KR20080106166A - 세포 발현 시스템에 의한 수소 생산 - Google Patents

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Abstract

수소 생산을 위한 발현 벡터, 숙주 세포 및 재조합 발현 시스템을 이용하는 방법이 개시된다. 상기 발현 벡터는 서열번호 1의 양방향성 히드로게나아제 단백질 복합체 코딩 서열을 포함한다.
Figure P1020087017875
수소, 양방향성 히드로게나아제, 발현 벡터.

Description

세포 발현 시스템에 의한 수소 생산{Hydrogen production by means of a cell expression system}
본 발명은 세포에 의한 수소의 생산을 위한 재조합 발현 시스템에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 세균 세포, 특히, 대장균에서 시아노박테리아(cyanobacteria)로부터 유래된, 히드로게나아제 단백질 복합체를 생산하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포, 및 상기 숙주 세포를 광합성에 의한 수소 생산(photosynthetic hydrogen production)을 위해 적합한 조건 하에서 인큐베이션하는 것에 의해 수소를 생산하는 방법에 관한 것이다.
수소 에너지는 전통적인 화석 연료를 대체할 잠재적인 후보이고, 특히, 미생물에 의해 생산되는 수소이다. 현재, 미생물 원(microbial source)으로부터 수소의 광합성 생산에 대해 다수의 제한이 존재한다. 시아노박테리아 및 녹조류(green algae)와 같은 전통적인 수소-생산 미생물은 비교적 낮은 에너지 전환 효율 및 낮은 수소 생성율을 보인다. 또한, 다양한 저해 인자들 때문에 시간의 경과에 따라 이 개체들로부터의 생산에 내재된 불안정성이 있다. 예를 들면, 담당하는 효소들은 본래 산소-민감성이며 미호기적(micro-aerobic) 조건에서도 변성된다.
전통적인 방법은 미생물로부터의 수소 생산을 증가시키기 위해 공정 제어의 진보에 집중해왔다. US4532210은 광의 존재 하에 조류(algae)에 광합성 생성물을 축적시키기 위해 호기적 조건 하에서 물에서 조류를 배양하는 단계와 수소를 발생시키기 위해 호흡에 의해 축적된 물질을 분해시키기 위해 암기에서 미호기적 조건 하에 상기 조류를 물에서 배양하는 단계를 교대시키는 것을 포함하는, 교차하는 광주기/암주기를 이용한 조류 배양에서의 수소 생산을 개시한다.
보다 최근에는, 상기 이슈를 다루기 위해 분자적 기법이 이용되고 있다. US6858718은 효소, 철 히드로게나아제(HydA)가 수소의 생산, 특히, 양성자의 수소 분자로의 가역적 환원을 촉매하는 산업적 응용을 갖는다는 것을 개시한다. 상기 문헌은 철 히드로게나아제를 코딩하는 조류, 스케네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus), 클라미도모나스 레인하르디티(Chlamydomonas reinhardtii), 및 클로렐라 푸스카(Chlorella fusca)로부터의 핵산 서열의 분리를 개시한다. 상기 발명은 또한 HydA에 대한 게놈 핵산, cDNA, 및 단백질 서열을 개시한다. 현재까지, 제안된 방법들 중 어느 것도 산업적 규모의 수소 생산에 적합하지 않았다.
본 발명은 광합성 세균 종, 예를 들면, 시아노박테리아 종으로부터 분리된 효소 또는 효소 복합체를 상기 효소 또는 효소 복합체를 발현하지 않는 숙주 세포, 통상적으로 세균 숙주 세포에서 발현시키는 방법; 및 상기 숙주 세포에 의한 수소의 생산에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명의 일 양태에 따르면,
a) 전사 프로모터 요소(transcriptional promoter element);
b) 시아노박테리아 히드로게나아제와 연관된 특이적 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및
c) 전사 종결자(transcriptional terminator)의 작동가능하게 연결된 요소를 포함하는, 히드로게나아제 단백질 또는 히드로게나아제 단백질 복합체를 생산하기 위한 발현 벡터가 제공된다.
바람직하게는, 상기 핵산 분자는
i) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
ii) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 70% 이상의 동일성(identity)을 갖는 핵산 분자;
iii) 서열번호 1의 핵산 서열과 혼성화하고 히드로게나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 또는
iv) 유전자 코드 때문에 상기 i), ii) 및 iii)의 서열로 축퇴(degenerate)되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
대안적으로, 상기 핵산 분자는
i) 서열번호 2, 4, 7, 9 및 12 각각의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
ii) 서열번호 2와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 4와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 7과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 9와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 11과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자; 또는
iii) 서열번호 2와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 4와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 7과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 9와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 11과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 서열번호 2, 4, 7, 9 및 12 각각의 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
대안적으로, 상기 핵산 분자는
i) 서열번호 2, 4, 7, 9 또는 12 중 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자; 또는
ii) 서열번호 2와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 4와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 7과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 9와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 11과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 2에 혼성화되고 디아포라아제(diaphorase) 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자이다. 대안적으로, 상기 핵산 분자는 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 4에 혼성화되고 NADH 데히드로게나아제(dehydrohgenase) I 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자(variant nucleic acid molecule)이다. 대안적으로, 상기 핵산 분자는 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 7에 혼성화되고 NAD 환원성 히드로게나아제(NAD reducing hydrogenase) 감마 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자이다. 대안적으로, 상기 핵산 분자는 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 9에 혼성화되고 NAD 환원성 히드로게나아제 델타 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자이다. 대안적으로, 상기 핵산 분자는 서열번호 12의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 12에 혼성화되고 NAD 환원성 히드로게나아제 베타 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자이다. 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 엄격한 혼성화 조건(stringent hybridization condition) 하에서 혼성화된다.
바람직하게는, 상기 핵산 분자는 서열번호 3, 5, 8, 10 및 13 각각의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
바람직하게는, 상기 변이체 핵산 분자는 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화된다.
바람직하게는, 상기 전사 프로모터 요소는 상기 핵산 분자 또는 변이체 핵산 분자에 유도성 발현(inducible expresison)을 부여하는 요소를 포함한다. 대안적으로, 상기 전사 프로모터 요소는 상기 핵산 분자 또는 변이체 핵산 분자에 억제성 발현(repressive expresison)을 부여하는 요소를 포함한다. 대안적으로, 상기 전사 프로모터 요소는 상기 핵산 분자 또는 변이체 핵산 분자에 구성적 발현(constitutive expresison)을 부여하는 요소를 포함한다.
바람직하게는, 상기 발현 벡터는 선택(selectable) 마커를 포함한다. 바람직하게는, 상기 발현 벡터는 번역 조절 요소(translational control element)를 포함한다. 바람직하게는, 상기 번역 조절 요소는 리보솜 결합 서열(ribosomal binding protein)이다.
바람직하게는, 상기 핵산 분자는 상기 뉴클레오티드 서열 내에 예를 들면, DNA 셔플링(DNA shuffling), 오류 유발 PCR(error-prone PCR) 또는 부위-지향적 돌연변이생성(site directed mutagenesis)에 의해 도입된, 코돈 사용(codon usage)을 최적화하기 위한 특정한 변화를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
바람직하게는, 상기 세포는 세균 세포, 보다 바람직하게는, 그람 음성 세균 세포, 예를 들면, 에스케리시아 속의 종(the genus Escherichia spp .), 바람직하게는 대장균(Escherichia coli), 보다 바람직하게는 대장균 BL21 또는 대장균 BL21 (DE3)pLys5이다. 대안적으로, 상기 세포는 또 다른 세균 세포, 예를 들면, 그람 양성 세균 세포이거나, 또는 대안적으로 효모 세포, 조류 세포(algae cell), 곤충 세포 또는 식물 세포일 수 있다.
바람직하게는, 상기 세포는 tRNA 유전자, 예를 들면, argU, ilex, leuW, proL 또는 glyT를 코딩하는 tRNA 유전자를 포함하는 벡터를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면,
i) 하나 이상의 시아노박테리아 히드로게나아제 유전자를 포함하는 핵산 분자를 숙주 세포에서의 발현을 위한 발현 벡터에 내포(incorporate)시키는 단계; 및
ii) 숙주 세포를 상기 발현 벡터로 형질감염시키는 단계를 포함하고,
결과적으로 수득된 형질감염된 숙주 세포는 수소를 생산하는 것인, 수소 생산 방법이 제공된다.
바람직하게는, 상기 하나 이상의 히드로게나아제 유전자는 양방향성(bidirectional) 히드로게나아제 유전자이다. 바람직하게는, 상기 시아노박테리아는 시네코시스티스(Synechocystis) 속의 시아노박테리아이고, 보다 바람직하게는, 시네코시스티스 종(Synechocystis sp). PCC 6803이다.
바람직하게는, 상기 핵산 분자는
i) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
ii) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 70% 이상의 동일성을 갖는 핵산 분자;
iii) 서열번호 1의 핵산 서열과 혼성화하는 핵산 분자; 또는
iv) 유전자 코드 때문에 상기 i), ii) 및 iii)의 서열로 축퇴(degenerate)되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
대안적으로, 상기 핵산 분자는
i) 서열번호 2, 4, 7, 9 및 12 각각의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
ii) 서열번호 2와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 4와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 7과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 9와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 11과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자; 또는
iii) 서열번호 2와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 4와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 7과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 9와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 11과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 서열번호 2, 4, 7, 9 및 12 각각의 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
대안적으로, 상기 핵산 분자는
i) 서열번호 2, 4, 7, 9 또는 12 중 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자; 또는 ii) 서열번호 2와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 4와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 7과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 9와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 11과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 2에 혼성화되고 디아포라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자이다. 대안적으로, 상기 핵산 분자는 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 4에 혼성화되고 NADH 데히드로게나아제 I 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자이다. 대안적으로, 상기 핵산 분자는 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 7에 혼성화되고 NAD 환원성 히드로게나아제 감마 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자이다. 대안적으로, 상기 핵산 분자는 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 9에 혼성화되고 NAD 환원성 히드로게나아제 델타 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자이다. 대안적으로, 상기 핵산 분자는 서열번호 12의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 12에 혼성화되고 NNAD 환원성 히드로게나아제 베타 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자이다. 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화된다.
바람직하게는, 상기 핵산 분자는 서열번호 3, 5, 8, 10 및 13 각각의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명에 따른 숙주 세포 및 상기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 배지를 포함하는 반응 용기(reaction vessel)가 제공된다. 바람직한 구체예에서, 상기 용기는 생물반응기(bioreactor), 예를 들면, 발효기(fermentor)이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면,
i) 본 발명에 따른 숙주 세포를 담은 용기를 제공하는 단계;
ii) 상기 용기에 담긴 세포 배양액에 의한 수소 생산을 촉진하는 세포 배양 조건을 제공하는 단계; 및 선택적으로,
iii) 상기 용기로부터 수소를 수집하는 단계를 포함하는, 수소 생산 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, i) 본 발명에 따른 숙주 세포를 담은 반응 용기; 및
ii) 상기 세포 배양 용기와 유체 소통(fluid connection) 관계에 있는 제2 용기를 포함하고, 상기 제2 용기는 상기 i)의 세포 배양 용기에 담긴 세포에 의해 생산되는 수소의 수집 및/또는 저장을 위해 개조된 것인, 세포에 의한 수소의 생산 및 수집용 장치가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 수소 생산을 위한 재조합 발현 시스템에서 시아노박테리아 히드로게나아제의 용도가 제공된다. 바람직하게는, 상기 시아노박테리아 히드로게나아제는
i) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
ii) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 70% 이상의 동일성을 가지며 히드로게나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;
iii) 서열번호 1의 핵산 서열과 혼성화하고, 히드로게나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 또는
iv) 유전자 코드 때문에 상기 i), ii) 및 iii)의 서열로 축퇴(degenerate)되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자가 제공된다.
본 명세서의 발명의 설명 및 청구항 전체에서, 단어 "포함한다(comprise)" 및 "함유한다(contain)" 및 상기 단어의 변형, 예를 들면, "포함하는(comprising)" 및 "포함한다(comprises)"는 "포함하나, 한정되지 않는(including but not limited to)"를 의미하며, 다른 모이어티(moiety), 첨가제, 화합물, 정수 또는 단계를 배제하도록 의도되지 않는다(배제하지 않는다).
본 명세서의 발명의 설명 및 청구항 전체에서, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수형은 복수형을 포괄한다. 특히, 부정관사가 사용되는 경우, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서에서는 단수형뿐 아니라 복수형을 고려하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 특정한 양태, 구체예 또는 실시예와 함께 기재된, 특징, 정수, 특정, 화합물, 화학적 모이어티(moiety) 또는 작용기는 융화될 수 없는 경우가 아닌 한, 본 명세서에 기재된 다른 양태, 구체예 또는 실시예에 적용가능한 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 다양한 양태가 하기에서 보다 상세하게 설명된다.
상세한 설명
미세조류(microalgae)(녹조류 및 시아노박테리아)는 태양 에너지 수확자(solar energy harvester)로서 생장할 때, 고등 식물에 비해 일부 독특한 장점을 갖는다; 그들은 보다 빠른 속도로 성장하고, 개방된 연못 또는 폐쇄된 반응기에서 보다 용이하게 조작되며, 일반적으로 보다 높은 광합성 효율을 갖는다. 시아노박테리아와 녹조류가 물로부터 H2를 생산하는 고유한 능력은 저 탄소 청정 에너지(low carbon clean energy) 기술의 개발에서 장점으로 개조될 수 있다. 이 능력은 두 개의 상이한 히드로게나아제의 활성에 의존적이다. 하나는 주로 이질 세포(heterocyst)에 한정되고, 니트로게나아제(nitrogenase)에 의해 생산되는 H2-기체의 재이용에서 기능하는, 이량체 막-결합 히드로게나아제(dimeric membrane-bound hydrogenase)이다. 제2의 히드로게나아제는 H2를 발생시키고 분해하기 위해 광합성에 의해 생성된 전자 및 양성자를 재결합하고 소비할 수 있는 효소인, 양방향성(bidirectional) 히드로게나아제이다.
시네코시스티스 종(Synechocystis sp.) PCC 6803은 단세포의 비-질소고정(non-nitrogen-fixing) 시아노박테리아이고 담수에 서식한다. 이 균주는 본래 외생 DNA에 의해 형질전환가능하고(즉, 스스로 DNA를 흡수함), 자발적으로 형질전환가능하며, 상동성 재조합(homologous recombination)에 의해 DNA를 게놈에 통합시킬 수 있다. 상기 개체는 광독립영양(photoautotrophic) 방식 내지 완전한 종속영양(heterotrophic) 방식에 이르는 다수의 상이한 조건에서 생장할 수 있어서 광합성의 연구(및 이 경우 히드로게나아제)와 같은 기본적인 과정을 간섭하는 유전적 변형을 가능하게 할 수 있다. 이 특성들 때문에 시네코시스티스 종 PCC 6803은 본 명세서에 기재된 것들과 같은 유전적 조작의 선호되는 선택 대상이 된다. 실제로, 이 개체는 (큰 서브유닛의 부재 때문에) 히드로게나아제 효소의 기능적 흡수가 결핍된 것으로 확인되었다. 이 특징은 또한 이 경우 내에서 이 개체의 '유용성(usefulness)'를 더 증가시켜, 흡수 히드로게나아제(uptake hydrogenase)의 유해한 영향을 제거하여 흡수 히드로게나아제의 비생산적(counter-productive)(이 경우) 효과를 고려할 필요 없이 히드로게나아제 활성의 인 비보 스크리닝을 수행할 수 있게 한다.
양방향성 히드로게나아제 효소 복합체를 형성하기 위한 5개의 유전자가 개시되었으며, 4개는 디아포라아제(diaphorase) 모이어티가 hoxFU에 의해 코딩되고 히드로게나아제 부분이 hoxYH에 의해 코딩되는 것인 랄스토니아 유트로피아(Ralstonia eutrophia)의 사량체(tetrameric) NAD+-환원성 히드로게나아제를 코딩하는 유전자에 상동성을 갖는다. 랄스토니아 유트로피아 내의 가용성 효소(soluble enzyme)와 대조적으로, 시네코시스티스 종 PCC 6803의 양방향성 히드로게나아제의 유전자 클러스터는 제3의 디아포라아제 서브유닛을 코딩하는 것으로 생각되는, 추가적인 개방 해독 프레임(hoxE)을 포함한다. 따라서, HoxEFU는 HoxE는 대장균의 NuoE에 상동성을 가지며, 주로 미토콘드리아 복합체(mitochondrial complex) I(NADH:Q 옥시도리덕타아제)의 세 개의 서브유닛에 대한 상당한 서열 유사성(상기 세 개의 서브유닛 중 하나는 복합체 I의 친수성 부분을 구성함) 때문에, 호흡 또는 광계(phohtosystem) I의 순환적 전자전달(cyclic electron transport)에서 활성을 발휘하는 복합체 I의 NADH 산화성 부분으로 작용하는 것으로 가정되었다. 선택적 분리 실험은 이질세포성(heterocystous) 시아노박테리아 종의 이질세포 및 영양 세포(vegetative cell) 및 단세포 내에서 활성이 검출되는 것으로 결정하였다.
시아노박테리아의 수소 생산은 니트로게나아제(nitrogenase) 또는 양방향성 히드로게나아제의 활성으로부터 유래될 수 있다. 따라서, 시아노박테리아에 의한 H2의 순 발생(net evolution)은 니트로게나아제 및 양방향성 히드로게나아제에 의해 촉매되는 H2 생산 및 흡수 히드로게나아제(uptake hydrogenease)에 의해 촉매되는 H2 소비의 합이다. 본 출원은 하기에 도시된 바와 같은, 니트로게나아제(2)에 의한 수소 생산에 비해 유의성 있게 증가된 반응의 에너지 효율성 때문에, 양방향성 히드로게나아제 효소(1)를 통한 수소의 생성에 관한 것이다:
2H+ + 2e- + 2NADP → H2 + 2NAD+ + 2Pi (1)
N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi (2)
시네코시스티스 종 PCC 6803 내에 존재하는 것으로 입증된 히드로게나아제 관련 유전자는: (1) sllO322 - 히드로게나아제 성숙(hydrogenase maturation) 단백질 HypF (hypF), (2) Sll1078 - 히드로게나아제 발현/형성 단백질 HypA (hypA), (3) sll1079 - 히드로게나아제 발현/형성 단백질 HypB (hypB), (4) sll1220 - NADH 데히드로게나아제 I 사슬 E (hoxE), (5) sll1221 - NADH 데히드로게나아제 I 사슬 F (hoxF), (6) sll1223 - NAD-환원성 히드로게나아제 HoxS 감마 서브유닛 (hoxU), (7) sll1224 - NAD-환원성 히드로게나아제 HoxS 델타 서브유닛 (hoxY) (EC. 1.12.1.2), (8) sll1226 - NAD-환원성 히드로게나아제 HoxS 베타 서브유닛 (hoxH), (9) sll1432 - 히드로게나아제 동종효소(isoenzyme) 형성 (니켈 내포) 단백질 HypB (hypB), (10) sll1462 - 히드로게나아제 발현/형성 단백질 HypE (hypE), (11) sll1559 - 가용성 히드로게나아제 42 kD 서브유닛, (12) slr1498 - 히드로게나아제 동종효소 형성 단백질 HypD (hypD), (13) slr1675 - 히드로게나아제 형성 (니켈 내포) 단백질 HypA (hypA), (14) slr2135 - 히드로게나아제 부속(accessory) 단백질, (15) ssl3580 - 히드로게나아제 발현/형성 단백질 HypC (hypC)를 포함한다.
시네코시스티스 종 PCC 6803 내의 상기 히드로게나아제 관련 유전자의 정확한 위치의 도면이 이 개체의 완전한 게놈의 약 75%를 차지하는 위치 맵(location map)인 도 1에 도시된다. 따라서, 본 발명은 길이가 약 7 kb인 도 2에 도시된 시네코시스티스 종 PCC 6803의 hox 오페론으로부터 유래된 서열을 이용한다.
벡터
본 명세서에서 사용된 용어 "벡터(vector)"는 그에 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터는 자발적 복제를 수행할 수 있거나 또는 숙주 DNA로 통합될 수 있다. 벡터는 재조합 DNA의 삽입을 위한 제한효소 인식 부위를 포함할 수 있고 하나 이상의 선택 마커(selectable marker)를 포함할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파아지, 또는 코스미드(cosmid) 형태의 핵산일 수 있다. 가장 바람직하게는, 벡터는 세균에서의 발현(bacterial expression), 예를 들면, 대장균(E. coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라(Salmonella), 스태필로콕코스(Staphylocoocus), 스트렙토콕코스(Streptococcus), 사카로마이세테스(Saccharomycetes) 등에서의 발현에 적합하다.
바람직하게는, 벡터는 세균 세포에서 증식할 수 있고 안정적으로 후속 세대들로 전달된다.
본 명세서에서 사용된 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 상호 간에 기능적 관계(functional relationship), 예를 들면, 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있도록 연결 관계에 있는, 코딩 서열과 조합된 전술된 조절 요소(control element) 또는 그의 조합을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "조절 서열(regulatory sequence)"은 유전자 발현을 조절할 수 있는 DNA 또는 RNA 요소를 의미한다. 발현 조절 서열의 예는 프로모터, 인핸서(enhancer), 사일랜서(silancer), 샤인 달가노(Shine Dalgarno) 서열, TATA-박스, IRES(internal ribosomal entry site), 전사 인자의 부착 부위, 전사 종결자(transcriptional terminator), 폴리아데닐화 부위(polyadenylation site), RNA 수송 신호 또는 UV-광 매개 유전자 반응을 위해 중요한 서열을 포함한다. 바람직하게는, 발현 벡터는 발현대상 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함한다. 조절 서열은 조직-특이적 조절성 서열 및/또는 유도성 서열 및 구성적(constitutive) 발현을 지시하는 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "프로모터(promoter)"는 RNA 폴리머라아제가 전사를 개시하기 위해 결합하는 DNA 또는 RNA의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 프로모터는 유도성이거나 또는 구성적으로 발현된다. 대안적으로, 프로모터는 억제자(represser) 또는 촉진성 단백질(stimulatory protein)의 제어 하에 있다. 바람직하게는, 프로모터는 T7, T3, lac, lac UV5, tac, trc, [lambda]PL, Sp6 또는 UV-유도성 프로모터이다. 보다 바람직하게는, 프로모터는 세균, 예를 들면, 대장균에서 기능하는 것으로 알려진, T7 프로모터 또는 T3 프로모터이다.
본 명세서에서 사용된 "전사 종결자(transcriptional terminator)"는 DNA를 RNA로 전사하는 것을 담당하는 RNA 폴리머라아제의 기능을 종료시키는, DNA 요소를 의미한다. 바람직한 전사 종결자는 GC-풍부 dyad 대칭성 영역(GC rich dyad symmetrical region)에 이어진 일련의 T 잔기들(run of T residues)을 특징으로 한다. 보다 바람직하게는, 전사 종결자는 T7 파아지로부터의 종결자 서열이다.
본 명세서에서 사용된 "번역 조절 요소(translational control element)"는 mRNA의 번역을 조절하는 DNA 또는 RNA 요소를 의미한다. 바람직한 번역 조절 요소는 리보솜 결합 부위이다. 바람직하게는, 번역 조절 요소는 프로모터와 동종의 시스템에서 유래된 프로모터, 예를 들면, 프로모터와 그의 연관된 리보자임 결합 부위이다. 바람직한 리보솜 결합 부위는 T7 리보솜 결합 부위 또는 T3 리보솜 결합 부위이다.
본 명세서에서 사용된 "제한효소 인식 부위(restriction enzyme recognition site)"는 제한효소에 의해 인식되는 DNA의 모티프(motif)를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "선택 마커(selectable marker)"는 숙주 세포에서 발현시, 상기 선택 마커를 발현하는 세포의 선택을 가능하게 하는 표현형을 세포에 부여하는 단백질을 의미한다. 일반적으로, 선택 마커는 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 히그로마이신, 네오마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 항생제에 대한 내성을 부여하는 단백질일 수 있다. 항생제의 추가적인 예는 페니실린, 암피실린 HCl, 암피실린 Na, 아목실린(Amoxycillin) Na, 카르베니실린 소디움, 페니실린 G, 세팔로스포린, 세포탁심 Na, 세팔렉신 HCl, 반코마이신, 시클로세린이다. 기타 예는 클로람페니콜, 에리트로마이신, 린코마이신, 테트라사이클린, 스펙티노마이신 술페이트, 클린다마이신 HCl, 클로르테트라사이클린 HCl과 같은 정균 저해제(bacteriostatic inhibitor)를 포함한다.
발현 벡터의 설계는 형질전환 대상 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준, 등과 같은 인자들에 의존한다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포에 도입되어 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산에 의해 코딩된, 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한, 단백질 또는 폴리펩티드(예를 들면, 시노코시스티스 종 PCC 6803 양방향성 히드로게나아제 단백질 복합체, 즉, hoxE, hoxF, hoxU, hoxY 및 hoxH 단백질 서브유닛)를 생산한다.
원핵생물에서 단백질의 발현은 가장 흔하게는 융합 단백질 또는 비-융합(non-fusion) 단백질의 발현을 지시하는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터를 포함하는 벡터를 갖는 대장균에서 수행된다. 융합 벡터(fusion vector)는 그 내부에 코딩된 단백질에, 주로 재조합 단백질의 아미노 말단에 다수의 아미노산을 추가한다. 그와 같은 융합 벡터는 일반적으로 세 가지 목적을 충족시킨다; 1) 재조합 단백질의 발현을 증가시키고, 2) 재조합 단백질의 용해도를 증가시키며; 및 3) 친화성 정제(affinity purification)에서 리간드로 작용하여 재조합 단백질의 정제를 보조한다. 종종, 단백질분해효소에 의한 절단 부위(proteolytic cleavage site)가 융합 모이어티와 재조합 단백질의 접합부(junction)에 도입되어 융합 단백질의 정제 후, 융합 모이어티로부터 재조합 단백질의 분리를 가능하게 한다. 그와 같은 벡터들은 본 발명의 범위 내에 속한다.
바람직하게는, 벡터는 세균 세포에서 양방향성 히드로게나아제 단백질 복합체의 발현에 필요한 유전적 요소들을 포함한다. 세균 세포에서의 전사 및 번역을 위해 요구되는 요소들은 프로모터, 상기 양방향성 히드로게나아제 단백질 복합체의 코딩 영역, 및 전사 종결자를 포함한다.
본 발명의 발현 벡터는 세균 발현 벡터, 예를 들면, 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA, 효모 발현 벡터, 예를 들면, 재조합 효모 발현 벡터, 곤충 세포에서의 발현을 위한 벡터, 예를 들면, 바큘로바이러스와 같은 재조합 바이러스 발현 벡터, 또는 식물 세포에서의 발현을 위한 벡터, 예를 들면, CaMV(cauliflower mosaic virus), TMV(tobacco mosaic virus)와 같은 재조합 바이러스 발현 벡터, 또는 Ti 플라스미드와 같은 재조합 플라스미드 발현 벡터일 수 있다.
바람직하게는, 벡터는 세균 발현 벡터이다. 바람직하게는, 발현 벡터는 고-카피-수 발현 벡터(high-copy-number expression vector)이고, 대안적으로, 발현 벡터는 저-카피-수 발현 벡터, 예를 들면, Mini-F 플라스미드이다.
바람직하게는, 상기 벡터는 T7 프로모터 시스템을 포함하는 세균 발현 벡터이다. 대안적으로, 상기 벡터는 tac 프로모터 시스템을 포함하는 세균 발현 벡터이다.
보다 바람직하게는, 상기 벡터는 pET 발현 벡터이다. 예를 들면, 상기 벡터는 pET-3a, pET-3b, pET-3c, pET-3d, pET-9a, pET-9b, pET-9c, pET-9d, pET-11a, pET-11b, pET-11c, pET-11d, pET-12a, pET-12b, pET-12c, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b, pET-17xb, pET-19b, pET-20b(+), pET-21(+), pET-21a(+), pET-21b(+), pET-21c(+), pET-21d(+), pET-22b(+), pET-23(+), pET-23a(+), pET- 23b(+), pET-23c(+), pET-23d(+), pET-24(+), pET-24a(+), pET-24b(+), pET-24c(+), pET-24d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a(+), pET-28b(+), pET-28c(+), pET-29a(+), pET-29b(+), pET-29c(+), pET-30 Ek/LIC, pET-30 Xa/LIC, pET-30a(+), pET-30b(+), pET-30c(+), pET-31b(+), pET-32 Ek/LIC, pET-32 Xa/LIC, pET-32a(+), pET-32b(+), pET-32c(+), pET-33b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-41b(+), pET-41c(+), pET-41 Ek/LIC, pET-42a(+), pET-42b(+), pET-42c(+), pET-43.1a(+), pET-43.1b(+), pET-43.1c(+), pET-43.1 Ek/LIC, pET-44a(+), pET-44b(+), pET-44c(+), pET-44 Ek/LIC, pET-45b(+), pET-46 Ek/LIC, pET-47b(+), pET-48b(+), pET-49b(+), pET-50b(+), pLacI, pLysE, pLysS와 같은 Novogen® pET 벡터이거나, 또는 Invitrogen®pET 벡터, 예를 들면, pET161-DEST, pET101/D-TOPO, pET151/D/LacZ, pET104.1-DEST, pET161-GW/CAT, pET104.1/GW/lacZ, pET SUMO/CAT, pET SUMO, pET-DEST41, pET-DEST42, pET101/D/LacZ, pET151/D-TOPO, pET161-DEST, pET100/D/LacZ, pET161-GW/CAT, pET151/D/LacZ, pET101/D-TOPO, pET104-DEST, pET160-DEST, pET102/D/LacZ, pET200/D/LacZ, pET200/D-TOPO, pET161/GW/D-TOPO, pET160-GW/CAT일 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 벡터는 도 3에 도시된 pET-17b(Novagen®, Madison, Wisconsin, USA), (Seed, B. (1987) Nature 329, 840)이다. 상기 pET-17b 벡터는 유용한 클로닝 부위들의 영역으로 이어지는 N-말단 11aa T7-Tag 서열을 갖는다. 다중 클로닝 영역(multiple cloning region)은 비대칭 링커(asymmetric linker)를 이용한 효율적인 클로닝을 가능하게 하는 두 개의 BstX I 부위를 포함한다. 독특한 부위들이 도 3의 원형 맵 상에 도시된다. 서열은 Pbr322 방식(convention)에 의해 번호가 표기되며, 따라서, T7 발현 영역은 상기 원형 맵에서 역전된다. T7 RNA 폴리머라아제에 의해 전사되는 코딩 가닥의 클로닝/발현 영역이 도 4에 표시된다.
pET-17b 벡터는 T7 프로모터(핵산 333-349), T7 전사 개시부(핵산 332) 및 T7 종결자(핵산 28-74)를 포함한다. 상기 pET-17b 벡터는 발현된 표소의 친화성 정제를 가능하게 하는 T7-Tag 서열을 더 포함한다. 상기 pET-17b 벡터는 BamHI 인식 부위 다음의 GAT 트리플렛으로부터 발현되는 번역 벡터(translation vector)이다.
특히, T7 프로모터 영역을 포함하는 벡터, 예를 들면, pET-17b의 이용은 숙주 세포가 높은 수준의 단백질 발현에 적합할 것을 요구한다.
시네코시스티스 종( Synechocystis sp .) PCC 6803 Hox 오페론
본 명세서에서 사용된 용어 "핵산 분자(nucleic acid molecule)"는 DNA 분자(예를 들면, cDNA 또는 게놈 DNA) 및 RNA 분자(예를 들면, mRNA) 및 예를 들면, 뉴클레오티드 유사체(analog)의 이용에 의해 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는, 이중 가닥 DNA이다.
게놈 DNA와 관련하여, 용어 "분리된(isolated)"은 게놈 DNA가 본래 결합되어 있는 염색체로부터 분리된 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게는 "분리된" 핵산은 상기 핵산이 유래된 개체의 게놈 DNA에서 본래 상기 핵산을 플랭킹(flanking)하는 서열(즉, 상기 핵산의 5'- 및/또는 3'- 말단에 위치한 서열)을 포함하지 않는다. 더욱이, cDNA 분자와 같은, "분리된" 핵산 분자는 다른 세포 물질 또는 재조합 기법에 의해 생산되는 경우, 배양 배지를 실질적으로 포함하지 않거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우, 화학적 전구체를 실질적으로 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "엄격한 조건 하에 혼성화한다(hybridizes under stringent conditions)"는 혼성화 및 세척 조건을 설명한다. 엄격한 조건은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있고 입수가능한 문헌에서 찾을 수 있다(예를 들면, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6). 상기 문헌에 수성(aqueous) 방법 및 비-수성(non-aqueous) 방법이 설명되며, 어느 것이나 이용될 수 있다. 엄격한 혼성화 조건의 바람직한 예는 약 45℃에서 6x 소디움 클로라이드/소디움 시트레이트(SSC)에서의 혼성화 및 뒤이은 50℃에서 0.2x SSC, 0.1 %(w/v) SDS에서의 1회 이상의 세척이다. 엄격한 혼성화 조건의 또 다른 예는 약 45℃에서 6x SSC에서의 혼성화 및 뒤이은 55℃에서 0.2x SSC, 0.1 %(w/v) SDS에서의 1회 이상의 세척이다. 엄격한 혼성화 조건의 또 다른 예는 약 45℃에서 6x SSC에서의 혼성화 및 뒤이은 60℃에서 0.2x SSC, 0.1 %(w/v) SDS에서의 1회 이상의 세척이다. 바람직하게는, 엄격한 혼성화 조건은 약 45℃에서 6x SSC에서의 혼성화 및 뒤이은 65℃에서 0.2x SSC, 0.1 %(w/v) SDS에서의 1회 이상의 세척이다. 특히 바람직한 엄격한 조건(및 실무자(practitioner)가 분자가 본 발명의 혼성화 한계 내에 속하는지 여부를 결정하기 위해 어떤 조건을 적용해야 하는지에 관해 확신이 없을 때 이용되어야 하는 조건)은 65℃에서 0.5 M 소디움 포스페이트, 7% (w/v) SDS에서의 혼성화, 및 뒤이은 65℃에서 0.2x SSC, 1 %(w/v) SDS에서의 1회 이상의 세척이다. 바람직하게는, 엄격한 조건 하에, 서열번호 1, 2, 4, 6, 7, 9, 11, 또는 12의 서열에 혼성화하는 본 발명의 분리된 핵산 분자는 천연 핵산 분자에 상당한다.
본 명세서에서 사용된, "천연(naturally-occurring)" 핵산 분자는 실제로 자연적으로 일어나는(예를 들면, 천연 단백질을 코딩하는) 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "유전자(gene)" 및 "재조합 유전자(recombinant gene)"는 단백질을 코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하고, 비-코딩 조절 서열(non-coding regulatory) 서열 및 인트론을 더 포함할 수 있는 핵산 분자를 의미하다.
"비-필수(non-essential)" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 파괴하지 않거나, 보다 바람직하게는, 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않으면서 야생형 서열(예를 들면, 서열번호 3, 5, 8, 10 또는 13)로부터 변화될 수 있는 잔기이고, 반면에, "필수(essential)" 아미노산 잔기는 그와 같은 변화를 초래한다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드에서 보존되는 아미노산 잔기들, 예를 들면, 보존된 칼륨 채널 도메인에 존재하는 아미노산 잔기들은 변화를 수용할 수 없으며, 다만, 예외적으로 막관통 도메인(transmembrance domain)의 아미노산 잔기들은 일반적으로 유의성 있게 활성을 변화시키지 않으면서, 거의 동등한 소수성을 갖는 다른 잔기들에 의해 치환될 수 있다.
"보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)"은 아미노산 잔기가 유사한 곁사슬을 갖는 아미노산 잔기에 의해 치환되는 경우이다. 유사한 곁사슬을 갖는 아미노산 잔기들의 패밀리는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 정의되어 있다. 이 패밀리는 염기성 곁사슬을 갖는 아미노산(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 곁사슬을 갖는 아미노산(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 곁사슬을 갖는 아미노산(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 곁사슬을 갖는 아미노산(예를 들면, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 곁사슬을 갖는 아미노산(예를 들면, 쓰레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 곁사슬을 갖는 아미노산(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 단백질의 비필수 아미노산 잔기들은 바람직하게는 동일한 곁사슬 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된다. 대안적으로, 또 다른 구체예에서, 포화 돌연변이유발(saturation mutagenesis)과 같은 것에 의해 코딩 서열 전체 또는 일부에 무작위로 돌연변이가 도입될 수 있고, 결과물인 돌연변이체는 활성을 유지하는 돌연변이체를 식별하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 서열번호 1, 2, 4, 6, 7, 9, 11, 또는 12의 돌연변이유발 후에, 코딩된 단백질이 재조합에 의해(recombinantly) 발현될 수 있고, 상기 단백질의 활성이 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 단백질의 "생물학적 활성 부분(biologically active portion)"은 분자와 비-분자(non-molecule) 간의 상호작용에 참여하는 단백질의 단편을 포함한다. 단백질의 생물학적 활성 부분은 전장 단백질(full length protein)보다 약간 작은 수의 아미노산을 포함하고, 단백질의 하나 이상의 활성을 보이는, 단백질의 아미노산 서열, 예를 들면, 서열번호 3, 5, 8, 10 및 13에 충분히 상동성을 갖거나 또는 그로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함한다. 통상적으로, 생물학적 활성 부분은 단백질의 하나 이상의 활성, 예를 들면, 막 흥분성(membrane excitability), 세포내 이온 농도, 막 분극(membrane polarization), 및 활성 전위(action potential)을 조절하는 능력을 갖는 도메인 또는 모티프를 포함한다.
단백질의 생물학적 활성 부분은 예를 들면, 길이가 서열번호 3, 5, 8, 10 또는 13의 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개 또는 그 이상의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드일 수 있다. 단백질의 생물학적 활성 부분은 조절-매개 활성(modulate-mediated activity), 예를 들면, 본 명세서에 기재된 생물학적 활성을 조절하는 작용제를 개발하기 위한 표적으로 이용될 수 있다.
서열들 간의 서열 상동성(sequence homology) 또는 서열 동일성(sequence identity)의 계산은 하기와 같이 수행된다.
두 개의 아미노산 서열 또는 두 개의 핵산 서열의 백분율 동일성(percent identity)를 결정하기 위해, 상기 서열들을 최적의 비교 목적으로 정렬시킨다(예를 들면, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 양자 모두에 갭(gap)이 도입될 수 있고 비-상동성 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다). 바람직한 구체예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 기준 서열(reference sequence)의 길이는 상기 기준 서열의 길이의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 60% 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 82%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 100%이다. 그 후, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에 있는 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열의 한 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 차지되는 경우, 상기 분자들은 그 위치에서 동일하다(본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 "동일성(identity)"은 아미노산 또는 핵산 "상동성(homology)"과 동일한 의미이다). 두 서열들 간의 백분율 동일성은 상기 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 갯수, 및 각 갭의 길이를 고려한, 상기 서열들 간에 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
서열의 비교 및 두 서열들 간의 백분율 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 이루어질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 두 개의 아미노산 서열 간의 백분율 동일성은 BLOSUM 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치(length weight)를 이용하여, GCG 소프트웨어(http://www.gcg.com에서 입수가능함)의 GAP 프로그램에 반영된 Needleman 등 (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)의 알고리즘을 이용하여 결정된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 두 개의 뉴클레오티드 서열 간의 백분율 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 80의 갭 가중치와 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 이용하여, GCG 소프트웨어 패키지(http://www.gcg.com에서 입수가능함)의 GAP 프로그램을 이용하여 결정된다. 특히 바람직한 파라미터의 세트(및 실무자가 분자가 본 발명의 서열 동일성 또는 상동성 한계 내에 속하는지 여부를 결정하기 위해 어떤 파라미터를 적용해야 하는지 확신이 없는 경우 이용되어야 하는 파라미터 세트)는 12의 갭 페널티(gap penalty), 4의 갭 연장 페널티(gap extend penalty) 및 5의 프레임쉬프트 갭 페널티에 의한 BLOSUM 62 평점(scoring) 매트릭스이다.
두 개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 간의 백분율 동일성은 PAM120 가중치 잔기 표(weight residue table), 12의 갭 길이 페널티 및 47의 갭 페널리를 이용하여 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 반영된 Meyers 등((1989) CABIOS 4:11-17)의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 핵산 및 단백질 서열은 예를 들면, 다른 패밀리 멤버 또는 관련 서열을 식별하기 위해, 공개 데이터베이스(public database)에 대한 검색을 수행하기 위해 "질의 서열(query sequence)"로 이용될 수 있다. 그와 같은 검색은 Altschul, 등. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 이용하여 수행될 수 있다. BLAST 검색은 본 발명의 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 점수(score) = 100 및 단어길이(wordlength) = 12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어길이 = 3으로 수행될 수 있다. 비교 목적으로 갭이 도입된(gapped) 정렬을 수득하기 위해, Altschul 등(1997, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402)에 개시된 바와 같이, gapped BLAST가 이용될 수 있다. BLAST 및 gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 개별적인 프로그램(예를 들면, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 이용될 수 있다. <http://www.ncbi.nlm.nih.gov>를 참조한다.
본 발명의 벡터에 의해 발현되는 폴리펩티드는 서열번호 3, 5, 8, 10, 또는 13의 아미노산 서열과 충분히 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본 명세서에서 용어 "충분히 동일한(sufficiently identical)" 또는 "실질적으로 동일한(substantially identical)"은 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 공통된 구조적 도메인 또는 공통된 기능적 활성을 갖도록 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 동일하거나 또는 동등한(예를 들면, 유사한 곁사슬을 갖는) 아미노산을 충분한 수 또는 최소한의 수로 포함하는 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 의미하도록 사용된다. 예를 들면, 약 60% 이상 또는 65% 이상의 동일성, 가능하게는 75% 동일성, 보다 가능하게는 85%, 90%. 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 공통된 구조적 도메인을 포함하는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열이 본 명세서에서 충분히 또는 실질적으로 동일한 것으로 정의된다.
본 출원의 발현 벡터는 양방향성 히드로게나아제 효소 단백질 복합체를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
상기 핵산 서열은 바람직하게는 도 2에 전반적으로 도시된 hox 오페론에 의해 코딩되는, 시네코시스티스 종 PCC 6803의 양방향성 히드로게나아제 효소 단백질 복합체를 코딩한다.
본 출원의 hox 오페론의 핵산 서열은 서열번호 1로 표시된다. 상기 서열은 길이가 약 6532개의 뉴클레오티드로 구성된다. 상기 오페론은 8개의 코딩 서열, 서열번호 1, 2, 4, 6, 7, 9, 11 및 12를 포함한다.
서열번호 2(서열번호 1의 31번 내지 429번 뉴클레오티드)는 길이가 약 399개의 뉴클레오티드로 구성되며 522개의 뉴클레오티드(174개의 아미노산)의 디아포라아제의, 133개의 아미노산으로 구성된, hoxE로 표시되는 NADH 데히드로게나아제 II 사슬 E(서열번호 3)를 코딩한다.
서열번호 4(서열번호 1의 627번 내지 2228번 뉴클레오티드)는 길이가 약 1620개의 뉴클레오티드로 구성되며, hoxF로 표시된, 533개의 아미노산으로 구성된 NADH 데히드로게나아제 II 사슬 F(서열번호 5)를 코딩한다.
서열번호 6(서열번호 1의 2269번 내지 2907번 뉴클레오티드)은 길이가 약 639개의 뉴클레오티드로 구성되며, 전사 조절 및 DNA 복제에 관여하는, 바이러스 조절 단백질(viral regulatory protein) E2와 28.1%의 동일성을 공유하는 미지의 단백질(unknown protein)을 코딩한다.
서열번호 7(서열번호 1의 2934번 내지 3650번 뉴클레오티드)은 길이가 약 717개의 뉴클레오티드로 구성되며, hoxU로 표시된, 238개의 아미노산으로 구성된 디아포라아제, NAD-환원성 히드로게나아제 감마 서브유닛(서열번호 8)을 코딩한다.
서열번호 9(서열번호 1의 3696번 내지 4244번 뉴클레오티드)는 길이가 약 549개의 뉴클레오티드로 구성되며, hoxY로 표시된, 182개의 아미노산으로 구성된 NAD-환원성 히드로게나아제 델타 서브유닛(서열번호 10)을 코딩한다.
서열번호 11(서열번호 1의 4560번 내지 5009번 뉴클레오티드)은 길이가 약 450개의 뉴클레오티드로 구성되며, 미지의 기능을 갖는 써무스 써모필루스(Thermus theromophilus) HB27 단백질과 32.8%의 동일성을 공유하는 미지의 단백질을 코딩한다.
서열번호 12(서열번호 1의 5099번 내지 6523번 뉴클레오티드)는 길이가 약 1425개의 뉴클레오티드로 구성되며, hoxH로 표시된, 474개의 아미노산으로 구성된 NAD-환원성 히드로게나아제 베타 서브유닛(서열번호 13)을 코딩한다.
본 발명의 발현 벡터에 내포된 추가적인 핵산 분자들이 하기에 기재된다.
일 구체예에서, 본 발명의 발현 벡터는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 3, 5, 8, 10 및 13의 폴리펩티드(시노코시스티스 종 PCC6803의 5량체(pentameric) 히드로게나아제 단백질 복합체 서브유닛)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 2, 4, 7, 9 및 12(HoxEFUYH 코딩 영역)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 대안적인 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 2, 4, 6, 7, 9, 11 및 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 1의 단편을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 바람직하게는, 상기 단편은 생물학적 활성 단편, 즉, 히드로게나아제 활성을 갖는 단편이다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 1, 2, 4, 6, 7, 9, 11 및 12 중 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 상보체(complement) 또는 그의 부분 또는 그의 단편인 핵산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 발현 벡터는 서열번호 1, 2, 4, 6, 7, 9, 11 및 12 중 어느 하나로 표시된 뉴클레오티드 서열에 충분히 상보적이어서 각각 서열번호 1, 2, 4, 6, 7, 9, 11 및 12 중 어느 하나로 표시된 뉴클레오티드 서열에 혼성화하여, 그에 의해 안정한 이중체(duplex)를 형성할 수 있는 핵산 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 1로 표시된 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 핵산 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 3, 5, 8, 10 및 13에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 천연 대립형질 변이체(naturally occuring allelic variant)를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 서열번호 3, 5, 8, 10 또는 13으로 표시된 히드로게나아제 서브 유닛의 대립형질 변이체는 hoxE, hoxF, hoxU, hoxY 또는 hoxH의 기능성 히드로게나아제 서브유닛을 포함한다. 기능성 대립형질 변이체는 히드로게나아제 활성을 유지하는, 서열번호 3, 5, 8, 10 및 13으로 표시된 hoxE, hoxF, hoxU, hoxY 또는 hoxH의 히드로게나아제 서브 유닛의 천연 아미노산 서열 변이체이다. 기능성 대립형질 변이체는 일반적으로 서열번호 3, 5, 8, 10 또는 13의 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환, 또는 상기 단백질의 비-핵심(non-critical) 영역의 비-핵심 잔기의 치환, 결실 또는 삽입만을 포함할 것이다. 비-기능성(nonfunctional) 대립형질 변이체는 히드로게나아제 활성을 갖지 않는, 서열번호 3, 5, 8, 10 또는 13의 천연 아미노산 서열 변이체이다. 비-기능성 대립형질 변이체는 일반적으로 서열번호 3, 5, 8, 10 또는 13의 아미노산 서열의 비-보존적(non-conservative) 치환, 결실, 또는 삽입, 또는 미성숙 절단(premature truncation) 또는 핵심적인 잔기 또는 핵심적인 영역의 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 것이다. 본 발명의 히드로게나아제 핵산 분자의 천연 대립형질 변이체 및 동족체(homologue)에 상응하는 핵산 분자는 서열번호 1, 2, 4, 6, 7, 9, 11 또는 12에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분을 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화 프로브로 이용하여, 본 발명의 핵산 분자에 대한 그들의 상동성에 근거하여 분리될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 2의 핵산 서열로 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 2와 혼성화하고 디아포라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 4의 핵산 서열로 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 4와 혼성화하고 NADH 데히드로게나아제 I 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 7의 핵산 서열로 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 7과 혼성화하고 NAD 환원성 히드로게나아제 감마 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 9의 핵산 서열로 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 9와 혼성화하고 NAD 환원성 히드로게나아제 델타 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 12의 핵산 서열로 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 12와 혼성화하고 NAD 환원성 히드로게나아제 베타 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편 및 하나 이상의 서열번호 4, 6, 7, 9, 11 또는 12의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편 및 서열번호 4, 6, 7, 9, 11 또는 12의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편, 및 하나 이상의 서열번호 4, 6, 7, 9, 11 또는 12의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 벡터는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편, 및 서열번호 4, 6, 7, 9, 11 또는 12의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 3의 폴리펩티드(시노코시스티스 종 PCC6803의 5량체 히드로게나아제 단백질 복합체의 hoxE 단백질 서브유닛) 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 3의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 3의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 5, 8, 10 또는 13의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 3의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 5, 8, 10 또는 13의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 3의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 5, 8, 10 또는 13의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 3의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 5, 8, 10 또는 13의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 벡터는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부 또는 그의 단편 및, 하나 이상의 서열번호 2, 6, 7, 9, 11 또는 12의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 벡터는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부 또는 그의 단편 및, 서열번호 2, 6, 7, 9, 11 또는 12의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편 및, 하나 이상의 서열번호 2, 6, 7, 9, 11 또는 12의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편 및, 서열번호 2, 6, 7, 9, 11 또는 12의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 5의 폴리펩티드(시노코시스티스 종 PCC6803의 5량체 히드로게나아제 단백질 복합체의 hoxF 단백질 서브유닛) 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 5의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 5의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 하나 이상의 서열번호 3, 8, 10 또는 13의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 5의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 3, 8, 10 또는 13의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 5의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 하나 이상의 서열번호 3, 8, 10 또는 13의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 5의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 3, 8, 10 또는 13의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부 또는 그의 단편 및, 하나 이상의 서열번호 2, 4, 6, 9, 11 또는 12의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부 또는 그의 단편 및, 서열번호 2, 4, 6, 9, 11 또는 12의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편 및, 하나 이상의, 서열번호 2, 4, 6, 9, 11 또는 12의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편 및, 서열번호 2, 4, 6, 9, 11 또는 12의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 8의 폴리펩티드(시노코시스티스 종 PCC6803의 5량체 히드로게나아제 단백질 복합체의 hoxU 단백질 서브유닛) 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 8의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 8의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 하나 이상의 서열번호 3, 5, 10 또는 13의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 8의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 3, 5, 10 또는 13의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 8의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 하나 이상의 서열번호 3, 5, 10 또는 13의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 8의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 3, 5, 10 또는 13의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부 또는 그의 단편 및, 하나 이상의 서열번호 2, 4, 6, 7, 11 또는 12의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부 또는 그의 단편 및, 서열번호 2, 4, 6, 7, 11 또는 12의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편 및, 하나 이상의, 서열번호 2, 4, 6, 7, 11 또는 12의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편 및, 서열번호 2, 4, 6, 7, 11 또는 12의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 10의 폴리펩티드(시노코시스티스 종 PCC6803의 5량체 히드로게나아제 단백질 복합체의 hoxY 단백질 서브유닛) 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 10의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 10의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 3, 5, 8 또는 13의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 10의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 하나 이상의 서열번호 3, 5, 8 또는 13의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 10의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 하나 이상의 서열번호 3, 5, 8 또는 13의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 10의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 3, 5, 8 또는 13의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부 또는 그의 단편 및, 하나 이상의 서열번호 2, 4, 6, 7, 9 또는 11의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부 또는 그의 단편 및, 서열번호 2, 4, 6, 7, 9 또는 11의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편 및, 하나 이상의, 서열번호 2, 4, 6, 7, 9 또는 11의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편 및, 서열번호 2, 4, 6, 7, 9 또는 11의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 13의 폴리펩티드(시노코시스티스 종 PCC6803의 5량체 히드로게나아제 단백질 복합체의 hoxH 단백질 서브유닛) 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 13의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 13의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 하나 이상의 서열번호 3, 5, 8 또는 10의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 13의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 3, 5, 8 또는 10의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 13의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 하나 이상의 서열번호 3, 5, 8 또는 10의 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 서열번호 13의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 3, 5, 8 또는 10의 폴리펩티드의 전체 길이에 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 뉴클레오티드 서열에 숙주 세포에서의 번역을 위해 코돈 및 mRNA 이차 구조를 최적화하는 특정한 변화를 포함하는, 전술된 바와 같은 핵산 분자를 포함한다.
바람직하게는, 핵산의 코돈 사용은 숙주 세포에서의 발현을 위해 개조될 수 있으며, 예를 들면, 코돈 최적화는 Calcgene, Hale, RS 및 Thomas G. Protein Exper. Purif. 12, 185-188 (1998), UpGene, Gao, W et al. Biotechnol. Prog. 20, 443-448 (2004), 또는 Codon Optimizer, Fuglsang, A. Protein Exper. Purif. 31, 247-249 (2003)를 이용하여 달성될 수 있다. 핵산을 바람직한 코돈 최적화에 따라 개선하는 것은 소수의 코돈의 변형(Vervoort et al. Nucleic Acids Res. 25: 2069-2074 (2000)), 또는 핵산 서열의 큰 섹션, 예를 들면, 최대 1000 bp의 DNA의 재작성(rewrite)(Hale, RS and Thomas G. Protein Exper. Purif. 12,185-188 (1998))을 포함한 다수의 상이한 실험 프로토콜에 의해 이루어질 수 있다. 핵산 서열의 재작성은 원하는 서열이 중첩(overlapping) 올리고뉴클레오티드 프라이머의 연장에 의해 생성되는 것인 순환적(recursive) PCR에 의해 이루어질 수 있다(Prodromou and Pearl, Protein Eng. 5: 827-829 (1992)). 보다 큰 스트레치의 DNA의 재작성은 최대 3회의 순차적인 순환적 PCR을 요구할 수 있다(Hale, RS and Thomas G. Protein Exper. Purif. 12, 185-188 (1998), Te'o et al, FEMS Microbiol. Lett. 190: 13-19, (2000)).
대안적으로, 숙주 세포에서 동족(cognent) tRNA의 수준이 상승될 수 있다. 이 상승은 예를 들면, 융화가능한 다중 카피 플라스미드(compatible multiple copy plasmid) 상의 상응하는 tRNA 유전자를 숙주 세포에 삽입하는 것에 의해, 또는 대안적으로 tRNA 유전자를 발현 벡터 자체에 삽입하는 것에 의해 개별적인 tRNA 유전자의 카피 수를증가시키는 것에 의해 이루어질 수 있다. 대장균 발현 시스템을 이용하는 경우, argU의 강화된 발현(AGG/AGA 인식)을 갖는 대장균 숙주 세포가 이용될 수 있다. 또한, ilex(AUA의 인식), leuW(CUA의 인식), proL(CCC의 인식) 또는 glyT(GGA의 인식)에 대한 tRNA를 포함하는 숙주 세포가 이용될 수 있다(Brinkmann et al. Genes, 85, 109-114, (1989), Kane FJ. Curr. Opin. Biotechnol. 6:494-500 (1995), Rosenburg et al, J. Bacteriol. 175, 716-722, (1993), Siedel et al, Biochemistry, 31, 2598-2608, (1992)).
또 다른 구체예에서, 상기 발현 벡터는 뉴클레오티드 서열에 상기 양방향성 히드로게나아제의 발현, 활성 또는 유효 수명(functional life)을 최적화하는 특정한 변화를 포함하는, 전술된 바와 같은 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게는, 전술된 양방향성 히드로게나아제 핵산에 유전적 조작 및 파괴 기법(genetic manipulation and disruption technique)이 적용된다. DNA 셔플링 (US 6,132,970, Punnonen J et al, Science & Medicine, 7(2): 38-47, (2000), US 6,132,970), 연속적 돌연변이유발 및 스크리닝(serial mutagenesis and screening)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 유전적 조작 및 파괴 기법이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되어 있다. 돌연변이유발의 일 예는 US 2003152944에 기재된 오류-유발(error-prone) DNA 폴리머라아제 및 반응 조건의 이용을 통해, 예를 들면, The GeneMorph® Il 키트(Stratagene®, US)와 같은 상업적으로 이용가능한 키트를 이용하여, PCR 동안 돌연변이가 의도적으로 도입되는 것인 오류-유발 PCR이다. 랜덤화된 DNA 서열을 발현 벡터에 클로닝하고 결과물인 돌연변이체 라이브러리에서 변화된 또는 개선된 단백질 활성을 스크리닝한다.
Hox 발현 벡터의 제조
본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 발현 벡터의 제조를 위해 이용가능한 분자적 기법을 알고 있을 것이다.
전술된 바와 같이, 본 발명의 발현 벡터에 내포될 핵산 분자는 공통의 프라이머(mutually priming) 올리고뉴클레오티드 및 본 명세서에 기재된 핵산 서열을 이용하여 핵산 분자를 합성하는 것에 의해 제조될 수 있다. 상보적인 점착 말단(complementary cohesive termini)를 통해 DNA를 벡터에 작동가능하게 연결시키는 다수의 분자적 기법들이 개발되었다. 일 구체예에서, 상보적인 호모폴리머 영역(homopolymer tract)이 벡터 DNA에 삽입되될 핵산 분자에 첨가될 수 있다. 그 후, 상기 벡터 및 핵산 분자가 재조합 DNA 분자를 형성하기 위해 상보적인 호모폴리머 테일 간의 수소 결합에 의해 결합될 수 있다.
대안적인 구체예에서, 하나 이상의 제한효소 인식 부위를 포함하는 합성 링커가 핵산 분자를 발현 벡터에 작동가능하게 연결시키기 위해 이용된다. 일 구체예에서, 상기 핵산 분자는 전술된 바와 같이, 제한효소 처리에 의해 생성된다. 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 3'-5'-엑소뉴클레아제 활성으로 돌출된 3'-단일가닥 말단을 제거하고 폴리머라아제 활성으로 짧아진(recessed) 3'-말단을 채우는 박테리오파아제 T4 DNA 폴리머라아제 또는 대장균 DNA 폴리머라아제 I으로 처리되어, 그에 의해 평활말단(blunt-ended) DNA 세그먼트를 생성한다. 상기 평활말단 세그먼트를 박테리오파아지 T4 DNA 리가아제와 같은, 평활말단 DNA 분자의 라이게이션을 촉매할 수 있는 효소의 존재 하에 몰 과량(large molar excess)의 링커 분자와 인큐베이션시킨다. 따라서, 상기 반응의 생성물은 그의 말단에 폴리머 링커 서열을 갖는 핵산 분자이다. 그 후, 이 핵산 분자들을 적합한 제한 효소에 의해 절단하고 상기 핵산 분자의 말단과 융화될 수 있는 말단을 생성하는 효소로 미리 절단한 발현 벡터에 라이게이션시킨다.
대안적으로, 라이게이션-독립적 클로닝(LIC) 부위를 포함하는 벡터가 이용될 수 있다. 이때, 요구되는 PCR 증폭 핵산 분자는 제한효소 처리 또는 라이게이션 없이 상기 LIC 벡터로 클로닝될 수 있다(Aslanidis and de Jong, Nucl. Acid. Res. 18, 6069-6074, (1990), Haun, et al, Biotechniques 13, 515-518 (1992).
선택된 플라스미드로의 삽입을 위한 목적 핵산 분자를 분리 및/또는 변형하기 위해, PCR을 이용하는 것이 바람직하다. 서열의 PCR 제조를 위해 사용할 적합한 프라이머가 핵산 분자의 필요한 코딩 영역을 분리하고, 제한효소 인식 부위 또는 LIC 부위를 첨가하고, 원하는 해독 프레임으로 코딩 영역을 배치하도록 설계될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 발현 벡터로 내포될 핵산 분자는 적합한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여, Saiki 등 (1988) Science 239, 487-491에 의해 개시된 중합효소 연쇄 반응의 이용에 의해 제조된다. 코딩 영역은 증폭되고, 반면에, 프라이머 자체는 증폭된 서열 생성물에 내포된다. 바람직한 구체예에서, 증폭 프라이머는 증폭된 생성물이 적합한 벡터 내로 클로닝될 수 있게 하는 제한효소 인식 부위를 포함한다.
바람직하게는, 서열번호 1의 핵산 분자는 PCR에 의해 수득되고 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 기법인, 제한효소 처리 및 라이게이션을 이용하여 발현 벡터 내로 도입된다. 보다 바람직하게는 서열번호 1의 핵산 분자는 pET-17b 발현 벡터로 도입되고 T7 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
대안적으로, 서열번호 1의 핵산 분자는 효모 상동성 재조합(yeast homologous recombination)에 의해 발현 벡터 내로 도입된다(Raymon et al., Biotechniques. 26(1): 134-8, 140-1, 1999).
본 발명의 발현 벡터는 전술된 핵산 분자의 단일 카피 또는 전술된 핵산 분자의 복수 개의 카피를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 발현 벡터는 도 4에 예시된 바와 같은, 서열번호 1(6532 bp)의 양방향성 히드로게나아제를 포함하는 pET-17b 발현 벡터(3306 bp)이다.
숙주 세포
본 명세서에서 사용된 "세포의 정제된 제제(purified preparation of cell)" 는 배양된 세포 또는 미생물 세포의 경우, 대상 세포(subject cell)의 10% 이상, 및 보다 바람직하게는 50%의 제제를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "숙주 세포(host cell)" 및 "재조합 숙주 세포(recombinant host cell)"는 호환적으로 사용된다. 상기 용어들은 특정한 대상 세포 및 그와 같은 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 의미한다. 돌연변이 또는 환경적 영향 때문에, 후속 세대들에서 특정한 변형이 일어날 수 있기 때문에, 그와 같은 자손은 실제로 부모 세포와 동일하지 않을 수 있으나, 여전히 본 명세서에서 사용된 상기 용어의 범위 내에 속한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 명세서에 기재된 핵산 분자, 예를 들면, 서열번호 1의 Hox 오페론, 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 본 발명의 발현 시스템에서 사용될 숙주 세포를 제공한다. 대안적인 구체예에서, 상기 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 핵산 분자, 예를 들면, 서열번호 1의 Hox 오페론, 또는 그의 부분 또는 그의 단편을 포함하는 본 발명의 발현 벡터를 포함하고, 상기 벡터는 숙주 세포의 게놈의 특정한 부위로 상동성 재조합에 의해 도입될 수 있게 하는 서열을 더 포함한다.
본 발명의 발현 시스템에서 사용되는 숙주 세포는 호기성 세포(aerobic cell) 또는 대안적으로 통성 혐기성 세포(facultative anaerobic cell)일 수 있다. 대안적으로, 상기 세포는 효모 세포(예를 들면, 사카로마이세스, 피키아(Pichia)), 조류 세포, 곤충 세포, 또는 식물 세포일 수 있다.
세균 숙주 세포는 그람-양성 세균 및 그람-음성 세균을 포함한다. 적합한 세균 숙주 세포는 그람 음성 세균, 예를 들면, 엔테로박테리아(Enterobacteria) 과의 세균, 가장 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대장균이 본 발명을 위해 가장 바람직한 숙주 세포이다. 대장균에서의 발현은 다른 발현 시스템에 비해 다수의 장점을 제공하며, 특히, 낮은 개발 비용 및 높은 생산 수율을 제공한다. 단백질의 고 발현을 위해 적합한 세포들은 예를 들면, 대장균 W3110, 대장균의 B 스트레인(strain)을 포함한다. 대장균 BL21, BL21(DE3), 및 BL21(DE3)pLysS, pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DHIOB/p3, DH1 IS, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, ER1647이 발현을 위해 특히 적합하다. 비병원성인 표준 연구 균주(standard laboratory strain)이기 때문에, 대장균 K12 균주도 바람직하며, NovaBlue, JM109 및 DH5α(Novogen®), 대장균 K12 RV308, 대장균 K12 C600, 대장균 HB101을 포함한다. 예를 들면, Brown, Molecular Biology Labfax (Academic Press (1991))을 참조한다.
대안적으로, 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 엔테로박터(Enterobacter), 세라티아(Serratia), 프로테우스 및 에르위니아(Erwinia) 속으로부터의 엔테로박테리아가 이용된다. 다른 원핵 숙주 세포는 세라티아(Serratia), 슈도모나스(Pseudomonas), 카울로박터(Caulobacter), 또는 시아노박테리아, 예를 들면, 시네코시스티스(Synechocystis) 또는 시네코콕코스(Synechococcus) 속의 세균, 보다 바람직하게는 시네코시스티스 종 PCC 6803 또는 시네코콕코스 종 PCC 6301을 포함한다. 대안적으로, 상기 숙주 세포는 바실러스 속의 세균, 예를 들면, 바실러스 브레비스(Bacillus brevis) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringienesis)일 수 있다. 대안적으로, 상기 숙주 세포는 락토콕코스(Lactococcus) 속의 세균, 예를 들면, 락토콕코스 락티스(Lactococcus lactis)일 수 있다. 대안적으로, 세균 세포는 액티노마이세테스(actinomycetes) 과의 세균, 보다 구체적으로 스트렙토마이세스(Streptomyces), 로도콕코스(Rhodococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 미코박테리움(Mycobacterium) 속의 세균일 수 있다. 보다 구체적으로, 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 암보파시엔스(Streptomyces ambofaciens), 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae) 스트렙토마이세스 그리세오푸스쿠스(Streptomyces griseofuscus), 로도콕코스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium gluamicum), 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)일 수 있다.
원핵세포 숙주에서 벡터를 증식시키는 표준 기법들이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들면, Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology 3rd Edition (John Wiley & Sons 1995) 참조).
대장균에서 재조합 단백질 발현을 최대화하기 위해, 본 발명의 발현 벡터는 재조합 단백질을 단백질분해효소에 의해 절단할 수 있는 능력이 손상된 숙주 세균에서 그 내부에 내포된 핵산 분자를 발현할 수 있다(Gottesman, S., (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California, 119-128). 대안적으로, 본 발명의 발현 벡터 내로 내포된 핵산 분자는 각 아미노산에 대한 개별적인 코돈이 대장균에서 우선적으로 이용되는 코돈들이 되도록 약화(attenuate)될 수 있다(Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). 본 발명의 핵산 서열의 그와 같은 변형은 표준 DNA 합성 기법에 의해 수행될 수 있다.
숙주 세포 형질전환
본 발명의 발현 벡터는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기법에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "형질전환(transformation)" 및 "형질감염(transfection)"은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 외래 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 다양한 기법을 의미한다. 본 발명의 발현 벡터에 의한 적합한 숙주 세포의 형질전환은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법들에 의해 이루어지고 통상적으로 벡터 및 숙주 세포의 종류에 의존적이다. 상기 기법은 인산칼슘 또는 염화칼슘 공-침전(co-precipitation), DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 리포좀-매개 형질감염(lipofection), 화학천공(chemoporation) 또는 전기천공(electroporation)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 세균 숙주 세포의 형질전환을 위한 기법들은 예를 들면, Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y; Ausubel et al (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY; Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110; Luchansky et al (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646에 개시된다. 그와 같은 모든 방법들이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
성공적으로 형질전환된 세포, 즉, 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 세포는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 기법들에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 발현 벡터로 형질감염된 세포들은 양방향성 히드로게나아제 단백질 복합체를 생성하기 위해 배양될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 기법에 의해, 세포들을 발현 벡터 DNA의 존재 여부에 대해 조사할 수 있다.
대안적으로, 양방향성 히드로게나아제 단백질 복합체, 또는 그의 부분 또는 그의 단편의 존재는 그에 혼성화되는 항체를 이용하여 검출될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 형질전환된 숙주 세포의 배양물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배양물은 동질의 클론으로 구성된다(clonally homogenous).
상기 숙주 세포는 전술된 발현 벡터의 단일 카피, 또는 대안적으로, 상기 발현 벡터의 복수 개의 카피를 포함할 수 있다.
수소 생산
전술된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는, 본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 히드로게나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 생산(즉, 발현)하기 위해 이용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명은 양방향성 히드로게나아제 단백질을 코딩하는, 본 발명의 핵산 코딩 서열을 이용한, 수소의 대량 생산을 위한 발현 시스템을 포함한다. 바람직하게는, 상기 발현 시스템은 대장균 발현 시스템이다.
본 발명의 형질전환된 숙주 세포는 숙주 개체에 따라, 당업자에게 익숙한 방식으로 생장되거나 배양된다. 대개, 숙주 세포는 통상적으로 당의 형태인 탄소원, 통상적으로 효모 추출물과 같은 유기 질소원 또는 암모늄 술페이트와 같은 염의 형태인 질소원, 철, 망간, 및 마그네슘과 같은 미량 원소(trace element), 및 적합한 경우, 비타민을 포함하는 액체 배지에서 산소를 통기시키면서, O℃ 내지 100℃, 바람직하게는 1O℃ 내지 60℃의 온도에서 배양된다.
액체 배지의 pH는 일정하게 유지되거나, 즉, 배양 기간 동안 조절되거나 또는 일정하게 유지되지 않을 수 있다. 배양물은 회분식(batchwise), 반-회분식(semi-batchwise) 또는 연속식으로 배양될 수 있다. 영양분은 발효의 개시 시에 제공되거나 또는 반-연속적으로 또는 연속적으로 공급될 수 있다. 생산된 생성물은 전술된 바와 같이, 당업자에게 공지된 방법, 예를 들면, 추출, 증류, 결정화, 바람직한 경우, 염에 의한 침전, 및/또는 크로마토그래피에 의해 개체로부터 분리될 수 있다. 이를 위해, 숙주 세포는 유리하게 미리 파쇄될 수 있다. 이 과정에서, pH 값은 유리하게 pH 4 내지 12, 바람직하게는 pH 6 내지 9, 특히 바람직하게는 pH 7 내지 8로 유지된다.
공지된 배양 방법에 대한 개요는 Chmiel의 교과서(Bioprozeβtechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to Bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) 또는 Storhas의 교과서 (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral equipment] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994))에서 찾을 수 있다.
사용되는 배양 배지는 대상이 되는 균주의 요건을 적합하게 충족시켜야 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지의 설명은 미국 세균학회(the American Society for Bacteriology)의 교과서 "Manual of Methods for General Bacteriology"(Washington D.C., USA, 1981)에서 찾을 수 있다. .
전술된 바와 같이, 본 발명에 따라 이용될 수 있는 배지는 일반적으로 하나 이상의 탄소원, 질소원, 무기 염, 비타민 및/또는 미량 원소를 포함한다.
바람직한 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당이다. 탄소원의 예는 글루코오스, 프럭토오스, 만노오스, 갈락토오스, 리보오스, 소르보오스, 리불로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 전분 또는 셀룰로오스이다. 당은 또한 당밀(molasses)과 같은 복합 화합물 또는 당 정제로부터의 다른 부산물을 통해 배지에 첨가될 수 있다. 다양한 탄소원의 혼합물의 첨가가 또한 유리할 수 있다. 다른 가능한 탄소원은 예를 들면, 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및/또는 코코넛 지방과 같은 오일 및 지방, 예를 들면, 팔미트산, 스테아르산 및/또는 리놀레산과 같은 지방산, 예를 들면, 글리세롤, 메탄올 및/또는 에탄올과 같은 알코올 및/또는 폴리알코올, 및/또는 예를 들면, 아세트산 및/또는 락트산과 같은 유기산이다.
질소원은 통상적으로 유기 질소 화합물 또는 무기 질소 화합물 또는 이 화합물들을 포함하는 물질이다. 질소원의 예는 액체 또는 기체 형태의 암모니아, 또는 암모늄 술페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카르보네이트 또는 암모늄 니트레이트와 같은 암모늄 염, 니트레이트, 우레아, 아미노산, 또는 콘스티프 리쿼(cornsteep liquor), 대두박(soya meal), 대두 단백질, 효모 추출물, 육즙(meat extract) 등과 같은 복합 질소원을 포함한다. 질소원들은 개별적으로 또는 혼합물로서 이용될 수 있다.
배지에 존재할 수 있는 무기 염 화합물은 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 염화물, 인(phosphorus) 염 및 술페이트염을 포함한다.
예를 들면, 술페이트, 술피트(sulfite), 디티오니트(dithionite), 테트라티오네이트(tetrathionate), 티오술페이트, 술피드와 같은 무기 황-함유 화합물, 또는 머캅탄 및 티올과 같은 유기 황 화합물이 황-함유 정제 화학제품(fine chemical), 특히, 메티오닌의 생산을 위해 황의 공급원으로 이용될 수 있다.
인산, 포타슘 디히드로겐포스페이트 또는 디포타슘 히드로겐포스페이트 또는 상응하는 나트륨-함유 화합물이 인의 공급원으로 이용될 수 있다.
금속 이온을 용액에 유지하기 위해 킬레이트제가 배지에 첨가될 수 있다. 특히 적합한 킬레이트제는 카테콜 또는 프로토카테콜과 같은 디히드록시페놀 및 시트르산과 같은 유기산을 포함한다.
숙주 세포를 배양하기 위해 본 발명에 따라 사용되는 발효 배지는 또한 일반적으로 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 폴산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신을 포함한, 비타민 또는 성장 촉진제와 같은 다른 성장 인자를 포함한다. 성장인자 및 염은 종종 효모 추출물, 당밀, 콘스티프 리쿼 등과 같은 복합 배지 성분으로부터 유래된다. 또한, 배양 배지에 적합한 전구체를 첨가할 수 있다. 배지 화합물의 정확한 조성은 특정한 실험에 크게 의존하며 각각의 특정한 경우에 대해 개별적으로 결정된다. 배지의 최적화에 대한 정보는 교과서 "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Editors P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)에서 찾을 수 있다. 성장 배지는 또한 상업적인 공급업체로부터 수득될 수 있으며, 예를 들면, Standard 1 (Merck) 또는 BHI(brain heart infusion, DIFCO) 등이 있다.
모든 배지 성분들은 열(1.5 바 및 121℃에서 20분) 또는 필터 멸균에 의해 멸균된다. 상기 성분들은 함께 또는 필요한 경우 별개로 멸균될 수 있다. 모든 배지 성분들이 배양의 개시 시에 존재하거나 또는 필요한 경우, 연속적으로 또는 회분식으로 첨가될 수 있다.
배양 온도는 일반적으로 15℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃, 보다 바람직하게는 25 내지 37℃, 보다 바람직하게는 35 내지 37℃, 보다 바람직하게는 37℃이고, 실험 동안 일정하게 유지될 수 있거나 또는 변화될 수 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5의 범위에 있고, 바람직하게는 약 7.0이어야 한다. 배양의 pH는 배양 동안 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 및 수성 암모니아와 같은 염기성 화합물, 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물을 첨가하여 조절될 수 있다. 거품형성(foaming)은 예를 들면, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제(antifoam)를 이용하여 조절될 수 있다. 벡터의 안정성을 유지하기 위해, 선택 효과를 갖는 적합한 물질, 예를 들면, 항생제를 배지에 첨가할 수 있다. 호기 조건은 산소 또는 산소-함유 기체 혼합물, 예를 들면, 주변 공기(ambient air)를 배양물에 도입하는 것에 의해 유지된다. 배양의 온도는 일반적으로 2O℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 4O℃이다. 배양은 원하는 생성물의 형성이 최대에 도달할 때까지 지속된다. 이 목표는 일반적으로 10 내지 160 시간 이내에 달성된다.
이 방법에 의해 수득된 발효액(fermentation broth), 특히, 다가 불포화지방산을 포함하는 발효액은 일반적으로 7.5 중량% 내지 25 중량%의 건조 질량을 포함한다.
그 후, 발효액은 더 가공될 수 있다. 필요에 따라, 바이오매스(biomass)는 예를 들면, 원심분리, 여과, 디캔팅(decanting) 또는 이 방법들의 조합과 같은 분리 방법에 의해 완전히 또는 부분적으로 발효액으로부터 제거되거나 또는 상기 발효액에 완전히 잔류될 수 있다. 바이오매스를 분리 후에 가공하는 것이 유리하다.
그러나, 발효액은 또한 예를 들면, 회전 증발기(rotary evaporator), 박막 증발기(thin-film evaporator), 유하액막 증발기(falling film evaporator)의 보조, 또는 역 삼투압 또는 나노여과와 같은 공지된 방법을 이용하여, 세포를 분리하지 않고 농후화되거나 또는 농축될 수 있다. 최종적으로, 그 내부에 존재하는 지방산을 수득하기 위해 이 농축된 발효액이 가공될 수 있다.
바람직하게는, 양방향성 히드로게나아제 복합체를 생산하기 위해 형질전환된 숙주 세포를 배양한다. 바람직하게는 숙주 세포에 의한 수소의 생산을 유도할 수 있는 조건에서 세포를 배양한다.
회분식 발효(batch fermentation)를 이용하여, 특히, 본 발명의 양방향성 히드로게나아제 발현 시스템을 이용한 수소의 대량 생산이 필요한 경우, 형질전환된 숙주 세포를 배양할 수 있다. 대안적으로, 유가(fed-batch) 배양 및/또는 연속 배양이 본 발명의 양방향성 히드로게나아제 발현 시스템으로 형질전환된 숙주 세포로부터 수소를 생성하기 위해 이용될 수 있다.
형질전환된 숙주 세포는 호기 조건 또는 혐기 조건에서 배양될 수 있다. 호기 조건에서, 바람직하게는, 산소는 배양 배지로부터 연속적으로, 예를 들면, 환원제 또는 산소 제거제(oxygen scavenger)의 첨가에 의해, 또는 반응 배지를 중성 기체로 정화(purge)시키는 것에 의해 배양 배지로부터 제거된다.
본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 숙주 세포의 대량 배양을 위한 기법은 예를 들면, Bailey and Ollis (1986) Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill, Singapore; 또는 Shuler (2001) Bioprocess Engineering: Basic Concepts, Prentice Hall에 개시된다. 그와 같은 모든 기법들은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
바람직하게는, 형질전환된 숙주 세포는 발현 벡터에 대한 적합한 선택적 항생제를 함유하는 LB에서 배양된다. 형질전환된 숙주 세포는 37℃에서 진탕하면서 OD600이 0.6 내지 1.0에 도달할 때까지 인큐베이션된다. 그 후, 배양물을 4℃에 밤새 보관한다. 다음날 아침, 세포들을 원심분리(마이크로원심분리기에서 30초)에 의해 회수하였다. 회수된 세포들을 신선한 LB 배지에 재현탁시킨다. 바람직하게는, 상기 LB 배지는 추가적인 영양 배지(nutrient media)를 포함한다. 바람직하게는, 영양 배지는 BG-11 또는 BG-110 배지이다(Stanier R.Y. et al. (1971) Bacteriol. Rev. 35: 171- 205).
바람직하게는, 본 발명의 양방향성 히드로게나아제 코딩 서열을 최적으로 발현하는 세균 세포의 배양에서 양방향성 히드로게나아제 함량은 전세포(whole cell) 배양액 l당 100 nmol 이상, 바람직하게는 전세포 배양액 l당 150 nmol 이상, 보다 바람직하게는, 전세포 배양액 l당 약 250 nmol, 훨씬 더 바람직하게는 전세포 배양액 l당 약 500 nmol, 및 가장 바람직하게는 전세포 배양액 l당 약 1000 nmol이다. 일반적으로, 양방향성 히드로게나아제 함량은 전세포 배양액 l당 약 200 nmol이다.
본 발명의 숙주 세포는 용기(vessel), 예를 들면 생물반응기(bioreactor)에서 배양될 수 있다. 생물반응기, 예를 들면, 발효기(fermentor)는 세포 또는 효소를 포함하는 용기이고 일반적으로 산업적 규모의 분자의 생산을 위해 이용된다. 상기 분자들은 상기 용기에 담긴 세포에 의해 또는 상기 반응 용기에서 종료되는 효소 반응을 통해 생산되는 재조합 단백질(예를 들면, 히드로게나아제와 같은 효소) 또는 화합물일 수 있다. 일반적으로, 세포 기반 생물반응기는 목적 세포를 포함하고 반응을 수행하기 위해 필요한 모든 영양분 및/또는 보조인자를 포함한다.
도 1은 시네코시스티스 종 PCC 6803의 전체 게놈 내에서 모든 수소 대사 관련 유전자의 1:1000 축척의 개략적 도시이다.
도 2는 시네코시스티스 종 PCC 6803 게놈 내의 hox 오페론의 개략적 도시이다.
도 3은 발현 벡터 pET-17b의 개략적 도시이다.
도 4는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터의 개략적 도시이다.
도 5는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열이다.
도 6은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열이다.
도 7은 서열번호 3의 아미노산 서열이다.
도 8은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열이다.
도 9는 서열번호 5의 아미노산 서열이다.
도 10은 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열이다.
도 11은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열이다.
도 12는 서열번호 8의 아미노산 서열이다.
도 13은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열이다.
도 14는 서열번호 10의 아미노산 서열이다.
도 15는 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열이다
도 16은 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열이다.
도 17은 서열번호 13의 아미노산 서열이다.
실시예 1
발현 벡터의 작제
양방향성 히드로게나아제 단백질 복합체 코딩 영역, 서열번호 1을 주형인 시네코시스티스 종 PCC 6803 라이브러리 및 올리고뉴클레오티드 프라이머 SynBamFwd: ccaatcatgg atccgctgta ttgctccttt ttgagg (서열번호 14) 및 SynEcoRev: ggattactga attcccgtct gaatgttttt tg (서열번호 15)를 이용한 PCR 증폭에 의해 생 성하였다. 결과적으로 수득된 상기 유전자 서열은 각각 5' 및 3' 말단에 내포된 BamHI 및 EcoRI 제한효소 인식 부위를 포함하는, 서열번호 1을 코딩했다.
도 4에 도시된 바와 같이, 상기 수득된 PCR 생성물을 내포된 제한효소 인식 부위, BamHI 및 EcoRI에서 제한효소에 의해 절단하고, BamHI 및 EcoRI에 의한 제한효소 처리에 의해 절단한 발현 벡터 pET-17b(전술됨)에 T4 리가아제를 이용한 라이게이션에 의해 삽입시켰다.
실시예 2
발현 벡터의 작제
대안적인 실시예에서, 양방향성 히드로게나아제 단백질 복합체 코딩 영역, 서열번호 1을 주형인 시네코시스티스 종 PCC 6803 라이브러리 및 올리고뉴클레오티드 프라이머 SynBamFwd: ccaatcatgg atccgctgta ttgctccttt ttgagg (서열번호 14) 및 SynNotRev: ggattactgc ggccgcccgt ctgaatgttt tttg (서열번호 16)를 이용한 PCR 증폭에 의해 생성하였다. 결과적으로 수득된 상기 유전자 서열은 각각 5' 및 3' 말단에 내포된 BamHI 및 Notl 제한효소 인식 부위를 포함하는, 서열번호 1을 코딩했다.
상기 수득된 PCR 생성물을 내포된 제한효소 인식 부위, BamHI 및 NotI에서 제한효소에 의해 절단하고, BamHI 및 NotI에 의한 제한효소 처리에 의해 절단한 발현 벡터 pET-17b(전술됨)에 T4 리가아제를 이용한 라이게이션에 의해 삽입시켰다.
실시예 3
형질전환
실시예 1 및 2에 기재된 발현 벡터 각각을 뒤이어 NovoBlue® 적격(competent) 세포(Novagen®, USA)에 형질전환시켰다. 1㎕의 각각의 발현 벡터 생성물과 20㎕의 NovaBlue® 세포를 얼음 상에서 5분간, 42℃에서 30초간 및 얼음 상에서 2분간 인큐베이션시켰다. 80㎕의 SOC(RT)를 첨가하고, 반응 혼합물을 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 반응 혼합물을 50㎕의 카르베니실린을 포함하는 LB 아가 상에 플레이팅하고, 37℃의 온도에서 20시간 동안 방치했다.
벡터 안정성
EcoRI 발현 벡터 형질전환체 및 NotI 발현 벡터 형질전환체로부터의 콜로니를 선택하고, 50㎍/ml 카르베니실린(carbenicillin)을 포함하는 10.0 ml LB 배양액(broth)에 100㎕를 재현탁시켰다. 그 후, 상기 반응 혼합액을 37℃에서 250 RPM 진탕 하에 20시간 배양하였다.
pET17b-hox 플라스미드의 존재를 확인하기 위해, 배양된 분리주(cultured isolate)로부터 플라스미드를 추출하였다. MoBio® 6 Minute Mini Plasmid Extraction Kit (MO BIO Laboratories, USA)를 이용하여 NotI 플라스미드의 추출을 수행하였다. Qiagen® Mini Plasmid Extraction Kit (Qiagen®, Inc. USA)를 이용하 여 EcoRI 플라스미드의 추출을 수행하였다.
추출된 플라스미드에 BamHI 및 EcoRI, 또는 BamHI 및 NotI을 이용하여 제한효소 처리(restriction digest)를 수행하고, 처리된 생성물을 대상으로 0.6% TAE 아가로오스 겔 상에서 100 V로 60분 동안 겔 전기영동을 수행하였다. 정확한 크기의 단편, 3.3kb pET-17b 벡터 및 6.4 kb hox 오페론 핵산 분자 삽입물을 포함하는 균주를 검출하였다.
양방향성 5량체 히드로게나아제 단백질 복합체의 발현
정확한 크기의 단편을 포함하는 두 개의 분리주, NotI 및 EcoRI을 대장균 BL21 및 대장균 BL21 (DE3)pLys5 세포주에 형질감염시켰다. 구체적으로, 분리된 세포의 1ng/㎕ 희석액을 얼음 상에서 5분간 인큐베이션시키고, 42℃에서 30초간 및 뒤이어 얼음 상에서 2분간 인큐베이션하여 BL21 및 BL21 (DE3)pLys5 세포주로의 형질감염을 위해 준비하였다. 그 후, 80㎕의 SOC(RT)를 첨가하고 반응 혼합물을 37℃에서 60분간 인큐베이션시켰다. 그 후, 100 ㎕의 반응 혼합물을 50 ㎍/ml의 카르베니실린 또는 암피실린을 포함하는 LB 아가 플레이트 상에 도말하고 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.
NotI 벡터로 형질감염시킨 세포의 하나의 콜로니를 50㎍/ml 카르베니실린을 포함하는 1 ml LB 배양액에 형질감염체 콜로니를 포함하는 접종원(inoculum)으로 이용하고, 250 ml 플라스크에 담긴 50 ml 배양에 접종하기 위해 이용하였다. 마찬가지로, EcoRI 벡터로 형질감염시킨 세포의 하나의 콜로니를 접종원으로 이용하였 다. 각각의 플라스크 배양물을 37℃에서 250 RPM으로 진탕시키면서 4-5 시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양물을 단백질 발현 자극(200㎕의 100 nM IPTG(최종 농도 0.4 nM) 첨가에 의한 유도)과 함께 및 상기 자극 없이 인큐베이션시켰다. 그 후, 배양물을 진탕시키면서 37℃에서 3시간 더 인큐베이션시켰다. 세포들을 5000xg로 4℃에서 원심분리에 의해 회수하였다. 세포 펠릿을 추후 사용을 위해 70℃에서 건조 상태로 보관하였다.
재조합 양방향성 히드로게나아제 단백질 복합체는 불용성 봉입체(inclusion body) 및 가용성 단백질로서 축적되었다. 펠릿을 12.5ml의 TRIS-HCl pH 8.0으로 1회 세척하였다.
2 ml의 Bacterial Protein Extraction Reagent (B-PER in phosphate buffer; Pierce, USA)를 이용하여 봉입체 단백질을 추출하고 40 ㎕의 10mg/ml 리소자임(최종 농도 200 ㎍/ml)을 이용하여 세포 파편을 소화시키고 봉입체를 방출시켰다. 그 후, 상기 "봉입체" 펠릿을 가열, 볼텍싱(vortexing) 및 초음파 처리(sonication)를 통해 1% SDS(1 ml)에 용해시켰다.
2 ml의 B-PER 시약(Pierce, USA) 및 볼텍싱 또는 피펫팅(pipetting)을 통한 기계적 균질화(mechanical homogenization)를 이용하여 가용성 단백질을 추출하였다. 그 후, 이 분획을 27,200 x g에서 1시간 동안 원심분리를 수행하여 분리하고 90%를 초과하는 회수율을 얻었다. 5ml의 트리클로로아세트산/아세톤(5 ml의 6N TCA 또는 3ml TCA, 300㎕의 TBP를 첨가하고, 30 mL의 최종 부피까지 아세톤을 첨가함)을 첨가하고 잘 혼합하여 -20℃에서 보관하여, TCA 침전을 이용하여 상기 가용 성 단백질을 농축하였다. 그 후, 상기 혼합물을 4,600 x g에서 1시간 동안 원심분리하여 침전시키고 평형 완충액(29,700㎕ 아세톤에 300㎕의 TBP를 첨가함)으로 세척하였다. 펠릿을 1% SDS에 재현탁시키고, 다시 가열, 볼텍싱 및 초음파처리에 의해 촉진하였다.
뒤이어, NotI 형질전환 세포 및 EcoRI 형질전환 세포로부터 분리된 가용성 단백질 및 봉입체를 pI에 따라 분리하고 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)를 이용하여 가시화시켰다. 구체적으로, 각 시료(유도 및 유도되지 않은, DE3 및 pLysS를 이용하여 형질전환된 NotI 세포 및 EcoRI 세포로부터 분리된 가용성 단백질 및 봉입체) 10㎕를 10% SDS-PAGE 겔에서 150V로 65분 동안 전개시켰다. 그 후, 1시간 동안 염색시키고, 밤새 탈색시켰다.
결과물인 SDS-PAGE 겔 내에서 두 개의 양방향성 히드로겐 서브유닛(디아포라아제 및 원형(native))의 상대적 위치를 고려하여, 밴드를 절단하고 세척하고 탈색시키고 트립신으로 소화시키고 펩티드를 추출하여 질량 분석법을 이용하여 식별하였다. QqTOF-MS-MS를 이용한, 펩티드 지문분석(fingerprinting)의 결과는 유도된 DE3 NotI 형질전환 세포주에서 hoxU 및 hoxU 서브유닛의 존재를 보여주었다. 유도된, EcoRI 형질전환 세포의 결과는 hoxH, hoxU, hoxF 및 hoxY의 존재를 나타냈고, DE3 및 pLysS 대장균 세포주 내에서 봉입체로서 존재한다는 것을 보여주었다.
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SEQUENCE LISTING <110> University of Sheffield <120> Expression System <130> P111114WO <160> 16 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 6532 <212> DNA <213> Synechocystis PCC6803 <400> 1 gctgtattgc tcctttttga ggatttttcc atgaccgttg ccaccgatcg ccaaactgtg 60 cccccatctg cggcccatcc tagtggagac aagcgtttta aggtgttaga cgccaccatg 120 aagcgcaacc aatttaatca ggatgccctc attgaaatcc tgcataaagc ccaggaaatt 180 tttggctacc tggaagagga tgttctgctc tacgtagccc gggggcttaa attacccctc 240 agccgggtgt ttggagtggc gactttttac catctttttt cccttaaacc cagtgggaaa 300 catacctgtg tggtctgctt gggaacggct tgctacgtta aaggggcggg ggatttgctg 360 aaaaccctag atcaggaagt ccatctgaaa ccgggggaaa cgacagagga tgacaaatgt 420 ccttggtgac ggcccgttgc attggagcct gtgcattgcc ccagccgtgg tctatgacgg 480 caaagtgttg ggcaagcaga atgacgaagc ggtattggcg gcgatacaac cttggttaag 540 taacagttaa cggatattaa gtatcaggtg attgcttgat cttttctagt tgattttttg 600 atttgttgtt attgagctta aaccccatgg acattaaaga attaaaggaa attgccacca 660 aaagccgtga gaaacaaaca aaaattcgca ttcgttgttg 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Ser Gly Leu Arg Gly Arg Gly Gly Gly Gly 165 170 175 Tyr Pro Thr Gly Leu Lys Trp Ala Thr Val Ala Lys Met Pro Gly Gln 180 185 190 Gln Lys Tyr Val Ile Cys Asn Ala Asp Glu Gly Asp Pro Gly Ala Phe 195 200 205 Met Asp Arg Ser Val Leu Glu Ser Asp Pro His Arg Ile Leu Glu Gly 210 215 220 Met Ala Ile Ala Ala Tyr Ala Val Gly Ala Asn His Gly Tyr Ile Tyr 225 230 235 240 Val Arg Ala Glu Tyr Pro Leu Ala Ile Gln Arg Leu Gln Lys Ala Ile 245 250 255 Gln Gln Ala Lys Arg Tyr Gly Leu Met Gly Thr Gln Ile Phe Asp Ser 260 265 270 Pro Ile Asp Phe Lys Ile Asp Ile Arg Val Gly Ala Gly Ala Phe Val 275 280 285 Cys Gly Glu Glu Thr Ala Leu Ile Ala Ser Val Glu Gly Lys Arg Gly 290 295 300 Thr Pro Arg Pro Arg Pro Pro Tyr Pro Ala Gln Ser Gly Leu Trp Gln 305 310 315 320 Ser Pro Thr Leu Ile Asn Asn Val Glu Thr Tyr Ala Asn Val Val Pro 325 330 335 Ile Ile Arg Glu Gly Gly Asp Trp Tyr Gly Ser Ile Gly Thr Glu Lys 340 345 350 Ser Lys Gly Thr Lys Val Phe Ala Leu Thr Gly Lys Val Glu Asn Ala 355 360 365 Gly Leu Ile Glu Val Pro Met Gly Thr Thr Val Arg Gln Val Val Glu 370 375 380 Glu Met Gly Gly Gly Val Pro Asn Gly Gly Gln Val Lys Ala Val Gln 385 390 395 400 Thr Gly Gly Pro Ser Gly Gly Cys Ile Pro Ala Asp Lys Leu Asp Thr 405 410 415 Pro Ile Glu Tyr Asp Thr Leu Leu Ala Leu Gly Thr Met Met Gly Ser 420 425 430 Gly Gly Met Ile Val Met Asp Glu Ser Thr Asn Met Val Asp Val Ala 435 440 445 Gln Phe Tyr Met Asp Phe Cys Lys Ser Glu Ser Cys Gly Lys Cys Ile 450 455 460 Pro Cys Arg Ala Gly Thr Val Gln Leu Tyr Asp Leu Leu Thr Arg Phe 465 470 475 480 Leu Glu Gly Glu Ala Thr Gln Glu Asp Leu Ile Lys Leu Glu Asn Leu 485 490 495 Cys His Met Val Lys Glu Thr Ser Leu Cys Gly Leu Gly Met Ser Ala 500 505 510 Pro Asn Pro Val Ile Ser Thr Leu Arg Tyr Phe Arg His Glu Tyr Glu 515 520 525 Glu Leu Leu Lys Val 530 <210> 6 <211> 639 <212> DNA <213> Synechocystis PCC6803 <400> 6 atgaatgttt taactgctcc catcaaaagt gacacttgga ctgaggccac ctgggaagaa 60 tttatccaag ccactgaaaa tcccgattat gacaaagcaa agttctacta ctatcaaaac 120 cagttgagaa ttgaaatgtc tcccgttggt aacgatcatt caagagacca ttacctaatt 180 agtaacgcta ttagtctgta tgcaattttt aagaaaattc cgctcaacgg aaatgatacc 240 tgtagttatc gtaaacccgg tcattgggag gtacaacctg atatttcttg ccatgtgggg 300 gataatgcta tggctatccc ctctggaaca ggtattgtca atttaaatga ttatcctccc 360 ccagatttag ttatcgaaat tgccaatact tccttagctg atgatcaagg aaaaaaacgg 420 ctactttatg aagagttagg cgtcaaagaa tattggattg tggatgtgaa ggccactaaa 480 atcatggggt ttaaaatgga aaaccaaggg agctaccaaa ttcgagaatc tttagtttta 540 cctggattaa atttagctgt tttggaagag gcgttgcaaa aaacacgcca aacgaatcat 600 ggagaagtca tgcgttggct acttcaacaa tttagttaa 639 <210> 7 <211> 717 <212> DNA <213> Synechocystis PCC6803 <400> 7 atgtctgttg ttactttaac cattgatgat aaggcgatcg ccattgaaga aggcgcaagt 60 attttgcaag cggctaaaga agcaggggtt cccattccca ccctttgcca tttagaaggg 120 atttcagaag cggcagcctg tcgtttgtgc atggtggaag tggaaggcac gaataaattg 180 atgcccgcct gcgttaccgc tgtgagcgaa gaaatggtag tccacaccaa cacagaaaaa 240 ttgcaaaatt accgacgtat gacagtggaa ttactttttt ccgaaggcaa tcatgtctgt 300 gccatttgtg tggctaacgg caactgtgaa ttgcaagata tggccattac ggtgggtatg 360 gatcacagcc gatttaaata tcaatttccc aagcgagaag tggatttatc ccatcccatg 420 tttggcattg atcataaccg ttgtattctc tgtacccgtt gtgtgcgagt ttgcgatgaa 480 attgagggag cccacgtttg ggatgtggct taccggggcg cagaatgcaa aattgtttct 540 ggtttaaatc agccctgggg aaccgttgat gcctgtactt cctgtggcaa atgtgtggat 600 gcctgtccca cgggttctat cttccataaa ggagaaacta ctgctgaaaa aattggcgat 660 cgccgtaagg tggagttttt agccactgcc cgtaaagaaa aggaatgggt caggtag 717 <210> 8 <211> 238 <212> PRT <213> Synechocystis PCC6803 <400> 8 Met Ser Val Val Thr Leu Thr Ile Asp Asp Lys Ala Ile Ala Ile Glu 1 5 10 15 Glu Gly Ala Ser Ile Leu Gln Ala Ala Lys Glu Ala Gly Val Pro Ile 20 25 30 Pro Thr Leu Cys His Leu Glu Gly Ile Ser Glu Ala Ala Ala Cys Arg 35 40 45 Leu Cys Met Val Glu Val Glu Gly Thr Asn Lys Leu Met Pro Ala Cys 50 55 60 Val Thr Ala Val Ser Glu Glu Met Val Val His Thr Asn Thr Glu Lys 65 70 75 80 Leu Gln Asn Tyr Arg Arg Met Thr Val Glu Leu Leu Phe Ser Glu Gly 85 90 95 Asn His Val Cys Ala Ile Cys Val Ala Asn Gly Asn Cys Glu Leu Gln 100 105 110 Asp Met Ala Ile Thr Val Gly Met Asp His Ser Arg Phe Lys Tyr Gln 115 120 125 Phe Pro Lys Arg Glu Val Asp Leu Ser His Pro Met Phe Gly Ile Asp 130 135 140 His Asn Arg Cys Ile Leu Cys Thr Arg Cys Val Arg Val Cys Asp Glu 145 150 155 160 Ile Glu Gly Ala His Val Trp Asp Val Ala Tyr Arg Gly Ala Glu Cys 165 170 175 Lys Ile Val Ser Gly Leu Asn Gln Pro Trp Gly Thr Val Asp Ala Cys 180 185 190 Thr Ser Cys Gly Lys Cys Val Asp Ala Cys Pro Thr Gly Ser Ile Phe 195 200 205 His Lys Gly Glu Thr Thr Ala Glu Lys Ile Gly Asp Arg Arg Lys Val 210 215 220 Glu Phe Leu Ala Thr Ala Arg Lys Glu Lys Glu Trp Val Arg 225 230 235 <210> 9 <211> 549 <212> DNA <213> Synechocystis PCC6803 <400> 9 atggctaaaa ttcgttttgc taccgtttgg ctcgctggtt gttccggctg tcatatgtcc 60 ttccttgata tggacgaatg gctcattgat ctcgctcaaa aagttgatgt ggttttcagt 120 cccgttggtt ctgatctcaa ggaatacccg gacaatgtgg atgtttgcct agtggaaggg 180 gcgatcgcca acgaagaaaa tttagagtta gctttggagt tgagacagaa aacgaaggta 240 gtaatttcct ttggggactg tgctgtaacc gccaatgtcc ccggtatgcg taatatgctc 300 aaaggtagcg atccggttct gcgccgagcc tatattgaac tgggagatgg gacgcctcaa 360 ctgcccgatg aacctggtat tgtgccgcct ctattagaca aggttattcc cctacatgag 420 gttattccgg tggatatttt tatgcccggt tgtcctcccg atgcccaccg tattcgagca 480 acgctagaac cattattaaa tggggaacat cccctcatgg aagggcgagc aatgatcaaa 540 tttggttaa 549 <210> 10 <211> 182 <212> PRT <213> Synechocystis PCC6803 <400> 10 Met Ala Lys Ile Arg Phe Ala Thr Val Trp Leu Ala Gly Cys Ser Gly 1 5 10 15 Cys His Met Ser Phe Leu Asp Met Asp Glu Trp Leu Ile Asp Leu Ala 20 25 30 Gln Lys Val Asp Val Val Phe Ser Pro Val Gly Ser Asp Leu Lys Glu 35 40 45 Tyr Pro Asp Asn Val Asp Val Cys Leu Val Glu Gly Ala Ile Ala Asn 50 55 60 Glu Glu Asn Leu Glu Leu Ala Leu Glu Leu Arg Gln Lys Thr Lys Val 65 70 75 80 Val Ile Ser Phe Gly Asp Cys Ala Val Thr Ala Asn Val Pro Gly Met 85 90 95 Arg Asn Met Leu Lys Gly Ser Asp Pro Val Leu Arg Arg Ala Tyr Ile 100 105 110 Glu Leu Gly Asp Gly Thr Pro Gln Leu Pro Asp Glu Pro Gly Ile Val 115 120 125 Pro Pro Leu Leu Asp Lys Val Ile Pro Leu His Glu Val Ile Pro Val 130 135 140 Asp Ile Phe Met Pro Gly Cys Pro Pro Asp Ala His Arg Ile Arg Ala 145 150 155 160 Thr Leu Glu Pro Leu Leu Asn Gly Glu His Pro Leu Met Glu Gly Arg 165 170 175 Ala Met Ile Lys Phe Gly 180 <210> 11 <211> 450 <212> DNA <213> Synechocystis PCC6803 <400> 11 atgaccaacc aaacttcttt cacaatttgt attgactcaa attttattgt ccgacttctt 60 gttgggtatt atgaagaaac tatctatctt gagatgtgga ataaatggtg taacgcaaat 120 actaaaattg ttgctcctga tctaatcaac tatgaggtga ctaatgtttt gtggcgttta 180 aacaagacca atcagattaa ctacactcaa gcccaaattg ctcttacaga aagttttaat 240 ctcggcattg aactttattc aaactcagaa ctacaccagg atgctttggc gatcgccgaa 300 aagtttcaat tgtcagccgc ctatgatgtc cattatttag ctttagcaga aaaaatgcag 360 atagattttt atacctgtga caaaaaactg ttcaattccg tacaacaaaa tttccctaga 420 ataaaattag ttattgctaa cagtagttag 450 <210> 12 <211> 1425 <212> DNA <213> Synechocystis PCC6803 <400> 12 atgtctaaaa ccattgttat cgatcccgtt acccggattg aaggccatgc caaaatctcc 60 attttcctca acgaccaggg caacgtagat gatgttcgtt tccatgtggt ggagtatcgg 120 ggttttgaaa aattttgcga aggtcgtccc atgtgggaaa tggctggtat taccgcccgt 180 atttgcggca tttgtccggt tagccatctg ctctgtgcgg ctaaaaccgg ggataagtta 240 ctggcggtgc aaatccctcc agccggggaa aaactgcgcc gtttaatgaa tttagggcaa 300 attacccaat cccacgccct aagttttttc catctcagca gtcctgattt tctgcttggt 360 tgggacagtg atcccgctac tcgcaatgtg tttggtttaa ttgctgctga ccccgattta 420 gctagggcag gtattcggtt acggcaattt ggccaaacgg taattgaact tttgggagct 480 aaaaaaatcc actctgcttg gtcagtgccc ggtggagtcc gatcgccgtt gtcggaagaa 540 ggcagacaat ggattgtgga ccgtttacca gaagcaaaag aaaccgttta tttagcctta 600 aatttgttta aaaatatgtt ggaccgcttc caaacagaag tggcagaatt tggcaaattt 660 ccctccctat ttatgggctt agttgggaaa aataatgaat gggaacatta tggcggctcc 720 ctgcggttta ccgacagtga aggcaatatt gtcgcggaca atctcagtga agataattac 780 gctgatttta ttggtgaatc ggtggaaaaa tggtcctatt taaaatttcc ctactacaaa 840 tctctgggtt atcccgatgg catttatcgg gttggtcccc ttgcccgcct taatgtttgt 900 catcacattg gcaccccgga agcagaccaa gaattagaag aatatcggca acgggctgga 960 ggtgtggcca cgtcctcttt cttttatcat tacgcccgct tggtggaaat tcttgcctgt 1020 ttagaagcca tcgaattgtt aatggctgac cctgatattt tgtccaaaaa ttgtcgagct 1080 aaggcagaaa ttaattgtac cgaagcggtg ggagtgagcg aagcaccccg gggtacttta 1140 ttccaccatt acaagataga tgaagatggt ctaattaaga aagtgaattt gatcattgcc 1200 acgggcaaca ataacttagc catgaataaa acagtggccc aaattgccaa acactacatt 1260 cgcaatcatg atgtgcaaga agggttttta aaccgggtgg aagcgggtat tcgttgttat 1320 gatccctgcc ttagttgttc tacccatgca gcgggacaaa tgccattgat gatcgattta 1380 gttaaccctc agggggaact aattaagtcc atccagcggg attaa 1425 <210> 13 <211> 474 <212> PRT <213> Synechocystis PCC6803 <400> 13 Met Ser Lys Thr Ile Val Ile Asp Pro Val Thr Arg Ile Glu Gly His 1 5 10 15 Ala Lys Ile Ser Ile Phe Leu Asn Asp Gln Gly Asn Val Asp Asp Val 20 25 30 Arg Phe His Val Val Glu Tyr Arg Gly Phe Glu Lys Phe Cys Glu Gly 35 40 45 Arg Pro Met Trp Glu Met Ala Gly Ile Thr Ala Arg Ile Cys Gly Ile 50 55 60 Cys Pro Val Ser His Leu Leu Cys Ala Ala Lys Thr Gly Asp Lys Leu 65 70 75 80 Leu Ala Val Gln Ile Pro Pro Ala Gly Glu Lys Leu Arg Arg Leu Met 85 90 95 Asn Leu Gly Gln Ile Thr Gln Ser His Ala Leu Ser Phe Phe His Leu 100 105 110 Ser Ser Pro Asp Phe Leu Leu Gly Trp Asp Ser Asp Pro Ala Thr Arg 115 120 125 Asn Val Phe Gly Leu Ile Ala Ala Asp Pro Asp Leu Ala Arg Ala Gly 130 135 140 Ile Arg Leu Arg Gln Phe Gly Gln Thr Val Ile Glu Leu Leu Gly Ala 145 150 155 160 Lys Lys Ile His Ser Ala Trp Ser Val Pro Gly Gly Val Arg Ser Pro 165 170 175 Leu Ser Glu Glu Gly Arg Gln Trp Ile Val Asp Arg Leu Pro Glu Ala 180 185 190 Lys Glu Thr Val Tyr Leu Ala Leu Asn Leu Phe Lys Asn Met Leu Asp 195 200 205 Arg Phe Gln Thr Glu Val Ala Glu Phe Gly Lys Phe Pro Ser Leu Phe 210 215 220 Met Gly Leu Val Gly Lys Asn Asn Glu Trp Glu His Tyr Gly Gly Ser 225 230 235 240 Leu Arg Phe Thr Asp Ser Glu Gly Asn Ile Val Ala Asp Asn Leu Ser 245 250 255 Glu Asp Asn Tyr Ala Asp Phe Ile Gly Glu Ser Val Glu Lys Trp Ser 260 265 270 Tyr Leu Lys Phe Pro Tyr Tyr Lys Ser Leu Gly Tyr Pro Asp Gly Ile 275 280 285 Tyr Arg Val Gly Pro Leu Ala Arg Leu Asn Val Cys His His Ile Gly 290 295 300 Thr Pro Glu Ala Asp Gln Glu Leu Glu Glu Tyr Arg Gln Arg Ala Gly 305 310 315 320 Gly Val Ala Thr Ser Ser Phe Phe Tyr His Tyr Ala Arg Leu Val Glu 325 330 335 Ile Leu Ala Cys Leu Glu Ala Ile Glu Leu Leu Met Ala Asp Pro Asp 340 345 350 Ile Leu Ser Lys Asn Cys Arg Ala Lys Ala Glu Ile Asn Cys Thr Glu 355 360 365 Ala Val Gly Val Ser Glu Ala Pro Arg Gly Thr Leu Phe His His Tyr 370 375 380 Lys Ile Asp Glu Asp Gly Leu Ile Lys Lys Val Asn Leu Ile Ile Ala 385 390 395 400 Thr Gly Asn Asn Asn Leu Ala Met Asn Lys Thr Val Ala Gln Ile Ala 405 410 415 Lys His Tyr Ile Arg Asn His Asp Val Gln Glu Gly Phe Leu Asn Arg 420 425 430 Val Glu Ala Gly Ile Arg Cys Tyr Asp Pro Cys Leu Ser Cys Ser Thr 435 440 445 His Ala Ala Gly Gln Met Pro Leu Met Ile Asp Leu Val Asn Pro Gln 450 455 460 Gly Glu Leu Ile Lys Ser Ile Gln Arg Asp 465 470 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SynBamFwd primer <400> 14 ccaatcatgg atccgctgta ttgctccttt ttgagg 36 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SynEcoRev primer <400> 15 ggattactga attcccgtct gaatgttttt tg 32 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SynNotRev primer <400> 16 ggattactgc ggccgcccgt ctgaatgttt tttg 34

Claims (52)

  1. a) 전사 프로모터 요소,
    b) 시아노박테리아 히드로게나아제와 연관된 특이적 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 및
    c) 전사 종결자의 작동가능하게 연결된 요소를 포함하는, 히드로게나아제 단백질 또는 히드로게나아제 단백질 복합체를 생산하기 위한 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는
    i) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자,
    ii) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 70% 이상의 동일성(identity)을 갖고 히드로게나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자,
    iii) 서열번호 1의 핵산 서열과 혼성화하고 히드로게나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
    iv) 유전자 코드 때문에 상기 i), ii) 및 iii)의 서열로 축퇴(degenerate)되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 발현 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것인 발현 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는
    i) 서열번호 2, 4, 7, 9 및 12 각각의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자,
    ii) 서열번호 2와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 4와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 7과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 9와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 11과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    iii) 서열번호 2와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 4와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 7과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 9와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 11과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 발현 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 2, 4, 7, 9 및 12 각각의 뉴클레오티드 서열로 구성된 것인 발현 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는
    i) 서열번호 2, 4, 7, 9 또는 12 중 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함 하는 핵산 분자, 또는
    ii) 서열번호 2와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 4와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 7과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 9와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 11과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 발현 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 2에 혼성화되고 디아포라아제(diaphorase) 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자인 것인 발현 벡터.
  8. 제6항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 4에 혼성화되고 NADH 데히드로게나아제(dehydrohgenase) I 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자인 것인 발현 벡터.
  9. 제6항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 7에 혼성화되고 NAD 환원성 히드로게나아제(NAD reducing hydrogenase) 감마 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자인 것인 발현 벡터.
  10. 제6항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 9에 혼성화되고 NAD 환원성 히드로게나아제 델타 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자인 것인 발현 벡터.
  11. 제6항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 12의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 12에 혼성화되고 NAD 환원성 히드로게나아제 베타 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자인 것인 발현 벡터.
  12. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 3, 5, 8, 10 및 13 각각의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것인 발현 벡터.
  13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 핵산 분자는 엄격한(stringent) 혼성화 조건 하에서 혼성화되는 것인 발현 벡터.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 프로모터 요소는 상기 핵산 분자 또는 변이체 핵산 분자에 유도성 발현(inducible expresison)을 부여하는 요소를 포함하는 것인 발현 벡터.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 프로모터 요소는 상 기 핵산 분자 또는 변이체 핵산 분자에 억제성 발현(repressible expresison)을 부여하는 요소를 포함하는 것인 발현 벡터.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 프로모터 요소는 상기 핵산 분자 또는 변이체 핵산 분자에 구성적 발현(constitutive expresison)을 부여하는 요소를 포함하는 것인 발현 벡터.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터는 선택 마커를 포함하는 것인 발현 벡터.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터는 번역 조절 요소(translational control element)를 포함하는 것인 발현 벡터.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 번역 조절 요소는 리보솜 결합 서열인 것인 발현 벡터.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 코돈 사용(codon usage)을 최적화하기 위해 상기 뉴클레오티드 서열 내에 특정한 변화를 포함하는 것인 발현 벡터.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, 상기 세포는 세균 세포인 것인 숙주 세포.
  23. 제22항에 있어서, 상기 세균 세포는 그람 음성 세균 세포인 것인 숙주 세포.
  24. 제23항에 있어서, 상기 세포는 에스케리시아 속 종(the genus Escherichia spp.)의 세포인 것인 숙주 세포.
  25. 제24항에 있어서, 상기 세포는 대장균인 것인 숙주 세포.
  26. 제25항에 있어서, 상기 세포는 대장균 BL21 또는 대장균 BL21 (DE3)pLys5인 것인 숙주 세포.
  27. 제22항에 있어서, 상기 세균 세포는 그람 양성 세균 세포인 것인 숙주 세포.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 tRNA 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 것인 숙주 세포.
  29. 제28항에 있어서, 상기 tRNA 유전자는 argU, ilex, leuW, proL 또는 glyT를 코딩하는 것인 숙주 세포.
  30. i) 하나 이상의 시아노박테리아 히드로게나아제 유전자를 포함하는 핵산 분자를 숙주 세포에서의 발현을 위한 발현 벡터에 내포(incorporate)시키는 단계, 및
    ii) 숙주 세포를 상기 발현 벡터로 형질감염시키는 단계를 포함하고, 결과적으로 수득된 형질감염된 숙주 세포는 수소를 생산하는 것인, 수소 생산 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 하나 이상의 히드로게나아제 유전자는 양방향성(bidirectional) 히드로게나아제 유전자인 것인 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 시아노박테리아는 시네코시스티스(Synechocystis) 속에 속하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 시아노박테리아는 시네코시스티스 종(Synechocystis sp). PCC 6803인 것인 방법.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는
    i) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자,
    ii) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 70% 이상의 동일성을 갖는 핵산 분 자,
    iii) 서열번호 1의 핵산 서열과 혼성화하는 핵산 분자, 또는
    iv) 유전자 코드 때문에 상기 i), ii) 및 iii)의 서열로 축퇴되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것인 방법.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는
    i) 서열번호 2, 4, 7, 9 및 12 각각의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자;
    ii) 서열번호 2와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 4와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 7과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 9와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 11과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    iii) 서열번호 2와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 4와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 7과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 9와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 11과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 핵산 분자는 각각 서열번호 2, 4, 7, 9 및 12의 뉴클레오티드 서열로 구성된 것인 방법.
  38. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는
    i) 서열번호 2, 4, 7, 9 또는 12 중 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    ii) 서열번호 2와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 4와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 7과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 9와 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 11과 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 2에 혼성화되고 디아포라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자인 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 표시되 는 핵산 분자, 또는 서열번호 4에 혼성화되고 NADH 데히드로게나아제 I 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자인 것인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 7의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 7에 혼성화되고 NAD 환원성 히드로게나아제 감마 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자인 것인 방법.
  42. 제38항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 9에 혼성화되고 NNAD 환원성 히드로게나아제 델타 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자인 것인 방법.
  43. 제38항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 12의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자, 또는 서열번호 12에 혼성화되고 NAD 환원성 히드로게나아제 베타 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 핵산 분자인 것인 방법.
  44. 제38항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 3, 5, 8, 10 및 13 각각의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 것인 방법.
  45. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포 및 상기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 배지를 포함하는 반응 용기(reaction vessel).
  46. 제45항에 있어서, 상기 용기는 생물반응기(bioreactor)인 것인 반응 용기.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 용기는 발효기(fermentor)인 것인 반응 용기.
  48. i) 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 포함하는 용기를 제공하는 단계,
    ii) 상기 용기에 담긴 세포 배양액에 의한 수소 생산을 촉진하는 세포 배양 조건을 제공하는 단계, 및 선택적으로,
    iii) 상기 용기로부터 수소를 수집하는 단계를 포함하는, 수소 생산 방법.
  49. i) 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 담은 반응 용기, 및
    ii) 상기 세포 배양 용기와 유체 소통(fluid connection) 관계에 있는 제2 용기를 포함하고, 상기 제2 용기는 상기 i)의 세포 배양 용기에 담긴 세포에 의해 생산되는 수소의 수집 및/또는 저장을 위해 개조된 것인, 세포에 의한 수소의 생산 및 수집용 장치.
  50. 수소 생산을 위한 재조합 발현 시스템에서 시아노박테리아 히드로게나아제의 용도.
  51. 제50항에 있어서, 상기 시아노박테리아 히드로게나제는
    i) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자,
    ii) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 70% 이상의 동일성(identity)을 갖는 핵산 분자,
    iii) 서열번호 1의 핵산 서열과 혼성화하고 히드로게나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
    iv) 유전자 코드 때문에 상기 i), ii) 및 iii)의 서열로 축퇴(degenerate)되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 분자에 의해 코딩되는 것인 용도.
  52. 서열번호 1의 핵산 서열에 의해 표시되는 핵산 분자.
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