CN104212780A - 一种α-淀粉酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种α-淀粉酶，该α-淀粉酶是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ ID NO.17的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-淀粉酶功能的由(a)衍生的蛋白质。本发明还提供一种α-淀粉酶的编码基因，该基因是如下(1)或(2)的DNA：(1)由SEQ ID NO.15的所示核苷酸序列组成的DNA；(2)由SEQ ID NO.16所示核苷酸序列组成的DNA。本发明又提供一种α-淀粉酶的应用。根据本发明的α-淀粉酶的最适温度为70℃，降解淀粉产物主要为葡萄糖，在葡萄糖浆工业上有巨大的应用前景。

Description

一种α-淀粉酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种在高温下具有较好活性的酶，具体涉及一种α-淀粉酶及其编码基因与应用。

技术背景

α-淀粉酶(α-1,4-D-glucan-glucanhydrolase,EC 3.2.1.1)是一种内切型淀粉酶，随机切割淀粉、糖原、寡糖或多聚糖分子内部的α-1,4葡萄糖苷键，产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，由于产物末端残基碳原子为A构型，故称α-淀粉酶。它广泛存在于动物、植物和微生物中，是一种工业酶，在淀粉工业、面包烘焙、洗涤剂、退浆和造纸工业中具有广泛的应用。从1956年首次报道分离α-淀粉酶开始，目前已经分离并鉴定的超过120种α-淀粉酶，从数量上看微生物来源的α-淀粉酶占大部分。微生物中能产生α-淀粉酶的属有：Bacillus，Thermomonospor,Acinetobacter,Pseudomonas,Streptomyces,Aspergillus，Penicillus等。目前在工业上大量使用的α-淀粉酶主要来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis),解淀粉芽抱杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，黑曲霉(Aspergillusniger)和米曲霉(Aspergillusoryzae)。

虽然α-淀粉酶的工业应用和许多微生物产淀粉酶已经研究了数十年，并取得了一定成果，然而，符合工业应用要求仍然有限，如当前市场上应用的α-淀粉酶主要仅是由米曲霉发酵生产得到的中温真菌淀粉酶(TAKA-amylase，真菌淀粉酶)和芽孢杆菌产生的高温细菌α-淀粉酶，虽然酶活力较高，但是其降解淀粉主要产物分别为混合的低聚糖和麦芽糖。目前葡萄糖浆工艺普遍需要经过高温液化和中温糖化两步降解才能得到主要产物为葡萄糖的降解产物，需要反复调节温度、pH等条件，工艺繁琐且增加能耗，而高产葡萄糖的α-淀粉酶因其可以同时起到液化淀粉到低聚糖和降解低聚糖为葡萄糖的作用，有效克服工艺缺陷，降低能耗。

近年来，一系列真菌α-淀粉酶被筛选出来并在大肠杆菌或毕赤酵母中实现了异源表达，如2011年来源于Aspergillusniger的酸性α-淀粉酶基因被克隆到pPIC9K载体在毕赤酵母中实现了高效表达(Zeng Q,Wei C,Jin J,et a1.Cloning of the gene encoding acid-stable alpha-amylase from Aspergillusniger andits expression in Pichiapatoris.Afr J Food Sci,2011,5:668.)，即便如此，目前暂时并未筛选到能降解淀粉大量产葡萄糖这种优良特性的α-淀粉酶，因此开发这类新的淀粉酶依然是研究热点。1990年以来，不少南极产淀粉酶低温真菌被分离和鉴定出来，1997年，M.Fenice á L等从南极维多利亚岛上分离到五株都具有淀粉酶活力的不同的G.pannorumvar.pannorum，其中no.1显示出了显著的活力，有产业化的应用前景(M.Fenice á L et al.1997.Production ofextracellular enzymes by Antarctic fungal strains.Polar Biol,17:275-280)；2011年，AbiramyKrishn等再次在南极岛上筛选到了数株低温下分泌淀粉酶的真菌，其主要菌属为Geomycespannorum(AbiramyKrishn et al.2011.Extracellularhydrolase enzyme production by soilfungi from King George Island,Antarctica.Polar Biol,34:1535–1542)。虽然对Geomycespannorum具有可观的淀粉酶活性，但关于其淀粉酶基因序列和蛋白序列并无报道，且由于该菌培养条件限制，至今还没有分离纯化出该菌的淀粉酶，对其酶学性质尚未研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种真菌α-淀粉酶及其编码基因。

本发明提供的α-淀粉酶，该α-淀粉酶是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ ID NO.17的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-淀粉酶功能的由(a)衍生的蛋白质。

该α-淀粉酶具有与SEQ ID NO.17所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。更优选地，该低温α-淀粉酶具有与SEQ ID NO.17所示氨基酸序列至少80％同源性的序列。进一步优选地，该低温α-淀粉酶具有与SEQ ID NO.17所示氨基酸序列至少90％同源性的序列。最佳地，该低温α-淀粉酶具有与SEQ IDNO.17所示氨基酸序列至少99％同源性的序列。

本发明提供的α-淀粉酶的编码基因是是如下(1)或(2)的DNA：(1)由SEQ ID NO.15的所示核苷酸序列组成的DNA；(2)由SEQ ID NO.16所示核苷酸序列组成的DNA。另外，该编码基因可以具有与所述(1)或(2)所示核苷酸序列至少70％同源性的序列；也可以不限于SEQ ID NO.15或SEQ IDNO.16所示序列，任何经过密码子优化后得到如SEQ ID NO.17所示氨基酸序列组成的蛋白质或其衍生的功能类似的蛋白质的核苷酸序列均落入本专利保护范围内。

该编码基因具有与SEQ ID NO.15所示核苷酸序列或SEQ ID NO.16所示核苷酸序列至少70％同源性的序列。更优选地，该编码基因具有与SEQ IDNO.15所示核苷酸序列或SEQ ID NO.16所示核苷酸序列至少80％同源性的序列。进一步优选地，该编码基因具有与SEQ ID NO.15所示核苷酸序列或SEQID NO.16所示核苷酸序列至少90％同源性的序列。最佳地，该编码基因具有与SEQ ID NO.15所示核苷酸序列或SEQ ID NO.16所示核苷酸序列至少99％同源性的序列。

本发明提供的重组表达载体包括上述编码基因。

所述重组表达载体为在毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点间插入上述编码基因而得到的重组表达载体。

本发明提供的重组宿主细胞包括上述重组表达载体。

所述重组宿主细胞是将上述重组表达载体转入到毕赤酵母GS115中得到的重组宿主细胞。

本发明提供一种制备α-淀粉酶的方法。

本发明所提供的制备α-淀粉酶的方法包括发酵培养含有上述α-淀粉酶的编码基因的重组菌，得到α-淀粉酶。

本发明成功地公开了GeomycesPannorum α-淀粉酶基因和蛋白质氨基酸序列。根据本发明的低温α-淀粉酶最适温度70℃，且降解产物主要为葡萄糖，适于工业上制糖应用的要求。

附图说明

图1示出了GeomycesPannorum α-淀粉酶毕赤酵母GS115重组菌诱导表达的蛋白电泳图(抗3mg/ml G418)。M表示蛋白Maker，1表示α-淀粉酶粗酶液，2表示纯化的α-淀粉酶。

图2示出了Geomycespannorum α-淀粉酶温度曲线，其中GpA1最适作用温度为70℃，且在50-70℃仍然保持较高酶活力，属于中温淀粉酶。

图3示出了Geomycespannorum α-淀粉酶温度耐受性，GpA1在50℃条件下稳定，60℃较为稳定，而在70℃条件下孵育30min基本失活；50℃(■)，60℃(●)，70℃(▲)。

图4示出了Geomycespannorum α-淀粉酶pH曲线，其中GpA1最适作用pH为6.0，在pH5.0～9.0区间内具有较高酶活力。

图5示出了Geomycespannorum α-淀粉酶pH耐受性，其中GpA1在pH5.0～8.0的区间内均具有较好的pH稳定性。

图6示出了GpA1水解可溶性淀粉48h的产物HPLC图，其中，保留时间5.9min表示葡萄糖；保留时间11.2min表示麦芽糖；未检测到麦芽三糖和麦芽四糖；水解主要产物是葡萄糖和麦芽糖且葡萄糖比例高达70％以上。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而非限定本发明保护的范围。

下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂或者耗材，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。如《分子克隆：实验室手册》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件进行，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.α-淀粉酶基因的扩增

1.1菌株及其培养

从马来西亚大学生物科学学院课题合作项目中获赠

GeomycespannorumAK07KGI1001 R1-2(1)(菌种鉴定NCBI登录号：JF720026，已保藏在CCTCC，编号为CCTCC AF2014016)。

用无菌水从培养10天的PDA斜面上洗下G.pannorum孢子，接种液体培养基，20℃培养7天收集菌丝体，用于基因组提取；用牙签接种淀粉固体培养基，20℃培养5天收集菌丝体，用于总RNA提取。

1.2基因组提取

参照Omega真菌基因组提取试剂盒说明书

1.3总RNA提取

按照Takara RNA提取试剂说明书进行操作。

1.4cDNA第一链合成

以抽提的总mRNA为模板，用Takara试剂盒的方法获得cDNA第一链，PCR体系及步骤如下：

65℃保温5min，冰上迅速冷却，向上述反应管中加入

42℃45min，95℃5min，冰上冷却。

1.5 Geomycespannorumα-淀粉酶保守区域克隆

在NCBI上找到与Geomycespannorum相近种属的菌种以及其它丝状真菌的α-淀粉酶氨基酸序列。在α-淀粉酶氨基酸保守区域MYLMVDVV的位置设计正向兼并引物JGpf1，在氨基酸保守区域ENHDVARF的位置设计反向兼并引物JGpr1。其中：

JGpf1的序列为SEQ ID NO.1：ATGTAYYTNATGGTYGAYRTGGT(该引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,下同)

JTGpr1的序列为SEQ ID NO.2：RAADCGNGSYWSGTCRTGRTTBTC以Geomycespannorum基因组为模板，用兼并引物JGpf1和JGpr1，进行PCR扩增α-淀粉酶保守区域，PCR体系为：

反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸25s，30个循环；72℃延伸10min；保存在4℃。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收，连pMD19-T Simple Vector，菌落PCR验证阳性克隆送测序，测序由华大基因完成。

基于上述得到的两条α-淀粉酶保守片段，在两端设计特异性引物Gpaf1/Gpar1，其中

Gpaf1的序列为SEQ ID NO.3：GCGGCATGTATCTAATGGTCG

Gpar1的序列为SEQ ID NO.4：GGTACGTCGTGGTTGTCCATGAAGG

PCR扩增α-淀粉酶保守片段的序列。PCR反应体系为：

反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，10个循环；72℃延伸10min；保存在4℃。

1.6 α-淀粉酶全长DNA克隆

基于上述得到的α-淀粉酶保守片段DNA序列，分别在上游和下游设计3条特异性引物(5’端：5-1SP1、5-1SP2、5-1SP3；3’端：3-1SP1、3-1SP2、3-1SP3)。以Geomycespannorum基因组为模板，用特异性引物和染色体步移试剂盒(Genome Walking Kit，购自大连宝生物工程有限公司)提供的四种兼并引物AP1、AP2、AP3、AP4进行热不对称PCR反应，通过三次巢式PCR反应获取保守片段两侧的未知序列。其中：

5-1SP1的序列为SEQ ID NO.5：CCCAGCATATTTCGGTGGAGCTTTG

5-1SP2的序列为SEQ ID NO.6：ATAAAACCATTGGCTTTTCTCCTGG

5-1SP3的序列为SEQ ID NO.7：ATATTCTCTGGGGCTCCCGCATATG

3-1SP1的序列为SEQ ID NO.8：GGCGCGATGAACTATCCTTCGTGAG

3-1SP2的序列为SEQ ID NO.9：TGGATAACCAGTAGCTTCCAAGGAG

3-1SP3的序列为SEQ ID NO.10：TGAACGCCTCCTGTACGGATACGAC

操作流程如下：

(1)1stPCR，反应体系：

反应条件为：94℃1min，98℃1min；94℃30s，60℃1min，72℃2min，5个循环；94℃30s，25℃3min，72℃2min；94℃30s，60℃1min，72℃2min，94℃30s，60℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，15个循环；72℃10min；保存在4℃。

(2)2ndPCR，反应体系：

反应条件：94℃30s，60℃1min，72℃2min，94℃30s，60℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，15个循环；72℃10min；保存在4℃。

(3)3rdPCR，反应体系：

反应条件：94℃30s，0℃1min，72℃2min，94℃30s，60℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，15个循环；72℃10min；保存在4℃。

将2nd和3rd PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，回收清晰条带，连接pMD19-T Simple Vector，菌落PCR验证阳性克隆，送测序，测序由华大基因完成。

将测序结果进行拼接，然后在拼接序列的两端设计特异性引物GpA1f1和GpA1r1，以基因组为模板，进行全长PCR验证，其过程如上所述。其中：

GpA1f1的序列为SEQ ID NO.11：TAAGTGCTGCATTTATGTCGGGCAC

GpA1r1的序列为SEQ ID NO.12：CATCCGAGGGATGCAAATGGTACAG

1.7α-淀粉酶cDNA克隆

分析1.6得到的α-淀粉酶基因DNA序列，根据保守氨基酸序列以3的倍数递推，同时结合NCBI BlastX比对结果，找到了在可能性最大的起始密码子ATG和终止密码密码子TAA。在密码子上预测网站

(http://linux1.softberry.com/berry.phtml？group＝programs&subgroup＝gfind&topi c＝fgenesh)，得到了主要可能的内含子，设计ORF的特异性引物：

GpA1F的序列为SEQ ID NO.13：ATGCGTGCTCTTGACGTCCTCC

GpA1R的序列为SEQ ID NO.14：TCAAAAACGCAGAAGTCGTGATAAA

以GeomycespannorumcDNA为模板，用特异性引物GpA1F和GpA1R，进行PCR扩增α-淀粉酶ORF，PCR体系为：

反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min45s，30个循环；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，10个循环；72℃延伸10min；保存在4℃。

同时以基因组为模板进行PCR，过程如1.5中所述，电泳验证DNA大于cDNA。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收，连pMD19-T Simple，菌落PCR验证阳性克隆送测序，测序由华大基因完成，比较得出内含子序列。由此获得Geomycespannorum完整α-淀粉酶cDNA序列，即开放阅读框。

将测序结果在GenBank上进行比对并分析表明，所获得的α-淀粉酶基因DNA由2106个核苷酸组成，序列如SEQ ID NO.15所示：

ATGCGTGCTCTTGACGTCCTCCTTGCCGCCTTCTCCCTCCTCCCCGCAGCACAGGCCCTCTCGCCGGCAGAATGGCGATCCCAATCCATATACCAGGTTGTGACAGACCGGTTTGCACACGCCAACGGGTCGACAACAGTGCATTGTGACCTGACAAAGCAGGACTACTGCGGGGGTTCCTGGAAGGGAATCGTGAATAAATTGGACTATATCCAGGATATGGGGTTTACTGCTGTGAGTCCTTCCAAATGGGTGAGCTTGTGGACTCTCAGAATGAAAATTGATGGTGGAACAGGTCTGGATATCGCCCGTTGTCGAGAACATCCTGAATAAGACGGCGGACGGAGCCGCATATCACGGATACTGGGCCAATGATATTTACCAGCTTAATGCGCATTTTGGAACTGTAGATGATCTGAAGAACCTTTCTGATGAGTTGCACGCCAGAGGAATGGTAAGTTTGTTTCCATGAGGCTGGGGCTCTGCCTGCTCTCCTGACATTCCCGAGTTCAGCAATGTGATAACAGATTTTAACGGTGAGTGTGCGTAGTATCTGATGGTCGACGTGGTGACGAATCACATGGCATATGCGGGAGCCCCAGAGAATATTGATTATAGCACTCTTCACCCCTTCAACAAGGTATGTCTCCATGAAATAAATTTAAATGGTGCCAGGAGAAAAGCCAATGGTTTTATACAGGAATCCTTCTATCACCCTCACTGCCCTATAGACTACACGAGCCAAAGCTCCACCGAAATATGCTGGGCGGGTTCCAACGCCGGTACCGGTTTCGTTTCACTCCCCGACTTGCGAACCGAGGACGACGATGTTCAGGCCGAATTCGACAAGTGGATCGGTCAACTGGTGGCCAACTACACCATCGACGGCCTGCGTATTGACTCCGCTGGGTCGGTCAACCAGGGCTTCTACCCATCCTTCCAAGCTGCCGCCGGCGGCATGCACATTCTCGCCGAAGTCTTCAGCGGAGACCCTCCCACTCTGTGCTCATACCTGGAATTTGTATCTGGCGCGATGAACTATCCTTCGTGAGAATTCCCACCAGCCTATCTAGAGTCTACGTTACCATTGGCTAACTATTTGGTCTAGATACTACTGGATAACCAGTAGCTTCCAAGGAGGCCCATTATCTGCGCTGGTCCAGGGCCTCAAGGAGATGAACGCCTCCTGTACGGATACGACGCTCCTAGGATCCTTCATGGAAAACCACGACCTCCCACGGTTCCCCTTTGAAACCACAGATGTCTCTCTCGACATGAACGCCATCGCCTACACGATGCTCACCGACGGTATCCCCGTCATATACAACGGGCAGGAACAAGGATTCGGTGGTGGTCTTCCCCCCTTATCCCGCGAAGCTCTCTGGTTTAGCGGCTACAAGACTACCGGCATACTGTACACTCACATCAAGCAACTTAACCAAGCCCGTTCTCGCGCCATAGCAGTGGACAAGGACTGGGTGAAGGAGCGAGTTTCAGTGAGCCAGCCAGATCCACAGACCCTGCTCATGCGCAAGGGGAAGGCTGGTAAGCAGATGGTCAGCTTGTTCACGAACCGCGGTGCTGGAGGAGAGGAGGTGATGACGCTTTTGTCGGCGGATACGGGGTTTACGGCGAACCTGGATGTTATTGAGGTCCTGAACTGCATTGATGCGAAGACGGATGGGAGTGGTGACCTTGGGGTTGGGATTGACAATGGAGAGCCGCTTGTGTTCTTCCCGGCAGCGAATCTGAAGGGGAGTGGCATCTGCACGAAATTAACTGGTATGTGTTCTCATCGTTTGATTCACTCTAGCTAGTTCTGGATATTATGCTAACGCGGTCAATGCAGGGCCATCTACTGTTGTCTCGACGACTAGAAAGGCCGTTCCCACTCGCACCAGCGCGGGCGCGGGATTAGGATCTGAAGCTACGGCCACAGGAACGGGCTCATCTGAGGATTCGGCCACAGGCACGGGCTCATCTGATGACTCGGCCACAGGAACAGAGGAGGGCTCTCCATCCGTGTCAAACAGCGCAGCGAACTCGCTTTCTGAAAGTGGGCCTCTCAGAGTCTTCGGTATTTTATCACGACTTCTGCGTTTTTGA

该α-淀粉酶基因cDNA的开放阅读框cDNA由1761个核苷酸组成，序列如SEQ ID NO.16所示：

ATGCGTGCTCTTGACGTCCTCCTTGCCGCCTTCTCCCTCCTCCCCGCAGCACAGGCCCTCTCGCCGGCAGAATGGCGATCCCAATCCATATACCAGGTTGTGACAGACCGGTTTGCACACGCCAACGGGTCGACAACAGTGCATTGTGACCTGACAAAGCAGGACTACTGCGGGGGTTCCTGGAAGGGAATCGTGAATAAATTGGACTATATCCAGGATATGGGGTTTACTGCTGTCTGGATATCGCCCGTTGTCGAGAACATCCTGAATAAGACGGCGGACGGAGCCGCATATCACGGATACTGGGCCAATGATATTTACCAGCTTAATGCGCATTTTGGAACTGTAGATGATCTGAAGAACCTTTCTGATGAGTTGCACGCCAGAGGAATGTATCTGATGGTCGACGTGGTGACGAATCACATGGCATATGCGGGAGCCCCAGAGAATATTGATTATAGCACTCTTCACCCCTTCAACAAGGAATCCTTCTATCACCCTCACTGCCCTATAGACTACACGAGCCAAAGCTCCACCGAAATATGCTGGGCGGGTTCCAACGCCGGTACCGGTTTCGTTTCACTCCCCGACTTGCGAACCGAGGACGACGATGTTCAGGCCGAATTCGACAAGTGGATCGGTCAACTGGTGGCCAACTACACCATCGACGGCCTGCGTATTGACTCCGCTGGGTCGGTCAACCAGGGCTTCTACCCATCCTTCCAAGCTGCCGCCGGCGGCATGCACATTCTCGCCGAAGTCTTCAGCGGAGACCCTCCCACTCTGTGCTCATACCTGGAATTTGTATCTGGCGCGATGAACTATCCTTCATACTACTGGATAACCAGTAGCTTCCAAGGAGGCCCATTATCTGCGCTGGTCCAGGGCCTCAAGGAGATGAACGCCTCCTGTACGGATACGACGCTCCTAGGATCCTTCATGGAAAACCACGACCTCCCACGGTTCCCCTTTGAAACCACAGATGTCTCTCTCGACATGAACGCCATCGCCTACACGATGCTCACCGACGGTATCCCCGTCATATACAACGGGCAGGAACAAGGATTCGGTGGTGGTCTTCCCCCCTTATCCCGCGAAGCTCTCTGGTTTAGCGGCTACAAGACTACCGGCATACTGTACACTCACATCAAGCAACTTAACCAAGCCCGTTCTCGCGCCATAGCAGTGGACAAGGACTGGGTGAAGGAGCGAGTTTCAGTGAGCCAGCCAGATCCACAGACCCTGCTCATGCGCAAGGGGAAGGCTGGTAAGCAGATGGTCAGCTTGTTCACGAACCGCGGTGCTGGAGGAGAGGAGGTGATGACGCTTTTGTCGGCGGATACGGGGTTTACGGCGAACCTGGATGTTATTGAGGTCCTGAACTGCATTGATGCGAAGACGGATGGGAGTGGTGACCTTGGGGTTGGGATTGACAATGGAGAGCCGCTTGTGTTCTTCCCGGCAGCGAATCTGAAGGGGAGTGGCATCTGCACGAAATTAACTGGGCCATCTACTGTTGTCTCGACGACTAGAAAGGCCGTTCCCACTCGCACCAGCGCGGGCGCGGGATTAGGATCTGAAGCTACGGCCACAGGAACGGGCTCATCTGAGGATTCGGCCACAGGCACGGGCTCATCTGATGACTCGGCCACAGGAACAGAGGAGGGCTCTCCATCCGTGTCAAACAGCGCAGCGAACTCGCTTTCTGAAAGTGGGCCTCTCAGAGTCTTCGGTATTTTATCACGACTTCTGCGTTTTTGA

该cDNA编码586个氨基酸，其序列如SEQ ID NO.17所示：

MRALDVLLAAFSLLPAAQALSPAEWRSQSIYQVVTDRFAHANGSTTVHCDLTKQDYCGGSWKGIVNKLDYIQDMGFTAVWISPVVENILNKTADGAAYHGYWANDIYQLNAHFGTVDDLKNLSDELHARGMYLMVDVVTNHMAYAGAPENIDYSTLHPFNKESFYHPHCPIDYTSQSSTEICWAGSNAGTGFVSLPDLRTEDDDVQAEFDKWIGQLVANYTIDGLRIDSAGSVNQGFYPSFQAAAGGMHILAEVFSGDPPTLCSYLEFVSGAMNYPSYYWITSSFQGGPLSALVQGLKEMNASCTDTTLLGSFMENHDLPRFPFETTDVSLDMNAIAYTMLTDGIPVIYNGQEQGFGGGLPPLSREALWFSGYKTTGILYTHIKQLNQARSRAIAVDKDWVKERVSVSQPDPQTLLMRKGKAGKQMVSLFTNRGAGGEEVMTLLSADTGFTANLDVIEVLNCIDAKTDGSGDLGVGIDNGEPLVFFPAANLKGSGICTKLTGPSTVVSTTRKAVPTRTSAGAGLGSEATATGTGSSEDSATGTGSSDDSATGTEEGSPSVSNSAANSLSESGPLRVFGILSRLLRF

该Geomycespannorumα-淀粉酶氨基酸序列与已报道的α-淀粉酶氨基酸序列最高同源度为53％。因此该基因是一个新的α-淀粉酶基因，将之命名为GpA1。

虽然以上提供了从野生菌株通过PCR方法获得全长α-淀粉酶基因DNA及cDNA的方法，但是，本领域的技术人员根据本发明所公开的基因序列，采用其它方法，如人工合成法，同样可以获得全长α-淀粉酶基因DNA及cDNA，这是显而易见的。

实施例2.含有α-淀粉酶基因的毕赤酵母重组表达载体的构建及其转化

2.1引物设计

9KA1Nf的序列为SEQ ID NO.18：GTTGCGGCCGCCTCTCGCCGGCAGAATG9KA1Nr的序列为SEQ ID NO.19：

GTTGCGGCCGCTCACGTGCAGATGCCACTCC

2.2重组表达载体构建

以连有α-淀粉酶基因开放阅读框的pMD19-T Vector为模板，用2.1所示引物进行PCR扩增；将PCR产物Not I单酶切，然后与同样经Not I单酶切的酵母表达载体pPIC9K连接，筛选，得到重组质粒(pPIC9KA1)；本实验的重组酶除去了原酶N端信号肽和C端的可能被切除的片段。

2.3毕赤酵母感受态细胞的制备

(1)将酵母接种YPD液体培养基，30℃培养至OD 1～2A(600nm)；

(2)将培养液6000rpm，4℃离心3min，收集菌体；

(3)用8ml缓冲液(100mM LiAc，10mM DTT，0.6M山梨醇，10mM pH 7.5Tris-HCl)重悬菌体，室温静置30Min；

(4)6000rpm，4℃离心5min，收集菌体；

(5)用2～3ml 1M山梨醇洗涤菌体，重复两次；

(6)用适量1M山梨醇重悬菌体，使细胞浓度为10¹⁰个/ml，静置冰上，待用。

2.4重组表达载体的转化

(1)将100ul重组质粒(9KA1)用SacI线性化酶切，用Takara核酸共沉剂进行浓缩，用10ul的无菌超纯水溶解质粒；

(2)将10ul的上述质粒与100ul的酵母感受态细胞混合，转入预冷的电极杯中，进行电击，迅速加入1ml预冷的1M山梨醇，转移至30℃培养箱中静置1h，涂布MD板。

2.5高拷贝转化子的筛选

将MD平板长出的毕赤酵母转化子用无菌水洗下，涂布分别含有1mg/ml，2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml G418的YPD平板，置于30℃培养箱中培养。在含有高浓度G418的YPD平板生长出的转化子即认为含有高拷贝葡萄糖淀粉酶基因。

实施例3.毕赤酵母重组菌的诱导表达及纯化

3.1在2.5所述含G418的YPD平板上挑取重组菌的单克隆，接种YPD液体培养基，30℃，200rpm培养24h。

3.2将上述种子培养液接入BMGY培养基，30℃，200rpm培养24h。

3.3培养至OD 6.0，6500rpm，离心5min收集菌体，转移至BMMY培养基，225rpm,，30℃诱导表达，每24h加100％甲醇至终浓度0.5％。

3.4诱导96h，离心收集上清，测酶活，测定蛋白浓度，并进行蛋白电泳。

3.5粗酶液经过硫酸铵沉淀，离子交换色谱，葡聚糖凝胶G-100纯化后得到单一蛋白条带。

图1显示Geomycespannorumα-淀粉酶毕赤酵母GS115重组菌诱导表达的蛋白电泳图。M表示蛋白Maker，1表示α-淀粉酶粗酶液，2表示纯化的α-淀粉酶。

实施例4.α-淀粉酶酶活测定

α-淀粉酶酶活测定采用Yoo改良法

4.1标准曲线绘制

(1)将可溶性淀粉先干燥至恒重，准确称取1.0000g，用去离子水定容至1000ml，配成1g/l标准液；

(2)取0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml的标准淀粉溶液，补加纯水至9.8ml；

(3)加入0.2ml 0.2ml I₂-KI(I₂，0.08％(w/v)；KI，0.8％(w/v))溶液显色，摇匀，使蓝色溶液稳定10min后，在分光光度计波长660nm处测定吸光值。

4.2酶活测定

(1)将1.000g可溶性淀粉溶于加热至沸腾的100ml柠檬酸盐缓冲液(100mM，pH 5.0)中，冷却后定容至100ml。

(2)加0.5ml底物溶液，40℃预热10min，加入0.5ml适当稀释的酶液，反应10min；

(3)加入0.2ml I₂-KI，摇匀，使蓝色溶液稳定10min后，在分光光度计波长660nm处测定吸光值。

4.3酶活单位定义

酶活力单位定义为：一个α-淀粉酶酶活单位(U)定义为在给定条件下，5min内水解1mg淀粉所需的酶量。

实施例5.α-淀粉酶酶学性质测定

5.1温度对GpA1酶活力的影响

在pH 6.0(100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)条件下，分别在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃测定Geomycespannorumα-淀粉酶酶活力，以最高酶活力为100％，计算其他温度条件下的相对酶活力。

用pH6.0的缓冲液将酶液适当稀释，分别在50℃、60℃、70℃保温，15min后每隔15min取样(至60min)，冰上迅速冷却，在50℃下测定残余酶活力，以没有热孵育的酶液酶活力为100％，计算相对酶活力，表示酶的热稳定性。

图2显示Geomycespannorumα-淀粉酶温度曲线，其中GpA1最适作用温度为70℃，且在50-70℃仍然保持较高酶活力，属于中温淀粉酶。

图3显示Geomycespannorumα-淀粉酶温度耐受性，GpA1在50℃条件下稳定，60℃较为稳定，而在70℃条件下孵育30min基本失活；50℃(■)，60℃(●)，70℃(▲)。

6.2pH对GpA2酶活力的影响。

5.2pH对GpA1酶活力的影响

在40℃，分别在4.0、5.0、6.0(柠檬酸-柠檬酸钠)、7.0(磷酸二氢钾-磷酸氢二钾)、8.0(Tris-盐酸)、9.0、10.0(甘氨酸-氢氧化钠)的条件下，测定Geomycespannorumα-淀粉酶酶活力，以最高酶活力为100％，计算其他温度条件下的相对酶活力。

用上述不同缓冲液将酶液适当稀释，分别在50℃条件下孵育30min，取出冰上迅速冷却，在pH5.0、40℃条件下测定残余酶活力，以没有孵育的酶液酶活力为100％，计算相对酶活力表示酶的pH耐受性。

图4显示Geomycespannorumα-淀粉酶pH曲线，其中GpA1最适作用pH为6.0，在pH5.0～9.0区间内具有较高酶活力。

图5显示Geomycespannorumα-淀粉酶pH耐受性，其中GpA1在pH5.0～8.0的区间内均具有较好的pH稳定性。

5.3 HPLC分析GpA1水解可溶性淀粉的产物

用pH 5.0的缓冲液配置1％(w/v)的可溶性淀粉底物溶液，在1ml底物溶液中加入0.1ml的酶液，混匀，置于50℃水浴中反应。反应48h后，取出在沸水浴中煮沸15min，使酶失活，12000rpm离心10min，然后用0.22um的过滤器过滤后，进行液相色谱分析。

液相分析在安捷伦液相色谱仪(Agilent Technologies 1200Series)上进行，采用示差折光检测器；使用Waters氨基柱(Waters Spherisorb S5NH2)检测，以85:15乙腈：水为流动相，流速0.8ml/min，柱温40℃，进样量10ul。

图6示出了GpA1水解可溶性淀粉48h的产物HPLC图，其中，保留时间5.9min表示葡萄糖；保留时间11.2min表示麦芽糖；未检测到麦芽三糖和麦芽四糖；水解主要产物是葡萄糖和麦芽糖且葡萄糖比例高达70％。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (8)

1.一种α-淀粉酶，该α-淀粉酶是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ ID NO.17的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-淀粉酶功能的由(a)衍生的蛋白质。

2.一种根据权利要求1所述的α-淀粉酶的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因是如下(1)或(2)的DNA：

(1)由SEQ ID NO.15的所示核苷酸序列组成的DNA；

(2)由SEQ ID NO.16所示核苷酸序列组成的DNA。

4.一种重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体包括根据权利要求2或3所述的编码基因。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为在毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点间插入所述的编码基因而得到的重组表达载体pBC12FNHA2。

6.一种重组宿主细胞，其特征在于，该重组宿主细胞包括根据权利要求4所述的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞是将所述的重组表达载体转入到毕赤酵母GS115中得到的重组宿主细胞。

8.一种制备α-淀粉酶的方法，其特征在于，包括发酵培养含有根据权利要求2或3所述编码基因的重组菌。