KR101443411B1 - 세정 효소 및 악취 방지 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아실트랜스퍼라아제 및 상기 아실트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 조성물은 방향성 에스테르의 생성에 있어서 유용함이 발견된다. 일부 기타 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 트리글리세라이드를 포함하는 얼룩을 세정하는 세탁물 세제에서 유용함이 발견된다. 일부 추가 구현예에서, 조성물은 세정 특성을 지닌 화합물을 생성하는데 사용된다 (예를 들어, 계면활성제 에스테르).

Description

세정 효소 및 악취 방지 {CLEANING ENZYMES AND MALODOR PREVENTION}

본 발명은 아실트랜스퍼라아제 및 상기 아실트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 방향성 (fragrant) 에스테르의 생성에서 유용함을 보인다. 일부 기타 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 트리글리세라이드를 함유하는 얼룩을 세탁하는 세탁물 세제에서 유용함을 보인다. 일부 추가 구현예에서, 상기 조성물은 클리닝 특성을 지닌 화합물 (예를 들어, 계면활성제 에스테르) 을 생성하는데 사용된다.

옷, 특히 유제품 (예를 들어, 우유, 아이스크림 또는 버터) 으로 얼룩진 옷을 리파아제를 함유하는 세탁물 세제로 세정하는 경우, 옷을 건조시킨 후에, 아기의 "구토물" 냄새 또는 썩은 버터 냄새와 같은 불쾌한 냄새가 종종 그 직물에서 난다. 이는 직물 및/또는 세탁물에 존재하는 단(短) 사슬 트리글리세라이드 (예를 들어, C4 내지 C12-함유 트리글리세라이드) 의 리파아제로 촉매작용된 가수분해에 의해 악취가 발생되는 것으로 여겨진다. 이러한 가수분해 반응으로, 휘발성이며 지속적인 악취를 야기시키는, 불쾌한 냄새가 나는 단 사슬 지방산 (예를 들어, 부티르산) 이 생성된다. 악취 방지 및/또는 세탁물에 쾌적한 방향을 부가 하는 측면에 대한 수많은 연구에도 불구하고, 당업계에서는 이러한 문제점을 다루는 세탁 조성물의 요구가 여전히 존재다.

본 발명의 개요

본 발명은 아실트랜스퍼라아제 및 아실트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질을 포함하는 조성물을 제시한다. 일부의 특히 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 방향성 에스테르의 생성에 있어서 유용함이 발견된다. 일부 기타 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 트리글리세라이드를 함유하는 얼룩을 세탁하는 세탁물 세제에 있어서 유용함이 발견된다. 일부 추가 구현예에서, 상기 조성물은 클리닝 특성을 지닌 화합물 (예를 들어, 계면활성제 에스테르) 을 생성하는데 사용된다.

본 발명은 아실트랜스퍼라아제 및 아실트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질을 포함하는 세정 조성물을 제공하는데, 이때 상기 아실트랜스퍼라아제 및 알코올 기질은, 세정 조성물을 아실 공여체와 조합할 때 검출가능한 에스테르를 생성하기에 유효한 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제는 SGNH-아실트랜스퍼라아제이다. 일부 추가 구현예에서, 세정 조성물은 아실 공여체 및 아실트랜스퍼라아제에 의해 촉매작용되는 알코올 기질 및 아실 공여체 간 반응의 결과로서 생성되는 에스테르를 추가로 포함한다. 또한 추가 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제는 SGNH-아실트랜스퍼라아제, 특히 AcT 이다. 또한 추가 구현예에서, 에스테르는 직물 관리제 (fabric care agent) 이다. 일부 추가 구현예에서, 직물 관리제는 에스테르 계면활성제이다. 또한 추가 구현예에서, 에스테르는 방향성 에스테르이다. 일부 구현예에서, 아실 공여체는 대상체 상 얼룩에 존재한다. 일부 추가 구현예에서, 아실 공여체-함유 대상체는 아실 공여체로 더럽혀진다. 또한 추가 구현예에서, 아실 공여체는 C1 내지 C18 아실 공여체이다. 일부 추가 구현예에서, 세정 조성물은 리파아제를 포함하지 않지만, 일부 대안의 구현예에서는, 세정 조성물은 리파아제를 추가로 포함한다. 일부 추가 구현예에서, 세정 조성물은 프로테아제 (protease), 아밀라아제 (amylase), 펙티나아제 (pectinase), 셀룰라아제 (cellulase), 큐티나아제 (cutinase), 펙테이트 리아제 (pectate lyase), 만나나아제 (mannanase), 또는 옥시도리덕타아제 (oxidoreductase) 를 추가로 포함한다. 일부 추가 구현예에서, 세정 조성물은 적어도 하나의 계면활성제, 증진제 (builder), 중합체, 염, 표백 활성화제, 표백 시스템, 용매, 버퍼 또는 향수를 추가로 포함한다.

본 발명은 또한 아실트랜스퍼라아제, 아실트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질, 및 아실 공여체를 조합하는 것을 포함하는 세정 방법을 제공하는데, 이때 상기 아실트랜스퍼라아제는 아실 공여체로부터 아실기를 알코올 기질 상으로 전이하는 것을 촉매작용하여 직물 관리 생성물을 생성한다. 또한 추가 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제는 SGNH-아실트랜스퍼라아제이다. 일부 구현예에서, SGNH-아실트랜스퍼라아제는 AcT 이다. 또한 추가 구현예에서, 에스테르는 직물 관리제이다. 일부 추가 구현예에서, 직물 관리제는 에스테르 계면활성제이다. 또한 추가 구현예에서, 에스테르는 방향성 에스테르이다.

본 발명은 또한 SGNH 아실트랜스퍼라아제 및 SGNH 아실트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질을 포함하는 세정 조성물을 제공하는데, 이때 상기 SGNH 아실트랜스퍼라아제 및 알코올 기질은 세정 조성물의 아실 공여체와의 접촉 시 검출가능한 에스테르를 생성하기에 유효한 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 세정 조성물은 아실 공여체-함유 대상체, 및 SGNH 아실트랜스퍼라아제로 촉매작용되는 알코올 기질과 아실 공여체 간의 반응 결과로서 생성된 에스테르를 추가로 포함한다. 일부 추가 구현예에서, 아실 공여체는 C1 내지 C18 또는 C1 내지 C10 아실 공여체이다. 또한 추가 구현예에서, 아실 공여체는 아실 공여체-함유 대상체이다. 또한 추가 구현예에서, 아실 공여체-함유 대상체는 아실 공여체로 더럽혀진다. 일부 바람직한 구현예에서, 대상체는 유제품으로 얼룩진다. 일부 추가 구현예에서, 세정 조성물은 리파아제를 포함하지 않지만, 일부 대안의 구현예에서는 세정 조성물은 리파아제 또는 적어도 하나의 리파아제를 추가로 포함한다. 일부 또한 추가의 구현예에서, 세정 조성물은 수성 조성물이다. 일부 바람직한 구현예에서, 수성 조성물은 임의의 고체 성분은 제외하고 적어도 90% 물을 포함한다. 일부 추가 구현예에서, 에스테르는 에스테르 계면활성제 또는 방향성 에스테르이다. 일부 추가 구현예에서, 세정 조성물은 적어도 하나의 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 추가 구현예에서, 세정 조성물은 또한 과산화물 공급원을 포함한다. 일부 추가 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제, 아밀라아제, 펙티나아제, 셀룰라아제, 큐티나아제, 펙테이트 리아제, 만나나아제, 및/또는 옥시도리덕타아제 또는 그의 혼합물을 추가로 포함하는 세정 조성물을 제공한다. 또한 추가 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 적어도 하나의 계면활성제, 증진제, 중합체, 염, 표백 활성화제, 표백 시스템, 용매, 버퍼 및/또는 향수 또는 그의 혼합물을 포함한다.

본 발명은 또한 SGNH 아실트랜스퍼라아제, SGNH 아실트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질, 및 아실 공여체-함유 물질로 더럽혀진 대상체를 조합하는 것을 포함하는 세정 방법을 제공하는데, 이때 상기 SGNH 아실트랜스퍼라아제는 아실 공여체로부터 아실기를 알코올 기질 상으로 전이하는 것을 촉매작용하여 에스테르를 생성한다. 일부 구현예에서, 에스테르는 C4 내지 C6 카르복실산 에스테르이다. 일부 바람직한 구현예에서, 에스테르는 부티르산 에스테르 또는 벤질 부티레이트이다. 또한 추가 구현예에서, 에스테르는 1차 알코올 및 C4 내지 C6 지방산의 에스테르이다. 일부 추가 구현예에서, 대상체는 직물이다. 일부 바람직한 구현예에서, 직물은 오일-함유 물질로 더럽혀진다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 직물은 트리아실글리세라이드-함유 물질로 얼룩진다. 또한 추가 구현예에서, 트리아실글리세라이드-함유 물질은 C4-C18 트리아실글리세라이드를 포함한다. -일부 추가 구현예에서, SGNH 아실트랜스퍼라아제는 직물 상에 존재하는 아실 공여체로부터 아실기를 알코올 기질 상으로 전이시키는 것을 촉매작용하여 방향성 에스테르를 생성한다. 또한 추가 구현예에서, SGNH 아실트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질은 또한 계면활성제 또는 에멀젼화제로서 작용한다. 또한 추가 구현예에서, SGNH 아실트랜스퍼라아제는 아실 공여체로부터 아실기를 계면활성제 또는 에멀젼화제 상으로 전이하는 것을 촉매작용하여 에스테르를 생성한다. 일부 추가 구현예에서, 상기 방법은 과산화물의 공급원을 SGNH 아실트랜스퍼라아제와 조합하는 것을 추가로 포함하고, 상기 방법은 과산 생성을 야기한다.

본 발명은 아실트랜스퍼라아제 (예를 들어, SGNH 아실트랜스퍼라아제) 및 아실 트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질을 포함하는 세정 조성물을 제공한다.

이들 구현예 중 일부에서, 아실트랜스퍼라아제 및 알코올 기질은, 세정 조성물과 아실 공여체-함유 대상체의 접촉시 검출가능한 에스테르를 생성하기에 유효한 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 세정 조성물은 아실 공여체-함유 대상체,및 아실트랜스퍼라아제에 의해 촉매작용되는 알코올 기질과 아실 공여체 간의 반응의 결과로서 생성되는 에스테르를 추가로 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 아실 공여체는 C1 내지 C10 아실 공여체이다.

일부 기타 구현예에서, 세정 조성물은 알코올 기질과 반응하는 추가된 아실 공여체 (예를 들어, 트리글리세라이드, 지방산 에스테르 등) 을 포함한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 조성물에 의해 생성된 에스테르는 방향성 에스테르, 계면활성제 에스테르, 계면활성제, 또는 직물 관리제, 또는 이들 조합물이다.

일부 구현예에서, 아실 공여체-함유 대상체는 아실 공여체로 더럽혀진다. 일부 바람직한 구현예에서, 아실 공여체는 오일성 물질, 예컨대 동물성 지방, 식물성 지방, 유제품 등이다. 일부 추가 바람직한 구현예에서, 아실 공여체와 알코올 기질의 조합으로 방향성 에스테르, 계면활성제 에스테르, 수용성 계면활성제 또는 직물 관리제 또는 이의 임의 조합물 생성이 도출된다. 실제로, 본 발명은 이익 조합을 제공하는 것을 의도한다.

일부 구현예에서, 세정 조성물은 적어도 하나의 리파아제를 추가로 포함한다. 일부 추가 구현예에서, 세정 조성물은 적어도 하나의 계면활성제 및/또는 적어도 하나의 과산화물 공급원을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 조성물의 계면활성제 또는 에멀젼화제는 아실 전이를 위한 알코올 기질에 작용한다.

일부 추가 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은, 헤미셀룰라아제 (hemicellulase), 퍼옥시다아제 (peroxidase), 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제 (xylanase), 리파아제, 포스포리파아제 (phospholipase), 에스테라아제 (esterase), 큐티나아제 (cutinase), 펙티나아제 (pectinase), 펙테이트 리아제, 아밀라아제, 만나나아제, 케라티나아제 (keratinase), 리덕타아제 (reductase), 옥시다아제 (oxidase), 페놀옥시다아제 (phenoloxidase), 리폭시게나아제 (lipoxygenase), 리그니나아제 (ligninase), 풀룰라나아제 (pullulanase), 탄나아제 (tannase), 펜토사나아제 (pentosanase), 말라나아제 (malanase), 베타-글루카나아제 (beta-glucanase), 아라비노시다아제 (arabinosidase), 히알루로니다아제 (hyaluronidase), 콘드로이티나아제 (chondroitinase), 라카아제 (laccase), 및 아밀라아제 또는 이들의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 추가 효소를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제와 함께 프로테아제, 리파아제, 큐티나아제 및/또는 셀룰라아제와 같은 적용가능한 통상의 효소를 포함하는 효소들의 조합 (즉, "칵테일") 이 사용된다.

일부 추가 구현예에서, 세정 조성물은 본원에서 자세히 설명되는 바와 같은, 적어도 하나의 계면활성제, 증진제, 중합체, 염, 표백 활성화제, 용매, 버퍼 또는 향수 등을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 세정 조성물은 수성 조성물이다. 일부 바람직한 구현예에서, 세정 조성물은 임의의 고체 성분은 배제하면서 적어도 약 90% 물을 포함한다.

본 발명은 또한 본원에서 제공된 세정 조성물을 이용하는 세정 방법도 제공한다. 이들 방법은 일반적으로 아실트랜스퍼라아제 (예를 들어, SGNH 아실트랜스퍼라아제), 아실트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질, 및 아실 공여체-함유 물질로 더럽혀진 대상체 (예를 들어, 직물) 를 조합하는 것을 포함하는데, 이때 상기 아실트랜스퍼라아제는 아실 공여체로부터의 아실기의 알코올 기질로의 전이를 촉매작용시켜 에스테르를 생성한다.

일부 구현예에서, 상기 대상체는 오일-함유 물질 (예를 들어, 트리아실글리세라이드-함유 물질, 예컨대 C4-C18 트리아실글리세라이드를 함유하는 물질) 로 더럽혀진다. 일부 바람직한 구현예에서는, 오일-함유 물질 및 알코올의 조합으로, 생성된 에스테르는 방향성 에스테르인 반면에, 다른 구현예에서는, 비(非)방향성 에스테르가 생성되고, 또 다른 기타 구현예에서는, 계면활성제 또는 기타 직물 관리제, 또는 이들 에스테르의 조합이 생성된다.

이들 구현예의 일부에서, 아실트랜스퍼라아제 효소를 사용하면, 트리글리세라이드로부터 아실 사슬의 제거율을 증가시키도록 리파아제 효소와 상조적으로 작용함으로써 및/또는 아실 사슬을 알코올 기질에 연결함으로써, 휘발성 지방산이라기보다는 오히려 에스테르 생성물을 형성시켜, 트리글리세라이드의 가수분해에 의해 전형적으로 생성되는 악취가 감소된다.

일부 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 또한 방향성 에스테르를 생성하기 위한 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 아실트랜스퍼라아제 (예를 들어, SGNH 아실트랜스퍼라아제), 아실트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질, 및 아실 공여체를 포함하며, 여기서 상기 아실트랜스퍼라아제는 수성 환경에서 아실 공여체로부터 아실기를 알코올 기질로 전이하는 것을 촉매작용하여 방향성 에스테르를 생성한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 알코올 기질 및 아실 공여체는 특정 방향성 에스테르를 생성하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 조성물은 방향성 에스테르를 추가로 포함하는 수성 조성물이다. 일부 기타 구현예에서, 조성물은 탈수 조성물이며, 이때, 방향성 에스테르는 조성물의 후속 재수화시에 생성된다.

일부 구현예에서, 아실 공여체는 C1 내지 C10 아실 사슬을 알코올 기질에 제공한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 방향성 에스테르를 생성하는 조성물은 세정 조성물이다.

일부 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제는 고체 지지체 상에 고정된다.

일부 추가 구현예에서, 조성물은 식료품을 포함한다. 일부 기타 구현예에서, 조성물은 세정 조성물이다. 일부 추가 구현예에서, 조성물은 추가로 적어도 하나의 계면활성제를 함유한다.

본 발명은 또한 본원에 제공된 조성물을 이용해 적어도 하나의 방향성 에스테르를 생성하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 이들 방법은 아실트랜스퍼라아제 (예를 들어, SGNH 아실트랜스퍼라아제), 아실트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질, 및 아실 공여체를 조합하는 것을 포함하며, 여기서 상기 아실트랜스퍼라아제는 아실 공여체로부터 아실기를 알코올 기질로 전이하는 것을 촉매작용하여 방향성 에스테르를 생성한다. 일부 구현예에서, 알코올 기질 및 아실 공여체는 특정 방향성 에스테르를 생성한다.

조성물이 탈수되는 일부 구현예에서, 상기 방법은 구성성분들을 조합한 후에 이들을 재수화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 재수화는 물, 우유 또는 타액을 포함하는 임의의 적합한 수성 매질의 첨가로 발생된다. 따라서, 일부 구현예에서, 재수화는 저작 동안에 발생하여 방향성 에스테르를 방출한다. 일부 기타 구현예에서, 알코올 기질 및 아실 공여체는 수성 환경에서 조합된다.

도면의 간단한 설명

하기 자세한 설명의 특정 측면은 수반되는 도면과 연관하여 읽을 때 가장 잘 이해된다. 통례에 따라 도면의 다양한 특징들은 일정한 비율로 재단하지 않음을 강조한다. 반면에, 다양한 특징들의 치수를 명확하게 하기 위해 임의로 확장 또는 감소한다.

도 1 은 트리부티린 및 2 개의 아실트랜스퍼라아제로, 시스-3-헥세놀, 2-페닐에탄올 및 2-메틸-1-부타놀의 이들 각각의 부티릴 에스테르로의 전환을 나타내는 그래프이다.

도 2 는 10, 30 및 120 분에 트리아세틴과 시스-3-헥세놀의 에스테르화를 위한 아실트랜스퍼라아제 (AcT) 의 자유형 및 졸-겔 캡슐화형의 비교를 나타내는 그래프를 제공한다.

도 3 은 세제 배경에서 트리부티린 및 AcT 를 이용하는 테트라에틸렌글리콜의 트랜스에스테르화를 나타내는 LC/MS 데이타의 그래프 패널을 제공한다.

도 4 는 세제 배경에서 트리부티린 및 AcT 를 이용하는 ¹³C-U-글리세롤의 트랜스에스테르화를 나타내는 LC/MS 데이타의 그래프 패널을 제공한다.

도 5 는 리파아제 및 AcT 의 존재하에서 유지방 및 벤질 알코올로부터 벤질 부티레이트의 제조를 나타내는 그래프를 제공한다.

도 6 은 유지방으로부터 방향성 에스테르를 제조하는 시범실시 방법의 예시를 제공한다.

도 7 은 1) KLM3 돌연변이 pLA231 및 2) 대조군을 이용하는 난황/소르비톨의 인큐베이션으로부터 지질의 TLC 분석 결과를 제공한다. 이 도면에서, "PE" 는 포스파티딜에탄올아민이고, "PC" 는 포스파티딜콜린이다.

도 8 은 샘플 2467-112-1 인, KLM3, pLA231 으로 처리한 난황/소르비톨의 GLC 크로마토그램을 제공한다.

도 9 는 샘플 2467-112-2 인, 난황/소르비톨 대조군 샘플의 GLC 크로마토그램을 제공한다.

도 10 은 KLM3 pLA 231 로 처리된 난황/소르비톨 (2467-112-1) 에서 동정된 피크의 Grindsted SMO 및 MS 스펙트럼으로부터 동정되는 소르비톨 모노올레이트의 GLC/MS 스펙트럼을 제공한다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은 아실트랜스퍼라아제 및 아실트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질을 포함하는 조성물을 제시한다. 일부의 특히 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 방향성 에스테르의 생성에 있어서 유용함이 발견된다. 일부 기타 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 트리글리세라이드를 함유하는 얼룩을 세탁하는 세탁물 세제에 있어서 유용함이 발견된다. 일부 추가 구현예에서, 상기 조성물은 클리닝 특성을 지닌 화합물 (예를 들어, 계면활성제 에스테르) 을 생성하는데 사용된다.

달리 기술되지 않는 한, 본 발명의 특정 측면의 실시는, 모두 당업계 내에 존재하는 분자생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 엔지니어링, 단백질 및 DNA 서열분석 및 재조합 DNA 분야에서 통상 사용되는 종래 기술을 포함된다. 본원 상기 및 하기 모두에서 언급된 모든 특허, 특허 출원, 논문 및 간행물은 본원에 명백하게 참조인용된다.

더욱이, 본원에서 제공된 표제들이 본 명세서를 전체적으로 참조할 때 나타날 수 있는 본 발명의 다양한 측면 또는 구현예들을 제한하는 것은 아니다. 따라서, 바로 직후에 정의되는 용어들은 본 명세서를 전체적으로 참조할 때 훨씬 더 충분히 정의된다. 그러나, 본 발명의 이해가 용이하도록, 다수의 용어를 하기에 정의하였다.

정의

본원에 다르게 정의되어 있지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속한 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본원에서 기재된 것을 실시하는데 있어서 유용함을 지니지만, 시범실시 방법 및 물질을 본원에 기재한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 단수 용어에는 문맥이 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수형 참조가 포함된다. 다르게 지시되지 않는다면, 핵산은 5' 에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 표기하며; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 각각 표기한다. 본 발명이 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않는 것은 자명한데, 그 이유는 이들은 당업자에 의해 사용되는 문맥에 따라 다양할 수 있기 때문이다.

본 명세서에 걸쳐서 나타낸 모든 최대 수치 한도는, 그 수치의 하한이 명백히 본원에 기재되어 있는 것처럼 모든 하한 수치를 포함하는 것으로 사용된다. 본 명세서에 걸쳐 나타낸 모든 최소 수치 한도는, 그 수치의 상한이 명백히 본원에 기재되어 있는 것처럼, 모든 상한 수치를 포함할 것이다. 본 명세서에 나타낸 모든 수치 범위는, 더 좁은 상기 수치 범위가 모두 본원에 기재되어 있는 것처럼, 더 넓은 상기 수치 범위 내에 존재하는 더 좁은 수치 범위 모두를 포함할 것이다.

본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "아실기" 는 화학식 (RC=O-) 의 유기기를 지칭한다.

본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "아실화"란, 하나의 분자 ("아실 공여체") 로부터 아실 (RCO-) 기를 다른 분자 ("기질") 상으로, 일반적으로 기질의 -OH 기의 수소를 아실기로 치환함으로써 전이하는 화학 반응을 지칭한다.

본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "아실 공여체" 란, 아실트랜스퍼라아제 반응에서 아실기를 제공하는 분자를 지칭한다.

본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "알코올 기질" 은, 탄소 원자에 결합된 반응성 히드록실기 (-OH) 를 포함하는 임의의 유기 분자를 지칭한다. 이 용어는 다당류 및 단백질은 제외한다. 물은 알코올 기질이 아니다. 알코올 기질의 예에는 이에 제한되는 것은 아니나, 지방족 알코올, 지환족 또는 방향족 알코올, 테르펜 알코올, 및 단량체 (monomeric), 이량체 (dimeric), 삼량체 (trimeric) 및 사량체 (tetrameric) 폴리올을 포함하는 폴리올이 포함된다. 일부 구현예에서, 알코올은 하나 이상의 히드록실기를 포함한다. 알코올 기질은 하기에 기술되는 아실트랜스퍼라아제 반응에서 아실기를 수용할 수 있다. 일부 구현예에서, 알코올은 1 차, 2 차 또는 3 차 알코올이다.

본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "트랜스퍼라아제" 란, 작용성 화합물의 기질 종으로의 전이를 촉매작용하는 효소를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "아실트랜스퍼라아제" 는, 아실 공여체 (예를 들어, 지질) 로부터 아실기를 알코올 기질 상으로 전이할 수 있는 E.C. 2.3.1.x 로 일반적으로 분류되는 임의의 효소를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "GDSX 아실트랜스퍼라아제" 는, 통상 N-말단 부근에, GDSX 서열 모티프 (여기서, X 는 종종 L 임) 을 함유하는 별개의 활성 부위를 갖는 아실트랜스퍼라아제를 지칭한다. GDSX 효소는 5 개의 공통 서열 (I- V) 을 가진다. 이들 효소는 공지되어 있다 (예를 들어, Upton et al., Trends Biochem. Sci., 20:178-179 [1995]; 및 Akoh et al., Prog. Lipid Res., 43:534-52 [2004] 참조). GDSX 아실트랜스퍼라아제의 서브-세트는, 공통 서열에서 보존된 SG 및 H 잔기를 함유한다. 이들 GDSX 아실트랜스퍼라아제가 "SGNH 아실트랜스퍼라아제" 이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "SGNH 아실트랜스퍼라아제" 는 SGNH 히드롤라아제 (hydrolase) 계통의 아실트랜스퍼라아제를 지칭하는데, 이때 SGNH 히드롤라아제 계통의 구성원은, 3-층 알파/베타/알파 구조 (베타-시트는 5 개의 평행한 가닥으로 이루어짐) 를 가진 SGNH 히드롤라아제-유형 에스테라아제 도메인을 포함한다. 이러한 도메인을 함유하는 효소는 에스테라아제, 리파아제 및 아실트랜스퍼라아제로서 작용하나, 전형적인 리파아제 (classical lipase) 와 서열 상동성은 거의 없다 (Akoh et al., Prog. Lipid Res., 43:534-552 [2004]; 및 Wei et al., Nat. Struct. Biol., 2: 218- 223 [1995] 참조).

SGNH 히드롤라아제-유형 에스테라아제 도메인을 함유하는 단백질이 다양한 종에서 발견되었는데, 여기에는 이에 제한되는 것은 아니나, 하기가 포함된다: 스트렙토마이세스 스카비에스 (Streptomyces scabies) 유래 에스테라아제 (Sheffield et al, Protein Eng., 14:513-519 [2001] 참조); 인플루엔자 C 바이러스, 코로나바이러스 및 토로바이러스 유래 바이러스성 헤마글루티닌-에스테라아제 표면 당단백질의 에스테라아제 (Molgaard et al., Acta Crystallogr. D 58:111-119 [2002] 참조); 포유류 아세틸히드롤라아제 (Lo et al., J. Mol. Biol., 330:539-551 [2003] 참조); 진균류 람노갈락트로난 (rhamnogalacturonan) 아세틸에스테라아제 (Molgaard et al, Structure 8:373-383 [2000] 참조); 및 대장균 (Escherichia coli) 유래의 다중작용성 효소 티오에스테라아제 I (TAP) (Molgaard et al, Acta Crystallogr.D 60: 472-478 [2004] 참조). SGNH 히드롤라아제-유형 에스테라아제 도메인은 이들의 촉매 센터를 안정화시키는 독특한 수소 결합 네트워크를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 이들은 보존된 Ser/Asp/His 삼작용기 촉매 (catalytic triad) 를 포함한다. SGNH 아실트랜스퍼라아제는 또한 GENBANK® 데아타베이스 (본원에 참조인용됨) 의 보존된 도메인 데이타베이스에서 기탁 번호 (accession number) cd01839.3 로 기술되어 있다. SGNH 아실트랜스퍼라아제는 아실 공여체와 접촉시 아실-효소 중간체를 형성하고, 아실기를 물 이외의 수용체에 전이한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "전형적인 리파아제" 란, 리파아제 활성을 갖고 활성 부위 세린을 포함하는 기호 GXSXG 모티프를 갖는 효소를 지칭한다 (예를 들어, Derewenda et al., Biochem Cell Biol., 69:842-51 [1991] 참조). 일부 구현예에서, 전형적인 리파아제는 트리아실글리세라이드의 sn1 및 sn3 위치에 대한 특이성을 갖는 트리아실글리세라이드 리파아제이다.

SGNH 아실트랜스퍼라아제 및 GDSL 아실트랜스퍼라아제는 유사한 구조를 가지며, 둘 다 구조적으로 전형적인 리파아제와는 뚜렷이 다르다.

본원에서 이용되는 바와 같은 용어 "트랜스에스테르화" 란, 지질 공여체 (자유 지방산 이외의 것) 로부터 아실기를 아실 수용체 (물 이외의 것) 로 효소-촉매작용된 전이를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "알코올분해 (alcoholysis)" 란, 생성물들 중 하나는 알코올의 H 와 결합되고 나머지 한 생성물은 알코올의 OR 기와 결합하도록, 알코올 ROH 와의 반응에 의한, 산 유도체의 공유 결합의 효소 촉매작용된 절단을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가수분해" 란, 지질로부터 아실기가 물 분자의 OH 기로 효소 촉매작용된 전이를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 구절 "수성 조성물" 및 "수성 환경" 에서 사용되는 용어 "수성" 이란, 적어도 약 50% 물로 이루어진 조성물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 수성 조성물은 적어도 약 50% 물, 적어도 약 60% 물, 적어도 약 70% 물, 적어도 약 80% 물, 적어도 약 90% 물, 적어도 약 95% 물, 또는 적어도 약 97% 물을 포함한다. 일부 구현예에서, 수성 조성물의 나머지 부분은 적어도 하나의 알코올을 포함한다.

일부 바람직한 구현예에서, 용어 "수성" 이란, 증류수와 비교했을 때, 적어도 약 0.75, 적어도 약 0.8, 적어도 약 0.9, 또는 적어도 약 0.95 의 물 활성 (A _w ) 을 가진 조성물을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "방향성 에스테르" 란, 상쾌한 향기 또는 맛을 가진 에스테르를 지칭한다. 이 용어는 방향성 에스테르 및 풍미있는 에스테르 양자 모두를 포함한다. 그러한 에스테르는 당업계에 익히 공지되어 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "직물 관리제" 란, 세정 특성을 갖고 및/또는 직물에 이점을 부여하는 화합물을 지칭한다. 그러한 화합물에는 계면활성제 및 에멀젼화제가 포함된다. 일부 구현예에서, 직물 관리제는 연화성과 같은 이점, 직물 감촉, 벗겨짐방지, 색 보유력 등에 있어서 개선을 부여한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "계면활성제 에스테르" 란, 계면활성제 특성을 가진 에스테르를 지칭하는데, 여기서 상기 계면활성제는 액체의 표면 장력을 낮추는 화합물이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "검출가능한 방향성" 이란, 인간의 코 또는 미뢰로 검출가능한 방향성 에스테르의 양을 지칭한다. 인간의 코 또는 미뢰가 아닌 질량 분석기로만 검출할 수 있는 양으로 존재하는 방향성 에스테르는 검출가능한 방향성이 아니다.

본원에서 이용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 란, 세정될 아이템을 지칭한다. 본 발명은 직물 (예를 들어, 의복), 실내장식품, 양탄자, 단단한 겉면 (예를 들어, 주방용 조리대, 방바닥, 등) 또는 식기류 (예를 들어, 플레이트, 컵, 받침 접시, 사발, 칼붙이, 은그릇, 등) 을 포함하나 이에 제한되지는 않는 세정에 적합한 임의의 대상체를 포함하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "얼룩진" 또는 "더럽혀진" 이란, 더러운 대상체를 지칭한다. 얼룩진 대상체에 있어서 얼룩이 인간의 육안으로 볼 수 있어야 하는 것은 아니다. 예를 들어, 얼룩진 또는 더럽혀진 대상체는, 동물 유래 지방 물질 (예를 들어 유제품), 식물, 인간의 땀 등을 함유하는 대상체 (예를 들어, 직물) 를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유제품" 이란, 우유 (예를 들어, 전지유, 감소지유, 탈지유 또는 버터밀크) 또는 이로부터 만들어진 제품, 예컨대 임의 유형의 치즈 (예를 들어, 크림 치즈, 하드 치즈, 소프트 치즈 등), 버터, 요구르트 및 아이스크림을 지칭한다. 실제로, 임의의 우유를 기재로 하는 제품이 본 정의에 포함되는 바와 같이, 본 발명이 임의의 특정 유제품에 국한되는 것으로 의도하지 않았다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아실 공여체-함유 대상체" 란, 아실 공여체 (예를 들어, 트리글리세라이드) 를 포함하는 대상체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 아실 공여체는 얼룩으로서 존재한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 고정된 효소의 문맥에서 용어 "고정된" 이란, 용액에서 자유롭지 않고 기질 (예를 들어, 고체 또는 반고체 지지체) 에 부착된 (예를 들어 사슬로 매어진) 효소를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "용액 중" 이란, 기질 상에 고정되지 않고 액체 조성물 내에서 자유로운 분자 (예를 들어, 효소) 를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "검출가능한 에스테르를 생성하기에 유효한 양" 의 구절 문맥에서 용어 "유효한 양" 및 "유효량" 은, 성분 (예를 들어, 효소, 기질, 아실 공여체 또는 이들의 임의 조합) 의, 이용되는 조건 하에서 목적하는 생성물을 생성하기 위한 양을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "과산화수소 공급원" 은 과산화수소는 물론 자연발생적으로 또는 효소작용으로 반응 생성물로서 과산화수소를 생성할 수 있는 시스템의 성분들을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "개인의 관리 제품" 이란, 샴프, 바디 로션, 샤워젤, 국소 보습제, 치약 및/또는 기타 국소 클리너를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 헤어, 스킨, 두피 및 이 (teeth) 의 세정, 표백 및/또는 소독에 사용되는 제품을 의미한다. 일부 특정 구현예에서, 이들 제품은 인간에게 사용되나, 다른 구현예에서는, 이들 제품은 비인간 동물에게 유용함이 발견된다 (예를 들어, 가축 적용).

본원에서 사용되는 바와 같이, "세정 조성물" 및 "세정 제형물" 이란, 직물, 접시, 콘택트 렌즈, 기타 고체 기질, 헤어 (샴프), 스킨 (비누 및 크림), 이 (구강세척제, 치약) 등과 같이 세정되는 아이템에서 원하지 않는 화합물을 제거하는데 있어서 유용함이 발견되는 조성물을 지칭한다. 상기 용어는 조성물이 아실트랜스퍼라아제 및 임의의 기타 효소(들) 및/또는 조성물 내에 존재하는 성분들과 혼화가능하는 한, 특정 유형의 원하는 세정 조성물 및 제품 형태 (예를 들어, 액체, 젤, 과립 또는 분무 조성물) 을 위해 선택되는 임의의 물질/화합물을 포함한다. 세정 조성물 물질의 특정 선택은, 세정될 대상체/표면 및 이용하는 동안 활용되는 세정 조건에 있어서 조성물의 바람직한 형태를 고려함으로써 용이하게 이루어진다.

상기 용어는 임의의 대상체 및/또는 표면을 세정, 표백, 소독 및/또는 살균하기에 적합한 임의의 조성물을 추가로 지칭한다. 상기 용어는 세제 조성물 (예를 들어, 액체 및/또는 고체 세탁물 세제 및 극세사 직물 (fine fabric) 세제; 유리, 목재, 세라믹 및 금속 주방용 조리대 및 창문 등을 세정하는데 사용하기에 적합한 경질 표면 세정용 제형물; 카페트 클리너; 오븐 클리너; 직물 청정제; 직물 연화제; 및 피륙 (textile) 및 세탁물 예비 얼룩 제거제 (pre-spotter), 및 접시 세제) 을 포함하나, 이에 제한되지 않는 것으로 의도된다.

실제로, 용어 "세정 조성물" 은 다르게 지시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 과립 또는 분말 형태의 다목적 또는 내구성이 강한 세척제 (wasing agent), 특히 세정 세제; 액체, 젤 또는 페이스트-형태의 다목적 세척제, 특히 내구성이 강한 액체 (HDL) 유형; 액체 극세사 세제; 손 식기세척제 또는 경량용의 세척제, 특히 고발포 유형의 것들; 가구 및 기관용 각종 정제, 과립, 액체 및 헹굼보조 유형을 포함하는 기계식 식기세척제; 항균 핸드워시 유형, 세정 바 (bar), 구강세척제, 의치 세정제, 자동차 또는 카페트 샴프, 목욕실 클리너를 포함하는 액체 세정제 및 소독제; 헤어 샴프 및 헤어 린스; 샤워젤 및 거품목욕제 및 금속 클리너; 및 표백 첨가제 및 "얼룩-스틱", "예비 처리" 및/또는 "예비 세척" 유형과 같은 세정 보조제를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세제 조성물" 및 "세제 제형물" 은 더럽혀진 대상체의 세정용 세척 매질에서, 사용되도록 의도된 혼합물과 관련되어 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 용어는 직물 및/또는 의복을 세탁하는 것과 관련하여 사용된다 (예를 들어, "세탁물 세제"). 일부 대안적인 구현예에서, 상기 용어는 기타 세제, 예컨대 접시, 은그릇, 칼붙이 등을 세정하는데 사용되는 것 (예를 들어 "식기세척 세제") 를 지칭한다. 본 발명은 임의의 특정 세제 제형물 또는 조성물에 국한해야 하는 것으로 의도되지 않는다. 실제로, 아실트랜스퍼라아제에 덧붙여, 상기 용어는 계면활성제, 다른 트랜스퍼라아제(들), 가수분해 및 기타 효소, 옥시도 리덕타아제, 증진제, 표백제, 표백 활성화제, 청색화제 (bluing agent) 및 형광 염료, 케이크 저해제, 차폐제, 효소 활성화제, 항산화제 및 가용화제를 함유하는 세제를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "경질 표면 세정 조성물" 이란, 마루, 주방용 조리대, 캐비넷, 벽, 타일, 목욕실 및 부엌 설비, 등과 같은 경질 표면을 세정하기 위한 세제 조성물을 지칭한다. 이러한 조성물은 고체, 액체, 에멀젼 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 형태로 제공된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "식기세척 조성물" 이란, 젤, 과립 및 액체 형태를 포함하나 이에 제한되지는 않는 식품 소비 및/또는 식품 처리에서 사용되도록 의도된 접시 및 기타 용구를 세정하기 위한 조성물의 모든 형태를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "직물 세정 조성물" 은 젤, 과립, 액체 및 바 형태를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 모든 형태의 직물을 세정하기 위한 세제 조성물을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "피륙" 은, 직포뿐 아니라, 방사, 직포, 니트 및 부직포로 전환 또는 이로서 사용되는데 적합한, 짧은 섬유 및 필라멘트을 지칭한다. 상기 용어는 천연 및 합성 (예를 들어 제작된) 섬유로 만들어진 방사를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "피륙 물질" 은 섬유, 방사 중간체, 방사, 직물 및 직물로 만들어진 제품 (예를 들어, 의복 및 기타 성형품) 의 일반 용어이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "직물" 은, 임의의 피륙 물질을 포함한다. 따라서, 상기 용어는 의복, 및 직물, 방사, 섬유, 부직포 물질, 천연물, 합성물 및 임의의 피륙물을 포함하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "융화성" 이란, 세정 조성물 물질이 아실트랜스퍼라아제의 효소 활성을, 아실트랜스퍼라아제가 통상의 사용 상황 동안에 원하는 만큼 유효하지 않을 정도로까지 감소시키지 않는 것을 의미한다. 구체적인 세정 조성물 물질을 이하에 상세히 예시한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "효소의 유효량" 은, 특정 적용 (예를 들어, 개인의 관리 제품, 세정 조성물 등) 에 필요한 효소 활성을 달성하는데 필수적인 효소의 양을 지칭한다. 그러한 유효량은 당업자가 용이하게 확정하며, 사용되는 특정 효소 또는 변이체, 세정 적용, 세정 조성물의 특정 조성물 및 액체, 젤 또는 건조 (예를 들어, 과립, 바) 조성물이 요구되는지 여부, 등의 다수의 인자를 기초로 한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "비(非)직물 세정 조성물" 은 경질 표면 세정 조성물, 식기세척 조성물, 개인의 관리 세정 조성물 (예를 들어, 경구 세정 조성물, 의치 세정 조성물, 개인용 클렌징 조성물 등), 및 펄프 및 제지 산업에 사용되기에 적합한 조성물을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효소에 의한 전환" 은, 기질 또는 중간체의 효소와의 접촉에 의한, 기질의 중간체로의 개질 또는 중간체의 말단 생성물로의 개질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 접촉은 기질 또는 중간체를 적절한 효소에 직접 노출시킴으로써 이루어진다. 일부 기타 구현예에서, 접촉이란, 기질 또는 중간체를, 효소를 발현 및/또는 분비하고/하거나 또는 목적하는 기질 및/또는 중간체를 목적하는 중간체 및/또는 말단 생성물로 각각 대사하는 유기체로 노출시키는 것을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "관심 단백질" 이란, 분석, 동정 및/또는 개질될 단백질 (예를 들어, 효소 또는 "관심 효소") 를 지칭한다. 천연 발생 및 재조합 관심 단백질은 본 발명에서 유용함이 발견된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "단백질" 은, 아미노산으로 이루어지고 당업자에게 단백질로 인식되는 임의의 조성물을 지칭한다. 용어 "단백질", "펩티드" 및 폴리펩티드가 상호 교환가능하게 본원에서 사용된다. 여기서, 펩티드가 단백질의 일부인 경우, 당업자는 문맥에서 상기 용어의 사용을 이해한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 기능적으로 및/또는 구조적으로 유사한 단백질이 "연관 단백질" 로 고려된다. 일부 구현예에서, 이들 단백질은 유기체 부류 간의 차이점을 포함해 상이한 속 및/또는 종으로부터 유래된다 (예를 들어, 박테리아 단백질 및 진균류 단백질) . 일부 구현예에서, 이들 단백질은 유기체 부류 간의 차이점을 포함해 상이한 속 및/또는 종으로부터 유래된다 (예를 들어, 박테리아 효소 및 진균류 효소). 추가 구현예에서, 연관 단백질이 동일한 종으로부터 제공된다. 실제로, 본 발명은 임의의 특정 공급원(들) 로부터의 연관 단백질에 국한해야 되는 것으로 의도하지 않았다. 더욱이, 용어 "연관 단백질" 은 3 차 구조 상동체 및 1 차 서열 상동체를 포함한다. 추가 구현예에서, 상기 용어는 면역적으로 교차-반응성인 단백질을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유도체" 란, 하나 이상의 아미노산을 C- 및 N-말단(들) 중 하나 또는 양자 모두로의 첨가, 아미노산 서열 내 하나 또는 수 개의 상이한 부위에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 및/또는 아미노산 서열 내 하나 이상의 부위에서 또는 단백질의 어느 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 및/또는 아미노산 서열 내 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 아미노산의 삽입으로 인한 단백질로부터 유래된 단백질을 지칭한다. 단백질 유도체의 제조는, 원 (native) 단백질을 인코팅하는 DNA 서열을 개질하고, 상기 DNA 서열을 적합한 숙주 내로 형질전환한 다음, 개질된 DNA 서열을 발현하여 유도체 단백질을 형성함으로써 달성될 수 있다.

연관 (및 유도체) 단백질은 "변이체 단백질" 을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 단백질은 모 단백질과 상이하며, 소수의 아미노산 잔기에 의해 서로간에도 상이하다. 상이하게 하는 아미노산 잔기의 개수는 하나 이상 (예를 들어, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 또는 그 이상의 개수) 개의 아미노산 잔기일 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체 간 상이한 아미노산의 개수는 약 1 내지 약 10 이다. 일부 특정 구현예에서, 연관 단백질 및 특히 변이체 단백질은 적어도 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 아미노산 서열 동일성을 포함한다. 게다가, 본원에서 사용되는 바와 같은 연관 단백질 또는 변이체 단백질은 또 다른 연관 단백질 또는 모 단백질과 우세 영역 개수 면에서 상이한 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 변이체 단백질은 모 단백질과 상이한 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 또는 약 10 개의 상응하는 우세 영역을 가진다.

하기를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌 본 발명의 효소의 변이체 제조에 적합한 여러 방법이 당업계에 공지되어 있다: 부위 집중 돌연변이 (site-saturation mutagenesis), 스캐닝 돌연변이, 삽입 돌연변이, 랜덤 돌연변이, 위치 특정 돌연변이, 및 방향적 진화 (directed-evolution) 및 각종 기타 재조합 접근법.

일부 구현예에서, 상동성 단백질을 조작하여 목적하는 활성(들)을 지닌 효소를 제조한다. 일부 구현예에서, 조작된 단백질은 SGNH-히드롤라아제 계통의 단백질 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 조작된 단백질은 하기 보존 잔기 중 적어도 하나 또는 조합물을 포함한다: L6, W14, W34, L38, R56, D62, L74, L78, H81, P83, M90, K97, G110, L114, L135, F180, G205. 대안 구현예에서, 이들 조작된 단백질은 GDSL-GRTT 및/또는 ARTT 모티프를 포함한다. 추가 구현예에서, 효소는 이량체, 팔량체 및 사량체를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다량체 (multimer) 이다.

일부 구현예에서, 1 차 구조와의 상동성을 확립하기 위하여, 아실트랜스퍼라아제의 아미노산 서열을 아실트랜스퍼라아제의 1 차 아미노산 서열 및 서열이 공지되어 있는 모든 아실트랜스퍼라아제 내 불변인 것으로 공지된 잔기 세트와 직접 비교한다. 보존 잔기를 정렬한 후, 정렬을 유지하기 위해 필요한 삽입 및 결손을 참조하여 (즉, 임의의 결손 및 삽입을 통해 보존된 잔기의 제거를 피함), 아실트랜스퍼라아제의 1 차 서열 내 특정 아미노산에 상응하는 잔기들을 정의한다. 일부 구현예에서, 보존된 잔기의 정렬은 100% 의 동등한 잔기를 규정 짓는다. 그러나, 약 75% 초과 또는 약 50% 만큼 적은 보존된 잔기의 정렬도 또한 동등한 잔기를 규정짓는데 적합하다. 일부 구현예에서, 촉매적 세린 및 히스티딘 잔기의 보존이 유지된다.

일부 구현예에서, 보존된 잔기는, 다른 아실트랜스퍼라아제 (예를 들어, 기타 마이코박테리아 (Mycobacterium) 종, 및 임의의 기타 유기체에서 유래된 아실트랜스퍼라아제) 에서 M.스메그마티스 아실트랜스퍼라아제의 해당하는 동등한 아미노산 잔기를 정의내리는데 유용하다.

일부 본 발명의 구현예에서, WO 05/056782 에서 제시된 M. 스메그마티스 아실트랜스퍼라아제를 인코딩하는 DNA 서열은 개질된다. 일부 구현예에서, 하기 잔기가 개질된다: Cys7, Asp10, Ser11, Leu12, Thr13, Trp14, Trp16, Pro24, Thr25, Leu53, Ser54, Ala55, Thr64, Asp65, Arg67, Cys77, Thr91, Asn94, Asp95, Tyr99, Val125, Pro138, Leu140, Pro146, Pro148, Trp149, Phe150, Ile153, Phe154, Thr159, Thr186, Ile192, Ile194, 및 Phe196. 그러나, 본 발명은 이들 위치에서 개질된 서열에 국한되어야 하는 것으로 의도되지 않는다. 실제로, 본 발명은 각종 개질 및 개질들의 조합을 포함하는 것으로 의도된다.

일부 추가 구현예에서, 동등한 잔기는 3 차 및 4 차 구조가 x-선 결정학으로 결정되어져 있는 아실트랜스퍼라아제에 대한 3 차 및 4 차 구조의 수준에서 상동성을 측정함으로써 정의된다. 상기 문헌에서, "동등한 잔기" 란, 카르보닐 히드롤라아제 및 M.스메그마티스 아실트랜스퍼라아제의 특정 아미노산 잔기의 둘 이상의 주 사슬 원자의 원자 자리표 (N 에 N, CA 에 CA, C 에 C, 및 O 에 O) 가, 정렬 후에 약 0.13 nm 및 약 0.1 nm 내에 있는 것으로 정의된다. 정렬은 최적의 모델이 M. 스메그마티스 아실트랜스퍼라아제에 대해서 당해 아실트랜스퍼라아제의 비(非) 수소 단백질 원자의 원자 자리표가 최대로 포개지도록 배향 및 위치된 후에 달성된다. 당업계에 공지된 바와 같이, 최적 모델은 이용가능한 최고의 분할로 하는 실험 회절 데이타에 있어서 가장 낮은 R 인자를 제공하는 결정학상 모델이다. M.스메그마티스 아실트랜스퍼라아제의 특정 잔기와 기능적으로 및/또는 구조적으로 유사한 동등한 잔기는, 단백질 구조를 변경, 개질 또는 조절하여, M.스메그마티스 아실트랜스퍼라아제의 특정 잔기를 정의하며 그로 기인된 방식으로 기질 결합 및/또는 촉매작용에서 변화를 꾀하도록 바람직하게 배좌 (conformation) 를 채택하는 아실트랜스퍼라아제의 아미노산으로서 정의된다. 추가로, 상기는 아실트랜스퍼라아제의 잔기이며 (3 차 구조가 x-선 결정학으로 수득되어진 경우임), 주어진 잔기의 주사슬 원자가 상동 위치를 차지하는지를 기초로 했을 때 등가 기준을 만족할 수는 없더라도, 잔기의 측 사슬 원자 중 적어도 2 개의 원자 자리표가 M.스메그마티스 아실트랜스퍼라아제의 상응하는 측 사슬 원자의 0.13 nm 내에 존재하는 정도로 유사한 위치를 차지한다. M.스메그마티스 아실트랜스퍼라아제의 3차원 구조의 자리표를 측정하여 WO05/056782 의 실시예 14 에 기재하였는데, 여기에는 3차 구조의 수준 상에서 동등한 잔기를 측정하는 데 있어서 상기에 개괄된 바와 같은 유용함이 발견된다.

야생형 및 돌연변이 단백질의 특성화 (characterization) 를 임의의 적합한 수단으로 수행하는데, 이는 관심 특성들의 평가를 기초로 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, pH 및/또는 온도뿐 아니라 세제 및/또는 산화 안정성이 본 발명의 일부 구현예에서 측정된다. 실제로, 이러한 특성들 (pH, 온도, 단백질분해 안정성, 세제 안정성, 및/또는 산화 안정성) 중 하나 이상에서 다양한 정도의 안정성을 갖는 효소가 유용하다는 점이 고려된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "~ 와 상응하는" 이란, 단백질 또는 펩티드에서 열거된 위치의 잔기 또는 단백질 또는 펩티드에서 열거된 잔기와 유사, 상동 또는 등가인 잔기를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "상응 영역" 이란, 일반적으로, 연관 단백질 또는 모 단백질을 따르는 위치와 유사한 위치를 지칭한다.

용어 "~ 을 인코딩하는 핵산 분자", "~ 을 인코딩하는 핵산 서열", "~ 을 인코딩하는 DNA 서열" 및 "~ 을 인코딩하는 DNA" 는, 데옥시리보핵산의 가닥을 따라 위치하는 데옥시리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 지칭한다. 이들 데옥시리보뉴클레오티드의 순서는 폴리펩티드 (단백질) 사슬의 방향을 따라 아미노산 순서를 결정한다. 그에 따라 DNA 서열이 아미노산 서열을 인코딩한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유사 서열" 이란, 관심 단백질 (즉, 전형적으로는 본래의 관심 단백질) 로서, 유사한 기능, 3 차 구조 및/또는 보존 잔기를 제공하는 단백질 내 서열을 지칭한다. 예를 들어, 알파 헬릭스 또는 베타 시트 구조를 포함하는 에피토프 영역에서, 유사 서열 내 대체 아미노산이 동일한 특정 구조를 유지한다. 상기 용어는 또한 뉴클레오티드 서열, 및 아미노산 서열을 지칭하기도 한다. 일부 구현예에서, 대체 아미노산이 유사하거나 또는 개선된 기능을 보이는 변이체 효소를 야기하도록 유사 서열은 개발된다. 일부 바람직한 구현예에서, 관심 단백질에서 3차 구조 및/또는 아미노산의 보존 잔기는 관심 분절 또는 단편에 또는 그 부근에 위치된다. 따라서, 관심 분절 또는 단편이 예를 들어 알파-헬릭스 또는 베타-시트 구조를 포함하는 경우, 대체 아미노산은 상기 특정 구조를 유지한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "상동성 단백질" 은, 관심 단백질 (예를 들어, 다른 공급원 유래의 아실트랜스퍼라아제) 로서 유사한 작용 및/또는 구조를 가진 단백질 (예를 들어, 아실트랜스퍼라아제) 를 지칭한다. 상동체가 반드시 진화적으로 연관되어야 하는 것으로 의도하지는 않는다. 따라서, 상기 용어는 상이한 종들로부터 수득된 동일 또는 유사한 효소(들) (즉, 구조 및 기능 면에서임) 을 포함하는 것으로 의도된다. 일부 바람직한 구현예에서, 관심 단백질 내 분절 또는 단편을 상동체 유래의 유사 분절로 대체하는 것이 변화의 중단을 감소시킬 것이기 때문에, 관심 단백질과 유사한 4 차, 3 차 및/또는 1 차 구조를 가진 상동체를 동정하는 것이 바람직하다. 일부 구현예에서, 상동성 단백질은 관심 단백질로서 유사한 면역 반응(들)을 유도한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "상동성 유전자" 는 상이한 종들에서 유래된 적어도 한 쌍의 유전자를 지칭하며, 상기 유전자는 서로 상응하고, 상기 유전자는 서로 동일하거나 또는 매우 유사하다. 상기 용어는 종분화에 의해 분리된 유전자 (즉, 새로운 종의 발달) (예를 들어 오르토로그 유전자 (orthologous gene)) 및 유전자 복제로 분리되어진 유전자 (예를 들어, 파라로그 유전자 (paralogous gene)) 를 포함한다. 이들 유전자는 "상동성 단백질" 을 인코딩한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "오르토로그" 및 "오르토로그 유전자" 는, 종분화에 의한 공통의 조상 유전자 (상동성 유전자) 로부터 진화된 상이한 종들의 유전자를 지칭한다. 전형적으로, 오르토로그는 진화 과정 동안 동일한 기능을 보유한다. 오르토로그의 동정으로 새롭게 서열된 게놈에서 유전자 기능의 신뢰할만한 예견시, 유용함이 발견된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "파라로그" 및 "파라로그 유전자" 는, 게놈 내 복제에 의해 연관된 유전자를 지칭한다. 오르토로그가 진화 과정을 통해 동일한 기능을 보유하는 반면에, 파라로그에서는 비록 일부 기능은 종종 원 기능과 연계되어 있지만, 새로운 기능이 진화된다. 파라로그 유전자의 예에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 모두 세린 프로테이나아제 (proteinase) 이고 동일한 종 내에서 함께 발생하는, 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제 및 트롬빈을 인코딩하는 유전자가 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "야생형", "천연형 (native)" 및 "자연발생적" 단백질은, 자연에서 발견되는 것들이다. 용어 "야생형 서열" 및 "야생형 유전자" 는 천연 또는 숙주 세포에서 자연적으로 발생하는 서열을 지칭하는데 본원에서 상호교환하여 사용된다. 천연 발생 단백질을 인코딩하는 유전자는 당업자에게 공지된 일반 방법에 따라 수득될 수 있다. 상기 방법은 일반적으로 관심 단백질의 영역을 인코딩하는 추정 서열을 갖는 표지된 프로브를 합성, 단백질을 발현하는 유기체로부터 게놈 라이브러리를 제조, 및 관심 유전자를 위한 라이브러리를 프로브에 혼성화함으로써 스크리닝하는 것을 포함한다. 이때, 포지티브 혼성화 클론을 지도화 및 서열화한다.

서열간 상동성 정도는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 측정될 수 있다 (예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; Wisconsin Genetics Software Package (Genetictics Computer Group, Madison, WI) 에서의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA 과 같은 프로그램; 및 Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984] 참조).

본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산 서열 동일성 백분율 (%)" 은, 서열의 뉴클레오티드 잔기와 동일한 후보 서열 내 뉴클레오티드 잔기의 백분율로서 정의된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "혼성화" 는 당업계에 공지된 바와 같이, 핵산 한 가닥이 염기쌍을 통해 상보성 가닥과 연결되는 프로세스를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 구절 "혼성화 조건" 은, 혼성화 반응이 수행되는 조건을 지칭한다. 이들 조건은 전형적으로 혼성화가 측정되는 조건의 "엄격성" 정도로 분류된다. 엄격성 정도는 예를 들어 핵산 결합 복합체 또는 프로브의 용융 온도 (Tm) 를 근거로 할 수 있다. 예를 들어, "최대 엄격성" 은 전형적으로 약 Tm-5℃ (프로브의 Tm 보다 5℃ 낮음) 에서 일어나고; "고 엄격성" 은 Tm 보다 약 5-10℃ 미만에서 일어나고; "중간 엄격성" 은 프로브 Tm 보다 약 10-20℃ 미만에서 일어나고; 및 "저 엄격성" 은 Tm 보다 약 20-25℃ 낮은 온도에서 일어난다. 다르게는, 또는 이에 더하여, 혼성화 조건은 하나 이상의 엄격 세정 및/또는 혼성화의 염 또는 이온 강도 조건을 기초로 한다. 예를 들어, 6xSSC = 매우 낮은 엄격성; 3xSSC = 저 내지 중간의 엄격성; 1xSSC = 중 엄격성; 및 0.5xSSC = 고 엄격성이다. 기능적으로, 최대 엄격성 조건은 혼성화 프로브와의 엄격한 동일성 또는 거의 엄격한 동일성을 가진 핵산 서열을 동정하는데 사용될 수 있고; 한편 고 엄격성 조건은 프로브와 약 80% 이상의 서열 동일성을 가진 핵산 서열을 동정하는데 사용된다.

높은 선택성 (selectivity) 을 요구하는 적용에 있어서, 일부 구현예에서는 비교적 엄격한 조건을 이용해 하이브리드를 형성하는 것이 바람직하다 (예를 들어, 비교적 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건을 이용한다).

적어도 2 개의 핵산 또는 폴리펩티드의 문맥에서 구절 "실질적으로 유사한" 및 "실질적으로 동일한" 이란, 전형적으로 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 대조군 (즉, 야생형) 서열과 비교했을 때, 적어도 약 40% 동일성, 적어도 약 50% 동일성, 적어도 약 60% 동일성, 적어도 약 75% 동일성, 적어도 약 80% 동일성, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 동일성, 종종 약 98% 및 약 99% 서열 동일성만큼 많은 동일성을 가진 서열을 포함하는 것을 의미한다. 서열 동일성은 표준 매개변수를 이용해 BLAST, ALIGN, 및 CLUSTAL 과 같은 공지된 프로그램으로 측정할 수 있다. (예를 들어, Altschul, et al, J. Mol. Biol. 215:403-410 [1990]; Henikoff et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 [1989]; Karin et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5873 [1993]; 및 Higgins et al, Gene 73:237 - 244 [1988] 를 참조한다). BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information 를 통해 공개적으로 입수가능하다. 또한, 데이타베이스는 FASTA (Pearson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 [1988]) 를 이용해 검색될 수 있다. 2 개의 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 하나의 징조는 제 1 의 폴리펩티드가 제 2 의 폴리펩티드와 면역학적으로 교차-반응성이라는 점이다. 보존성 아미노산 치환에 의해 상이한 폴리펩티드들이 면역학적으로 교차-반응성인 것이 전형적이다. 따라서, 예를 들면, 한 폴리펩티드가 제 2 의 폴리펩티드와 실질적으로 동일하고, 이때 그 2 개의 펩티드들은 오직 보존성 치환에 의해서만 상이하다. 2 개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 징조는 두 개의 분자가 엄격한 조건 (예를 들어, 중 내지 고 엄격성 범위 내) 에서 서로 혼성화한다는 점이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "회수된", "단리된" 및 "분리된" 은, 자연적으로 결합된 하나 이상의 성분이 제거된, 단백질, 세포, 핵산 또는 아미노산을 지칭한다. 일부 경우에서, 단리된 단백질은 배양액으로 분비된 후 그 배양액에서 회수되는 단백질이다.

용어 "재조합체" 란, 숙주 세포에서 자연적으로 발생되지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 재조합체 분자는, 자연적으로 발생하지 않는 방식으로 함께 연결된 둘 이상의 자연-발생 서열을 포함할 수 있다. 재조합 세포는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 재조합 방법을 이용하여 제조된 단백질은 통상 그러한 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포를 이용하여 제조된다.

용어 "이종성" 이란, 일반적으로 상호간에 결합되지 않는 요소들이다. 예를 들어, 숙주 세포가 이종성 단백질을 생성한다면, 상기 단백질은, 일반적으로 상기 숙주 세포에서 생성되지 않는 단백질이다. 마찬가지로, 이종성 인코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터는 야생형 숙주 세포 내에서 통상 작동적으로 연결되지 않는 인코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터이다. 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 발현과 관련된, 용어 "상동성" 은, 폴리뉴클레오티드 또는 단백질이 발현되는 숙주 세포에서 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "숙주 세포" 는 일반적으로 원핵 또는 진핵 숙주로서, 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 구축된 벡터로 형질전환되거나 또는 트랜스펙션된 숙주이다. 형질전환된 숙주 세포는 단백질 변이체를 인코딩하는 벡터를 복제하거나 또는 원하는 단백질 변이체를 발현할 수 있다. 단백질 변이체의 프리 (pre)- 또는 프리프로 (prepro)-형태를 인코딩하는 벡터의 경우, 상기 변이체는 발현되었을 때, 전형적으로 숙주 세포로부터 숙주 세포 배지 내로 분비된다.

일부 구현예에서, 본 발명은 수성 환경에서 알코올 기질로 아실 공여체로부터의 아실기의 전이 (예를 들어, C2 내지 C20 에스테르) 를 효과적으로 촉매작용시키는 일정한 아실트랜스퍼라아제의 활성에 관련이 있다. 본원에서 상세히 기술되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 이들 효소들의 상기 활성이 활용되어 상쾌한 방향 또는 풍미를 갖는 에스테르를 생성한다. 일부 기타 구현예에서, 이들 효소들의 활성이 세정 적용시 악취를 감소시키는데 활용되는 것이 바람직하다.

임의의 특정 효소, 알코올 기질, 또는 아실 공여체에 국한되는 것으로 의도하지 않으면서, 오로지 본원에서 기술된 방법의 일부 구현예의 이해를 보조하도록, 대상 방법의 일부 구현예들로 수행된 반응을 하기에 예시하였으며, 여기서 "AcT" 는 "아실트랜스퍼라아제" 를 나타낸다.

예를 들어, 또다시, 임의의 특정 효소, 알코올 기질, 또는 아실 공여체에 국한되도록 바라지 않으면서, 단지 본원에서 기술된 방법의 일부 구현예의 이해를 돕고자, 아실트랜스퍼라아제 효소를 적합한 아실 공여체 (예를 들어, 트리글리세라이드, 예컨대 트리부티린 또는 트리아세틴) 로부터 아실기를 게라니올 또는 시트로넬롤 등의 테르펜 알코올로 전이시켜 방향성 에스테르를 생성하는데 활용한다. 마찬가지로, 기타 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제는 오일성 얼룩의 악취를 감소하는데 있어서 유용함이 발견된다. 일부 특정 바람직한 구현예에서, 오일성 얼룩은 유제품 얼룩이다. 이들 악취 감소/예방 구현예에서, 트리글리세라이드의 가수분해에 의해 생성된 악취가 나는 휘발성 지방산 (예를 들어, 부티르산) 의 양을 감소시키도록, AcT 효소가 활용된다. 일부 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제 효소가 적어도 하나의 리파아제 효소와 상조적으로 작용하여 트리아실글리세라이드로부터 아실 사슬의 제거율을 증가시키는 한편, 기타 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제는 알코올 기질에 아실 사슬을 연결시킴으로써 휘발성 지방산보다도 에스테르 생성물을 생성하도록 작용한다. 일부 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제는 상기 양자의 방식 모두로 작용한다. 일부 구현예에서, 트리아실글리세라이드로부터의 아실 사슬은 알코올 기질과 연결되어 방향성 에스테르를 생성한다. 이들 구현예에서, 악취가 나는 휘발성 지방산보다는 방향성 에스테르가 부산물로서 생성된다. 상기 구현예를 도 6 에 도식하였다.

이들 구현예 및 다수의 기타 구현예를 하기에 상세히 설명한다.

하기의 상세한 설명 이전에, 본원에서 논의하는 방법은 아실 공여체로부터 아실기를 알코올 기질로 전이하는 것을 촉매작용하여 에스테르를 생성하는 능력을 가진 상이한 각종 효소들을 이용하는데, 이 방법들에서 유용함이 발견된다는 점을 유의한다. 상기 효소에는 이에 제한되는 것은 아니나, 전형적인 리파아제, 아실-CoA-의존 트랜스퍼라아제, 포스포리파아제, 큐티나아제, GDSX 히드롤라아제, SGNH 히드롤라아제, 세린 프로테아제, 및 에스테라아제, 및 아실 공여체와 접촉시 아실-효소 중간체를 형성하고, 아실기를 물 이외의 수용체로 전이시킬 수 있는 임의의 효소가 포함된다.

일부 구현예에서, 효소는 야생형 효소이며, 기타 구현예에서는, 효소는, 야생형 효소와 비교했을 때, 효소로 하여금 기질 특이성을 변경시키거나 또는 아실 트랜스퍼라아제 활성을 증가시키게 하는 개질된 아미노산 서열을 가진다. 이들 구현예, 그 안에서 유용함이 발견되는 추가의 성분들을 추가로 설명하는데 있어서, 본 발명을 제시한다.

아실트랜스퍼라아제

상기에서 본 바와 같이, 본 발명은 적어도 하나의 아실트랜스퍼라아제를 함유하는 에스테르-생성 조성물, 및 효소(들)을 이용하는 방법을 제공한다. 본 조성물의 아실트랜스퍼라아제는 아실 공여체로부터 아실기를 알코올 기질로 전이하는 것을 촉진할 수 있는 임의의 효소를 포함한다는 점이 고려된다. 상기에서 주목되는 바와 같이, 여러 종류의 효소들에 있어서, 본 발명의 방법면에서 유용함이 발견된다. 이들 구현예에서, 활용되는 효소는 물 보다는 알코올 기질에 더 높은 특이성을 지닌다. 이들 구현예의 일부에서는, 효소는 비교적 낮은 가수분해 활성 (즉, 물의 존재하에서 아실 공여체를 가수분해하는 능력이 비교적 열악함) 및 비교적 높은 아실트랜스퍼라아제 활성 (즉, 수성 환경에서 알코올의 존재하, 아실 공여체를 가수분해하는 능력이 더 나음) 을 보이는데, 여기서, 알코올분해 : 가수분해의 비율은 약 1.0 초과, 적어도 약 1.5, 또는 적어도 약 2.0 의 비율이다. 일부 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제는 또한 물 보다는 과산화물에 대해서 더 높은 특이성을 지녀, 과산 세정제 제조를 도모한다 (예를 들어, 과가수분해 (perhydrolysis) : 가수분해 비율이 약 1.0 초과, 적어도 약 1.5, 또는 적어도 약 2.0 의 비율).

일부 구현예에서, GDSX 아실트랜스퍼라아제, 특히 SGNH 아실트랜스퍼라아제에서 유용함이 발견된다. 본 발명에서 유용함이 발견되는 시범사례의 SGNH 아실트랜스퍼라아제에는 NCBI 의 GENBANK® 데이타베이스에 하기 기탁 번호로 기탁되어 있는 야생형 SGNH 아실트랜스퍼라아제가 포함된다: YP_890535 (GID: 11846860; 또한 WO05/056782; M. 스메그마티스 참조); NP_436338.1 (GID: 16263545; 시노리조븀 멜리로티 (Sinorhizobium meliloti)); ZP_01549788.1 (GID: 118592396; 스타피아 집합체 (Stappia aggregate); NP_066659.1 (GID: 10954724; 아그로박테리움 리조진 (Agrobacterium rhizogenes)); YP_368715.1 (GID: 78065946; 부르크홀더리아 종 (Burkholderia sp .)); YP_674187.1 (GID: 110633979; 메조리조븀 종 (Mesorhizobium sp .)); 및 NP_532123.1 (GID: 17935333; 아그로박테리움 튜메파시엔 (Agrobacterium tumefaciens)), 야생형 오르토로그 및 그의 상동체, 및 상기 야생형 효소 중 임의의 것과, 아미노산 서열이 적어도 약 70% 동일, 적어도 약 80% 동일, 적어도 약 90% 동일, 적어도 약 95% 동일, 또는 적어도 적어도 약 98% 동일한 상기의 변형체가 포함된다. 이들 GENBANK® 기탁은 그 안에 있는 핵산 및 단백질 서열 및 상기 서열의 주석을 포함해, 전체가 참조로 인용된다. 추가 상기 효소들의 예는 당업계에 공지된 표준 서열 비교 방법 (예를 들어, BLAST 등) 을 이용하여 NCBI 의 GENBANK® 데이타베이스의 서열 상동성을 근거로 검색하여 수득한다. 일부 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제는 GENBANK® 등록 YP_890535 (GID: 11846860; M 스메그마티스; 또한 WO05/056782 참조) 에 기재된 아미노산과 적어도 약 70% 가 동일한 아미노산 서열을 가진다.

추가 시범사례의 SGNH 아실트랜스퍼라아제 효소에는, 이의 종 및 GENBANK® 기탁 번호가 참조되어 있는 하기가 포함된다: 아그로박테리움 리조진 (Q9KWA6), A. 리조진 (Q9KWB1), A. 튜메파시엔 (Q8UFG4), A. 튜메파시엔 (Q8UAC0), A. 튜메파시엔 (Q9ZI09), A. 튜메파시엔 (ACA), 프로스테코박터 데종게이 (Prosthecobacter dejongeii) (RVM04532), 리조븀 로티 (Rhizobium loti) (Q98MY5), R. 멜리로티 (Q92XZ1), R. 멜리로티 (Q9EV56), R. 리조진 (NF006), R. 리조진 (NF00602875), R. 솔라나세라룸 (solanacerarum) (Q8XQI0), 시노리조븀 멜리로티 (RSM02162), S.멜리로티 (RSM05666), 메조리조븀 로티 (Mesorhizobium loti) (RMLO00301), A. 리조진 (Q9KWA6), A. 리조진 (Q9KWB1), 아그로박테리움 튜메파시엔 (AAD02335), 메조리조븀 로티 (Q98MY5), 메조리조븀 로티 (ZPOO197751), 랄스토니아 솔라나세아룸 (Ralstonia solanacearum) (Q8XQI0), 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) (ZPOO166901), 모락셀라 보비스 (Moraxella bovis) (AAK53448), 부르크홀더리아 세파시아 (Burkholderia cepacia) (ZP00216984), 크로모박테리움 비오라세움 (Chromobacterium violaceum) (Q7NRP5), 피렐루라 종 (Pirellula sp .) (NP_865746), 비브리오 불니피큐스 (Vibrio vulnificus) (AA007232), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) (AAC38796), 시노리조븀 멜리로티 (SMa1993), 시노리조븀 멜리로티 (Q92XZ1) 및 시노리조븀 멜리로티 (Q9EV56). 이들 단백질의 아미노산 서열, 서열 정렬, 및 상기와 관련된 기타의 모든 정보가 WO05/056782 의 모든 취지에 대해 본원에서 참조 인용된다.

이러한 효소의 수 가지 예들을 구체화하였고, 그의 활성을 보유 또는 변경하는 변이체 효소에 대해 제공되는 다수의 시범사례의 아미노산 치환은 WO05/056782 에 기술되어 있는데, 이는 참조 인용되어 있다. 일부 구현예에서 또는 그로 인해 허용되어진 수백개의 아미노산 치환 목록에는 가수분해 활성, 과가수분해 활성, 과산 분해 활성 및/또는 M.스메그마티스 퍼히드롤라아제의 안정성을 변경시키는데 있어서 유용함이 발견되며, WO05/056782 의 표 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 및 10-9 에 기술되어 있다. SGNH 아실트랜스퍼라아제의 구조적 유사성이 주어진다면, WO05/056782 에 기술된 아미노산 치환은 SGNH 아실트랜스퍼라아제 계통의 다른 원들로 용이하게 전이가능하다. 각각의 WO05/056782 에 기술된 아미노산 치환 및 이들 치환으로 생성된 아미노산 서열이 본원에 참조 인용된다.

일부 구현예에서, 본원에서 활용된 아실트랜스퍼라아제는 아세틸-CoA 의존 효소가 아니다. 일부 대안적인 구현예에서, 즉각적인 방법에 사용된 GDSX 또는 SGNH 아실트랜스퍼라아제는 야생형 아실트랜스퍼라아제 칸디다 파라프실로시스 (Candida parapsilosis), 에로모나스 히드라필라 (Aeromonas hydrophila), 또는 에로모나스 살모니시다 (Aeromonas salmonicida) 이며, 한편 다른 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제는 상기와 적어도 약 95% 동일한 상기의 변이체이다.

본 발명에서 사용된 아실트랜스퍼라아제는 당업계에 공지된 바와 같은 통상의 방법을 이용하여 제조 및 단리된다. 일부 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제의 제조는 재조합 방법 및 천연형이 아닌 숙주를 이용하여 수행되는데, 상기 둘 중 하나는 아실트랜스퍼라아제를 세포내에 생성하거나 또는 아실트랜스퍼라아제를 분비한다. 일부 구현예에서, 신호 서열이 효소에 첨가되어, 원형질막 주위 공간 (즉, 대장균과 같은 그람-음성 개체에서), 또는 세포외 공간 (즉, 바실러스 (Bacillus) 및 액티노마이시트 (Actinomycete) 와 같은 그람-양성 개체), 또는 진핵 숙주 (예를 들어, 트리코데르마 (Trichoderma), 아스페르길러스 (Aspergillus), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 및 피키아 (Pichia)) 로의 분비에 의한 효소의 발현을 촉진시킨다. 각종 기타 유기체가 본 발명에서 발현 숙주로서 유용하다는 점이 발견되므로, 이들 특정한 숙주로 본 발명의 임의의 측면이 국한되는 것을 의도하지는 않는다.

예를 들어, 바실러스 세포는 세포외 단백질 (예를 들어, 프로테아제) 의 발현에 적합한 숙주로서 익히 공지되어 있다. 단백질의 세포내 발현은 덜 자세히 공지되어 있다. 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilis) 에서 효소 단백질의 세포내 발현은 종종 유전자의 5' 말단 상의 신호 서열의 부재 시에, pVeg, pSPAC, pAprE, 또는 pAmyE 를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 프로모터를 사용하여 달성된다. 일부 구현예에서, 발현은 복제 플라스미드로부터 달성되고 (높거나 또는 낮은 복사 수), 한편 대안의 구현예에서, 발현은 목적하는 구축물을 염색체 내로 혼입함으로써 달성된다. 혼입은 aprE, amyE, 또는 pps 유전자 자리 (locus) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 유전자 자리에서 가능하다. 일부 구현예에서, 효소는 혼입된 구축물의 하나 이상의 복사물로부터 발현된다. 대안의 구현예에서, 다중의 혼입된 복사물은 증폭할 수 있는 구축물의 혼입에 의해 (예를 들어, 직접적인 반복 서열 옆에 있고 항균성 카세트에 연결됨), 또는 다중 복사물의 결찰 및 염색체로의 후속하는 혼입에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 복제 플라스미드 또는 혼입된 구축물을 사용한 효소의 발현은 적절한 배지 내에서 pNB 활성 어세이 (본원에 기술됨) 를 사용하여 모니터링된다.

바실러스를 사용함으로써, 일부 구현예에서, 그람 양성 숙주 스트렙토마이세스 내에서의 효소의 발현은 복제 플라스미드를 사용하여 수행되며, 한편 다른 구현예에서, 효소의 발현은 스트렙토마이세스 염색체 내로 벡터를 혼입함으로써 달성된다. 스트렙토마이세스에서 인지될 수 있는 임의의 프로모터는 효소 유전자의 전사를 구동하는데 있어서 유용함이 발견된다 (예를 들어, 글루코오스 이소머라제 프로모터, A4 프로모터). 셔틀 벡터 또는 스트렙토마이세스 단독이거나, 복제 플라스미드가 또한 본 발명에서 발현에 있어서 유용한 점이 발견된다 (예를 들어, pSECGT).

다른 구현예에서, 효소는 진균류 숙주 세포 (예를 들어, 피키아 종, 아스페르길러스 종 또는 트리코데르마 종 숙주 세포 등) 을 포함하나 이에 제한되지 않는 기타 숙주 세포에서 생성된다.

일부 구현예에서, 숙주 세포를 배양하고 있는 배양 배지에서 효소가 회수가능하도록, 상기 효소는 숙주 세포에서 분비된다.

일단 효소가 배양 배지 내로 분비된다면, 효소는 임의의 적합한 및/또는 통상의 방법 (예를 들어, 침전, 원심분리, 친화력 (affinity), 친화 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 소수 상호작용 크로마토그래피 2-상 분배 (partitioning), 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상 크로마토그래피 또는 양이온 교환 수지, 예컨대 DEAE 상 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 겔 여과 (예를 들어, Sephadex G-75), 여과 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 방법) 으로 회수된다. 실제로, 다수의 적합한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 일부 대안의 구현예에서, 효소가 배양 배지의 다른 성분들로부터의 정제 없이 사용된다. 이들 구현예 중 일부에서, 배양 배지는 단순히 농축된 다음 성장 배지의 성분들로부터 단백질의 추가 정제 없이 사용되는 한편, 다른 구현예에서는, 상기는 임의의 추가 개질 없이 사용된다.

알코올 기질

본 발명에서 유용함이 발견되는 알코올 기질에는 탄소 원자에 결합된 반응성 히드록실기를 함유하는 임의의 유기 분자를 포함하나, 히드록실-함유 다당류 및 단백질은 배제된다. 일부 구현예에서, 알코올 기질은 화학식 Z-OH (식 중, Z 는 임의의 분지형, 직쇄형 사슬, 고리형, 방향족 또는 선형 유기성 기, 또는 이의 임의의 치환된 버젼임) 의 것이다. 일부 구현예에서, Z 는 치환 또는 비치환된, 탄소수 2 내지 30 의, 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 또는 헤테로아릴기이다. 일부 추가 구현예에서, Z 는 지방족 부분 (moiety), 지환족 또는 방향족 부분에 의해 치환된 지방족 부분 (예를 들어, 테르펜) 이다. 일부 기타 구현예에서, 알코올 기질은 폴리올, 예컨대 글리콜-함유 분자 (예를 들어, 테트라에틸렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리테트라히드로푸란) 이다. 적합한 알코올 기질은 단량체 폴리올 (예를 들어, 글리세린), 및 이량체, 삼량체 및 사량체 폴리올, 및 당 알코올, 예컨대 에리트리톨, 이소말티톨, 락티톨, 말티톨, 만니톨, 소르비톨 및 자일리톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리올은 화학식 (Z-OH)_n 또는 Z-(OH)_n (식 중, n 은 적어도 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 또는 약 6 (예를 들어, n 은 1 ~ 4 임) 임) 의 분자이다. 일부 구현예에서, 알코올은 계면활성제 또는 에멀젼화제의 일부로서 존재한다 (예를 들어, 고 선형 제 1 차 알코올, 예컨대 NEODOL™ 세제).

일부 구현예에서, 하기에 기술된 방향성 에스테르 제조 방법에서 사용되는 알코올 기질은, 화학식 Z-OH (식 중, Z 는 지환족 또는 방향족 부분, 또는 예를 들어 테르펜임) 의 것이다.

본 발명의 방법에서 유용함이 발견되는 시범사례의 알코올 기질은 에탄올, 메탄올, 글리세롤, 프로판올, 부타놀, 및 하기 표 1 - 3 에 나타낸 알코올 기질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

아실 공여체

본 발명의 방법에서 활용된 아실 공여체는, 전이가능 아실기를 함유하는 임의의 유기성 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 전형적인 아실 공여체는 화학식 R¹C(=O)OR² (식 중, R¹ 및 R² 는 독립적으로 임의의 유기성 부분임) 의 에스테르이나, 기타 분자에도 또한 유용함이 발견된다. 일부 구현예에서, 적합한 아실 공여체는 단량체이나, 기타 구현예에서, 이들은 이량체, 삼량체 및 더 높은 크기의 폴리올 에스테르를 포함하는 중합체성이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "단 사슬 아실 공여체" 는 R¹C(=O)OR² (식 중, R¹ 은 적어도 1 내지 9 개의 탄소 원자의 사슬을 포함하는 임의의 유기 부분이고, R² 는 임의의 유기 부분임) 의 에스테르이다. 일부 구현예에서, 단 사슬 아실 에스테르는 2 내지 10 개의 탄소 원자 (즉, C₂ - C₁₀ 탄소 사슬) 의 아실 사슬을 포함한다. 시범사례의 장 사슬 아실 에스테르는 C₆, C₇, C₈, C₉, C₁₀ 탄소 사슬을 포함한다. 시범사례의 장 사슬 아실 에스테르는 아세틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 또는 헥실기 등을 포함한다.

"장 사슬 아실 공여체" 는 화학식 R¹C(=O)OR² (식 중, R¹ 은 적어도 10 개의 탄소 원자의 사슬을 포함하는 임의의 유기 부분이고, R² 는 임의의 유기 부분임) 의 에스테르이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 장 사슬 아실 공여체는 C₁₁, C₁₂, C₁₃, C₁₄, C₁₅, C₁₆, C₁₇, C₁₈, C₁₉, C₂₀, C₂₁ 또는 C₂₂ 아실 사슬을 포함한다.

본 발명에서 유용함이 발견되는 시범사례의 에스테르는 하기 화학식의 것을 포함한다:

[식 중,

R¹ 은 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 부분임. 일부 구현예에서, R¹ 은 약 1 내지 약 50,000 개의 탄소 원자, 약 1 내지 약 10,000 개의 탄소 원자, 또는 심지어 약 2 내지 약 100 개의 탄소 원자를 포함함;

각각의 R² 는 임의 치환된 알콕실레이트 부분 (일부 구현예에서, 각각의 R² 는 독립적으로 에톡실레이트, 프로폭실레이트 또는 부톡실레이트 부분임) 임;

R³ 은 하기 화학식을 갖는 에스테르-형성 부분임:

R⁴CO- (식 중, "R⁴" 는 H, 치환 또는 비치환된, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 및 헤테로아릴 (일부 구현예에서, R⁴ 는 치환 또는 비치환된, 직쇄형 또는 분지쇄의, 탄소수 5 내지 22 이상의 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 부분, 탄소수 5 내지 12 이상의 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 또는 헤테로아릴 부분이거나, 또는 R⁴ 는 치환 또는 비치환된 C₅-C₁₀ 또는 더 긴 사슬의 알킬 부분이거나, 또는 R⁴ 는 치환 또는 비치환된 C₁₁-C₂₂ 또는 더 긴 사슬의 알킬 부분임) 임);

x 는 R¹ 이 H 일 때 1 이고; R¹ 이 H 가 아닌 경우에는, x 는 R¹ 내 탄소의 개수 이하의 정수임;

p 는 x 이하인 정수임;

m 은 0 내지 50 의 정수, 0 내지 18 의 정수, 또는 0 내지 12 의 정수임, 및

n 은 적어도 1 임].

본 발명의 일부 구현예에서, 에스테르 부분을 포함하는 분자는 화학식

[식 중,

R¹ 는 C₂-C₃₂ 치환 또는 비치환된 알킬 또는 헤테로알킬 부분임;

각각의 R² 는 독립적으로 에톡실레이트 또는 프로폭실레이트 부분임;

R³ 은 하기 화학식을 갖는 에스테르-형성 부분임:

R⁴CO- (식 중, R⁴ 는 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 및 헤테로아릴이고, 일부 구현예에서, R⁴ 는 치환 또는 비치환된, 직쇄형 또는 분지쇄의, 탄소수 5 내지 22 이상의 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 부분, 치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 12 이상의 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 또는 헤테로아릴 부분이거나, 또는 R⁴ 는 치환 또는 비치환된 C₅-C₁₀ 또는 그 이상의 알킬 부분, 또는 R⁴ 는 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₂ 또는 그 이상의 알킬 부분임);

x 는 R¹ 에서의 탄소 개수 이하인 정수임;

p 는 x 이하의 정수임;

m 은 1 내지 12 의 정수임; 및

n 은 적어도 1 임] 을 갖는 알킬 에톡실레이트 또는 프로폭실레이트이다.

본 발명의 일부 구현예에서, 에스테르 부분을 포함하는 분자는 하기 화학식을 갖는다:

[식 중,

R¹ 은 H 또는 1 차, 2 차, 3 차 또는 4 차 아민 부분을 포함하는 부분이고, 아민 부분을 포함하는 상기 R¹ 부분은 치환 또는 비치환된 알킬, 헤테로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 및 헤테로아릴 부분으로부터 선택됨. 일부 구현예에서, R¹ 은 약 1 내지 약 50,000 개의 탄소 원자, 약 1 내지 약 10,000 개의 탄소 원자, 또는 약 2 내지 약 100 개의 탄소 원자를 포함함;

각각의 R² 는 알콕실레이트 부분 (일부 구현예에서, 각각의 R² 는 독립적으로 에톡실레이트, 프로폭실레이트 또는 부톡실레이트 부분임) 임;

R³ 은 하기 화학식을 갖는 에스테르-형성 부분임:

R⁴CO- (식 중, R⁴ 는 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 및 헤테로아릴 (일부 구현예에서, R⁴ 는 치환 또는 비치환된, 직쇄형 또는 분지쇄의, 탄소수 5 내지 22 의 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 부분임), 치환 또는 비치환된, 탄소수 9 내지 12 이상의 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 또는 헤테로아릴 부분, 또는 R⁴ 는 치환 또는 비치환된 C₅-C₁₀ 또는 그 이상의 알킬 부분, 또는 R⁴ 는 치환 또는 비치환된 C₁₁-C₂₂ 또는 그 이상의 알킬 부분임);

x 는 R¹ 이 H 인 경우 1 이고; R¹ 이 H 가 아닌 경우, x 는 R¹ 에서 탄소의 개수 이하인 정수임;

p 는 x 이하의 정수임;

m 은 0 내지 12 의 정수 또는 1 내지 12 의 정수, 및

n 은 적어도 1 임].

적합한 아실 공여체에는, 아세틸기, 부티릴기, 및 장 사슬 아실기를 각각 제공하는, 트리아세틴, 트리부티린 및 더 긴 사슬의 분자를 포함하나 이에 제한되지 않는 합성 트리글리세라이드, 동물 유래 트리글리세라이드, 유제품 트리글리세라이드 및 식물 유래 트리글리세라이드 등의 임의의 유형의 트리글리세라이드가 포함된다. 디아실글리세라이드, 모노아실글리세라이드, 인지질, 리소인지질, 당지질도 또한 본 발명에서 유용함이 발견된다. 일부 구현예에서, 디아실- 및 트리아실글리세라이드는 동일한 지방산 사슬을 포함하며, 한편 다른 구현예에서는, 이들은 상이한 지방산 사슬을 포함한다. 기타 적합한 에스테르에는, 색-형성 에스테르, 예컨대 p-니트로페놀 에스테르가 포함된다. 추가적인 에스테르로는, 지방족 에스테르 (예를 들어, 에틸 부티레이트), 이소프레노이드 에스테르 (예를 들어, 시트로넬릴 아세테이트) 및 방향족 에스테르 (예를 들어, 벤질 아세테이트) 가 있다.

본 발명의 세정 구현예 일부에서, 아실 공여체가 대상체 (예를 들어, 대상체 상의 얼룩으로서) 에 존재한다. 일부 특정 바람직한 구현예에서, 아실 공여체는 제자리 (in situ) 에서 주제의 조성물에 의해 탈아실화 (de-acylate) 된다.

일부 구현예에서, 본원에서 상세히 기술된 방향성 에스테르-제조 방법 중 일부는 단 사슬 (예를 들어, C2-C10) 의 아실기, 예컨대 아세틸 및 부티릴기의 전이가 요구된다.

세정 조성물

본 발명은 또한 적어도 하나의 아실트랜스퍼라아제 및 적어도 하나의 아실트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질을 포함하는 세정 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 세정 조성물은 제형되어 아실 공여체 분자 (예를 들어, 트리글리세라이드) 로 얼룩진 대상체를 제자리에서 세정한다. 따라서, 일부 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제 및 알코올 기질은 아실 공여체-함유 대상체와 세정 조성물의 접촉 시 검출가능한 에스테르를 생성하는데 유효한 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 세정 조성물은 아실-공여체 함유 대상체와의 접촉시, 아실-공여체 함유 대상체 및 아실트랜스퍼라아제에 의해 촉매작용된 알코올 기질과 아실 공여체 간 반응의 결과로서 생성된 에스테르를 추가로 포함한다. 상기에서 주목되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제는 SGNH 아실트랜스퍼라아제이다. 일부 추가 구현예에서, 세정 조성물은 아실 공여체로부터 아실기가 아실트랜스퍼라아제에 의해 알코올 기질로 전이되는 경우, 직물 관리제 (예를 들어, 계면활성제 에스테르) 가 생성되도록 하는 알코올 기질 및 아실 공여체 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 알코올 기질은, 이것이 또한 세정 조성물 내에 존재하는 계면활성제 또는 에멀젼화제로서 기능한다는 점에서, 이중-용도 분자이다. 상기 알코올 기질의 예에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 지방 알코올 (예를 들어, C8-C18 선형 또는 분지형 지방족 알코올), 예를 들어, 세틸 알코올 (예를 들어, 헥사데칸-1-올), 지방 알코올 유래 지방 알코올 에톡실레이트 (예를 들어 NEODOL™ 에톡실레이트), 및 폴리올 에톡실레이트 (예를 들어, 글리세린 에톡실레이트) 가 포함되며, 이는 통상 세정 조성물에 사용된다.

하기에 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명의 세정 조성물은 고체 (예를 들어, 고체 물질 상에 흡착되는 알코올 기질 및 효소), 액체, 및 젤을 포함하는 임의의 적합한 형태로 제공된다. 일부 바람직한 구현예에서, 조성물은 농축 형태로 제공된다. 기타 구현예에서, 주제의 세정 조성물은 그대로 활용되고, 일부 추가 구현예에서는, 분무 또는 예비-세정 조성물로서 사용된다. 사용시, 세정 조성물의 작용 형태 (예를 들어, 세정 조성물의 용해 또는 희석된 형태) 는 수성이고, 따라서 적어도 약 50% 물을 포함하고, 많은 경우에서는 약 50% 내지 약 99.99% 물을 포함한다. 일부 구현예에서, 알코올 기질의 주제의 세정 조성물 내 작용 농도는 약 0.0001% 내지 약 50% (v/v 또는 w/v), 약 1% 미만, 약 0.1% 미만, 약 0.01% 미만, 또는 약 0.001% 미만 알코올이다. 일부 구현예에서, 주제의 아실트랜스퍼라아제 효소의 세정 조성물 내 작용 농도는 약 0.01 ppm (100 만분의 부, w/v) 내지 약 1000 ppm, 약 0.01 ppm 내지 약 0.05 ppm, 약 0.05 ppm 내지 약 0.1 ppm, 약 0.1 ppm 내지 약 0.5 ppm, 약 0.5 ppm 내지 약 1 ppm, 약 1 ppm 내지 약 5 ppm, 약 5 ppm 내지 약 10 ppm, 약 10 ppm 내지 약 50 ppm, 약 50 ppm 내지 약 100 ppm, 약 100 ppm 내지 약 500 ppm, 또는 약 500 ppm 내지 약 1000 ppm 이다.

일부 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 적어도 하나의 리파아제 (예를 들어, IUBMB 효소 명명법에 따라 EC 3.1.1.3 로 정의된 활성을 가진 트리아실글리세롤 리파아제) 를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 리파아제는 상기에서 기술한 바와 같은 전형적인 리파아제이다. 아실트랜스퍼라아제 및 리파아제가 상조적으로 작용하여 대상체에서 아실글리세라이드 분자 (예를 들어, 트리아실글리세롤) 로부터 아실 사슬을 제거하는 것이 예상된다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 작용의 메카니즘에 국한되는 것으로 의도되지 않는다.

일부 구현예에서, 세정 조성물은 과산화수소 그 자체, 또는 반응 생성물로서 과산화수소를 생성하는 조성물일 수 있는 과산화물 공급원을 포함한다. 반응 생성물로서 과산화수소를 생성하는 적합한 과산화수소 공급원에는 하기로부터 선택되는 과산소 공급원이 포함되나 이에 제한되지 않는다: (i) 약 0.01 내지 약 50, 약 0.1 내지 약 20, 또는 약 1 내지 10 중량% 의 과염 (per-salt), 유기 과산소산 (peroxyacid), 우레아 과산화수소 및 그의 혼합물; (ii) 약 0.01 내지 약 50, 약 0.1 내지 약 20, 또는 약 1 내지 10 중량% 의 탄수화물, 및 약 0.0001 내지 약 1, 약 0.001 내지 약 0.5, 약 0.01 내지 약 0.1 중량% 의 탄수화물 옥시다아제; 및 (iii) 그의 혼합물. 적합한 과염에는 알칼리금속 과붕산염, 알칼리금속 과탄산염, 알칼리금속 과인산염, 알칼리금속 과황산염 및 그의 혼합물이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

일부 바람직한 구현예에서, 당류는 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류 (예를 들어, 탄수화물) 및 그의 혼합물로부터 선택된다. 적합한 당류에는 D-아라비노오스, L-아라비노오스, D-셀로비오스, 2-데옥시-D-갈락토오스, 2-데옥시-D-리보오스, D-프룩토오스, L-푸코오스, D- 갈락토오스, D-글루코오스, D-글리세로-D-굴로-헵토오스, D-락토오스, D-릭소오스, L-릭소오스, D-말토오스, D-만노오스, 멜레지토오스, L-멜리비오스, 팔라티노오스, D-라피노오스, L-람노오스, D-리보오스, L-소르보오스, 스타키오스, 수크로오스, D-트레할로오스, D-자일로오스, L-자일로오스 및 그의 혼합물로부터 선택되는 당류가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

적합한 탄수화물 옥시다아제에는 알도스 옥시다아제 (IUPAC 분류 EC 1.1.3.9), 갈락토오스 옥시다아제 (IUPAC 분류 EC 1.1.3.9), 셀로비오스 옥시다아제 (IUPAC 분류 EC 1.1.3.25), 피라노스 옥시다아제 (IUPAC 분류 EC1.1.3.10), 소르보오스 옥시다아제 (IUPAC 분류 EC1.1.3.11) 및/또는 헥소오스 옥시다아제 (IUPAC 분류 EC 1.1.3.5), 글루코오스 옥시다아제 (IUPAC 분류 EC 1.1.3.4) 및 그의 혼합물로부터 선택되는 탄수화물 옥시다아제가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 세정 조성물로 세정된 아실 공여체-함유 대상체는 오일성 물질 (예를 들어, 트리아실글리세라이드를 포함하는 물질 등) 로 얼룩진다. 일부 구현예에서, 대상체 (예를 들어, 직물) 은 유제품으로 얼룩진다.

하기에 기술되는 방법 수행에 있어서, 필수적이지는 않지만, 일부 구현예에서, 알코올 기질의 선택이 아실 공여체와의 반응시에 방향성 에스테르 생성을 결정한다. 방향성 에스테르를 하기에 자세히 설명한다.

일부 구현예에서, 세정 조성물은 직물 세정 조성물 (즉, 세탁물 세제), 표면 세정 조성물 또는 식기류 세정 조성물 또는 자동 식기세척기 세제 조성물이다. 시범사례의 세정 조성물의 제형물은 본원에 참조 인용되고 있는 WO0001826 에 상세히 기술되어 있다.

일부 구현예에서, 주제의 세정 조성물은 약 1% 내지 약 80%, 약 5% 내지 약 50% (중량 기준) 의 적어도 한 계면활성제 (예를 들어, 비이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제 또는 쯔비터이온성 계면활성제 또는 이의 임의의 혼합물) 를 함유한다. 시범사례의 계면활성제에는 이에 제한되는 것은 아니지만, 선형 알킬 벤젠 술포네이트 및 선형 알킬 소듐 술포네이트를 포함하는 알킬 벤젠 술포네이트 (ABS), 알킬 페녹시 폴리에톡시 에탄올 (예를 들어, 노닐 페녹시 에톡실레이트 또는 노닐 페놀), 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 및 모노에탄올아민이 포함된다. 세제, 특히 세탁물 세제에서 유용함이 발견되는 시범사례의 계면활성제는, U.S. 특허 제 3,664,961 호, 제 3,919,678 호, 제 4,222,905 호, 및 제 4,239,659 호에 기술된 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 세제는 고체이나, 기타 구현예에서는 이는 액체이고, 다른 구현예에서는, 이는 젤이다. 일부 바람직한 구현예에서, 세제는 버퍼 (예를 들어, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨), 세제 증진제(들), 표백제, 표백 활성화제(들), 추가 효소(들), 효소 안정화제(들), 비누거품 부스터(들), 억제제(들), 항-변색제(들), 항부식제(들), 오점 현탁화제(들), 방오제(들) (soil release agent), 살균제(들), pH 조절제(들), 비(非)증진제 알칼리도 공급원(들), 킬레이트제(들), 유기 또는 무기 충전제(들), 용매(들), 하이드로트로프 (들) (hydrotrope), 형광 발광제(들) (optical brightener), 염료(들) 및/또는 향수를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 주제의 세정 조성물은 하나 이상의 기타 효소 (예를 들어, 펙틴 리아제, 엔도글리코시다아제, 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 펙테이트 리아제, 아밀라아제, 만나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 페놀옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀룰라나아제, 탄나아제, 펜토산나아제, 말라나아제, 베타-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 라카아제, 및 아밀라아제) 또는 그의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제와 함께 프로테아제, 리파아제, 큐티나아제 및/또는 셀룰라아제와 같은 통상 적용가능한 효소들을 포함하는 효소들의 조합 (즉, "칵테일") 이 이용된다.

세제 세정 조성물에 유용한 광범위한 종류의 기타 성분들이 또한 본원 조성물에 제공되는데, 여기에는 기타 활성 성분, 담체, 하이드로트롭, 가공 보조제, 염료 또는 안료, 액체 제형물용 용매 등이 포함된다. 추가 증분의 침전이 바람직한 구현예에서, 비누거품 부스터, 예컨대 C₁₀-C₁₆ 알콜아미드가 조성물에, 전형적으로 약 1% 내지 약 10% 수준으로 혼입된다.

일부 구현예에서, 세제 조성물은 물 및 담체와 같은 기타 용매를 함유한다. 메탄올, 에탄올, 프로판올, 및 이소프로판올로 예시되는 저분자량 1 차 또는 2 차 알코올이 적합하다. 1가 (Monohydric) 알코올이 계면활성제를 용해하는데 바람직하나, 폴리올, 예컨대 약 2 내지 약 6 개의 탄소 원자 및 약 2 내지 약 6 개의 히드록시기를 포함하는 것 (예를 들어, 1,3-프로판디올, 에틸렌 글리콜, 글리세린 및 1,2-프로판디올) 에서 유용함이 또한 발견된다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 5% 내지 약 90%, 전형적으로 약 10% 내지 약 50% 의 상기 담체를 포함한다.

일부 구현예에서, 본원에 제공되는 세제 조성물은 수성 세정 조작에 사용되는 동안, 세정 물의 pH 가 약 6.8 내지 약 11.0 이 되도록 제형된다. 따라서, 완제품은 전형적으로 상기 범위 내에서 제형된다. 권고되는 취급 수준에서 pH 를 조절하는 기술에는, 버퍼, 알칼리, 산 등을 이용하는 것이 포함되고, 이는 익히 당업자에게 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 세정 조성물은 약 pH 9.0 내지 약 pH 11.5, 약 pH 9.0 내지 약 pH 9.5, 약 pH 9.5 내지 약 pH 10.0, 약 pH 10.0 내지 약 pH 10.5, 약 pH 10.5 내지 약 pH 11.0, 또는 약 pH 11.0 내지 약 pH 11.5 의 범위에서 작동 pH 를 갖는 자동 식기세척기 세제를 포함한다. 일부 기타 구현예에서, 세정 조성물은 약 pH 7.5 내지 약 pH 8.5, 약 pH 7.5 내지 약 pH 8.0, 또는 약 pH 8.0 내지 약 pH 8.5 의 범위에서 작동 pH 를 갖는 액체 세탁물 세제를 포함한다. 일부 기타 구현예에서, 세정 조성물은 약 pH 9.5 내지 약 pH 10.5, 약 pH 9.5 내지 약 pH 10.0, 또는 약 pH 10.0 내지 약 pH 10.5 의 범위에서 작동 pH 를 갖는 고체 세탁물 세제를 포함한다.

각종 표백 화합물, 예컨대 과탄산염, 과붕산염 등이 또한 본 발명의 조성물에서 전형적으로는 약 1 중량% 내지 약 15 중량% 의 수준에서 유용함이 발견된다. 원하는 바 대로, 그러한 조성물은 또한 테트라아세틸 에틸렌디아민, 노나노일옥시벤젠 술포네이트 등과 같은 표백 활성화제를 포함하며, 이는 당업계에 공지되어 있다. 취급 수준은 전형적으로 약 1 중량% 내지 약 10 중량% 범위이다.

각종 방오제, 특히 음이온성 올리고에스테르 유형의 것, 각종 킬레이트제, 특히 아미노포스포네이트 및 에틸렌디아민디숙시네이트, 각종 점토 오점 제거제 (clay soil removal agent), 특히 에톡실레이트화 테트라에틸렌 펜타민, 각종 분산제, 특히 폴리아크릴레이트 및 폴리아스파라테이트, 각종 발광제, 특히 음이온성 발광제, 각종 비누거품 억제제, 특히 실리콘 및 2 차 알코올, 각종 직물 연화제, 특히 스멕타이트 점토 (smectite clay) 등 모두가 본 조성물의 다양한 구현예에서 약 1 중량% 내지 약 35 중량% 의 범위 수준에서 유용함이 발견된다. 표준 제형 방식이 당업자에게는 익히 공지되어 있다.

효소 안정화제도 또한 본 세정 조성물의 일부 구현예에서 유용함이 발견된다. 이러한 안정화제에는 이에 제한되는 것은 아니나, 프로필렌 글리콜 (바람직하게는 약 1% 내지 약 10%), 소듐 포르메이트 (바람직하게는 약 0.1% 내지 약 1%), 및 칼슘 포르메이트 (바람직하게는 약 0.1% 내지 약 1%) 이 포함된다.

게다가 추가 구현예에서, 본 발명의 세정 조성물은 또한 적어도 하나의 증진제를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 증진제는 조성물에 약 5 중량% 내지 약 50 중량% 의 수준으로 존재한다. 전형적인 증진제에는, 1-10 미크론 제올라이트, 폴리카르복실레이트, 예컨대 시트레이트 및 옥시디숙시네이트, 층을 이룬 실리케이트, 포스페이트 등이 포함된다. 기타 통상적인 증진제는 표준 제형 방식에 기술되어 있으며, 이는 당업자에게 익히 공지되어 있다.

기타 임의의 성분들은 킬레이트제, 점토 오점 제거/재퇴적 방지제, 중합체성 분산제, 표백제, 광택제, 비누거품 억제제, 용매 및 미용제를 포함한다.

본 발명은 또한 본원에서 제공된 세정 조성물의 사용 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 세정 방법은 하기를 포함한다: 적어도 하나의 아실트랜스퍼라아제, 적어도 하나의 아실트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질, 및 아실-공여체 함유 물질로 더럽혀진 대상체를 조합하는 것; 여기서 상기 아실트랜스퍼라아제는 아실 공여체로부터 아실기를 알코올 기질 상으로 전이하는 것을 촉매작용하여 에스테르를 생성시킨다. 일부 구현예에서, 알코올 기질은 결과로 나타나는 방향성 에스테르를 생성하도록 선택된다. 일부 기타 구현예에서, 아실기는 계면활성제 또는 에멀젼화제 또는 상기에 목록된 다른 제제 중 하나 이상으로 전이된다. 일부 구현예에서, 세정 조성물은 방향성을 제공하는 것 이외에 다른 세정 기능을 수행하지 않는 (즉, 계면활성제, 에멀젼화제, 산화제 등으로서 역할을 하지 않음) 아실 공여체를 추가로 포함한다. 이러한 아실 공여체는 이에 제한되는 것은 아니나, 트리아세틴 및 트리부티린을 포함한다.

일부 대안의 구현예에서, 본 발명의 세정 방법은 세정 특성을 가진 에스테르, 예컨대 세척 동안 세정 활성을 지닌, 에스테르 계면활성제 또는 에스테르 에멀젼화제를 생성하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 대상체는 직물 (의류, 실내장식품, 카페트, 침구류, 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아님), 또는 경질 표면 (주방 겉면, 침실 겉면, 타일 등) 또는 식기류일 수 있다. 일부 구현예에서, 직물은 오일-함유 물질, 예컨대 트리아실글리세라이드-함유 물질로 더럽혀진다. 일부 구현예에서, 오일-함유 물질은 적어도 하나의 C4-C18 트리아실글리세라이드를 포함한다 (예를 들어, 유제품).

일부 구현예에서, 세정 방법은 아세틸 트랜스퍼라아제를 함유하나, 리파아제 (예를 들어, 전형적인 리파아제) 를 포함하지 않는 세정 조성물을 이용한다. 일부 대안의 구현예에서, 주제의 세정 방법은 주제의 아세틸트랜스퍼라아제 및 리파아제 (예를 들어, Lipolase™, Lipozym™, Lipomax™, Lipex™, Amano™ 리파아제, Toyo-Jozo™ 리파아제, Meito™ 리파아제 또는 Diosynth™) 를 함유하는 세정 조성물을 활용한다. 일부 구현예에서, 특정 아실트랜스퍼라아제-리파아제 조합을 이용하면, 리파아제 효소를 단독으로 이용하는 방법을 수행할 때보다 악취가 현저히 덜하다. 본 발명은 임의의 특정 메카니즘 또는 이론에 국한되어야 한다는 것을 의도하지 않는다. 그러나, 아실트랜스퍼라아제 및 리파아제가 상조적으로 작용하여 트리아실글리세라이드 (예를 들어, 부티르산-함유 트리아실글리세라이드) 로부터 아실기를 제거하여 악취를 감소시키는 것이 고려된다.

따라서, 일부 구현예에서, 세정 조성물 내 아실트랜스퍼라아제를 사용하면, 아실트랜스퍼라아제를 함유하지 않는 등가의 세정 조성물과 비교시, 악취를 야기하는 지방산에 있어서 약 10% 초과 감소, 악취를 야기하는 지방산에 있어서 약 20% 감소, 악취를 야기하는 지방산에 있어서 약 30% 초과 감소, 악취를 야기하는 지방산에 있어서 약 50% 초과 감소, 악취를 야기하는 지방산에 있어서 약 70% 초과 감소, 악취를 야기하는 지방산에 있어서 약 80% 초과 감소 또는 악취를 야기하는 지방산에 있어서 약 90% 초과 감소를 초래한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 세정 조성물 내 주제의 아실트랜스퍼라아제의 사용으로 악취를 발생하지 않는다.

방향성 에스테르의 생성을 위한 조성물

상기에서 주목되는 바와 같이, 본 발명은 방향성 에스테르의 제조를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 아실트랜스퍼라아제, 아실트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질, 및 아실 공여체를 포함한다. 이들 구현예 중 일부에서, 아실트랜스퍼라아제는 수성 환경에서 아실 공여체로부터 아실기를 알코올 기질로 전이하는 것을 촉매작용하여 방향성 에스테르를 생성시킨다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 실질적으로 건조 (예를 들어, 탈수된) 조성물이며, 이때에는 방향성 에스테르는 조성물의 재수화시에만 오직 생성된다. 다른 구현예에서, 조성물은 방향성 에스테르를 추가로 포함하는 수성 조성물이다.

많은 구현예에서, 조성물의 아실 공여체 및 알코올 기질이 선택되어 특정 방향성 에스테르를 생성한다. 주제의 조성물을 이용하여 생성된 시범사례의 방향성 에스테르는 그 에스테르 제조를 위한 아실 공여체 및 알코올 기질의 적합한 조합과 함께 하기 표 1-3 에 나타낸다. 기타 방향성 에스테르는 공지되어 있으며, 그러한 방향성 에스테르의 분자 구조가 주어진다면, 주제의 아실트랜스퍼라아제의 존재하에서 조합될 수 있는 에스테르 및 알코올 기질은 명백해질 것이다. 이들 표에서, "AcT" 는 M.스메그마티스의 야생형 아실트랜스퍼라아제이고, "KLM3" 는 에로모나스 종의 아실트랜스퍼라아제인데, 이는 WO04/064987 에 기술된 바와 같고, Lipomax™ 는 슈도모나스 알칼리진 (Pseudomonas alcaligenes) 유래의 리파아제이다 (Genencor).

일부 구현예에서, SGNH 아실트랜스퍼라아제는 컬럼 또는 겔과 같은 기질 (예를 들어, 고체 또는 반고체 지지체) 상에 고정되어, 효소로부터 알코올 기질 및 아실 공여체를 세정함으로써 반응을 종결 가능하게 한다.

방향성 에스테르의 제조 방법

상술한 조성물은 적어도 하나의 아실트랜스퍼라아제, 적어도 하나의 아실트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질 및 적어도 하나의 아실 공여체를 조합하는 것을 일반적으로 포함하는 각종 방향성-에스테르 제조 방법에 있어서 유용함이 발견되는데, 이때 수성 환경에서 상기 아실트랜스퍼라아제는 상기 아실 공여체로부터 아실기를 알코올 기질 상으로 전이하는 것을 촉매작용하여 방향성 에스테르를 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 성분들을 조합한 후, 이들을 재수화하는 것을 포함한다. 일부 대안의 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제, 알코올 기질 및 아실 공여체는 수성 환경에서 조합된다. 상기에서 주목되는 바와 같이, 일부 대안의 구현예에서, 아실트랜스퍼라아제는 SGNH 아실트랜스퍼라아제이다.

이들 방법은 방향성 에스테르가 바람직한 각종 방법에서 유용함이 발견된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조성물은 식료품에 혼입되어 소비하는 동안 풍미 또는 방향을 개선 또는 생성시키거나, 또는 상술한 바와 같이 세정 방법에 사용된다. 일부 추가 구현예에서, 조성물은 에스테르 제조 방법에 사용된다.

한 실시예에서, 방향성 에스테르-생성 조성물은 건조 형태 (예를 들어, 기질 상에 흡착됨) 로 츄잉검 또는 캔디와 같은 식료품에 혼입된다. 식료품의 재수화 (예를 들어, 저작 동안 또는 물 또는 우유와 같은 수분 함유 액체의 첨가에 의해) 는 아실트랜스퍼라아제 반응을 개시시켜 제자리에서 방향성 에스테르를 생성한다. 마찬가지로, 일부 구현예에서, 상기 방법은 음식, 향수 및/또는 세정 산업에 사용되어 벌크 방향성 에스테르 제조한다.

일부 구현예에서, 알코올 기질은 방향성 알코올 그 자체이다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 상술한 반응의 냄새는 시간이 경과함에 따라 변한다 (예를 들어, 방향성 알코올 기질의 냄새에서 그 알코올의 에스테르의 냄새로).

일부 추가 구현예에서, 방향성 알코올은 장 아실 사슬 (예를 들어, 장 사슬 지방산) 을 이용하여 트랜스에스테르화되어 비(非)방향성 에스테르를 생성한다. 이들 구현예의 일부에서, 비방향성 에스테르는 시간 경과에 따라 자연적으로 또는 히드롤라아제의 존재하에서 가수분해되어 방향성 알코올을 재생한다.

제자리에서의 계면활성제 에스테르의 제조 방법

일부 구현예에서, 지질의 제자리 개질은 아실트랜스퍼라아제, 인지질 및 소르비톨을 함유하는 입자를 이용해 수행된다. 일부 구현예에서, 입자는 당업자에게 공지된 "Bariere System" 에 구체적으로 나타낸 바와 같이, 나노캡슐화, 마이크로캡슐화, 타정, 펠렛화 및/또는 WAX 에스테르의 코팅을 이용하여 제조된 형태를 포함한다.

일부 구현예에서, 추가 코팅이 온도 보호 기술 (temperature protection technology; TPT) 시스템에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, 지질 기질인 인지질 및 수용체 분자인 소르비톨 양자의 농도는 세척 공정에서 매우 낮아, 녹색 세제의 제조를 국한시킨다. 일부 구현예에서, 기질 및 수용체 분자를 KLM3 효소와 함께 폐쇄 구획에서 포함시킴으로써, 반응물의 농도가 신속한 생전환 공정을 위해 충분히 높다는 점을 확실히 한다. 일부 구현예에서, 온도 및 습도의 규정된 조건에서 저장 동안, KLM3 가 제자리 개질 공정을 촉매작용하고, 이로 인해 리소-PC 및 소르비톨-아실 에스테르를 제조한다. 인지질 (PC) 의 완전한 전환을 허용하기 위해, PC 와 소르비톨간 비율은, PC : 소르비톨에 대해서, 약 1 : 2; 약 1 : 5, 약 1 : 10, 약 1 : 50, 또는 가장 바람직하게는 약 1: 100 의 비율로 최적화된다. 일부 구현예에서, 최상의 세제 조성물을 공급하기 위해, 인지질 모두를 리소-인지질 유도체 및 등가의 양의 소르비톨-아실 에스테르로 전환한다. 최적의 KLM3 아실트랜스퍼라아제 돌연변이를 이용하면, 효소에 의한 반응은 상당량의 자유 지방산 없이 오직 리소-인지질 및 소르비톨-아실 에스테르만 도모한다. 세제의 강력한 효과를 달성하기 위해, 인지질 모두는 리소-인지질 유도체로 전환한다.

일부 구현예에서, 생화학 반응은 캡슐화 후에 일어나고, 일부 구현예에서는, 추가의 보존 시간 (shelf time) 을 요구한다. 반응이 완료될 때, 입자들을 세척 분말에 첨가하다. 입자는 세척 공정 동안 가용되고, 세제가 방출된다. 큰 범위의 기질 (지방산의 트리글리세라이드, 디글리세라이드, 모노글리세라이드, 인지질, 갈락토지질, 비닐에스테르, 메틸 에스테르 등) 모두에서 유용함이 발견된다. 마찬가지로, 다수의 수용체 분자도 적합하다. 이들 수용체는 소르비톨, 자일리톨, 글루코오스, 말토오스, 수크로오스, 폴리올 및 장, 중 및 단 사슬 알코올, 다당류, 예컨대 이들 다당류에서 유래된 올리고당, 펙틱, 전분, 갈락토만난, 알기네이트, 카라기난 키토산 및 가수분해된 키토산을 포함한다. 구현예에 덧붙여, 수용체 분자는 폴리펩티드 및 펩티드이다.

아실트랜스퍼라아제 효소, 아미노산 변경, 결정 구조, 어세이 방법, 사용 방법, 서열, 상동체, 오르토로그, 서열 정렬, 도면, 표, 세정 조성물 등의 모든 기재내용을 포함하나, 이에 제한되지 않는 WO05/056782 의 전체 개시는 모든 취지를 위해 본원에서 참조 인용된다.

실험

하기의 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 구현예 및 관점을 설명하고 추가로 예시하기 위해서 제공되며, 이의 범주를 제한하는 것으로 해석하지는 않는다.

PCT 공보 WO05/056782 는 아실트랜스퍼라아제 효소의 동정 및 용도에 관한 것이다. PCT 공보 WO05/056782 의 각각의 실시예 1 내지 27 이, 상기 문헌에서 하기를 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 개시된 모든 방법을 본원에 참조로 개시하기 위해 개별적으로 삽입되었다: 아실트랜스퍼라아제의 제조 방법, 아실트랜스퍼라아제의 동정 방법, 아실트랜스퍼라아제의 시험 방법, 아실트랜스퍼라아제 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열, 아실트랜스퍼라아제의 이용 방법 및 아실트랜스퍼라아제가 이용될 수 있는 조성물.

실시예 1

시스 -3- 헥세놀 , 2- 페닐에탄올 및 이소아밀 알코올의 아실화

시스-3-헥세놀, 2-페닐에탄올 및 이소아밀 알코올의 아실화를 수중에서 트리부티린 및 가용성 아실트랜스퍼라아제와 함께 수행했다.

전형적인 절차에서, 200 mM 포스페이트 버퍼, pH 7 (500 uL) 중에서 알코올 (2 uL) 및 트리부티린 (2 uL) 를 아실트랜스퍼라아제 (M. 스메그마티스; AcT) (34 ppm) 또는 KLM3' (20 ppm) 로 45℃ 에서 40 분 동안 처리했다. 이어서, 디클로로메탄 (500 uL) 을 각 바이알에 첨가한 후, 보텍스 (vortex) 교반 (10 초) 및 원심분리하여 유기 및 수성 층을 분리했다. 이어서, 유기층을 제거하고, GC/MS 로 분석했다. 상기 분석을 30m x 0.25mm (0.25 ㎛ 필름) HP-5MS 컬럼을 이용해 Agilent 6890 GC/MS 로 수행했다. 상기 GC/MS 방법은 헬륨을 담체 기체 (1 cc/분) 로서 사용하고, 250℃ 의 주입 포트 온도 및 20: 1 의 분할률을 이용했다. 오븐 온도 프로그램은 60℃ 에서 1 분간 유지하면서 출발해, 30℃/분으로 300℃ 로 총 10 분의 실행시간 동안 증가시킨다. 질량 검출기를 30 내지 400 AMU 으로 2 분 후 주입 스캐닝에서 개시하였다.

도 1 은 이들 실험 각각에서 알코올 부분이 그의 각 부티르산 에스테르로 전환되는 것을 나타낸다. 상기 양은 KLM3' 보다, ACT 로 하였을 때 현저하게 더 컸다.

실시예 2

시트로넬롤 및 게라니올의 아실화

트리아세틴 및 트리부티린 둘 모두를 아실 공여체로 이용하면서, 테르펜 알코올인 시트로넬롤 (1) 및 게라니올 (2) 를 아실트랜스퍼라아제 AcT 및 KLM3' 에 대한 기질로서 평가하였다.

테르펜 알코올 (2uL) 과, 트리아세틴 또는 트리부티린 (2 uL) 중 하나를 50 mM 포스페이트 버퍼, pH 7 (500 uL) 중에서, AcT (34 ppm) 또는 KLM3' (20 ppm) 으로 45℃ 에서 40 분 동안 처리했다. 이어서, 분취량 (50 uL) 을 각 반응물로부터 제거하여, 메탄올/디클로로메탄 (1:3, 500 uL) 로 희석하고, 에스테르 생성의 증거를 위해 GC/MS 로 분석했다. 그 결과를 표 4 에 제공한다.

실시예 3

직물 I 상에 흡착된 아실트랜스퍼라아제를 이용하는 수 중 알코올의 아실화

1 mL 분취량의 아실트랜스퍼라아제 용액 (pH 8, 5 mM HEPES 버퍼 중 100 ppm) 을 면 니트 천 (10 x 10 cm) 의 사각형 섹션 중심에 첨가하고, 상기 천을 하룻밤 통풍시켰다.

50 mM 소듐 포스페이트 버퍼, pH 7 중, 벤질 알코올 (1 % v/v) 및 트리아세틴 (1 % v/v) 을 함유하는 용액 분취량 (10 mL) 을 AcT 가 흡착되어 있는 천 조각 견본 (swatch) 뿐 아니라 효소가 없는 대조군의 천 조각 견본 양자 모두에 첨가했다. 냄새가 현저하게 나지 않는 대조군과는 달리, AcT 효소를 함유하는 직물에서는 2 분 내에 벤질 아세테이트의 특징적인 냄새가 발생했다.

실시예 4

직물 II 상에 고정된 아실트랜스퍼라아제를 이용하는 수중 알코올의 아실화

니트 면 직물 조각견본 (20 × 20 cm) 을 플라스틱 시트 상에 놓고, AcT (1 ml, 12 mg/mL), 폴리에틸렌이민 (20% w/v 용액 중 500 uL) 및 탈이온수 (1 mL) 로 처리했다. 상기 직물을 주위 조건하에서 하룻밤 건조하게 하고, 그 이후 상기를 플라스틱 시트에서부터 제거하고, 50 mM 소듐 포스페이트 버퍼 (400 mL, pH 7) 중에 느슨한 교반과 함께 하룻밤 담그었다. 이어서, 면 조각견본을 수돗물로 철저하게 헹구고 널어 말리게 했다. 제 2 의 면 조각견본을, 직물에 적용된 효소 혼합물이 상술한 성분에 더하여 라텍스 현탁액 (1 mL 의 AIRFLEX™ 423, AirProducts, Allentown, PA) 을 함유한다는 점을 제외하고는 상술한 방법에 따라 준비했다.

두 개의 조각견본을 나란히 놓고 50 mM 소듐 포스페이트 버퍼 (40 mL, pH 7) 중 벤질 알코올 (2 % v/v) 및 트리아세틴 (2% v/v) 의 수성 용액으로 처리했다. 대조군 조각견본과는 반대로, 벤질 아세테이트의 냄새가 분명히 양 조각견본에서 나타났다. 또한, 상기 조각견본들을, 결합된 AcT 의 가수분해 활성을 시각화하도록, p-니트로페닐 부티레이트 (수 중 10 mM, 200 uL) 의 용액으로 처리했다. 상기 경우, AcT/PEI 로 처리한 면 조각 견본만이 눈에 띄는 색을 나타냈다.

실시예 5

전분 상에 흡착된 트리아세틴 /알코올 혼합물의 재수화에 의한 수중 벤질 알코올의 아실화

벤질 알코올 (0.5 mL) 및 트리아세틴 (0.5 mL) 을 10 g 의 말토덱스트린 (Grain Processing Corp., IA) 에 첨가한 후, 강렬한 기계식 교반을 하여, 냄새가 거의 없거나 전혀 없는 자유롭게 유동하는 분말을 수득했다. 상기 혼합물 일부 (1 g) 를 페트리 접시에 놓은 다음 AcT (1 ppm) 용액으로 처리하였고, 그 결과 5 분 미만 내에 벤질 아세테이트의 특징적인 냄새가 생성되었다. 대조군은 물을 이용하여 수행하였는데, 이는 1 시간 미만 안으로 벤질 아세테이트 생성을 도출하지 못했다.

실시예 6

실리카 졸- 겔에 고정된 AcT 를 이용하는 트랜스에스테르화

아실트랜스퍼라아제 (AcT) 를 실리카 졸 겔에 고정하고, 이를 수성 조건 하에서 방향성 에스테르를 생성하는 능력에 대해서 가용성 형태의 효소와 비교했다.

i) AcT 의 졸 겔 캡슐화

소듐 실리케이트 (27% SiO₂, 14% NaOH, Sigma Aldrich Corp., WI) 및 소듐 메틸 실리코네이트 (수 중 30%, Gelest, NJ) 의 1 : 1 혼합물 분취량 (2.2 mL) 을, 교반과 함께 인산 (4 mL, 1.5 M) 에 첨가했다. 이어서, 아실트랜스퍼라아제 (1 mL, 12 mg/mL) 용액을 상기 혼합물에 첨가하고, 실온에서 겔화가 후에 일어날 때까지 실온에 정치해두었다. 이어서, 생성 겔을 50 mM 포스페이트 버퍼, pH 7 (50 mL) 로 2 회 세척하고, 밀폐된 용기에 하룻밤 경화시켰다.

ii) 시스-3-헥세놀의 에스테르화

상술한 습윤 졸-겔 (0.66 g, 1 mg 의 AcT 에 상당함) 부분을, 50 mM 소듐 포스페이트 버퍼, pH 7 중 시스-3-헥세놀 (20 uL) 및 트리아세틴 (40 uL) 과 함께 인큐베이션했다. 시스-3-헥세놀의 아세틸 에스테르로의 전환을 가용성 AcT (0.5 mg 의 AcT) 를 함유하는 대조군과 비교했다. 분취량 (10 uL) 을 10, 30 및 120 분에 두 반응물에서 취해 GC/MS 로 분석했다. 그 결과를 도 2 에 나타낸다.

30 및 120 분 시간점에서 자유형 효소에서 분명히 보이듯이, 고정된 효소가 자유형 효소보다 더 낮은 비율로 아세틸 에스테르를 형성하는 것이 분명하나 (체류 시간 4.5 분), 고정된 형태의 효소의 제거는 방향성 에스테르의 후속적인 가수분해를 막는다.

실시예 7

AcT 를 이용하는 방향성 에스테르 및 알코올의 트랜스에스테르화

50 mM K 포스페이트 버퍼, pH 7 중 벤질 알코올 및 시트로넬릴 아세테이트 (1% v/v 각각) 혼합물을 실온에서 AcT (10 ppm) 로 처리했다. 수 분 내, 벤질 아세테이트 및 시트로넬롤의 특징적인 냄새가 분명해졌다. 이들 화합물의 존재는 실시예 1 에 기술된 방법을 이용하는 GC/MS 로 확인했다. 실험 결과는 덜 두드러진 냄새를 갖는 전구체로부터의 두 방향제의 동시 생성 가능성을 입증했다.

실시예 8

버터로 더럽혀진 직물로부터 방향성 에스테르 생산

용융 버터 (40-50 mg) 를 6 개의 직편물 (knit woven) 면 조각견본 (각각 250-300 mg) 에 적용하고, 실온에서 냉각되게 했다. 상기 조각견본의 중량을 잰 다음 LIPOMAX 또는 AcT 또는 이 두 효소의 조합으로 처리했다 (표 5). 각 조각 견본을 벤질 알코올 (10 uL, 0.005% v/v) 및 효소(들) 을 함유하는 20 mL 의 5 mM HEPES 버퍼, pH 7 에 첨가했다. 실온에서 20 분 동안 교반한 후, 조각 견본을 꺼내고 두 패널목록으로써 건조 전 후에 냄새에 대해서 평가했다. 총 중량 손실도 또한 건조 후에 측정했다. 그 결과를 표 6 에 요약했다.

실시예 9

트랜스에스테르화 대 가수분해의 비율 측정

트리부티린 (10uL) 을 4% 에탄올을 함유하는 버퍼 (1 mL) 에 첨가하고, AcT 또는 KLM3' + 효소가 없는 대조군으로 40℃ 에서 2 시간에 걸쳐 처리했다. 분취량 (100 uL) 을 각 샘플에서부터 취하고, 디클로로메탄 (900 uL) 으로 희석한 후, GC/MS 분석했다. 에틸 부티레이트 대 부티르산의 비율 및 양을 각 조건에 대해서 기록했다. 대조군에서는 기질의 아실전이 또는 가수분해가 없었다. AcT 처리된 샘플은 트리부티린의 완전한 소화 및 1 : 2 의 부티르산 대 에틸 부티레이트 비율을 보였다. KLM3' 처리된 샘플은 오직 트리부티린 부분 소화를 보였으나, 부티르산 대 에틸 부티레이트 비율은 1 : 5 였다.

실시예 10

가용성 및 고정 형태의 AcT 양자 모두를 이용해 획득된 과산 및 방향제의 동시 제조

AcT, 트리아세틴, 희석 수성 과산화수소 (50 내지 500 ppm) 및 벤질 알코올 (10 - 50 ppm) 의 조합으로 과아세트산 및 방향성 벤질 아세테이트 양자 모두를 제조한다.

벤질 알코올 (50 uL), 글리세롤 트리아세테이트 (트리아세틴, 100 uL) 및 염료 피나시아놀 클로라이드 (80% 아세톤 중 1 mg/mL, 50 uL) 의 용액을 30% 과산화수소 (100 uL) 및 아실트랜스퍼라아제 (100 uL) 의 75 ppm 용액으로 처리했다. 벤질 알코올의 특징적인 방향성이 1 내지 2 분에 검출되었다. 염료는 10 분 이내에 완전히 탈색되었다. 과아세트산의 불쾌한 악취는 실질적으로 방향제로 차폐되었다.

실험을 시클로헥실메탄올 (50 uL) 로 반복하여, 그 결과 염료가 표백되었으며, 방향성 시클로헥실메틸 아세테이트가 형성되었다. AcT 를 뺀 대조군 실험에서는 현저한 방향제 형성 및 염료 표백이 도출되지 않았다.

아실트랜스퍼라아제 (1 mL, 10 ppm) 용액을 소형의 니트 면 조각견본 (5 x 5 cm) 에 첨가하고, 건조되게 하였다. 벤질 알코올 (50 uL), 글리세롤 트리아세테이트 (트리아세틴, 100 uL), 30% 과산화수소 (100 uL) 및 염료 피나시아놀 클로라이드 (50 uL, 80% 아세톤 중 1 mg/mL) 의 용액 1 ~ 2 mL 의 첨가로, 방향성 벤질 아세테이트가 발생하였으며, 염료가 표백되었다.

첨가 순서를 역으로 할 수 있어, 이로 인해 벤질 알코올 (50 uL), 글리세롤 트리아세테이트 (트리아세틴, 100 uL) 및 염료 피나시아놀 클로라이드 (50 uL, 80% 아세톤 중 1 mg/mL) 의 용액 1 ~ 2 mL 를 직물 조각견본에 첨가하고, 건조되게 하였다. AcT (1 mL, 10 ppm) 및 과산화수소 (1 mL, 3%) 를 후속 첨가하여 염료가 보라색에서 무색으로 표백되었고, 벤질 아세테이트의 냄새는 10 분 이내에 야기되었다.

실시예 11

세제 배경에서 트리부티린으로 폴리올의 아실화

A) 1.5 g/L AATCC HDL 을 함유하는 5 mM HEPES 버퍼, pH 7.8 중 트리부티린 (1% v/v) 및 테트라에틸렌글리콜 (1% v/v) 의 에멀젼을 철저한 보르텍스 혼합으로 제조했다. 상기 혼합물의 분취량 (200 uL) 을, 1.5 g/L AATCC HDL 을 함유하는 5 mM HEPES 버퍼, pH 7.8 을 1.8 mL 첨가하여 10 배 희석하고, AcT (10 ppm) 으로 실온에서 교반을 하면서 처리했다. 소량의 분취량 (50 uL) 을 소정의 시간점에서 회수하여 20% 수성 아세토니트릴에 희석한 후 LC/MS 분석을 했다.

LC/MS 분석은, 포지티브 전자분무 (+ve ESI) 모드로 작동하는, Quantum TSQ 3중 4극자 질량 분석기와 결부된 Surveyor HPLC 시스템 상에서 수행했다 (ThermoFisher, San Jose, CA). 사용된 HPLC 컬럼은 Agilent Zorbax SB-Aq C1 8 컬럼 (100 x 2.1 mm) 이었다. 화합물을 용매 A (H₂O 중 25mM 암모늄 포르메이트) 으로 시작해 용매 B (90% 메탄올 + 10% 용매 A) 의 양을 늘리고, 다시 용매 A 로 되돌아가는 구배를 10 분에 걸쳐 이용하여 용리하였다.

처음에 오직 두 출발 물질들, 즉 212 m/z 로 3.9 분에 테트라에틸렌글리콜 및 320 m/z 로 6.9 분에 용리하는 트리부티린을 관찰했다. 두 화합물 모두는 그들의 암모늄 이온 부가물 (adduct) 에 대해 기대되는 m/z 비율을 제공했다. AcT 효소 첨가 후, 테트라에틸렌 글리콜의 모노부티릴 에스테르에 상당하는 282 m/z 로 5.8 분에 용리하는 새로운 피크를 관찰했다 (도 3). 하룻밤 교반 후, 부티르산의 냄새가 분명히 식별가능했다.

B) ¹³C-균일하게 표지된 글리세롤 (¹³C-U-글리세롤) 및 트리부티린을 이용해 상기의 실험을 반복했다. 상기 동위원소-표지된 기질은, 표지된 글리세롤 아실 수용체 (m/z 113) 의 아실화에 의해 형성된 부티레이트 에스테르 (모노- 및 디- 부티린 각각에 대해서 m/z 183 및 253) 를, 트리부티린 아실 공여체 유래의 모노부티린 (m/z 180), 디부티린 (m/z 250) 및 글리세롤 (m/z 110) 사이에서 구별가능하게 했다.

하룻밤 인큐베이션 후 혼합물의 LC/MS 분석 (도 4) 은 표지되지 않은 유사체 외에도, 표지된 모노- 및 디- 부티린의 형성을 나타낸다.

실시예 12

세탁 조건 하에서 유지방으로 더럽혀진 직물로부터의 방향 발생

유지방으로 더럽혀진 면 조각견본을, 자유 단 사슬 지방산 (C4 내지 C8) 의 양을 감소하면서, 유쾌한 냄새가 나는 단 사슬 지방산 에스테르를 생성하는 목적으로, Terg-O-tometer (U. S. Testing, Co. Inc. Hoboken, N. J.) 에서 리파아제 및/또는 아실트랜스퍼라아제 (AcT) + 수용체 알코올의 존재하 세탁 조건으로 세척했다.

유지방으로 더럽혀진 조각견본 (CFT CS-10, Test Fabrics, Inc. West Pittston, PA, USA) (1L Terg 포트 당 6) 을, 리파아제 없이, Lipex (Novozymes)(1.2 ppm), 또는 Lipomax (Genencor)(2 ppm) +/- 아실트랜스퍼라아제 (AcT) (2 ppm) 로, 5 mM HEPES 버퍼, pH 7.8, 경도 6 gpg 중 내구성이 강한 액체 세제 (AATCC HDL) 배경 (1.5 g/L) 에서 처리했다. 벤질 알코올 (1 g/L) 을 77°F 에서 30 분의 세척 기간 이전에 각 포트에 첨가했다.

15 및 30 분 시간점 모두에서, 분취량 (8 mL) 을 각 포트에서 꺼내고, 헥산 (2 mL) 으로 추출했다. 헥산 층을 원심분리에서 수성 층으로부터 분리하고, 1 mL 를 기체 크로마토그래피 (GC) 바이알에 첨가했다. GC/MS 분석을 30m x 0.25mm (0.25 ㎛ 필름) HP-5MS 컬럼을 이용해 Agilent 6890 GC/MS 로 수행했다. 상기 GC/MS 방법은 담체 기체로서 헬륨 (1 cc/분) 을 사용하고, 250℃ 의 주입 포트 온도 및 20: 1 의 분할률을 이용했다. 오븐 온도 프로그램은 60℃ 에서 1 분간 유지로 출발해, 20℃/분으로 240℃ 로 총 10 분의 실행시간 동안 증가시킨다. 질량 검출기를 30 내지 400 AMU 으로 2 분 후 주입 스캐닝에서 개시하였다.

GC/MS 결과를 도 5 및 하기 표 7 에 나타낸다. 벤질 부티레이트는, 대조군 (포트 1) 또는 대조군 + AcT (포트 2) 포트 둘 중 어디에서도 검출되지 않았다. 두 Lipex 및 Lipomax 를 단독으로 했을 때 약간의 벤질 부티레이트를 생성했으며, 전자로 했을 때에는, 두 시간 지점에서 더 많이 생성했다. AcT 의 첨가로, 두 리파아제로 하였을 때 생성된 벤질 부티레이트의 양이 늘어나나, 그 효과는 Lipomax 에 대하였을 때 훨씬 더 큰데, 이는 강한 상승 효과를 시사하는 것이다.

실시예 13

세탁 조건 하 유지방으로 더럽혀진 직물에서의 악취 감소

실시예 12 에서 기술한 세척 실험 후에, 면 조각견본을 하룻밤 건조하고, 악취에 대해 주관적으로 평가하여, 표 8 에 요약했다.

가장 심한 악취는 Lipex 로 처리한 조각견본과 관련 있었다. Lipomax 로 처리한 조각견본은 현저하게 덜한 악취를 가지나, 대조군보다는 심했다. Lipomax + AcT 로 처리한 조각견본은 Lipomax 만으로 처리한 조각견본과 비교했을 때, 악취가 현저히 감소했다.

실시예 14

소르비톨 및 난황으로부터 소르비톨 모노올레에이트를 제조하기 위한 KLM3' 의 용도

지질 아실 트랜스퍼라아제 KLM3 돌연변이 pLA231 를 40 ℃ 에서 4 시간 동안 난황 및 소르비톨을 함유하는 시스템에서 인큐베이션함으로써 테스트했다.

반응 생성물을 유기 용매로 추출하고, 단리된 지질을 HPTLC 및 GLC/MS 로 분석했다. 그 결과, KLM3 돌연변이 pLA 231 의, 소르비톨 및 난황으로부터 소르비톨 모노올레에이트를 생산하는 능력을 확인했다.

세제 산업에서, 상이한 제형으로 소르비톨을 이용하는 것이 공지되어 있다. 또한, 직물은 종종 지방/오일 및 에그를 포함하는 지방성 얼룩을 포함하는 것도 공지되어 있다.

상기 조사의 한 목적은, 세정 용도의 계면활성제를 제조하기 위해, 소르비톨 및 난황의 혼합물에서 KLM3 돌연변이의 효과를 연구하는 것이다.

재료 및 방법

KLM3 변이체 pLA231 : 돌연변이 W122A, A236E, L31F (활성: 1.6 TIPU/ml)

소르비톨, 70% (Danisco)

난황: 저온살균 난황, Hedegaard, DK 9560 Hadsund.

소르비톨 모노올레에이트 참조 성분, Grindsted SMO 아이템 제 452454 호 에서 동정됨

HPTLC

어플리케이터: CAMAG 어플리케이터 AST4.

HPTLC 플레이트: 20 x 10 cm (Merck no. 1.05641)

상기 플레이트를 160℃ 오븐에서 20 ~ 30 분 동안 건조함으로써 이용하기 전에 활성화시켰다.

적용: 클로로포름 :메탄올 (2 : 1) 중에 용해된 8.0μl 의 추출된 지질을 AST4 어플리케이터를 이용해 HPTLC 플레이트에 적용했다.

작동-버퍼 :4: 클로로포름:메탄올:물(74:26:4)

적용/용리 시간: 16 분

전개 유동액: 16% H₃PO₄ 중 6% 큐프리아세테이트

용리 후, 플레이트를 160℃ 에서 오븐에서 10 분 동안 건조하고, 냉각한 다음 전개 유동액에 적신 후 160℃ 에서 6 분 추가 건조했다. 플레이트를 시각적으로 평가하고 스캐닝했다 (Camag TLC 스캐너).

GLC 분석

WCOT 융합 실리카 컬럼 12.5 m x 0.25 mm ID x 0.1 μ 필름 두께 5% 페닐-메틸-실리콘 (CP Sil 8 CB, Chrompack) 가 장착된 Perkin Elmer Autosystem 9000 Capillary Gas Chromatograph

담체 기체: 헬륨

주입기. PSSI 냉 분할 주입 (초기 온도 50℃, 385℃ 까지 가열), 부피 1.0 μl

검출기 FID: 395℃

오븐 프로그램: 1 2 3

오븐 온도, ℃. 90 280 350

등온, 시간, 분. 1 0 10

온도 속도, ℃/분 15 4

샘플 제조: 샘플로부터 추출한 지질을 내부 표준 헵타데칸 0.5 mg/ml 을 함유하는 헵탄:피리딘 (2:1) 0.5 ml 중에 용해했다. 300μl 샘플 용액을 크림프 바이알로 옮기고, 300 μl MSTFA (N-메틸-N-트리메틸실릴-트리플루오르아세아미드) 를 첨가하고 20 분 동안 60℃ 에서 반응시켰다.

실험

KLM3 pLA 231 를 표 9 에 나타낸 방법에 따라 난황 및 소르비톨의 기질에서 테스트했다.

절차

난황 및 소르비톨을 자석교반기로 드램 글라스에서 혼합하고 50℃ 로 가열했다. 효소를 첨가하고 4 시간 동안 50 ℃ 에서 인큐베이션했다.

7.5 ml 클로로포름: 메탄올 2.1 을 첨가하고 Whirley 상에서 혼합함으로써 반응을 중단했다. 지질을 30 분 동안 Rotamix (25 rpm) 상에서 추출하고, 샘플을 10 분 동안 700 g 에서 원심분리했다. 1 ml 의 용매 상을 TLC 및 GLC/MS 분석을 위해 꺼냈다.

결과

샘플 1 및 2 에서의 지질의 HPTLC 분석을 도 7 에 나타내었다.

HPTLC 크로마토그램은 소르비톨 에스테르로 예상되는 극성의 성분의 형성을 보인다.

추가 동정을 위해, 샘플을 GLC/MS 로 분석했다.

효소처리된 샘플 (1) 및 대조군 샘플 (2) 의 GLC 크로마토그램을 도 8 및 도 9 에 나타낸다.

도 8 에서 소르비톨 모노올레에이트로 마킹된 피크의 MS 스펙트럼을 도 10 에 나타내고, 이를 소르비톨 모노올레에이트의 MS 스펙트럼과 비교했다.

반응 생성물의 HPTLC 분석은 극성 성분이 인큐베이션 동안에 형성되는 점을 나타낸다. GLC/MS 분석으로 소르비톨 모노올레에이트가 형성되는 것을 확인했다. 소르비톨 모노올레에이트는 수계에서 계면활성제로서 역할을 할 표면 활성 특성을 가진 극성 성분이다.

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당업자는 본 발명이 언급된 목적을 달성하고, 언급된 목표 및 장점, 뿐 아니라 발명 고유의 것을 수득하기 위해 잘 조정된다는 것을 쉽게 인지한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 대표적인 구현예이고, 예시적이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도된 것은 아니다. 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않고 본원에 개시된 본 발명에 다양한 치환 및 변형이 이뤄질 수 있다는 것을 당업자는 잘 알 것이다.

본원에 설명으로 기재된 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들이 없어도 적합하게 실시될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 상세한 설명의 용어로서 사용되고 제한이 없으며, 그러한 용어 및 표현의 사용에 있어서, 제시되고 기재된 특징 또는 그의 일부의 임의의 동등물을 배제하려는 의도가 없으나, 청구된 본 발명의 범주 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것이 인지된다. 그러므로, 본 발명이 일부의 구현예 및 임의의 특징을 참고로 하여 구체적으로 개시되어 있다 하더라도, 본원에 개시된 개념의 변형 및 변경이 당업자에 의해 재분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변경은 청구의 범위에 의해 정의된 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려되는 것으로 이해되어야만 한다.

본 발명은 본원에 광범위하고 일반적으로 기재되어 있다. 일반적인 개시 내에 포함되는 조금 더 좁은 종 및 하부 속명 그룹 각각이 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 여기에는, 종으로부터 임의의 주제 물질을 제거하는 부정적인 제한이나 조건과 함께, 본 발명의 종명 기재가, 시행된 물질이 본원에서 구체적으로 언급이 되었든 그렇지 않든 간에 상관없이 포함된다.

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31. 하기를 조합하는 것을 포함하는 세정 방법:

    a) 과가수분해(perhydrolysis) : 가수분해 비율이 약 1.0 을 초과하는 SGNH 아실트랜스퍼라아제,

    b) 상기 SGNH 아실트랜스퍼라아제에 대한 알코올 기질,

    c) 아실 공여체-함유 물질로 더럽혀진 대상체, 및

    d) 과산화수소의 공급원

    으로; 이때 상기 SGNH 아실트랜스퍼라아제가 상기 더럽혀진 대상체로부터의 상기 아실 공여체로부터 상기 알코올 기질 상으로 아실기를 전이하는 것을 촉매작용하여 에스테르를 생성하고, 추가로 상기 에스테르의 과가수분해를 촉매작용하여 과산을 생성하는 방법.
32. 제 31 항에 있어서, 상기 에스테르가 C4 내지 C6 카르복실산 에스테르인 방법.
33. 제 31 항에 있어서, 상기 에스테르가 부티르산 에스테르 또는 벤질 부티레이트인 방법.
34. 제 31 항에 있어서, 상기 에스테르가 1차 알코올 및 C4 내지 C6 지방산의 에스테르인 방법.
35. 제 31 항에 있어서, 상기 대상체가 직물인 방법.
36. 제 35 항에 있어서, 상기 직물이 오일-함유 물질로 더럽혀진 것인 방법.
37. 제 35 항에 있어서, 상기 직물이 트리아실글리세라이드-함유 물질로 얼룩진 것인 방법.
38. 제 37 항에 있어서, 상기 트리아실글리세라이드-함유 물질이 C4-C18 트리아실글리세라이드를 포함하는 방법.
39. 제 31 항에 있어서, 상기 SGNH 아실트랜스퍼라아제가 상기 대상체 상에 존재하는 아실 공여체로부터 아실기를 상기 알코올 기질 상으로 전이하는 것을 촉매작용하여 방향성 에스테르를 생성하는 방법.
40. 제 31 항에 있어서, 상기 SGNH 아실트랜스퍼라아제에 대한 상기 알코올 기질이 또한 계면활성제 또는 에멀젼화제로서 작용하는 방법.
41. 제 40 항에 있어서, 상기 SGNH 아실트랜스퍼라아제가 상기 아실 공여체로부터 아실기를 상기 계면활성제 또는 에멀젼화제로 전이하는 것을 촉매작용하여 에스테르를 생성하는 방법.
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43. 제 31 항에 있어서, 상기 과산화수소의 농도가 약 50 내지 500 ppm 인 방법.

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