrato 20 (CBM20 ou CD20), enquanto a outra é por vezes chamada de local de ligação secundário (SBS). SBSs e CBMs parecem funcionar 1) alvejando a enzima em direção ao seu substrato, 2) guiando o substrato para o sulco de local ativo, 3) por interrupção de substrato, 4) intensificando a processividade, 5) por regulação alostérica, 6) passando produtos de reação e/ou 7) ancorando a parede celular do micro-organismo original.

[0069] Muitas dessas funções putativas estão de acordo com as funções atribuídas à ligação não catalítica em CBMs. Em contraste com os CBMs, os SBSs têm uma posição fixa em relação ao local catalítico, tornando-os mais ou menos adequados para assumir funções específicas (Cuyvers S., Dornez E., Delcour J. A., Courtin C. M. (2012), Occurrence and functional significance of secondary carbohydrate binding sites in glycoside hydrolases. Crit. Rev. Biotechnol. 32, 93 a 107).

[0070] Algumas alfa-amilases comercialmente disponíveis que podem ter atividade GSH ou enzimas usadas em processos de hidrólise de carboidratos estão comercialmente disponíveis, ver, por exemplo, TERMAMYL® 120-L, LC e SC SAN SUPER®, SUPRA®, e LIQUEZYME® SC comercializadas pela Novo Nordisk A/S, FUELZYME® LF da Verenium, e CLARASE® L, SPEZYME® FRED, SPEZYME® XTRA, GC626, e GZYME® G997 comercializadas pela Danisco, US, Inc., Genencor Division.

[0071] A glicoamilases (EC 3.2.1.3) são selecionadas dentre a família glicosídeo hidrolase GH 15 e incluem, porém sem limitação, glicoamilase de Trichoderma reesei (TrGA e sua variante CS4, Brew1), glicoamilase de Aspergillus fumigatus (AfuGA), glicoamilase de Fusarium verticillioides (FvGA). Proteases (também denominadas peptidases ou proteinases) são enzimas com capacidade para clivar ligações de peptídeo. Proteases evoluíram múltiplas vezes e diferentes classes de proteases podem realizar a mesma reação por mecanismos catalíticos completamente diferentes. As proteases podem ser encontradas em animais, plantas, bactérias, archaea e vírus.

[0072] A proteólise pode ser obtida por enzimas atualmente classificadas em seis grupos amplos: proteases aspárticas, cisteína proteases, serina proteases, treonina proteases, proteases glutâmicas e metaloproteases.

[0073] Dessa forma, em uma outra modalidade, o método descrito no presente documento também pode incluir uma protease juntamente com a amido hidrolase e inoculante que compreende pelo menos uma cepa bacteriana. De preferência, a protease é uma endopeptidase selecionada dentre o grupo que consiste em metalopeptidases, serina proteases, treonina proteases e proteases aspárticas.

[0074] De preferência, a protease é uma protease ácida e, mais preferencialmente, é uma protease fúngica ácida.

[0075] Nesta descrição podem ser usadas quaisquer proteases ácidas. Por exemplo, as proteases fúngicas ácidas incluem aquelas obtidas a partir de Aspergillus, Trichoderma, Mucor e Rhizopus, como A. niger, A. awamori, A. oryzae, Trichoderma reesei e M. miehei. AFP pode ser derivada da expressão de proteína endógena ou heteróloga de origem bacteriana, vegetal ou fúngica.

[0076] Uma metaloproteinase ou metaloprotease é qualquer enzima protease cujo mecanismo catalítico envolve um metal. A maioria das metaloproteases necessitam de zinco, mas algumas usam cobalto. O íon metálico é coordenado para a proteína através de três ligantes.

[0077] Existem dois subgrupos de metaloproteinases: (a) Exopeptidases, metaloexopeptidases (número EC: 3.4.17) e (b) Endopeptidases, metaloendopeptidases (3.4.24).

[0078] As metaloendopeptidases bem conhecidas incluem proteínas ADAM e metaloproteinases de matriz.

[0079] As serina proteases (ou serina endopeptidases) são enzimas que clivam ligações de peptídeos em proteínas, em que a serina serve como o aminoácido nucleofílico no local ativo (da enzima). São encontradas ubiquamente tanto em eucariotas como procariotas. As serina proteases se encontram em duas amplas categorias com base em sua estrutura: tipo quimotripsina (tipo tripsina) ou tipo subtilisina.

[0080] As treonina proteases são uma família de enzimas proteolíticas que contêm um resíduo de treonina (Thr) dentro do local ativo.

[0081] As proteases aspárticas são um tipo catalítico de enzimas protease que usam uma molécula da água ativada ligada a um ou mais resíduos de aspartato para catálise de seus substratos de peptídeo. Em geral, as mesmas têm dois aspartatos altamente conservados no local ativo e são idealmente ativas em pH ácido. Quase todas as aspartil proteases são inibidas por pepstatina.

[0082] Os inoculantes de silagem são aditivos de forragem que contêm bactérias produtoras de ácido lático (LAB) e outras bactérias anaeróbicas (como Lactobacillus buchneri). Esses inoculantes são usados para manipular e intensificar a fermentação em fenolagem (alfafa, grama, cereais), silagem de milho e milho com alta umidificação. Os objetivos são uma fermentação mais rápida e eficiente, com perdas reduzidas de fermentação, qualidade e palatabilidade de forragem melhoradas, maior vida útil de reservatório e melhorias no desempenho dos animais.

[0083] As colheitas de grãos que são colhidas para silagem contêm uma população natural de micróbios tanto “bons” como “ruins”. Os micróbios “bons” incluem bactérias produtoras de ácido lático (LAB) que ajudam a ensilar a colheita. Os micróbios “ruins” ou de deterioração incluem clostrídios, enterobactérias, bacilos, leveduras e fungos que afetam negativamente a qualidade da silagem.

[0084] Os micróbios de deterioração podem causar fermentação insatisfatória, excesso de matéria seca, perdas de energia e nutrientes, desenvolvimento de sabores desagradáveis/aromas que reduzem a ingestão e podem até produzir toxinas que podem comprometer a saúde dos animais.

[0085] A produção de silagem depende da conversão de açúcares vegetais em ácido. O ácido diminui o pH e preserva a forragem. A primeira etapa do processo de fabricação de silagem é criar condições (anaeróbicas) isentas de oxigênio através da compactação e vedação da forragem. As bactérias anaeróbicas (com repulsa ao oxigênio) estão presentes em pequenos números em todo o material vegetal. Uma vez que as condições isentas de oxigênio são alcançadas, essas bactérias começam a se multiplicar e converter açúcares vegetais em ácidos de fermentação. À medida que os níveis de ácido de fermentação aumentam, o pH cai preservando a forragem como silagem.

[0086] Existe uma variedade de bactérias de ocorrência natural que podem estar presentes na silagem. As mesmas produzem uma faixa de ácidos de fermentação. Uma fermentação lática é a mais desejável devido ao fato de que energia mínima é perdida durante o processo de fermentação e o ácido lático produz silagem palatável e com alto valor de alimentação.

[0087] As bactérias produtoras de ácido lático mais comuns (“LAB”) em inoculantes comerciais são Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, várias espécies de Pediococcus e outras espécies de Lactobacillus. As espécies e cepas específicas de LAB em inoculantes comerciais foram selecionadas devido ao fato de que crescem de maneira rápida e eficaz e produzem principalmente ácido lático. As mesmas aumentam a taxa de fermentação, causando um declínio mais rápido em pH, com um pH final ligeiramente mais baixo. Os produtos de fermentação são deslocados, resultando em mais ácido lático e menos ácido acético, etanol e dióxido de carbono. O ácido lático é mais forte que o ácido acético e contém quase tanta energia quanto os açúcares originais.

[0088] Os inoculantes de silagem são principalmente anaeróbicos como o LAB, o que significa que podem crescer com a disponibilidade ou não de oxigênio. Quando o oxigênio está disponível, os inoculantes ajudam a acelerar o processo de tornar o material de silagem anaeróbico. Uma vez que as condições anaeróbicas são obtidas, essas mesmas bactérias comutam para a produção rápida e eficaz de ácidos (ácido lático e algum ácido acético) para reduzir o pH e impedir o crescimento de micróbios de deterioração. Quando o oxigênio está menos disponível, os inoculantes limitam os micróbios de deterioração que podem crescer em condições anaeróbias (por exemplo, clostrídios, listeria).

[0089] Diferentes cepas bacterianas variam em sua capacidade de produzir ácido lático. As cepas mais desejáveis são aquelas que podem converter açúcar em ácido lático com perda mínima de matéria seca e energia. Qualquer inoculante disponível comercialmente pode ser usado. Os exemplos de inoculantes disponíveis comercialmente são os inoculantes da marca Pioneer®, 1132, 1127, 11H50 e 1174. Também podem ser mencionadas as marcas 11C33 e 11CFT da Pioneer®, que contêm uma cepa patenteada de Lactobacillus buchneri que reduz o aquecimento e a deterioração da silagem no tempo de alimentação.

[0090] Os exemplos não limitantes das composições e métodos revelados no presente documento incluem:

[0091] 1. Um método para melhorar a digestibilidade de ração de grãos com alta umidificação e/ou ração de grãos reidratada para animais que compreende a) processar a ração de grãos em fragmentos de ração de grãos e b) colocar os fragmentos de ração de grãos da etapa (a) em contato com pelo menos uma amido hidrolase que é tanto estável quanto ativa em um pH menor que 5,0 em combinação com pelo menos um inoculante que compreende pelo menos uma cepa bacteriana.

[0092] 2. O método, da modalidade 1, em que a amido hidrolase é selecionada dentre a família de glicosídeo hidrolase 13 e/ou 15.

[0093] 3. O método, da modalidade 1, em que a amido hidrolase tem um domínio de ligação a amido, em que a dita amido hidrolase pode hidrolisar amido bruto.

[0094] 4. O método, da modalidade 1, 2 ou 3, em que a amido hidrolase é selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos uma alfa amilase ou pelo menos uma glicoamilase.

[0095] 5. O método, da modalidade 1, 2, 3 ou 4, em que a etapa (b) compreende adicionalmente pelo menos uma protease.

[0096] 6. O método, da modalidade 5, em que a protease é uma endopeptidase.

[0097] 7. O método, da modalidade 6, em que a endopeptidase é selecionada dentre o grupo que consiste em metalopeptidases, serina proteases, treonina proteases e proteases aspárticas.

[0098] 8. O método, de qualquer uma das modalidades 1 a 7, em que o pelo menos um inoculante compreende pelo menos uma cepa de lactobacilo.

[0099] 9. O método, de qualquer uma das modalidades 1 a 8, em que a ração de grão é selecionada dentre o grupo que consiste em silagem de milho, grão de milho, silagem de cevada, grão de cevada, sorgo, silagem de sorgo, sementes oleaginosas ou uma combinação dos mesmos.

[00100] 10. O método, das modalidades 1 a 9, em que o animal é um ruminante.

EXEMPLOS

[00101] A menos que definido de outro modo no presente documento, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual esta descrição pertence. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2ª Edição, John Wiley e Sons, Nova Iorque (1994), e Hale e Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.I. (1991) fornecem a um versado um dicionário geral de muitos dos termos usados com esta revelação.

[00102] A descrição é adicionalmente definida nos seguintes Exemplos. Deve ser entendido que os Exemplos, embora indicando certas modalidades, são dados apenas a título de ilustração. A partir da discussão acima e dos Exemplos, um perito na técnica pode determinar características essenciais desta divulgação e, sem se afastar do seu espírito e escopo, pode fazer várias mudanças e modificações para adaptar a vários usos e condições. EXEMPLO 1 Materiais usados nos exemplos subsequentes

[00103] As amostras biológicas e de proteína listadas na Tabela 1 foram usadas em exemplos subsequentes. A Tabela 1 mostra o tipo de enzima, organismo de fonte (quando conhecido) e fonte interna ou comercial das amostras e referências de patentes para sequências. Tabela 1. Lista de enzimas, componentes e biomaterial avaliados. Nome do produto Tipo de Fontes de organismo Referências ou proteína produto LAT alfa-amilase Bacillus licheniformis Patente US2013/0171296 AkAA alfa-amilase Fonte de Aspergillus Patente US7354752 kawachii, recombinante AcAA alfa-amilase Fonte de Aspergillus Patente US8945889 clavatus, recombinante TrGA glicoamilase Fonte de Trichoderma Patente US7413879 reseei, recombinante CS4 glicoamilase Fonte de Trichoderma Patente US8058033 reseei, variante, recombinante Brew1 glicoamilase Recombinante, variante, Patente US8809023 fonte Trichoderma reseei FvGA glicoamilase Fonte de Fusarium Patente verticillioides, recombinante WO2016100871 AfuGA glicoamilase Fonte de Aspergillus Patente fumigatus, recombinante US20160115509 AFP protease Fonte de T. reseei, Patente US8288517 recombinante 11B91 da marca Inoculantes Lactobacillus buchneri, L. Pioneer, uma empresa Pioneer®* plantarum DuPont P7524 da marca milho Zea mays Pioneer, uma empresa Pioneer® DuPont

[00104] De acordo com o produtor, 11B91 da marca Pioneer® é um produto inoculante de milho com alta umidificação designado para: melhorar a fermentação, reter teor de nutrientes e intensificar a digestibilidade de milho com alta umidificação ensilado. Uso em milho com alta umidificação ensilado na maturidade adequada em silos verticais de saco ou reservatório em umidificações que se situam na faixa de 22% a 32%. A concentração de proteína das enzimas usadas é dada abaixo na Tabela 2. EXEMPLO 2 Hidrólise de milho rompido com amido hidrolases e suas combinações com protease ácida no pré-tratamento com inoculantes microbianos

[00105] Os miolos de milho da Pioneer de cultivar P7524 foram usados. O mesmo consistiu em 88,2% de matéria seca (DM), 9,3% de proteína bruta (CP), 2,0% de fibra em detergente ácido (ADF), 6,6% de fibra em detergente neutro tratada com amilase (aNDF), 78,5% de carboidratos não fibrosos (NFC), 89,0% de nutrientes digestíveis totais (TDN). Foi primeiramente rompido em cerca de 3 a 10 fragmentos com o uso do moinho Buehler (Bühler AG, Uzwil, Suíça) na definição 9. Os fragmentos tiveram um comprimento entre 1 mm e 0,9 cm (Figura 1). Os fragmentos menores que 1 mm de diâmetro foram removidos por peneiramento. A 100 g do milho moído colocado em sacos plásticos vedadores de alimento OBH Nordica com volume de cerca de 0,7 litro (OBH Nordica Group AB, Sundbyberg, Suécia), foram adicionados 26 g de água de torneira de modo que a umidificação final fosse de 30% (p/p), 100 µl de inoculante diluído (Pioneer 11B91) e enzimas conforme apresentado na Tabela 2. Tabela 2. As composições das misturas de incubação de inoculante mais enzima Tratamentos Milho Água Inoculan- Enzima Proteína de Proteína de Número [g] [g] te (µl) enzima enzima de 11B91 dosada (mg) dosada em repeti- [µl] adicionada ppm com base ções em matéria seca de milho Tempo Zero (Em 100 26 0 0 0 3 branco -20 °C)

Tratamentos Milho Água Inoculan- Enzima Proteína de Proteína de Número [g] [g] te (µl) enzima enzima de 11B91 dosada (mg) dosada em repeti- [µl] adicionada ppm com base ções em matéria seca de milho Controle (apenas 100 26 100 0 0 0 5 inoculante) AFP+inoculante 100 26 100 5 0,66 7,5 3 LAT+inoculante 100 26 100 5 1,02 11,6 3 AkAA+inoculante 100 26 100 5 0,585 6,6 3 AcAA+inoculante 100 26 100 5 0,475 5,4 3 CS4+inoculante 100 26 100 5,6 0,595 6,8 3 TrGA+inoculante 100 26 100 5 0,285 3,2 3 TrGA+inoculante 100 26 100 11,6 0,661 7,5 2 Brew1+inoculante 100 26 100 6,9 0,656 7,5 3 AfuGA+inoculante 100 26 100 7,8 0,663 7,5 3 FvGA+inoculante 100 26 100 4,6 0,851 9,6 3 AkAA+TrGA+AFP* 100 26 100 5 0,700 8 3 +inoculante AcAA+CS4+AFP*+ 100 26 100 5 0,360 4,1 3 inoculante *A razão de peso de proteína entre as alfa-amilases, glicoamilases e protease ácida fúngica de AkAA/AcAA, TrGA/CS4 e APF são 29%, 70% e 1%, respectivamente.

[00106] O inoculante 11B91 da Pioneer foi preparado mediante a suspensão de 1 g do produto pulverulento em 1.000 g de água de torneira e misturados bem como o inoculante diluído. Os sacos plásticos que contêm o milho fragmentado, o inoculante com e sem (controle) e as enzimas a serem testadas foram vedados a vácuo com o uso de um vedador a vácuo da OBH Nordica. Esses sacos vedados foram incubados a 22 °C ou a -20 °C (em branco) durante 35 dias.

[00107] Após uma incubação de 35 dias a 22 °C, 5 g da amostra de fragmento de milho foram tomados de cada um dos sacos plásticos e foram transferidos para um tubo de centrifugação Falcon de 50 ml no qual foram adicionados 15 ml de água Milli-Q. A mistura foi misturada durante 1 minuto e deixada repousar durante 3 minutos. O sobrenadante (extrato de nutriente solúvel) foi coletado por centrifugação em 3.500 rpm durante 10 min a 15 °C. O sobrenadante foi, então, filtrado passando-se através de Millipore steriflip de 0,22 µm (n° de catálogo SCGP00525). O filtrado foi medido acerca do pH (Tabela 3). As concentrações de glicose foram quantificadas por HPLC conforme é mostrado na Figura 2. Para a quantificação de glicose por HPLC, o filtrado (40 µl) foi injetado na análise por HPLC em uma coluna de HPLC Aminex HPX-87N (Bio-Rad) a uma taxa de fluxo de 0,6 ml/min, a temperatura de forno de coluna definida em 75 °C, mais de 15 min com o uso de água como eluente. O pico de glicose foi detectado com o uso de um detector RI em linha (índice refratário) e as áreas de pico foram integradas com o uso do software Chromeleon (Dionex) de acordo com as instruções do fabricante e comparadas com as áreas de pico de padrões de glicose em 0, 0,025, 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 e 2,0 mg/ml.

[00108] Os resultados são apresentados na Tabela 3 e mostram que o milho dosado com o inoculante 11B91, que é uma mistura de Lactobacillus buchneri e L. plantarum (de acordo com o fabricante), diminuiu o pH de 6,46 (pH em branco ou inicial) para pH 4,25 (Controle).

[00109] Observou-se que pode levar até 3 dias de incubação para alcançar uma diminuição de pH de cerca de 2,2 unidades de pH com o uso do inoculante 11B91 sozinho, sob as condições experimentais descritas no presente documento. Tabela 3. O pH do extrato aquoso do milho com alta umidificação pré- tratado após 35 dias

[00110] O branco é o pH do milho com alta umidificação sem um inoculante após 35 dias de armazenamento a -20 °C em vez de incubação a 22 °C. Ctrl é o controle no qual o milho com alta umidificação foi incubado com o inoculante sem a adição de enzimas. Para os detalhes das enzimas adicionadas, consulte a Tabela 2 acima. O número (n) de repetições é 2 a 5. Tratamentos Concentração de enzima Número pH (ppm com base em matéria de Final seca de milho) repetições Tempo Zero (Em branco -20 °C) 0 3 6,46 Controle 0 5 4,25 AFP mais inoculante 7,5 3 4,27 LAT mais inoculante 11,6 3 4,03 AkAA mais inoculante 6,6 3 3,97 AcAA mais inoculante 5,4 3 4,04 CS4 mais inoculante 6,8 3 4,02 TrGA mais inoculante 3,2 3 4,03 TrGA mais inoculante 7,5 2 4,03 Brew1 mais inoculante 7,5 3 4,03 AfuGA mais inoculante 7,5 3 4,05 FvGA mais inoculante 9,6 3 4,03 AkAA+TrGA+AFP mais inoculante 8,0 3 4,04 AcAA+CS4+AFP mais inoculante 4,1 3 3,94

[00111] Um pH 4,25 e pH 4,27 foi medido para os tratamentos de controle (apenas inoculante) e protease mais inoculante, respectivamente.

[00112] Quando os tratamentos de enzima amido hidrolase foram adicionados à combinação de protease e inoculante, foi observada uma diminuição adicional em pH de cerca de 0,2 unidade de pH (para pH em torno de 4,0).

[00113] A diminuição adicional de 0,2 unidade de pH foi observada quando tanto uma amido hidrolase como protease foram usadas em combinação com um inoculante. Isso pode ser devido ao aumento da disponibilidade de nutrientes disponíveis para os lactobacilos presentes que, por sua vez, leva à produção de mais ácidos orgânicos. Os ácidos orgânicos (conhecidos como acidificantes ou acidulantes)

são conhecidos como sendo aditivos alimentares importantes para a indústria pecuária.

[00114] A Figura 2 e a Tabela 4 mostram que nem a amostra de controle (apenas inoculante) nem a amostra tratada com AFP (protease e inoculante) e LAT (alfa amilase e inoculante) tiveram uma quantidade de glicose maior que 0,5 mg por grama de milho, de fato, os níveis de glicose nesses três tratamentos foram ainda mais baixos do que no branco devido ao consumo da glicose livre encontrada no milho pelo inoculante.

[00115] O LAT é uma alfa-amilase bacteriana que gera maltose, maltossacarídeos e glicose. Acredita-se que a produção de glicose foi baixa devido à incubação com o inoculante de lactobacilo que resultou no consumo de parte da glicose gerada por LAT.

[00116] A adição das alfa-amilases ácidas estáveis e ativas AkAA, AcAA, glicoamilases TrGA, CS4, Brew1, AfuGA e FvGA em uma dose de 3 a 12 ppm gerou uma liberação de glicose na faixa de 1 a 14 mg por grama de milho, conforme é mostrado na Tabela 4. Especificamente, a glicose liberada se situa na faixa de 0,1% a 1% do milho fermentado. A mistura de 3 enzimas AcAA + CS4 + AFP (alfa amilase, glicoamilase e protease mais inoculante) liberou uma alta quantidade de glicose com base na quantidade de enzima dosada (consulte a Tabela 4). A mistura de AkAA + TrGA + AFP gerou a próxima quantidade mais alta de glicose com base na quantidade de enzima dosada, seguido de TrGA, então, AfuGA e finalmente CS4. Entre as glicoamilases testadas, FvGA foi constatada como sendo menos eficaz.

[00117] Os dados apresentados no presente documento na Tabela 4 mostram que as duas alfa-amilases ácidas estáveis e ativas de AkAA e AcAA que têm um domínio de ligação de amido (SBD) são 3 a 6 vezes mais eficazes do que uma alfa-amilase como LAT que é desprovida de um SBD.

Tabela 4. A razão entre glicose liberada e proteína de enzima dosada.

Tratamento Dose de Glicose (mg produzido Eficácia enzima por grama de milho com Glicose (ppm) alta umidificação com (mg)/enzim base em matéria seca) a (ppm) Branco 0 0,83 Ctrl 0 0,17 AFP mais inoculante 7,5 0,08 0,01 LAT mais inoculante 11,6 0,42 0,04 AkAA mais inoculante 6,6 1,47 0,22 AcAA 5,4 4,24 0,78 CS4 mais inoculante 6,8 11,40 1,68 TrGA mais inoculante 3,2 5,72 1,79 TrGA mais inoculante 7,5 13,32 1,78 Brew1 mais inoculante 7,5 9,12 1,22 AfuGA mais inoculante 7,5 12,73 1,70 FvGA mais inoculante 9,6 11,86 1,24 AkAA+TrGA+AFP mais inoculante 8 14,16 1,77 AcAA+CS4+AFP mais inoculante 4,1 14,29 3,48

Claims (18)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para melhorar a digestibilidade de ração em grãos com alta umidificação e/ou ração em grãos reidratada para animais caracterizado pelo fato em que compreende a) processar a ração em grãos em fragmentos de ração em grãos e b) colocar os fragmentos de ração em grãos da etapa (a) em contato com pelo menos uma amido hidrolase que é tanto estável quanto ativa em um pH menor que 5,0 em combinação com pelo menos um inoculante que compreende pelo menos uma cepa bacteriana.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato em que a amido hidrolase tem um domínio de ligação a amido, em que a dita amido hidrolase pode hidrolisar amido bruto.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato em que a amido hidrolase é selecionada dentre a família de glicosídeo hidrolase 13 e/ou 15.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato em que a amido hidrolase é selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos uma alfa amilase ou pelo menos uma glicoamilase.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato em que a etapa (b) compreende, ainda, uma protease.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato em que a etapa (b) compreende, ainda, uma protease.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 6, caracterizado pelo fato em que a protease é uma endopeptidase.

8. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato em que a protease é uma endopeptidase.

9. Método, de acordo com a reivindicação 6 ou 8, caracterizado pelo fato em que a endopeptidase é selecionada dentre o grupo que consiste em metalopeptidases, serina proteases, treonina proteases e proteases aspárticas.

10. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato em que a endopeptidase é selecionada dentre o grupo que consiste em metalopeptidases, serina proteases, treonina proteases e proteases aspárticas.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato em que o pelo menos um inoculante compreende pelo menos uma cepa de lactobacilo.

12. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato em que o pelo menos um inoculante compreende pelo menos uma cepa de lactobacilo.

13. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato em que o pelo menos um inoculante compreende pelo menos uma cepa de lactobacilo.

14. Método, de acordo com a reivindicação 6, 8 ou 10, caracterizado pelo fato em que o pelo menos um inoculante compreende pelo menos uma cepa de lactobacilo.

15. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato em que o pelo menos um inoculante compreende pelo menos uma cepa de lactobacilo.

16. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato em que o pelo menos um inoculante compreende pelo menos uma cepa de lactobacilo.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato em que a ração em grãos é selecionada dentre o grupo que consiste em silagem de milho, grão de milho, silagem de cevada, grão de cevada, sorgo, silagem de sorgo, sementes oleaginosas ou uma combinação dos mesmos.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato em que o animal é um ruminante.