CN118126970A - 一种血红素加氧酶突变体及其应用 - Google Patents

一种血红素加氧酶突变体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN118126970A
CN118126970A CN202410260336.5A CN202410260336A CN118126970A CN 118126970 A CN118126970 A CN 118126970A CN 202410260336 A CN202410260336 A CN 202410260336A CN 118126970 A CN118126970 A CN 118126970A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
mutant
heme oxygenase
enzyme
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410260336.5A
Other languages
English (en)
Inventor
张仙
游智能
贺松
薛江涛
郑明坤
戴忆思
葛丽蓉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Baifu'an Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Baifu'an Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Baifu'an Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Baifu'an Biotechnology Co ltd
Priority to CN202410260336.5A priority Critical patent/CN118126970A/zh
Publication of CN118126970A publication Critical patent/CN118126970A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/165—Heterorings having nitrogen atoms as the only ring heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/99—Miscellaneous (1.14.99)
    • C12Y114/99003—Heme oxygenase (1.14.99.3)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种利用血红素加氧酶制备胆绿素的方法，包括如下步骤：以氯化血红素为底物，使用血红素加氧酶SEQ ID NO:2或者其突变体催化氧化反应，得到胆绿素。本发明的方法底物浓度高，反应条件温和，产物收率高，具有工业应用开发前景。

Description

一种血红素加氧酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及一种血红素加氧酶突变体及其应用。
背景技术
胆绿素(biliverdin)，又称去氢胆红素，是一种线性四吡咯色素。在脊椎动物体内，衰老的红细胞在单核吞噬细胞系统的作用下，释放出血红蛋白，血红蛋白随后被分解成珠蛋白和血红素。血红素在血红素加氧酶(heme oxygenase)的作用下，将铁卟啉环的α-亚甲基桥氧化断裂形成胆绿素。随后胆绿素进一步被胆绿素还原酶(biliverdin reductase)还原，生成胆红素，由此可见胆绿素可以作为生产胆红素的原料。
胆红素是重要药材牛黄的主要成分之一，还是中国药典中记载的100多种中成药制剂的主要成份，市场需求量巨大。目前胆红素的生产方法主要有两种：一是动物药源提取法，即从猪、牛等动物的胆汁中提取胆红素，这是目前市场上胆红素的主要生产方法。但是天然胆红素在动物胆汁中的含量甚微，例如猪胆汁中胆红素含量约为万分之五，提取1公斤胆红素至少需要5吨的猪胆，导致生产胆红素的成本较高且不可持续。另一种方法是酶法合成，即利用胆绿素为原料通过酶法合成胆红素，生物法具有反应条件温和、产物光学纯度高等优点，具有良好的工业应用前景。
由于天然的胆绿素获取比较困难，早期都是通过化学法直接合成，但是化学方法生产会引入胆绿素的多种同分异构体，造成目标产物纯度不高，下游分离纯化的难度很大。随后，许多研究开始转向利用酶法合成胆绿素，酶法是利用商业化的氯化血红素为底物，在血红素加氧酶的作用下，氧化生成胆绿素。由此合成的胆绿素可以作为原料进一步制备胆红素。氯化血红素、胆绿素和胆红素的化学结构式如下所示：
2012年，美国犹他州立大学Jon Y Takemoto从蓝藻(Synechocystis PCC6803)克隆获得一个血红素加氧酶基因，将其成功在大肠杆菌表达，并用于体外生物转化血红素合成胆绿素，胆绿素的滴度仅达到23.5mg/L(BMC biotechnology,2012:12:1-10)。专利文献CN109182232A报道了一种能表达来源于集胞藻(Synechocystis sp.)血红素加氧酶基因的重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌经诱导表达培养后，在培养液中加入氯化血红素作为底物，在胞内血红素加氧酶的催化作用下，用于生物转化法制备胆绿素，最终转化体系中的胆绿素产量可达61.7mg/L，氯化血红素的摩尔转化率为34.5％。专利CN114891711A报道了一种能表达破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)来源的血红素加氧酶的重组大肠杆菌，在其胞内构建了辅酶循环系统和膜表面展示系统，来增大血红素加氧酶和底物血红素之间的接触，以提高转化效率、缩短转化时间，从而实现微生物法高效催化合成胆绿素，最终胆绿素产量达到76.3mg/L(生物工程学报,2022,38:2581-2593)。专利文献CN116676204A公开了一种重组酵母基因工程菌及其在生物转化法合成胆绿素中的应用，该重组酵母基因工程菌以巴斯德毕赤酵母为宿主菌，过表达拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的血红素加氧酶，以该重组毕赤酵母基因工程菌为催化剂，以氯化血红素为底物，生物转化法合成胆绿素，胆绿素转化得率可以达到132mg/L，是目前报道的生物法合成胆绿素的最高产量，然而转化率仅为18.5％。
发明内容
我们对于上述现有技术的多种来源的血红素加氧酶包括蓝藻(SynechocystisPCC6803)、集胞藻(Synechocystis sp.)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等来源的血红素加氧酶进行了研究，发现这些血红素加氧酶在呈游离状态催化氯化血红素反应合成胆绿素时，表现的氧化酶活力较低，适用的底物浓度很低，甚至不能高于0.3g/L，没有实际应用的可能性。
考虑到酶催化法即游离酶或固定化酶催化法具有反应体系成分明晰、反应条件容易控制、后处理工序简单方便、产物容易分离纯化等优势，我们重点研究了游离酶催化方法。为此对于众多生物来源的血红素加氧酶或同工酶进行了广泛调研，通过对六十多种来源血红素加氧酶的进行实验比较，筛选出氧化活力高、底物和产物耐受浓度高的血红素加氧酶，发现一种棒状杆菌Corynebacterium sp.来源的血红素加氧酶(NCBI号：WP_014319205.1)是其中的佼佼者。进一步地，为了提高其酶活力，我们还通过易错PCR的随机突变方法对该酶进行突变，还得到了一些酶活力进一步提高的突变体。因此，本发明包括如下技术方案。
一种酶催化制备胆绿素的方法，包括如下步骤：
以氯化血红素为底物，使用棒状杆菌Corynebacterium sp.来源的血红素加氧酶(氨基酸序列为SEQ ID NO:2，NCBI号：WP_014319205.1，本文中命名为CoHO)或者其酶活力提高的突变体催化氧化反应，得到胆绿素。
MTTATAGLAVELKQSTAQAHEKAEHSTFMSDLLKGRLGVAEFTRLQEQAWLFYTALEQAVDAVRASGFAESLLDPALNRAEVLARDLDKLNGSSEWRSRITASPAVIDYVNRLEEIRDNVDGPALVAHHYVRYLGDLSGGQVIARMMQRHYGVDPEALGFYHFEGIAKLKVYKDEYREKLNNLELSDEQREHLLKEATDAFVFNHQVFADLGKGL(SEQID NO:2)。
该酶催化方法中，反应体系中可以添加有葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和辅酶NADP+(β-烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，辅酶II)或NAD+(β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，即辅酶I)，以便促进氧化反应。
上述葡萄糖脱氢酶可以是常用的葡萄糖脱氢酶比如市售酶制剂，例如是来源于巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium的葡萄糖脱氢酶(Journal of Biological Chemistry,1989,264:6381-6385)。
在一种实施方式中，上述血红素加氧酶或者其突变体呈现为酶形式，比如为游离酶或者固定化酶。
可替代地，上述血红素加氧酶或突变体也可以呈现为其表达微生物菌体形式。
上述反应体系可以为缓冲溶液例如磷酸盐缓冲溶液，pH值可以为6.0-9.0，优选pH7.0-8.5，例如为pH8.0左右；
反应温度可以为20-35℃，优选25-32℃，例如为30℃左右。
例如，上述氧化反应的条件可以为：底物氯化血红素浓度为0.1～1g/L，葡萄糖用量为1～10g/L，催化量的血红素加氧酶或其突变体，葡萄糖脱氢酶的用量为0.5～1.5g/L，NADP+用量为0.05～0.2mM，反应液水相pH为6.0～9.0，反应温度为20～35℃，反应过程中通入持续氧气或空气；所述的氧化反应的时间以反应转化率停止增长的时间为准。
本发明第二个方面提供了一种血红素加氧酶突变体，其为氨基酸序列SEQ ID NO:2中的下述位点发生突变后所形成的突变体：第34位赖氨酸(K34)、第54位苏氨酸(T54)、第60位缬氨酸(V60)、第93位丝氨酸(S93)、第101位苏氨酸(T101)、第122位甘氨酸(G122)、第143位异亮氨酸(I143)、第167位丙氨酸(A167)、第178位谷氨酸(E178)、第199位天冬氨酸(D199)、或者它们中两种以上的组合，该血红素加氧酶突变体具有血红素加氧酶SEQ IDNO:2的功能。
进一步地，上述的突变选自下组：第34位赖氨酸替换为谷氨酸(K34E)或天冬氨酸(K34D)、第54位苏氨酸替换为甲硫氨酸(T54M)或半胱氨酸(T54C)、第60位缬氨酸替换为丙氨酸(V60A)、第93位丝氨酸替换为甘氨酸(S93G)或亮氨酸(S93L)、第101位苏氨酸替换为酪氨酸(T101Y)、第122位甘氨酸替换为天冬酰胺(G122N)、第143位异亮氨酸替换为精氨酸(I143R)、第167位丙氨酸替换为天冬氨酸(A167D)或组氨酸(A167H)或苏氨酸(A167T)、第178位谷氨酸替换为赖氨酸(E178K)或谷氨酰胺(E178Q)、第199位天冬氨酸替换为天冬酰胺(D199N)或苯丙氨酸(D199F)或缬氨酸(D199V)、或者它们中两种以上的组合。
优选地，上述的血红素加氧酶突变体为选自下述的多肽：
(a)氨基酸序列为SEQ ID NO:3的多肽，其为氨基酸序列SEQ ID NO:2发生K34E、T54M、V60A、S93G、A167D、E178K和D199N突变所形成的突变体；
(b)氨基酸序列与SEQ ID NO:3有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性、且酶活力相比SEQ ID NO:3提高的多肽。
MTTATAGLAVELKQSTAQAHEKAEHSTFMSDLLEGRLGVAEFTRLQEQAWLFYMALEQAADAVRASGFAESLLDPALNRAEVLARDLDKLNGGSEWRSRITASPAVIDYVNRLEEIRDNVDGPALVAHHYVRYLGDLSGGQVIARMMQRHYGVDPEALGFYHFEGIDKLKVYKDEYRKKLNNLELSDEQREHLLKEATNAFVFNHQVFADLGKGL(SEQID NO:3)。
进一步地，本发明还提供了一种编码上述血红素加氧酶突变体SEQ ID NO:3的基因。
优选地，上述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
相应地，本发明还提供了一种DNA分子，其包含上述的基因比如SEQ ID NO:4。优选地，还包含调控该基因表达的启动子。
本发明另一个方面提供了一种质粒，其包含上述的DNA分子。
上述的质粒载体可以选自PET系列，比如载体是pET22b、pET24a、pET28a等，但并不受限于此。
本发明的另一个方面提供了一种微生物，其表达上述血红素加氧酶突变体SEQ IDNO:3的工程菌。优选是转化了上述质粒的转化子。
该工程菌的微生物宿主选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、需钠弧菌、谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母。优选所述微生物宿主是大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明筛选出的Corynebacterium sp.来源的血红素加氧酶(NCBI号：WP_014319205.1)及其突变体SEQ ID NO:3能够呈游离酶形式高效催化浓度为1g/L以上的底物氯化血红素反应得到胆绿素，转化率达到95％以上，而且热稳定性高，具有工业化开发应用前景。
附图说明
图1是表达野生型血红素加氧酶的质粒pET28a-CoHO的结构图谱。
图2是检测血红素加氧酶突变体M6催化氯化血红素反应的HPLC图谱。
具体实施方式
基于生物信息学分析和实验对比，发明人筛选得到一种来源于棒状杆菌Corynebacterium sp.的血红素加氧酶(NCBI号：WP_014319205.1)，简称CoHO，其具有符合预期的催化氯化血红素发生氧化反应的功能。为了提高该酶在工业上应用的可行性，增强其酶活力，我们继续对该野生酶进行突变，筛选出酶活力提高的突变株。
经过数轮易错PCR的随机突变库高通量筛选，最终获得了多个酶活力提高明显的突变体，包括一个(K34E、T54M、V60A、S93G、A167D、E178K、D199N)突变体，其酶活力比野生型高出近十倍，而且其热稳定性(50℃保温3小时的酶活性保持率)较高。
在本文中，术语“野生(型)血红素加氧酶”、“野生酶”表示相同的意义，都是指野生型的氨基酸序列为SEQ ID NO:2的血红素加氧酶(NCBI号：WP_014319205.1)。
相对应地，术语“血红素加氧酶突变体”、“突变血红素加氧酶”和“突变酶”表示相同的意义，都是指血红素加氧酶的突变体例如SEQ ID NO:3。为简要起见，有时为了表述方便起见，在本发明中可以将野生型血红素加氧酶与其突变体统称为“血红素加氧酶”，只要不与野生酶SEQ ID NO:2混淆即可。
所述的“突变”包括但不限于氨基酸残基的替换、删除、插入、化学修饰，优选是正向突变即酶活力提高的突变。所述取代可以是非保守取代、保守取代或非保守取代和保守取代的组合。“保守的”氨基酸取代或突变是指具有相似侧链的残基的可互换性，并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。然而，如本文所用，如果保守的突变可以代替地为脂肪族至脂肪族、非极性至非极性、极性至极性、酸性至酸性、碱性至碱性、芳族至芳族、或限制残基至限制残基的取代，则保守的突变不包括亲水至亲水、疏水至疏水、含羟基至含羟基或小残基至小残基的取代。本技术领域公知，保守性置换的常见情况包括：芳香族氨基酸F、W、Y之间的相互置换；疏水性氨基酸L、I、V之间的相互置换，极性氨基酸Q、N之间的相互置换，碱性氨基酸K、R、H之间的相互置换，酸性氨基酸D、E之间的相互置换，羟基的氨基酸S、T之间的相互置换。此外，A、V、L或I可以保守地突变为另一脂肪族残基或另一非极性残基。
“非保守取代”是指用具有显著不同的侧链特性的氨基酸进行的多肽中氨基酸的取代或突变。非保守取代可以使用上面所列的定义组之间而不是之内的氨基酸。在一个实施方案中，非保守突变影响(a)取代区域中肽主链的结构(例如，脯氨酸取代甘氨酸)、(b)电荷或疏水性、或(c)侧链体积。
“缺失”是指通过从参考多肽移除一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。缺失可以包括移除1个或多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸、或20个或更多个氨基酸、多达构成参考酶的氨基酸总数的10％，同时保留酶活性和/或保留工程化血红素加氧酶的改良特性。缺失可以针对多肽的内部和/或端部。在多个实施方案中，缺失可以包含连续的区段或者可以是不连续的。
“插入”是指通过从参考多肽添加一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。在一些实施方案中，改良的工程化血红素加氧酶(heme oxygenase)包括将一个或多个氨基酸插入天然存在的血红素加氧酶SEQ ID NO:2中以及将一个或多个氨基酸插入其他改良的血红素加氧酶SEQ ID NO:3多肽中。插入可以是在多肽的内部，或羧基端或氨基端。如本文所用的插入包括如本领域中已知的融合蛋白。插入可以是连续氨基酸区段或者被天然存在的多肽中的一个或多个氨基酸分隔开。
为简要起见，本文中的氨基酸缩写既可以使用英文三字母、也可以采用英文单字母，这是本领域技术人员熟知的，这些缩写列于如下表1中：
表1、氨基酸中英文对照及缩写
本发明的血红素加氧酶突变体的氨基酸数量只有215个，序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。
这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
为了在微生物宿主例如基因工程中最常用的大肠杆菌宿主中最佳地表达血红素加氧酶SEQ ID NO:2及其突变体SEQ ID NO:3，本发明对其表达基因进行了密码子优化。
密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以被用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。
经过密码子优化，血红素加氧酶突变体SEQ ID NO:3的编码基因可以是SEQ IDNO:4。
当作为生物催化剂用于制备胆绿素时，本发明的血红素加氧酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。
生物催化领域公知，与游离酶法相比，应用固定化酶技术具有生产过程简化、生产效率提高等优点。同时，由于酶可多次使用，且酶的稳定性提高，从而有效提高了单位酶的生产力；其次，固定化酶极易与底物、产物分开，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。
本领域技术人员容易理解，菌体本身就是一种天然的酶固定化形式，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。有些小分子化合物的反应底物和反应产物可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。
另一方面，相比分离出的酶的催化，本发明利用微生物的简单发酵就可以源源不断、取之不尽地提供酶或的供应，无需进一步提取、纯化分离酶等操作，经济性显而易见，为工业化应用创造条件。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例
实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆委托生工生物科技(上海)股份有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4·3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
空质粒载体pET-28a购自Novagen公司。
E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。
限制性内切酶EcoR I、Xho I、和T4 DNA连接酶均为New England Biolabs(NEB)公司的市售产品。
血红素加氧酶的活力测定方法：在含有0.2g/L底物氯化血红素、10mM的葡萄糖、0.2mM NADP+、1.5g/L葡萄糖脱氢酶的5mL反应体系(100mM磷酸钾缓冲液，pH 8.0)中，加入适量的血红素加氧酶，30℃保温反应30min后，取样进行液相色谱分析转化率。1个酶活力单位(U)定义为上述条件下每分钟催化生成1μmol产物所需的酶量。
底物和产物HPLC检测方法：安捷伦Agilent 1260液相色谱仪，C18柱(250mm×4.6mm)，流动相为乙腈/0.1％三氟乙酸水溶液＝95:5(v/v)，柱温30℃，流速1.0ml/min，检测波长396nm。
需说明的是，为描述方便起见，在实施例中，可将菌株编号、质粒编号、酶编号、酶编码基因编号共用一个编号，这是本领域技术人员容易理解的，即同一个编号在不同环境中可以指代不同的生物形式。
实施例1：血红素加氧酶的基因克隆
通过生物信息学分析方法预测可能对氯化血红素具有高催化活性的血红素加氧酶，并将其基因分选出来进行克隆表达，验证其功能。采用这种方法，从棒状杆菌(Corynebacterium sp.)克隆得到一条血红素加氧酶(NCBI号：WP_014319205.1，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)，其编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。以棒状杆菌(Corynebacterium sp.)的基因组DNA为模板，采用本领域常规技术方法(如聚合酶链式反应PCR)，获得编码所述血红素加氧酶的完整核酸分子。其中涉及的合成引物，优选的如SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示：
上游引物：CCGGAATTCATGACCACTGCAACCGCA(SEQ ID NO:5)，
下游引物：CCGCTCGAGTTACAGCCCTTTACC(SEQ ID NO:6)。
其中上游引物下划线所示序列为EcoR I的酶切位点，下游引物下划线所示序列为Xho I的酶切位点。
以棒状杆菌(Corynebacterium sp.)的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应PCR进行基因扩增。
PCR体系(50μL)：2×Taq PCR MasterMix 25μl，基因组DNA (100ng/μL)1μL，上下游引物(10μM)各2.5μL，加灭菌蒸馏水补足至50μL。
PCR反应程序：(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化，并用DNA回收试剂盒回收目的片段。
实施例2：野生型血红素加氧酶重组表达载体和重组表达转化体的制备
将实施例1中PCR扩增获得的血红素加氧酶目的基因与空载质粒pET28a分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I在37℃双酶切12h。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，用T4 DNA连接酶将得到的线性化pET28a质粒与纯化后的目的基因片段置于16℃连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并均匀涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，置于37℃培养箱中静置培养约12h，对长出来的菌落进行菌落PCR验证，挑取菌落PCR为阳性的克隆进行测序验证。经测序验证正确后，提取相应的质粒，即得到血红素加氧酶的重组表达载体pET28a-CoHO，参见图1。
将所得到的重组表达载体进一步转化至E.coli BL21(DE3(感受态细胞中，挑取阳性克隆，即获得野生血红素加氧酶的重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-CoHO。
实施例3：血红素加氧酶突变体的构建及高通量筛选
采用易错PCR技术对如序列表SEQ ID NO:1所示编码野生型血红素加氧酶的核苷酸序列进行随机突变。
以pET28a-CoHO质粒为模板，以如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列为引物，用rTaq DNA聚合酶进行易错PCR，构建随机突变库。
PCR体系(50μL)：rTaq DNA聚合酶0.5μL，10×PCR buffer(Mg2+Plus)5.0μL，dNTPMixture(各2.0mM)4.0μL，终浓度为150μmol/L的MnCl2，pET28a-CoHO质粒0.5ng，上下游引物(10μM)各2μL，加灭菌蒸馏水补足至50μL。
PCR反应程序：(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)58℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，对回收后的目的基因DNA片段与空载质粒pET28a分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I在37℃双酶切12h。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，用T4 DNA连接酶将得到的线性化pET28a质粒与纯化后的目的基因DNA片段置于16℃连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并均匀涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，置于37℃培养箱中静置培养约12h。
将转化平板上的转化子用灭菌牙签挑入96孔深孔板中，于37℃，220rpm摇床中培养过夜。从一级板中吸取20μL菌液接入二级板中，于37℃，220rpm摇床中培养3-4h后，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃培养20h。然后于4℃、3500×g离心10min，倒掉上层培养基，每个孔中加入200μL溶菌酶液(750mg溶菌酶和10mg DNA酶溶解于1L去离子水中)，振荡混匀，再于37℃摇床上处理2h。随后4℃、3500×g离心10min，取10μL适当稀释的细胞破碎上清转移到包含190μL反应液的96孔酶标板中(反应液配方为：100mM，pH 8.0磷酸钾缓冲液，0.2g/L氯化血红素，0.1mM NADPH)中，于30℃检测340nm处吸光度在1min内的变化值，突变体的活力越高则其在340nm处的吸光度值变化越快，如此筛选得到性能提高的突变体，并委托生工生物科技(上海)股份有限公司对相应的基因进行核酸测序，通过基因组测序比对来确定氨基酸突变位点。
测定突变体库中各菌株的酶活力，筛选得到了活性显著提高的突变体，进而对这些突变体的50℃热稳定性进行了表征，优选出酶活力和热稳定性增高的系列突变菌株/突变体，这些突变菌株的催化活性和热稳定性列于表1中。在表1的列表中，序列标号分别指表1后面相对应的序列。在酶活性列中，与野生酶CoHO相比，一个加号“+”表示突变体的活性提高了1～2.0倍；两个加号“++”表示突变体的活性提高了2.1～5.0倍；三个加号“+++”表示突变体的活性提高了5.1-10.0倍。在热稳定性列中，一个加号“+”对应于50℃保温3h后，突变体的残余活性保留5.0～25.0％；两个加号“++”对应于50℃保温3h后，突变体的残余活性保留25.1～50.0％；三个加号“+++”对应于50℃保温3h后，突变体的残余活性保留50.1～80.0％。
表1、血红素加氧酶CoHO及突变体表达菌株的酶活性和热稳定性列表
对应于序列标号的血红素加氧酶突变体的氨基酸序列分别如下：
(1)将如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第34位赖氨酸替换为谷氨酸；
(2)将如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第34位赖氨酸替换为天冬氨酸，第54位苏氨酸替换为甲硫氨酸；
(3)将如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第34位赖氨酸替换为天冬氨酸，第54位苏氨酸替换为半胱氨酸，第93位丝氨酸替换为甘氨酸；
(4)将如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第54位苏氨酸替换为甲硫氨酸；
(5)将如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第54位苏氨酸替换为甲硫氨酸，第60位缬氨酸替换为丙氨酸，第167位丙氨酸替换为组氨酸，第199位天冬氨酸替换为天冬酰胺；
(6)将如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第34位赖氨酸替换为谷氨酸，第54位苏氨酸替换为甲硫氨酸，第60位缬氨酸替换为丙氨酸，第93位丝氨酸替换为甘氨酸，第167位丙氨酸替换为天冬氨酸，第178位谷氨酸替换为赖氨酸，第199位天冬氨酸替换为天冬酰胺；
(7)将如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第60位缬氨酸替换为丙氨酸；
(8)将如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第93位丝氨酸替换为甘氨酸；
(9)将如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第60位缬氨酸替换为丙氨酸，第93位丝氨酸替换为甘氨酸，第101位苏氨酸替换为酪氨酸；
(10)将如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第93位丝氨酸替换为亮氨酸，第122位甘氨酸替换为天冬酰胺，第143位异亮氨酸替换为精氨酸，第167位丙氨酸替换为天冬氨酸，第199位天冬氨酸替换为苯丙氨酸；
(11)将如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第143位异亮氨酸替换为精氨酸；
(12)将如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第167位丙氨酸替换为苏氨酸；
(13)将如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第167位丙氨酸替换为天冬氨酸，第178位谷氨酸替换为谷氨酰胺，第199位天冬氨酸替换为天冬酰胺；
(14)将如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第178位谷氨酸替换为赖氨酸；
(15)将如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的第199位天冬氨酸替换为缬氨酸。
通过统计发现，一些酶活力提高的突变体相对于野生酶SEQ ID NO:2的突变位点基本集中于第34位赖氨酸(K34)、第54位苏氨酸(T54)、第60位缬氨酸(V60)、第93位丝氨酸(S93)、第101位苏氨酸(T101)、第122位甘氨酸(G122)、第143位异亮氨酸(I143)、第167位丙氨酸(A167)、第178位谷氨酸(E178)和第199位天冬氨酸(D199)，其中有些位点的突变呈现部分重复性即规律性，提示这些位点的氨基酸残基或许是酶活性口袋/通道的关键或重要位点，有待于进一步研究。
另外，突变菌株M6的酶活力和热稳定性的综合性能是最优的，该突变体相对于野生酶发生了K34E、T54M、V60A、S93G、A167D、E178K、D199N突变，氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
实施例4：菌株发酵
将实施例2和3中所得的野生酶重组表达菌株和突变菌株接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，作为种子液。将发酵罐温度和搅拌转速分别设置为37℃和400rpm，通气量调至1vvm(3L/min)。待发酵罐各参数稳定后，在火焰保护下将200mL种子液接入装有3L培养基(甘油5g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，Na2HPO4 3g/L，Na2SO40.7g/L，KH2PO4 3.4g/L，MgSO4 0.25g/L，NH4Cl 2.7g/L，pH7.0)的发酵罐中，发酵开始。随着细胞生长，溶氧(DO)下降，当DO降至30％以下时提高搅拌转速，至转速升高至500rpm。发酵过程中流加氨水控制pH在7.0左右。发酵开始2h后每隔1h取样，检测发酵液中的细胞浓度(OD600)。培养4h后，补加碳氮源(250g/L甘油、60g/L蛋白胨、60g/L酵母膏)，流速为35mL/h。培养5h时，将发酵罐料液温度调节至25℃，同时将补料速率降低至27mL/h，培养5.5h加入IPTG水溶液(母液浓度1M，终浓度0.2mM)对目标蛋白进行诱导表达。诱导表达后每隔2h取样，测定OD600，诱导后20h，结束发酵。将发酵液离心共获得300g静息细胞。
实施例5：细胞破碎液、冻干酶粉及冻干细胞的制备
将160g实施例4中收获的每种细胞悬浮于1L的缓冲液中，高压匀浆破碎，离心收集上清液，即可获得粗酶液。收集的粗酶液放置在-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，获得所述冻干酶粉20g。将100g实施例4中收获的每种细胞进行冷冻干燥，获得含有野生酶或突变酶的冻干细胞25g。将所获得的冻干酶粉和冻干细胞保存在4℃冰箱内备用。
实施例6-21：野生血红素加氧酶及其突变体催化血红素氧化合成胆绿素的考察
在20mL夹套反应器中进行反应，通过氧气气球提供氧气，10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.0)中加有0.1g/L氯化血红素，1g/L葡萄糖，0.5g/L葡萄糖脱氢酶，0.05mMNADP+，1g/L实施例4中所得野生酶重组表达菌株和突变菌株的静息细胞。在25℃条件下磁力搅拌反应。通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(1.0M)，维持反应液pH为7.0。反应5小时后，测定底物转化率，结果见表2。
表2、血红素加氧酶及其突变体催化氯化血红素的氧化
从表2中可以看出，实施例12使用的突变菌株M6的酶催化反应表现仍然是最好的，与表1结果有相似性，表明突变体SEQ ID NO:3的酶活力明显高于野生酶。下文中重点研究该突变菌株M6即突变酶SEQ ID NO:3，将其命名为CoHOM6。
实施例22：CoHOM6催化氯化血红素氧化合成胆绿素
在20mL夹套反应器中进行反应，通过氧气气球提供氧气，10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)中加有1g/L氯化血红素，10g/L葡萄糖，1.5g/L葡萄糖脱氢酶，0.2mM NADP+，5g/L血红素加氧酶CoHOM6的冻干酶粉。在30℃条件下磁力搅拌反应。通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(1.0M)，维持反应液pH为8.0。间歇取样检测反应转化率，反应8h后，测得转化率为90％。
实施例23：CoHOM6催化氯化血红素氧化合成胆绿素
在20mL夹套反应器中进行反应，通过氧气气球提供氧气，10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)中加有1g/L氯化血红素，10g/L葡萄糖，1.5g/L葡萄糖脱氢酶，0.2mM NADP+，10g/L血红素加氧酶CoHOM6的冻干酶粉。在30℃条件下磁力搅拌反应。通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(1.0M)，维持反应液pH为8.0。间歇取样检测反应转化率，反应8h后，测得转化率为96％。
实施例24：CoHOM6催化氯化血红素氧化合成胆绿素
在20mL夹套反应器中进行反应，通过氧气气球提供氧气，10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)中加有1g/L氯化血红素，10g/L葡萄糖，1.5g/L葡萄糖脱氢酶，0.2mM NADP+，10g/L血红素加氧酶CoHOM6的冻干细胞。在35℃条件下磁力搅拌反应。通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(1.0M)，维持反应液pH为8.0。间歇取样检测反应转化率，反应8h后，测得转化率为97％。
实施例25：1-L规模CoHOM6催化氯化血红素氧化合成胆绿素
在2L夹套反应器中进行反应，1L磷酸钾缓冲液(10mM,pH 8.0)中加有1g/L氯化血红素，10g/L葡萄糖，1.5g/L葡萄糖脱氢酶，0.2mM NADP+，10g/L血红素加氧酶CoHOM6的冻干酶粉。利用通气装置向反应体系中持续通入空气。在30℃条件下机械搅拌反应，搅拌转速为300rpm。通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(1.0M)，维持反应液pH为8.0。间歇取样检测反应转化率，反应12h后，测得转化率为96％，用1M的HCl调节pH至3～4终止反应，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，将萃取液混合，用等体积饱和食盐水洗涤两次，洗涤后的萃取液用无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发浓缩至有结晶析出，冷却至室温，抽滤除去残余溶剂，获得胆绿素产品0.82g，分离得率为93％。检测酶催化反应的HPLC图谱如图2所示。
实施例26：1-L规模CoHOM6催化氯化血红素氧化合成胆绿素
在2L夹套反应器中进行反应，1L磷酸钾缓冲液(10mM,pH 8.0)中加有1g/L氯化血红素，10g/L葡萄糖，1.5g/L葡萄糖脱氢酶，0.2mM NADP+，10g/L血红素加氧酶CoHOM6的冻干细胞。利用通气装置向反应体系中持续通入空气。在33℃条件下机械搅拌反应，搅拌转速为300rpm。通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(1.0M)，维持反应液pH为8.0。间歇取样检测反应转化率，反应12h后，测得转化率为97％，用1M的HCl调节pH至3～4终止反应，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，将萃取液混合，用等体积饱和食盐水洗涤两次，洗涤后的萃取液用无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发浓缩至有结晶析出，冷却至室温，抽滤除去残余溶剂，获得胆绿素产品0.84g，分离得率为95％。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。应理解，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的提示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该视为仍在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酶催化制备胆绿素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以氯化血红素为底物，使用棒状杆菌Corynebacterium sp.来源的血红素加氧酶或者其酶活力提高的突变体催化氧化反应，得到胆绿素，所述血红素加氧酶的氨基酸序列为SEQID NO:2。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中添加有葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和辅酶NADP+或NAD+。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血红素加氧酶或者其突变体呈现为酶形式或者表达微生物菌体形式。
4.一种如权利要求1中所述的血红素加氧酶突变体，其特征在于，所述突变体为氨基酸序列SEQ ID NO:2中的下述位点发生突变后所形成的突变体：第34位赖氨酸、第54位苏氨酸、第60位缬氨酸、第93位丝氨酸、第101位苏氨酸、第122位甘氨酸、第143位异亮氨酸、第167位丙氨酸、第178位谷氨酸、第199位天冬氨酸、或者它们中两种以上的组合，该血红素加氧酶突变体具有血红素加氧酶SEQ ID NO:2的功能。
5.如权利要求4所述的血红素加氧酶突变体，其特征在于，其为选自下述的多肽：
(a)氨基酸序列为SEQ ID NO:3的多肽；
(b)氨基酸序列与SEQ ID NO:3有90％以上同源性、且酶活力相比SEQ ID NO:3提高的多肽。
6.编码如权利要求5中所述血红素加氧酶突变体SEQ ID NO:3的基因。
7.如权利要求6所述的基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
8.一种DNA分子，其特征在于，包含如权利要求7所述的基因。
9.一种质粒，其特征在于，包含如权利要求8所述的DNA分子。
10.一种微生物，其为表达如权利要求5中所述血红素加氧酶突变体SEQ ID NO:3的工程菌。
CN202410260336.5A 2024-03-07 2024-03-07 一种血红素加氧酶突变体及其应用 Pending CN118126970A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410260336.5A CN118126970A (zh) 2024-03-07 2024-03-07 一种血红素加氧酶突变体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410260336.5A CN118126970A (zh) 2024-03-07 2024-03-07 一种血红素加氧酶突变体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118126970A true CN118126970A (zh) 2024-06-04

Family

ID=91239983

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410260336.5A Pending CN118126970A (zh) 2024-03-07 2024-03-07 一种血红素加氧酶突变体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118126970A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112831488B (zh) 一种谷氨酸脱羧酶及γ-氨基丁酸高产菌株
CN106164260A (zh) 假丝酵母及其羰基还原酶的产生及应用
CN114854707B (zh) 一种7β-羟基甾体脱氢酶突变体
CN111411092A (zh) 高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌及其应用
US20100015681A1 (en) Hydrogen Production By Means Of A Cell Expression System
EP2796548A1 (en) Stereoselective production of (R)-3-quinuclidinol
CN118126970A (zh) 一种血红素加氧酶突变体及其应用
CN112226428B (zh) 油酸水合酶突变体及其在制备10-羟基硬脂酸中的应用
CN114908129B (zh) 用于制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的脱氢酶
CN114958934A (zh) 一种制备l-草铵膦的方法
CN114703114A (zh) 一种基因工程菌及其用途和制备l-苯苷氨酸的方法
CN111254170B (zh) 一种多酶耦合制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的方法
CN107119065A (zh) 一种用于生产哌啶甲酸的重组质粒、基因工程菌株及方法
CN109897872B (zh) 酶法制备(2s,3s)-n-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷
CN110872595B (zh) 抗酸表达盒及其在发酵产有机酸中的应用
CN118726285A (zh) 烯还原酶突变体、核酸、重组表达载体及其应用
CN112280756B (zh) 异亮氨酸羟化酶突变体及在(2s,3r,4s)-4-羟基异亮氨酸合成中的应用
CN112538472B (zh) 一种苏氨酸脱氨酶突变体及其在l-2-氨基丁酸制备中的应用
CN118126972B (zh) 一种羰基还原酶突变体及其制备方法和应用
CN112592913B (zh) 一种热稳定的苏氨酸脱氨酶及其应用
CN118207172B (zh) 双功能谷胱甘肽合酶突变体及其应用
CN114196642B (zh) 谷氨酸脱氢酶变体及其在制备l-氨基酸中的应用
CN115029329B (zh) 一种羰基还原酶突变体及其在制备r-扁桃酸中的应用
CN113512571B (zh) 鸟氨酸环化脱氨酶催化合成l-哌啶酸的方法
CN114736882B (zh) 一种单胺氧化酶及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination