JP2002233384A - Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 - Google Patents
Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｌ−システイン生産能を有するコリネ型細菌
を創製し、同細菌を用いてＬ−システインを製造する方
法を提供する。 【解決手段】 セリンアセチルトランスフェラーゼをコ
ードする遺伝子で形質転換されたこと、又は細胞内のセ
リンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の
発現が増強されるように同遺伝子の発現調節配列が改変
されたこと等により、細胞内のセリンアセチルトランス
フェラーゼ活性が上昇したコリネ型細菌、好ましくはさ
らに、Ｌ−システイン分解系が抑制されたコリネ型細菌
を培地に培養し、該培養物中にＬ−システインを生成蓄
積せしめ、該培養物からＬ−システインを採取すること
により、Ｌ−システインを製造する。
を創製し、同細菌を用いてＬ−システインを製造する方
法を提供する。 【解決手段】 セリンアセチルトランスフェラーゼをコ
ードする遺伝子で形質転換されたこと、又は細胞内のセ
リンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の
発現が増強されるように同遺伝子の発現調節配列が改変
されたこと等により、細胞内のセリンアセチルトランス
フェラーゼ活性が上昇したコリネ型細菌、好ましくはさ
らに、Ｌ−システイン分解系が抑制されたコリネ型細菌
を培地に培養し、該培養物中にＬ−システインを生成蓄
積せしめ、該培養物からＬ−システインを採取すること
により、Ｌ−システインを製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−システインの
製造法に関し、詳しくはＬ−システインの製造に好適な
新規なコリネ型細菌、及びそれを用いたＬ−システイン
の製造法に関する。Ｌ−システイン及びＬ−システイン
の誘導体は、医薬品、化粧品及び食品分野で利用されて
いる。
製造法に関し、詳しくはＬ−システインの製造に好適な
新規なコリネ型細菌、及びそれを用いたＬ−システイン
の製造法に関する。Ｌ−システイン及びＬ−システイン
の誘導体は、医薬品、化粧品及び食品分野で利用されて
いる。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｌ−システインは、毛髪、角、羽
毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、ある
いはＤＬ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸を前
駆体とする微生物酵素変換により得られている。さら
に、微生物を用いた発酵法によるＬ−システインの生産
も試みられている。
毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、ある
いはＤＬ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸を前
駆体とする微生物酵素変換により得られている。さら
に、微生物を用いた発酵法によるＬ−システインの生産
も試みられている。
【０００３】Ｌ−システインの生合成について、エシェ
リヒア・コリ等の細菌では詳細に研究されており（Kred
ich, N. M. et al., J. Biol. Chem., 241, 4955-4965
(1966), Kredich, N. M. et al., 1987, Biosynthesis
of Cysteine. In: Neidhardt, F.C., et al., (eds) Es
cherichia coli and Salmonella typhimurium: cellula
r and molecular biology, Vol.1, American Society f
or Microbiology, Washington D.C., 419-428）、Ｌ−
セリンから２段階の反応によりＬ−システインが生成す
ることがわかっている。エシェリヒア・コリでは、第一
の反応は、アセチル−ＣｏＡによるＬ−セリンの活性化
であり、セリンアセチルトランスフェラーゼ（serine a
cetyltransferase（EC 2.3.1.30）：以下、「SAT」とも
いう）により触媒される。第二の反応は、上記反応によ
り生成するＯ−アセチルセリンからＬ−システインが生
成する反応であり、Ｏ−アセチルセリン（チオール）リ
アーゼにより触媒される。
リヒア・コリ等の細菌では詳細に研究されており（Kred
ich, N. M. et al., J. Biol. Chem., 241, 4955-4965
(1966), Kredich, N. M. et al., 1987, Biosynthesis
of Cysteine. In: Neidhardt, F.C., et al., (eds) Es
cherichia coli and Salmonella typhimurium: cellula
r and molecular biology, Vol.1, American Society f
or Microbiology, Washington D.C., 419-428）、Ｌ−
セリンから２段階の反応によりＬ−システインが生成す
ることがわかっている。エシェリヒア・コリでは、第一
の反応は、アセチル−ＣｏＡによるＬ−セリンの活性化
であり、セリンアセチルトランスフェラーゼ（serine a
cetyltransferase（EC 2.3.1.30）：以下、「SAT」とも
いう）により触媒される。第二の反応は、上記反応によ
り生成するＯ−アセチルセリンからＬ−システインが生
成する反応であり、Ｏ−アセチルセリン（チオール）リ
アーゼにより触媒される。
【０００４】また、エシェリヒア・コリでは、Ｌ−シス
テイン分解は、システインデスルフヒドラーゼ（cystei
ne desulfhydrase：以下、「CD」ともいう）活性の低下
によってが抑制されることが知られている（特開平11-1
55571号）。
テイン分解は、システインデスルフヒドラーゼ（cystei
ne desulfhydrase：以下、「CD」ともいう）活性の低下
によってが抑制されることが知られている（特開平11-1
55571号）。
【０００５】SATをコードする遺伝子（cysE）は、エシ
ェリヒア・コリにおいては、野生株及びＬ−システイン
分泌変異株よりクローニングされている（Denk, D. and
Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1
987)）。また、これらのcysEの塩基配列が決定され、Ｌ
−システインによるフィードバック阻害が減少したSAT
は、２５６位のメチオニン残基がイソロイシン残基に置
換されていたことが報告されている。さらに、上記変異
とは異なる変異によりＬ−システインによるフィードバ
ック阻害が低減されたＳＡＴをコードするＤＮＡを用い
て、Ｌ−システイン等を製造する方法が開示されている
（WO 97/15673号国際公開パンフレット）。このSATは、
９７位のアミノ酸残基から２７３位のアミノ酸残基まで
の領域における変異、又は２２７位のアミノ酸残基から
Ｃ末端領域の欠失を有する。
ェリヒア・コリにおいては、野生株及びＬ−システイン
分泌変異株よりクローニングされている（Denk, D. and
Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1
987)）。また、これらのcysEの塩基配列が決定され、Ｌ
−システインによるフィードバック阻害が減少したSAT
は、２５６位のメチオニン残基がイソロイシン残基に置
換されていたことが報告されている。さらに、上記変異
とは異なる変異によりＬ−システインによるフィードバ
ック阻害が低減されたＳＡＴをコードするＤＮＡを用い
て、Ｌ−システイン等を製造する方法が開示されている
（WO 97/15673号国際公開パンフレット）。このSATは、
９７位のアミノ酸残基から２７３位のアミノ酸残基まで
の領域における変異、又は２２７位のアミノ酸残基から
Ｃ末端領域の欠失を有する。
【０００６】上述のように、Ｌ−システインによるフィ
ードバック阻害が低減したSATをコードする遺伝子を利
用してＬ−システインを製造する技術が知られている
が、本発明者らは、Ｌ−システインによるフィードバッ
ク阻害が低減されたＳＡＴを保持するエシェリヒア属細
菌は、Ｌ−システインの生産性が不安定であることを見
い出した。そして、この不安定性は、細胞中のCD活性を
低下させることにより安定化されることを見出し、安定
してＬ−システインを産生するエシェリヒア・コリを創
製することに成功している（特開平11-155571号）。
ードバック阻害が低減したSATをコードする遺伝子を利
用してＬ−システインを製造する技術が知られている
が、本発明者らは、Ｌ−システインによるフィードバッ
ク阻害が低減されたＳＡＴを保持するエシェリヒア属細
菌は、Ｌ−システインの生産性が不安定であることを見
い出した。そして、この不安定性は、細胞中のCD活性を
低下させることにより安定化されることを見出し、安定
してＬ−システインを産生するエシェリヒア・コリを創
製することに成功している（特開平11-155571号）。
【０００７】また、抗生物質又は他の毒性の物質を細胞
から放出するために好適である蛋白質をコードする遺伝
子（流出遺伝子）を過剰発現する微生物、具体的には大
腸菌を用いてＬ−システインなどを製造する方法が開示
されている（特許第29920110号）。
から放出するために好適である蛋白質をコードする遺伝
子（流出遺伝子）を過剰発現する微生物、具体的には大
腸菌を用いてＬ−システインなどを製造する方法が開示
されている（特許第29920110号）。
【０００８】一方、コリネバクテリウム・グルタミカム
においては、Ｓ−（β−アミノエチル）−システイン
（ＡＥＣ）耐性を示す遺伝子として、aecD遺伝子が同定
されている（Rossol, I. et al., J. Bacteriol., 174
(9), 2968-2977 (1992)）。aecD遺伝子は、生育には必
須ではなく、増幅された場合のみＡＥＣ耐性に関与する
こと、及び、同遺伝子によってコードされる蛋白質は、
ＡＥＣ、システイン等を基質とするＣ−Ｓリアーゼ活性
を有することが示されている。Rossolらは、リアーゼが
シンセターゼと同様に、脱離及びそれと逆の合成反応を
触媒しうることに着目し、新規な含硫アミノ酸の酵素的
合成を示唆している。しかし、微生物を用いた発酵法に
よる含硫アミノ酸の製造の成功例はほとんど知られてい
ないことから、Ｃ−Ｓリアーゼを用いる可能性として
は、逆反応を利用した酵素的合成法を挙げるに止めて留
めている。
においては、Ｓ−（β−アミノエチル）−システイン
（ＡＥＣ）耐性を示す遺伝子として、aecD遺伝子が同定
されている（Rossol, I. et al., J. Bacteriol., 174
(9), 2968-2977 (1992)）。aecD遺伝子は、生育には必
須ではなく、増幅された場合のみＡＥＣ耐性に関与する
こと、及び、同遺伝子によってコードされる蛋白質は、
ＡＥＣ、システイン等を基質とするＣ−Ｓリアーゼ活性
を有することが示されている。Rossolらは、リアーゼが
シンセターゼと同様に、脱離及びそれと逆の合成反応を
触媒しうることに着目し、新規な含硫アミノ酸の酵素的
合成を示唆している。しかし、微生物を用いた発酵法に
よる含硫アミノ酸の製造の成功例はほとんど知られてい
ないことから、Ｃ−Ｓリアーゼを用いる可能性として
は、逆反応を利用した酵素的合成法を挙げるに止めて留
めている。
【０００９】上記のように、エシェリヒア属細菌におい
てはＬ−システイン生産菌の育種についていくつか報告
があり、コリネバクテリウム・グルタミカムのＬ−シス
テイン分解に関与する酵素についてもある程度の報告が
なされている。しかしながら、培地から回収することが
可能な程度のＬ−システインを醗酵生産した例は、コリ
ネ型細菌では知られていない。
てはＬ−システイン生産菌の育種についていくつか報告
があり、コリネバクテリウム・グルタミカムのＬ−シス
テイン分解に関与する酵素についてもある程度の報告が
なされている。しかしながら、培地から回収することが
可能な程度のＬ−システインを醗酵生産した例は、コリ
ネ型細菌では知られていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑みなされたものであり、Ｌ−システイン生産能を有す
るコリネ型細菌を創製し、同細菌を用いてＬ−システイ
ンを製造する方法を提供することを課題とする。
鑑みなされたものであり、Ｌ−システイン生産能を有す
るコリネ型細菌を創製し、同細菌を用いてＬ−システイ
ンを製造する方法を提供することを課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意検討を行った結果、コリネ型細菌にお
いて、例えば細胞内のセリンアセチルトランスフェラー
ゼ活性を上昇させることによって、Ｌ−システイン生産
能を付与することができることを見出した。さらに、Ｌ
−システイン分解系を抑制することによって、Ｌ−シス
テイン生産能を増強することができることを見出し、本
発明を完成するに至った。
を解決すべく鋭意検討を行った結果、コリネ型細菌にお
いて、例えば細胞内のセリンアセチルトランスフェラー
ゼ活性を上昇させることによって、Ｌ−システイン生産
能を付与することができることを見出した。さらに、Ｌ
−システイン分解系を抑制することによって、Ｌ−シス
テイン生産能を増強することができることを見出し、本
発明を完成するに至った。
【００１２】すなわち本発明は、以下のとおりである。 （１）Ｌ−システイン生産能を有するコリネ型細菌。 （２）細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ活性
が上昇した(1)のコリネ型細菌。 （３）Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減
されたセリンアセチルトランスフェラーゼを保持するこ
とにより、細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ
活性が上昇した（2)のコリネ型細菌。 （４）前記Ｌ−システインによるフィードバック阻害が
低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼが、野生
型セリンアセチルトランスフェラーゼの２５６位のメチ
オニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロ
イシン残基以外のアミノ酸残基に置換する変異、又は２
５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基からＣ
末端側の領域を欠失させる変異を有する(3)のコリネ型
細菌。 （５）セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする
遺伝子で形質転換されたこと、又は前記細菌細胞内のセ
リンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の
発現が増強されるように同遺伝子の発現調節配列又は発
現調節に関与する遺伝子が改変されたことにより、細胞
内のセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇した
(2)〜(4)のいずれかのコリネ型細菌。 （６）前記セリンアセチルトランスフェラーゼをコード
する遺伝子がエシェリヒア属細菌のｃｙｓＥである(5)
のコリネ型細菌。 （７）さらに、Ｌ−システイン分解系が抑制された(1)
〜(6)のいずれかのコリネ型細菌。 （８）細胞内のシステインデスルフヒドラーゼ活性が低
減されたことによりＬ−システイン分解系が抑制された
（７）のコリネ型細菌。 （９）ａｅｃＤ遺伝子が破壊されたことにより細胞内の
システインデスルフヒドラーゼ活性が低減された（８）
のコリネ型細菌。 （１０）（１）〜（９）のいずれかのコリネ型細菌を培
地に培養し、該培養物中にＬ−システインを生成蓄積せ
しめ、該培養物からＬ−システインを採取することを特
徴とするＬ−システインの製造法。
が上昇した(1)のコリネ型細菌。 （３）Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減
されたセリンアセチルトランスフェラーゼを保持するこ
とにより、細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ
活性が上昇した（2)のコリネ型細菌。 （４）前記Ｌ−システインによるフィードバック阻害が
低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼが、野生
型セリンアセチルトランスフェラーゼの２５６位のメチ
オニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロ
イシン残基以外のアミノ酸残基に置換する変異、又は２
５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基からＣ
末端側の領域を欠失させる変異を有する(3)のコリネ型
細菌。 （５）セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする
遺伝子で形質転換されたこと、又は前記細菌細胞内のセ
リンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の
発現が増強されるように同遺伝子の発現調節配列又は発
現調節に関与する遺伝子が改変されたことにより、細胞
内のセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇した
(2)〜(4)のいずれかのコリネ型細菌。 （６）前記セリンアセチルトランスフェラーゼをコード
する遺伝子がエシェリヒア属細菌のｃｙｓＥである(5)
のコリネ型細菌。 （７）さらに、Ｌ−システイン分解系が抑制された(1)
〜(6)のいずれかのコリネ型細菌。 （８）細胞内のシステインデスルフヒドラーゼ活性が低
減されたことによりＬ−システイン分解系が抑制された
（７）のコリネ型細菌。 （９）ａｅｃＤ遺伝子が破壊されたことにより細胞内の
システインデスルフヒドラーゼ活性が低減された（８）
のコリネ型細菌。 （１０）（１）〜（９）のいずれかのコリネ型細菌を培
地に培養し、該培養物中にＬ−システインを生成蓄積せ
しめ、該培養物からＬ−システインを採取することを特
徴とするＬ−システインの製造法。
【００１３】本発明においてＬ−システイン生産能と
は、本発明の細菌を培地に培養したときに、培地から回
収することができる量のＬ−システインを培地中に蓄積
する能力をいう。細胞が生育に必要する量のＬ−システ
インを生産する能力は、本発明にいうＬ−システイン生
産能ではない。
は、本発明の細菌を培地に培養したときに、培地から回
収することができる量のＬ−システインを培地中に蓄積
する能力をいう。細胞が生育に必要する量のＬ−システ
インを生産する能力は、本発明にいうＬ−システイン生
産能ではない。
【００１４】また、「Ｌ−システイン分解系の抑制」と
は、システインの分解に関与する酵素のうち少なくとも
一つの活性が低下又は消失していることをいう。「フィ
ードバック阻害の低減」とは、低減されたフィードバッ
ク阻害が残存している場合に加えて、フィードバック阻
害が実質的に解除されている場合を含む。尚、本発明に
おいてＬ−システインとは、特記しない限り、還元型Ｌ
−システインもしくはＬ−シスチンまたはこれらの混合
物を指す。
は、システインの分解に関与する酵素のうち少なくとも
一つの活性が低下又は消失していることをいう。「フィ
ードバック阻害の低減」とは、低減されたフィードバッ
ク阻害が残存している場合に加えて、フィードバック阻
害が実質的に解除されている場合を含む。尚、本発明に
おいてＬ−システインとは、特記しない限り、還元型Ｌ
−システインもしくはＬ−シスチンまたはこれらの混合
物を指す。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】＜１＞本発明のコリネ型細菌 本発明の細菌は、Ｌ−システイン生産能を有するコリネ
型細菌である。本発明において、「コリネ型細菌」と
は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現
在コリネバクテリウム属に分類された細菌も含み（Int.
J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1981)）、またコリネ
バクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細
菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のも
のが挙げられる。
型細菌である。本発明において、「コリネ型細菌」と
は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現
在コリネバクテリウム属に分類された細菌も含み（Int.
J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1981)）、またコリネ
バクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細
菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のも
のが挙げられる。
【００１７】コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ
ム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・アルカノリティカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム コリネバクテリウム・メラセコーラ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス コリネバクテリウム・ハーキュリス ブレビバクテリウム・ディバリカタム ブレビバクテリウム・フラバム ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ブレビバクテリウム・アルバム ブレビバクテリウム・セリヌム ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス
ム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・アルカノリティカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム コリネバクテリウム・メラセコーラ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス コリネバクテリウム・ハーキュリス ブレビバクテリウム・ディバリカタム ブレビバクテリウム・フラバム ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ブレビバクテリウム・アルバム ブレビバクテリウム・セリヌム ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス
【００１８】具体的には、下記のような菌株を例示する
ことができる。 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806 コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13
032, ATCC13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FER
M BP-1539) コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868 ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067,
AJ12418(FERM BP-2205) ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATC
C6872 ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111 ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス ATCC15354
ことができる。 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806 コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13
032, ATCC13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FER
M BP-1539) コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868 ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067,
AJ12418(FERM BP-2205) ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATC
C6872 ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111 ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス ATCC15354
【００１９】これらを入手するには、例えばアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受ける
ことができる。すなわち、各菌株毎に対応する登録番号
が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受け
ることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記
載されている。また、AJ12340株は、1987年10月27日付
けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵
便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３
号）にFERM BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基
づいて寄託されている。また、AJ12418株は、1989年１
月５日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所にFERM BP-2205の受託番号でブダペスト条約に基
づいて寄託されている。
・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受ける
ことができる。すなわち、各菌株毎に対応する登録番号
が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受け
ることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記
載されている。また、AJ12340株は、1987年10月27日付
けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵
便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３
号）にFERM BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基
づいて寄託されている。また、AJ12418株は、1989年１
月５日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所にFERM BP-2205の受託番号でブダペスト条約に基
づいて寄託されている。
【００２０】本発明の細菌の第一の形態は、細胞内のセ
リンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇したコリネ
型細菌である。「細胞内のセリンアセチルトランスフェ
ラーゼ（以下、「SAT」ともいう）活性が上昇した」と
は、細胞当たりのSAT活性が野生型のコリネ型細菌のそ
れよりも高くなったことをいう。例えば、細胞当たりの
SAT分子の数が増加した場合や、SAT分子当たりのSAT活
性が上昇した場合などが該当する。また、比較対象とな
る野生型のコリネ型細菌とは、例えばコリネバクテリウ
ム・グルタミカムATCC13032である。細胞内のSAT活性が
増強された結果、コリネ型細菌のＬ−システイン生産量
が上昇すると考えられる。
リンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇したコリネ
型細菌である。「細胞内のセリンアセチルトランスフェ
ラーゼ（以下、「SAT」ともいう）活性が上昇した」と
は、細胞当たりのSAT活性が野生型のコリネ型細菌のそ
れよりも高くなったことをいう。例えば、細胞当たりの
SAT分子の数が増加した場合や、SAT分子当たりのSAT活
性が上昇した場合などが該当する。また、比較対象とな
る野生型のコリネ型細菌とは、例えばコリネバクテリウ
ム・グルタミカムATCC13032である。細胞内のSAT活性が
増強された結果、コリネ型細菌のＬ−システイン生産量
が上昇すると考えられる。
【００２１】コリネ型細菌細胞内のSAT活性の増強は、S
ATをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって
達成される。例えば、SATをコードする遺伝子断片を、
該細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型
のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを宿主
コリネ型細菌に導入して形質転換すればよい。
ATをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって
達成される。例えば、SATをコードする遺伝子断片を、
該細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型
のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを宿主
コリネ型細菌に導入して形質転換すればよい。
【００２２】SAT遺伝子は、コリネ型細菌由来の遺伝子
およびエシェリヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子の
いずれも使用することができる。SAT遺伝子としては、
野生型SAT遺伝子の他に、アセチル−ＣｏＡによるＬ−
セリンの活性化を触媒する活性を実質的に損なわないよ
うな１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有するもので
あってもよい。
およびエシェリヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子の
いずれも使用することができる。SAT遺伝子としては、
野生型SAT遺伝子の他に、アセチル−ＣｏＡによるＬ−
セリンの活性化を触媒する活性を実質的に損なわないよ
うな１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有するもので
あってもよい。
【００２３】エシェリヒア・コリのSATをコードする遺
伝子として、cysEが野生株及びＬ−システイン分泌変異
株よりクローニングされている（Denk, D. and Boeck,
A.,J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987)）。
したがって、その塩基配列に基づいて作製したプライマ
ーを用いて、コリネ型細菌の染色体DNAを鋳型とするPCR
法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et
al., Trends Genet.5, 185 (1989)参照）によって、SA
T遺伝子を取得することができる（特開平11-155571号参
照）。他の微生物のSATをコードする遺伝子も、同様に
して取得され得る。
伝子として、cysEが野生株及びＬ−システイン分泌変異
株よりクローニングされている（Denk, D. and Boeck,
A.,J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987)）。
したがって、その塩基配列に基づいて作製したプライマ
ーを用いて、コリネ型細菌の染色体DNAを鋳型とするPCR
法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et
al., Trends Genet.5, 185 (1989)参照）によって、SA
T遺伝子を取得することができる（特開平11-155571号参
照）。他の微生物のSATをコードする遺伝子も、同様に
して取得され得る。
【００２４】染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miu
ra, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工
学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、
１９９２年参照）等により調製することができる。
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miu
ra, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工
学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、
１９９２年参照）等により調製することができる。
【００２５】PCR法により増幅されたSAT遺伝子は、エシ
ェリヒア・コリ及び／またはコリネ型細菌の細胞内にお
いて自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを
調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、
後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内に
おいて自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC1
8、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pAC
YC184, pMW219等が挙げられる。
ェリヒア・コリ及び／またはコリネ型細菌の細胞内にお
いて自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを
調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、
後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内に
おいて自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC1
8、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pAC
YC184, pMW219等が挙げられる。
【００２６】コリネ型細菌で機能するベクターとは、例
えばコリネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。
具体的に例示すれば、以下のものが挙げられる。 pAM330 特開昭58-67699号公報参照 pHM1519 特開昭58-77895号公報参照 pSFK6 特開2000-262288号公報参照
えばコリネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。
具体的に例示すれば、以下のものが挙げられる。 pAM330 特開昭58-67699号公報参照 pHM1519 特開昭58-77895号公報参照 pSFK6 特開2000-262288号公報参照
【００２７】また、これらのベクターからコリネ型細菌
中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ
断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクター
に挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の
両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして
使用することができる。
中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ
断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクター
に挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の
両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして
使用することができる。
【００２８】このようなシャトルベクターとしては、以
下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持
する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示
した。 pAJ655 エシェリヒア・コリAJ11882(FERM BP-136)コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム SR8201(ATCC39135) pAJ1844 エシェリヒア・コリAJ11883(FERM BP-137)コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム SR8202(ATCC39136) pAJ611 エシェリヒア・コリAJ11884(FERM BP-138) pAJ3148 コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクムSR8203(ATCC39137) pAJ440 ハ゛チルス・ス゛フ゛チリスAJ11901(FERM BP-140) pHC4 エシェリヒア・コリAJ12617(FERM BP-3532) また、実施例に記載したプラスミドpVK7（特開平１１−
２６６８８１号参照）も、エシェリヒア・コリ及びコリ
ネ型細菌のシャトルベクターとして好適である。
下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持
する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示
した。 pAJ655 エシェリヒア・コリAJ11882(FERM BP-136)コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム SR8201(ATCC39135) pAJ1844 エシェリヒア・コリAJ11883(FERM BP-137)コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム SR8202(ATCC39136) pAJ611 エシェリヒア・コリAJ11884(FERM BP-138) pAJ3148 コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクムSR8203(ATCC39137) pAJ440 ハ゛チルス・ス゛フ゛チリスAJ11901(FERM BP-140) pHC4 エシェリヒア・コリAJ12617(FERM BP-3532) また、実施例に記載したプラスミドpVK7（特開平１１−
２６６８８１号参照）も、エシェリヒア・コリ及びコリ
ネ型細菌のシャトルベクターとして好適である。
【００２９】これらのベクターは、寄託微生物から次の
ようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリ
ゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで
遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリ
コールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
ようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリ
ゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで
遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリ
コールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００３０】SAT遺伝子とコリネ型細菌で機能するベク
ターを連結して組換えDNAを調製するには、SAT遺伝子の
末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結
はT4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通で
ある。
ターを連結して組換えDNAを調製するには、SAT遺伝子の
末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結
はT4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通で
ある。
【００３１】上記のように調製した組換えDNAをコリネ
型細菌に導入するには、これまでに報告されている形質
転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コ
リＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞
を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法
（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159(197
0)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されて
いるような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調
製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.
A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あ
るいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母につ
いて知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換
えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェ
ロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に
導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen.
Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hop
wood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,
J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1
929 (1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形質
転換は、エレクトロポレーション法（杉本ら、特開平2-
207791号公報）によっても行うことができる。
型細菌に導入するには、これまでに報告されている形質
転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コ
リＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞
を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法
（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159(197
0)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されて
いるような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調
製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.
A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あ
るいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母につ
いて知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換
えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェ
ロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に
導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen.
Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hop
wood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,
J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1
929 (1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形質
転換は、エレクトロポレーション法（杉本ら、特開平2-
207791号公報）によっても行うことができる。
【００３２】SAT遺伝子のコピー数を高めることは、SAT
遺伝子をコリネ型細菌の染色体DNA上に多コピー存在さ
せることによっても達成できる。コリネ型細菌の染色体
DNA上にSAT遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DN
A上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換
えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列と
しては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在す
るインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、
特開平2-109985号公報に開示されているように、SAT遺
伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色
体DNA上に多コピー導入することも可能である。
遺伝子をコリネ型細菌の染色体DNA上に多コピー存在さ
せることによっても達成できる。コリネ型細菌の染色体
DNA上にSAT遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DN
A上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換
えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列と
しては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在す
るインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、
特開平2-109985号公報に開示されているように、SAT遺
伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色
体DNA上に多コピー導入することも可能である。
【００３３】SAT活性の増強は、上記の遺伝子増幅によ
る以外に、染色体DNA上またはプラスミド上のSAT遺伝子
のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換す
ることによっても達成される（特開平１−２１５２８０
号公報参照）。例えば、lacプロモーター、trpプロモー
ター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして
知られている。発現調節配列の置換は、例えば温度感受
性プラスミドを用いた遺伝子置換によっても行うことが
できる。コリネ型酸菌の温度感受性プラスミドとして
は、p48K、pSFKT1、pSFKT2、pSFKT3、pSFKT4、pSFKT5及
びpSFKT6（以上、特開2000-262288号公報参照）、pHSC4
（フランス特許公開1992年2667875号公報、特開平5-749
1号公報参照）等が挙げられる。また、国際公開WO00/18
935に開示されているように、SAT遺伝子のプロモーター
領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改
変することも可能である。これらのプロモーター置換ま
たは改変によりSAT遺伝子の発現が強化され、SAT活性が
増強される。これら発現調節配列の改変は、SAT遺伝子
のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
る以外に、染色体DNA上またはプラスミド上のSAT遺伝子
のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換す
ることによっても達成される（特開平１−２１５２８０
号公報参照）。例えば、lacプロモーター、trpプロモー
ター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして
知られている。発現調節配列の置換は、例えば温度感受
性プラスミドを用いた遺伝子置換によっても行うことが
できる。コリネ型酸菌の温度感受性プラスミドとして
は、p48K、pSFKT1、pSFKT2、pSFKT3、pSFKT4、pSFKT5及
びpSFKT6（以上、特開2000-262288号公報参照）、pHSC4
（フランス特許公開1992年2667875号公報、特開平5-749
1号公報参照）等が挙げられる。また、国際公開WO00/18
935に開示されているように、SAT遺伝子のプロモーター
領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改
変することも可能である。これらのプロモーター置換ま
たは改変によりSAT遺伝子の発現が強化され、SAT活性が
増強される。これら発現調節配列の改変は、SAT遺伝子
のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００３４】さらに、SAT遺伝子の発現に抑制機構が存
在する場合には、抑制が解除又は低減されるように、発
現調節配列又は抑制に関与する遺伝子を改変することに
よっても、SAT遺伝子の発現を強化することができる。
在する場合には、抑制が解除又は低減されるように、発
現調節配列又は抑制に関与する遺伝子を改変することに
よっても、SAT遺伝子の発現を強化することができる。
【００３５】コリネ型細菌細胞内のSAT活性は、Ｌ−シ
ステインによるフィードバック阻害が低減されたSAT
（以下、「変異型SAT」ともいう）をコリネ型細菌に保
持させることによっても、上昇させることができる。変
異型SATとしては、野生型SATの２５６位のメチオニン残
基に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロイシン残
基以外のアミノ酸残基に置換する変異、又は２５６位の
メチオニン残基に相当するアミノ酸残基からＣ末端側の
領域を欠失させる変異を有するSATが挙げられる。前記
リジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基として
は、通常のタンパク質を構成するアミノ酸のうち、メチ
オニン残基、リジン残基及びロイシン残基を除く１７種
類のアミノ酸残基が挙げられる。より具体的にはイソロ
イシン残基が挙げられる。
ステインによるフィードバック阻害が低減されたSAT
（以下、「変異型SAT」ともいう）をコリネ型細菌に保
持させることによっても、上昇させることができる。変
異型SATとしては、野生型SATの２５６位のメチオニン残
基に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロイシン残
基以外のアミノ酸残基に置換する変異、又は２５６位の
メチオニン残基に相当するアミノ酸残基からＣ末端側の
領域を欠失させる変異を有するSATが挙げられる。前記
リジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基として
は、通常のタンパク質を構成するアミノ酸のうち、メチ
オニン残基、リジン残基及びロイシン残基を除く１７種
類のアミノ酸残基が挙げられる。より具体的にはイソロ
イシン残基が挙げられる。
【００３６】本発明における変異型SATとしては、上記
のＬ−システインによるフィードバック阻害を低減する
変異に加えて、アセチル−ＣｏＡによるＬ−セリンの活
性化を触媒する活性を実質的に損なわないような１若し
くは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又
は逆位を含むアミノ酸配列を有するものであってもよ
い。そのような変異を有するSATにおいては、２５６位
のメチオニン残基の位置が変わっている場合もあるが、
そのような場合であっても、２５６位のメチオニン残基
に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロイシン残基
以外のアミノ酸残基に置換することによって、Ｌ−シス
テインによるフィードバック阻害が低減した変異型SAT
が取得され得る。
のＬ−システインによるフィードバック阻害を低減する
変異に加えて、アセチル−ＣｏＡによるＬ−セリンの活
性化を触媒する活性を実質的に損なわないような１若し
くは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又
は逆位を含むアミノ酸配列を有するものであってもよ
い。そのような変異を有するSATにおいては、２５６位
のメチオニン残基の位置が変わっている場合もあるが、
そのような場合であっても、２５６位のメチオニン残基
に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロイシン残基
以外のアミノ酸残基に置換することによって、Ｌ−シス
テインによるフィードバック阻害が低減した変異型SAT
が取得され得る。
【００３７】コリネ型細菌に変異型SATを保持させるに
は、細胞内のSAT遺伝子に、コードされるSATのＬ−シス
テインによるフィードバック阻害が解除されるような変
異を導入することによって行うことができる。変異の導
入は、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニ
トロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常の突
然変異に用いられている変異剤による処理によって行う
ことができる。
は、細胞内のSAT遺伝子に、コードされるSATのＬ−シス
テインによるフィードバック阻害が解除されるような変
異を導入することによって行うことができる。変異の導
入は、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニ
トロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常の突
然変異に用いられている変異剤による処理によって行う
ことができる。
【００３８】また、変異型SAT遺伝子をコリネ型細菌に
導入することによっても、変異型SATを保持させること
ができる。変異型SAT遺伝子は、野生型SAT遺伝子に、コ
ードされるSATのＬ−システインによるフィードバック
阻害が解除されるような変異、例えば野生型SATの２５
６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン
残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換する変
異、又は２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸
残基からＣ末端側の領域を欠失させる変異を導入するこ
とによって取得することができる。野生型SAT遺伝子に
所望の変異を導入する方法としては、部位特異的変異が
挙げられる。変異型SAT遺伝子としては、エシェリヒア
・コリの変異型SATをコードする変異型cysEが知られて
いる（WO 97/15673号国際公開パンフレット、特開平11-
155571号参照）。
導入することによっても、変異型SATを保持させること
ができる。変異型SAT遺伝子は、野生型SAT遺伝子に、コ
ードされるSATのＬ−システインによるフィードバック
阻害が解除されるような変異、例えば野生型SATの２５
６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン
残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換する変
異、又は２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸
残基からＣ末端側の領域を欠失させる変異を導入するこ
とによって取得することができる。野生型SAT遺伝子に
所望の変異を導入する方法としては、部位特異的変異が
挙げられる。変異型SAT遺伝子としては、エシェリヒア
・コリの変異型SATをコードする変異型cysEが知られて
いる（WO 97/15673号国際公開パンフレット、特開平11-
155571号参照）。
【００３９】本発明の細菌の第二の形態は、細胞内のSA
T活性が上昇し、さらに、Ｌ−システイン分解系が抑制
されたコリネ型細菌である。エシェリヒア・コリにおい
ては、Ｌ−システインの分解に関与する酵素としては、
CD及びシスタチオンβリアーゼが知られている。以下、
コリネ型細菌のCD活性を低下又は消失させる方法につい
て例示する。
T活性が上昇し、さらに、Ｌ−システイン分解系が抑制
されたコリネ型細菌である。エシェリヒア・コリにおい
ては、Ｌ−システインの分解に関与する酵素としては、
CD及びシスタチオンβリアーゼが知られている。以下、
コリネ型細菌のCD活性を低下又は消失させる方法につい
て例示する。
【００４０】コリネ型細菌の細胞内のCD活性を低下又は
消失させるには、例えば、コリネ型細菌を紫外線照射ま
たはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン
（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられて
いる変異剤によって処理し、CD活性が低下した変異株を
選択する方法が挙げられる。また、CD活性が低下したコ
リネ型細菌は、変異処理の他に、CDをコードする遺伝子
の内部を欠失し、正常に機能するCDを産生しないように
改変したglnE遺伝子（欠失型CD遺伝子）を含むＤＮＡで
コリネ型細菌を形質転換し、欠失型CD遺伝子と染色体上
のCD遺伝子との間で組換えを起こさせることにより、染
色体上のCD遺伝子を破壊することができる。このような
相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既
に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性
複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある。
消失させるには、例えば、コリネ型細菌を紫外線照射ま
たはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン
（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられて
いる変異剤によって処理し、CD活性が低下した変異株を
選択する方法が挙げられる。また、CD活性が低下したコ
リネ型細菌は、変異処理の他に、CDをコードする遺伝子
の内部を欠失し、正常に機能するCDを産生しないように
改変したglnE遺伝子（欠失型CD遺伝子）を含むＤＮＡで
コリネ型細菌を形質転換し、欠失型CD遺伝子と染色体上
のCD遺伝子との間で組換えを起こさせることにより、染
色体上のCD遺伝子を破壊することができる。このような
相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既
に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性
複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある。
【００４１】欠失型CD遺伝子を、宿主染色体上のCD遺伝
子と置換するには、例えば以下のようにすればよい。温
度感受性複製起点と変異型CD遺伝子とクロラムフェニコ
ール等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入して
組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡでコリネ型細
菌を形質転換し、温度感受性複製起点が機能しない温度
で形質転換株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で
培養することにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組
み込まれた形質転換株が得られる。
子と置換するには、例えば以下のようにすればよい。温
度感受性複製起点と変異型CD遺伝子とクロラムフェニコ
ール等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入して
組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡでコリネ型細
菌を形質転換し、温度感受性複製起点が機能しない温度
で形質転換株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で
培養することにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組
み込まれた形質転換株が得られる。
【００４２】こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込ま
れた株は、染色体上にもともと存在するCD遺伝子配列と
の組換えを起こし、染色体CD遺伝子と欠失型CD遺伝子と
の融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター
部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟
んだ状態で染色体に挿入されている。したがって、この
状態では正常なCD遺伝子が優性であるので、形質転換株
は正常なCDを発現する。
れた株は、染色体上にもともと存在するCD遺伝子配列と
の組換えを起こし、染色体CD遺伝子と欠失型CD遺伝子と
の融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター
部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟
んだ状態で染色体に挿入されている。したがって、この
状態では正常なCD遺伝子が優性であるので、形質転換株
は正常なCDを発現する。
【００４３】次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型CD遺伝子の
みを残すために、２個のCD遺伝子の組換えにより１コピ
ーのCD遺伝子を、ベクター部分（温度感受性複製起点及
び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮＡから
脱落させる。その際、正常なCD遺伝子が染色体ＤＮＡ上
に残され、欠失型CD遺伝子が切り出される場合と、反対
に欠失型CD遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、正常なCD
遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合も、温
度感受性複製起点が機能する温度で培養すれば、切り出
されたＤＮＡはプラスミド状で細胞内に保持される。次
に、温度感受性複製起点が機能しない温度で培養する
と、プラスミド上のCD遺伝子は、プラスミドとともに細
胞から脱落する。そして、PCRまたはサザンハイブリダ
イゼーション等により、染色体上に欠失型CD遺伝子が残
った株を選択することによって、CD遺伝子が破壊された
株を取得することができる。
みを残すために、２個のCD遺伝子の組換えにより１コピ
ーのCD遺伝子を、ベクター部分（温度感受性複製起点及
び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮＡから
脱落させる。その際、正常なCD遺伝子が染色体ＤＮＡ上
に残され、欠失型CD遺伝子が切り出される場合と、反対
に欠失型CD遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、正常なCD
遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合も、温
度感受性複製起点が機能する温度で培養すれば、切り出
されたＤＮＡはプラスミド状で細胞内に保持される。次
に、温度感受性複製起点が機能しない温度で培養する
と、プラスミド上のCD遺伝子は、プラスミドとともに細
胞から脱落する。そして、PCRまたはサザンハイブリダ
イゼーション等により、染色体上に欠失型CD遺伝子が残
った株を選択することによって、CD遺伝子が破壊された
株を取得することができる。
【００４４】後記実施例に示したように、ブレビバクテ
リウム・フラバム及びコリネバクテリウム・グルタミカ
ムにおいては、主要なCDはaecD遺伝子によってコードさ
れていることが、CD活性を有する蛋白質の精製、アミノ
酸配列決定、前記蛋白質をコードする遺伝子のクローニ
ング及び配列決定によって明らかにされた。
リウム・フラバム及びコリネバクテリウム・グルタミカ
ムにおいては、主要なCDはaecD遺伝子によってコードさ
れていることが、CD活性を有する蛋白質の精製、アミノ
酸配列決定、前記蛋白質をコードする遺伝子のクローニ
ング及び配列決定によって明らかにされた。
【００４５】遺伝子破壊株又は変異株のCD活性が低下又
は消失していることは、候補株の菌体抽出液について、
Kredichら（J. Biol. Chem., 248, 6187-6196 (1973)）
の方法等によりCD活性を測定し、親株のCD活性と比較す
ることにより確認することができる。
は消失していることは、候補株の菌体抽出液について、
Kredichら（J. Biol. Chem., 248, 6187-6196 (1973)）
の方法等によりCD活性を測定し、親株のCD活性と比較す
ることにより確認することができる。
【００４６】同様にして、Ｌ−システインの分解に関与
する他の酵素の活性を低下又は消失させることができ
る。コリネバクテリウム・グルタミカムのaecD破壊株IR
33は既に構築され、報告されている（I. Rossol & A. P
uhler, J. Bacteriol, 174, 2968-2977 (1992)）。
する他の酵素の活性を低下又は消失させることができ
る。コリネバクテリウム・グルタミカムのaecD破壊株IR
33は既に構築され、報告されている（I. Rossol & A. P
uhler, J. Bacteriol, 174, 2968-2977 (1992)）。
【００４７】＜２＞Ｌ−システインの製造法 上記のようにして細胞内のSAT活性が上昇したコリネ型
細菌、又は、さらにＬ−システイン分解系が抑制された
コリネ型細菌であって、Ｌ−システイン生産能を有する
コリネ型細菌を培地で培養し、該培地中にＬ−システイ
ンを生成蓄積せしめ、該培地からＬ−システインを採取
することにより、Ｌ−システインを製造することができ
る。
細菌、又は、さらにＬ−システイン分解系が抑制された
コリネ型細菌であって、Ｌ−システイン生産能を有する
コリネ型細菌を培地で培養し、該培地中にＬ−システイ
ンを生成蓄積せしめ、該培地からＬ−システインを採取
することにより、Ｌ−システインを製造することができ
る。
【００４８】尚、本発明の方法により製造されるＬ−シ
ステインには、還元型のシステインに加えてシスチンも
含まれる場合があるが、本発明の製造法の対象物にはシ
スチン又は還元型のシステイン及びシスチンの混合物も
含まれる。
ステインには、還元型のシステインに加えてシスチンも
含まれる場合があるが、本発明の製造法の対象物にはシ
スチン又は還元型のシステイン及びシスチンの混合物も
含まれる。
【００４９】本発明のコリネ型細菌を用いてＬ−システ
インを生産するには、炭素源、窒素源、無機塩類、その
他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素
を含有する通常の培地を用いて常法により行うことがで
きる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能であ
る。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌
株の利用可能であるものならばいずれの種類を用いても
よい。
インを生産するには、炭素源、窒素源、無機塩類、その
他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素
を含有する通常の培地を用いて常法により行うことがで
きる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能であ
る。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌
株の利用可能であるものならばいずれの種類を用いても
よい。
【００５０】炭素源としては、グルコース、グリセロー
ル、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノー
ス、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使
用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノー
ル等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用し
て用いられる。
ル、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノー
ス、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使
用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノー
ル等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用し
て用いられる。
【００５１】窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモ
ニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩ま
たは硝酸塩等が使用される。
ニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩ま
たは硝酸塩等が使用される。
【００５２】有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタ
ミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプ
トン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が
使用され、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変
異株を使用する場合には要求される栄養素を補添するこ
とが好ましい。
ミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプ
トン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が
使用され、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変
異株を使用する場合には要求される栄養素を補添するこ
とが好ましい。
【００５３】無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養は、発酵温度20〜45℃、pHを5〜9に制御し、通気培
養を行う。培養中にpHが下がる場合には、炭酸カルシウ
ムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和す
る。かくして10時間〜120時間程度培養することによ
り、培養液中に著量のＬ−システインが蓄積される。
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養は、発酵温度20〜45℃、pHを5〜9に制御し、通気培
養を行う。培養中にpHが下がる場合には、炭酸カルシウ
ムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和す
る。かくして10時間〜120時間程度培養することによ
り、培養液中に著量のＬ−システインが蓄積される。
【００５４】培養物からのＬ−システインの採取は、通
常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組
み合わせることにより実施できる。
常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組
み合わせることにより実施できる。
【００５５】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００５６】＜１＞コリネ型細菌におけるＬ−システイ
ン分解酵素の同定 コリネ型細菌におけるＬ−システイン分解酵素を同定す
ることを目的として、ブレビバクテリウム・フラバム22
47株（ATCC14067）の菌体破砕液から、各種クロマトグ
ラフィーによってCD活性を示す酵素を精製した。酵素活
性の測定は、Kredichら（J. Biol. Chem., 248, 6187-6
196 (1973)）の方法を用いた。ATCC14067株を最少培地
（グルコース 5g/L, 尿素 1.5g/L, 硫安 1.5g/L, KH2PO
4 1g/L, K 2HPO4 3g/L, MgSO4・7H2O 0.1g/L, CaCl2 1mg/
L, ビオチン 30μg, チアミン 100μg, FeSO4・7H2O 10m
g, MnSO4・4H2O 10mg (pH 7.0)）にて培養後、菌体破砕
液を調製した。菌体破砕液から、DEAE-Sepharose FF
（アマシャムファルマシアバイオテク社）、BUTYL-Toyo
pearl 650M（トーソー(株)）、MonoQ（アマシャムファ
ルマシアバイオテク社）、RESOURCE ISO（アマシャムフ
ァルマシアバイオテク社）、Superdex-200（アマシャム
ファルマシアバイオテク社）を用いて、順次CD活性を有
する画分を精製し、SDS-PAGEにてほぼ一本のみのバンド
を示す蛋白質溶液を得た。得られた酵素蛋白質は、還元
条件下でのSDS-PAGEにて約43kDaの分子量を示した。
ン分解酵素の同定 コリネ型細菌におけるＬ−システイン分解酵素を同定す
ることを目的として、ブレビバクテリウム・フラバム22
47株（ATCC14067）の菌体破砕液から、各種クロマトグ
ラフィーによってCD活性を示す酵素を精製した。酵素活
性の測定は、Kredichら（J. Biol. Chem., 248, 6187-6
196 (1973)）の方法を用いた。ATCC14067株を最少培地
（グルコース 5g/L, 尿素 1.5g/L, 硫安 1.5g/L, KH2PO
4 1g/L, K 2HPO4 3g/L, MgSO4・7H2O 0.1g/L, CaCl2 1mg/
L, ビオチン 30μg, チアミン 100μg, FeSO4・7H2O 10m
g, MnSO4・4H2O 10mg (pH 7.0)）にて培養後、菌体破砕
液を調製した。菌体破砕液から、DEAE-Sepharose FF
（アマシャムファルマシアバイオテク社）、BUTYL-Toyo
pearl 650M（トーソー(株)）、MonoQ（アマシャムファ
ルマシアバイオテク社）、RESOURCE ISO（アマシャムフ
ァルマシアバイオテク社）、Superdex-200（アマシャム
ファルマシアバイオテク社）を用いて、順次CD活性を有
する画分を精製し、SDS-PAGEにてほぼ一本のみのバンド
を示す蛋白質溶液を得た。得られた酵素蛋白質は、還元
条件下でのSDS-PAGEにて約43kDaの分子量を示した。
【００５７】上記のようにして精製したCD活性を有する
蛋白質のN末端アミノ酸配列、及びリジルエンドペプチ
ダーゼにて切断したペプチドのアミノ酸配列を、エドマ
ン分解法にて決定した。結果を下記に示す。
蛋白質のN末端アミノ酸配列、及びリジルエンドペプチ
ダーゼにて切断したペプチドのアミノ酸配列を、エドマ
ン分解法にて決定した。結果を下記に示す。
【００５８】（N末端アミノ酸配列） MRFPELEELKNRRTLKWTRFPEDVL（配列番号１） （内部アミノ酸配列） ILREEGK（配列番号２）
【００５９】上記の内部アミノ酸配列を有する蛋白質を
FASTAにて検索したところ、コリネバクテリウム・グル
タミカム由来のaecD遺伝子（I. Rossol & A. Puhler,
J. Bacteriol, 174, 2968-2977 (1992)）産物の一部と1
00%の一致が見られた。
FASTAにて検索したところ、コリネバクテリウム・グル
タミカム由来のaecD遺伝子（I. Rossol & A. Puhler,
J. Bacteriol, 174, 2968-2977 (1992)）産物の一部と1
00%の一致が見られた。
【００６０】上記Ｎ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸
配列から推定されるDNA配列をもとに、下記塩基配列を
有するプライマー１、２を作製し、ATCC14067株の染色
体DNAを鋳型としてPCR反応を実施した。
配列から推定されるDNA配列をもとに、下記塩基配列を
有するプライマー１、２を作製し、ATCC14067株の染色
体DNAを鋳型としてPCR反応を実施した。
【００６１】（プライマー１） AARTGGACNMGNTTYCCNGA（配列番号３） （プライマー２） CTTACCCTCCTCACGAAGAA（配列番号４）
【００６２】得られたフラグメントについて塩基配列を
決定した結果、報告されているコリネバクテリウム・グ
ルタミカムのaecD遺伝子の塩基配列とほぼ一致した。た
だし、前記のようにして決定した蛋白質Ｎ末端のアミノ
酸配列は、既報のaecD遺伝子の開始コドンから上流に12
9bpさかのぼった位置の配列と一致した。このことよ
り、精製されたCD活性を有する蛋白質は、aecD遺伝子産
物であり、このaecD遺伝子の正しい開始コドンATGは、
少なくともATCC14067株では、既報の開始コドンから上
流に129bpさかのぼった点にあると判断した。
決定した結果、報告されているコリネバクテリウム・グ
ルタミカムのaecD遺伝子の塩基配列とほぼ一致した。た
だし、前記のようにして決定した蛋白質Ｎ末端のアミノ
酸配列は、既報のaecD遺伝子の開始コドンから上流に12
9bpさかのぼった位置の配列と一致した。このことよ
り、精製されたCD活性を有する蛋白質は、aecD遺伝子産
物であり、このaecD遺伝子の正しい開始コドンATGは、
少なくともATCC14067株では、既報の開始コドンから上
流に129bpさかのぼった点にあると判断した。
【００６３】上記のようにして得られたコリネバクテリ
ウム・グルタミカムのaecD遺伝子の塩基配列及び同塩基
配列によってコードされ得るアミノ酸配列を、配列番号
５及び６に示す。
ウム・グルタミカムのaecD遺伝子の塩基配列及び同塩基
配列によってコードされ得るアミノ酸配列を、配列番号
５及び６に示す。
【００６４】＜２＞コリネバクテリウム・グルタミカム
のaecD破壊株のCD活性の測定 コリネバクテリウム・グルタミカムのaecD破壊株IR33は
既に構築され、報告されている（I. Rossol & A. Puhle
r, J. Bacteriol, 174, 2968-2977 (1992)）。IR33株
は、クロラムフェニコール耐性遺伝子カセットの挿入に
よって不活性化されたaecD遺伝子を保持するプラスミド
pIR33を用いて、相同組換えによって染色体上のaecD遺
伝子が破壊された株である。この文献記載のIR33株、及
びその親株であるATCC13032株のCD活性を測定した。CD
活性は、菌体破砕液を調製し、Kredichらの方法により
測定した。結果を表１に示す。IR33株のCD活性は、野生
株であるATCC13032株の約１／３に低下していた。
のaecD破壊株のCD活性の測定 コリネバクテリウム・グルタミカムのaecD破壊株IR33は
既に構築され、報告されている（I. Rossol & A. Puhle
r, J. Bacteriol, 174, 2968-2977 (1992)）。IR33株
は、クロラムフェニコール耐性遺伝子カセットの挿入に
よって不活性化されたaecD遺伝子を保持するプラスミド
pIR33を用いて、相同組換えによって染色体上のaecD遺
伝子が破壊された株である。この文献記載のIR33株、及
びその親株であるATCC13032株のCD活性を測定した。CD
活性は、菌体破砕液を調製し、Kredichらの方法により
測定した。結果を表１に示す。IR33株のCD活性は、野生
株であるATCC13032株の約１／３に低下していた。
【００６５】
【表１】表１ ───────────────── 菌株 CD活性（mU/mg） ───────────────── ATCC13032 38 IR33 12 ─────────────────
【００６６】以上のように、aecD遺伝子の破壊によって
CD活性が大きく低下し、コリネバクテリウム・グルタミ
カムにおいて主要なCD活性は、aecD遺伝子にコードされ
ていることが確認された。
CD活性が大きく低下し、コリネバクテリウム・グルタミ
カムにおいて主要なCD活性は、aecD遺伝子にコードされ
ていることが確認された。
【００６７】＜３＞aecD破壊株への、エシェリヒア・コ
リ由来脱感作型SAT遺伝子含有プラスミドの導入 エシェリヒア・コリ由来の野生型SAT遺伝子（cysE）、
又は同SAT遺伝子の256位のMet残基がIle残基に変異した
ことによって脱感作型となった脱感作型SATをコードす
る遺伝子（特開平１１−１５５５７１号）を、コリネバ
クテリウム・グルタミカムのaecD破壊株であるIR33株、
及び野生株ATCC13032株に導入した。
リ由来脱感作型SAT遺伝子含有プラスミドの導入 エシェリヒア・コリ由来の野生型SAT遺伝子（cysE）、
又は同SAT遺伝子の256位のMet残基がIle残基に変異した
ことによって脱感作型となった脱感作型SATをコードす
る遺伝子（特開平１１−１５５５７１号）を、コリネバ
クテリウム・グルタミカムのaecD破壊株であるIR33株、
及び野生株ATCC13032株に導入した。
【００６８】野生型SAT遺伝子を搭載したプラスミドpC
E、及び脱感作型SAT遺伝子を搭載したプラスミドpCEM25
6I（特開平１１−１５５５７１号）から、EcoRI消化に
よって各SAT遺伝子含有断片を切り出し、コリネ型細菌
−エシェリヒア・コリ間のシャトルベクターであるプラ
スミドpVK7（特開平１１−２６６８８１号参照）のEcoR
I部位に挿入した。pVK7は、エシェリヒア・コリ用ベク
ターであるpHSG299（Km r;Takeshita, S. et al., Gene,
61, 63-74, (1987）、特開平10-215883号参照）にブレ
ビバクテリウム ラクトファーメンタムのクリプティッ
クプラスミドであるpAM330を結合することによって構築
したプラスミドであり、pHSG299由来のマルチプルクロ
ーニングサイトとlacZ'を保持している。
E、及び脱感作型SAT遺伝子を搭載したプラスミドpCEM25
6I（特開平１１−１５５５７１号）から、EcoRI消化に
よって各SAT遺伝子含有断片を切り出し、コリネ型細菌
−エシェリヒア・コリ間のシャトルベクターであるプラ
スミドpVK7（特開平１１−２６６８８１号参照）のEcoR
I部位に挿入した。pVK7は、エシェリヒア・コリ用ベク
ターであるpHSG299（Km r;Takeshita, S. et al., Gene,
61, 63-74, (1987）、特開平10-215883号参照）にブレ
ビバクテリウム ラクトファーメンタムのクリプティッ
クプラスミドであるpAM330を結合することによって構築
したプラスミドであり、pHSG299由来のマルチプルクロ
ーニングサイトとlacZ'を保持している。
【００６９】上記のようにして、野生型SAT遺伝子又は
脱感作型SAT遺伝子が、pVK7上のlacZ'に順向きにで挿入
されたプラスミドを得た。野生型SAT遺伝子を有するプ
ラスミドをpVK7-CE、脱感作型SAT遺伝子を有するプラス
ミドのをpVK7-256と、各々命名した。
脱感作型SAT遺伝子が、pVK7上のlacZ'に順向きにで挿入
されたプラスミドを得た。野生型SAT遺伝子を有するプ
ラスミドをpVK7-CE、脱感作型SAT遺伝子を有するプラス
ミドのをpVK7-256と、各々命名した。
【００７０】pVK7、pVK7-CE、pVK7-256の各々を、エレ
クトロポレーション法を用いてATCC13032及びIR33に導
入した。形質転換株は、カナマイシン耐性を指標として
選択した。
クトロポレーション法を用いてATCC13032及びIR33に導
入した。形質転換株は、カナマイシン耐性を指標として
選択した。
【００７１】＜４＞Ｌ−システイン及びＬ−シスチンの
生産 得られた形質転換体を、25mg/Lのカナマイシンを含むM-
CM2G（ポリペプトン 10g/L、酵母エキス 10g/L、NaCl 5
g/L、グルコース 5g/L、DL-メチオニン 0.2g/L、pH7.
2）プレートに塗布し、31.5℃で48時間培養後、下記組
成のシステイン生産培地20mlを入れたフラスコに接種
し、31.5℃で72時間振とう培養した。
生産 得られた形質転換体を、25mg/Lのカナマイシンを含むM-
CM2G（ポリペプトン 10g/L、酵母エキス 10g/L、NaCl 5
g/L、グルコース 5g/L、DL-メチオニン 0.2g/L、pH7.
2）プレートに塗布し、31.5℃で48時間培養後、下記組
成のシステイン生産培地20mlを入れたフラスコに接種
し、31.5℃で72時間振とう培養した。
【００７２】（システイン生産培地） グルコース 100g/L (NH4)2SO4 45g/L KH2PO4 1g/L MgSO4・7H2O 1g/L FeSO4・7H2O 10mg/L MnSO4・5H2O 10mg/L サイアミン・HCl 300μg/L ビオチン 100μg/L 大豆タンパク質塩酸加水分解物 480mg/L 「味液」（登録商標、味の素(株) Ｌ−イソロイシン 100mg/L Ｌ−ロイシン 100mg/L Ｌ−グリシン 100mg/L ＤＬ−メチオニン 100mg/L CaCO3 50g/L
【００７３】Ｌ−システインの蓄積量は、沈殿したＬ−
シスチンを溶解するため、培養液を0.5N HClで希釈した
ものを、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leucon
ostoc mesenteroides）を用いるバイオアッセイ（Tsuno
da T. et al., Amino acids,3, 7-13 (1961)）により、
還元型システイン（L-Cys）及びシスチン(L-CysH)の総
量として測定した。
シスチンを溶解するため、培養液を0.5N HClで希釈した
ものを、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leucon
ostoc mesenteroides）を用いるバイオアッセイ（Tsuno
da T. et al., Amino acids,3, 7-13 (1961)）により、
還元型システイン（L-Cys）及びシスチン(L-CysH)の総
量として測定した。
【００７４】
【表２】 表２ ─────────────────────────────── 宿主菌株 導入プラスミド L-Cys＋L-CysH蓄積（mg/L） ─────────────────────────────── ATCC13032 pVK7 ＜５０ ATCC13032 pVK7-CE ＜５０ ATCC13032 pVK7-256 １４０ IR33 pVK7 ＜５０ IR33 pVK7-CE ７０ IR33 pVK7-256 ２５０ ───────────────────────────────
【００７５】以上のように、コリネバクテリウム・グル
タミカムにおいて、エシェリヒア・コリ由来SAT遺伝子
の増幅によって、Ｌ−システイン蓄積が生ずることが示
された。SAT遺伝子としては、野生型のものより脱感作
型のものの方が好ましかった。また、aedD遺伝子の破壊
によって、Ｌ−システイン蓄積の促進がみられた。
タミカムにおいて、エシェリヒア・コリ由来SAT遺伝子
の増幅によって、Ｌ−システイン蓄積が生ずることが示
された。SAT遺伝子としては、野生型のものより脱感作
型のものの方が好ましかった。また、aedD遺伝子の破壊
によって、Ｌ−システイン蓄積の促進がみられた。
【００７６】
【発明の効果】本発明のコリネ型細菌は、Ｌ−システイ
ン生産能を有しているので、Ｌ−システインの発酵生
産、及びさらなるＬ−システイン生産菌育種の材料とし
て有用である。
ン生産能を有しているので、Ｌ−システインの発酵生
産、及びさらなるＬ−システイン生産菌育種の材料とし
て有用である。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.） <120> Ｌ−システイン生産菌及びＬ−システインの製造法（L-Cysteine- Producing Bacterium and Method for Producing L-Cysteine） <130> P-8282 <140> <141> 2001-02-09 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Corynebacterium flavum <400> 1 Met Arg Phe Pro Glu Leu Glu Glu Leu Lys Asn Arg Arg Thr Leu Lys 1 5 10 15 Trp Thr Arg Phe Pro Glu Asp Val Leu 20 25 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Corynebacterium flavum <400> 2 Ile Leu Arg Glu Glu Gly Lys 1 5 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <220> <221> misc#feature <222> (9,11,18) <223> n=a or g to c or t <400> 3 aartggacnm gnttyccnga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 4 cttaccctcc tcacgaagaa 20 <210> 5 <211> 1620 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (232)..(1338) <400> 5 gatatcgccg cttgggactg tgattgggct tacctctttg gcttcgaaca ccggggttga 60 ggtagtggtt acttccatgg tttcctcagc ggaaacggct tggctatcag cactttcacc 120 cgaacagcct gcaagaagtg cgacggctaa cagggctggg attgtcctca acttcacttc 180 gggctccttc ttagtaatag gttcgtagaa aagtttacta agcctgagag t atg cga 237 Met Arg 1 ttt cct gaa ctc gaa gaa ttg aag aat cgc cgg acc ttg aaa tgg acc 285 Phe Pro Glu Leu Glu Glu Leu Lys Asn Arg Arg Thr Leu Lys Trp Thr 5 10 15 cgg ttt cca gaa gac gtg ctt cct ttg tgg gtt gcg gaa agt gat ttt 333 Arg Phe Pro Glu Asp Val Leu Pro Leu Trp Val Ala Glu Ser Asp Phe 20 25 30 ggc acc tgc ccg cag ttg aag gaa gct atg gca gat gcc gtt gag cgc 381 Gly Thr Cys Pro Gln Leu Lys Glu Ala Met Ala Asp Ala Val Glu Arg 35 40 45 50 gag gtc ttc gga tac cca cca gat gct act ggg ttg aat gat gcg ttg 429 Glu Val Phe Gly Tyr Pro Pro Asp Ala Thr Gly Leu Asn Asp Ala Leu 55 60 65 act gga ttc tac gag cgt cgc tat ggg ttt ggc cca aat ccg gaa agt 477 Thr Gly Phe Tyr Glu Arg Arg Tyr Gly Phe Gly Pro Asn Pro Glu Ser 70 75 80 gtt ttc gcc att ccg gat gtg gtt cgt ggc ctg aag ctt gcc att gag 525 Val Phe Ala Ile Pro Asp Val Val Arg Gly Leu Lys Leu Ala Ile Glu 85 90 95 cat ttc act aag cct ggt tcg gcg atc att gtg ccg ttg cct gca tac 573 His Phe Thr Lys Pro Gly Ser Ala Ile Ile Val Pro Leu Pro Ala Tyr 100 105 110 cct cct ttc att gag ttg cct aag gtg act ggt cgt cag gcg atc tac 621 Pro Pro Phe Ile Glu Leu Pro Lys Val Thr Gly Arg Gln Ala Ile Tyr 115 120 125 130 att gat gcg cat gag tac gat ttg aag gaa att gag aag gcc ttc gct 669 Ile Asp Ala His Glu Tyr Asp Leu Lys Glu Ile Glu Lys Ala Phe Ala 135 140 145 gac ggt gcg gga tca ctg ttg ttc tgc aat cca cac aac cca ctg ggc 717 Asp Gly Ala Gly Ser Leu Leu Phe Cys Asn Pro His Asn Pro Leu Gly 150 155 160 acg gtc ttt tct gaa gag tac atc cgc gag ctc acc gat att gcg gcg 765 Thr Val Phe Ser Glu Glu Tyr Ile Arg Glu Leu Thr Asp Ile Ala Ala 165 170 175 aag tac gat gcc cgc atc atc gct gat gag atc cac gcg cca ctg gtt 813 Lys Tyr Asp Ala Arg Ile Ile Ala Asp Glu Ile His Ala Pro Leu Val 180 185 190 tat gaa ggc acc cat gtg gtt gct gct ggt gtt tct gag aac gct gca 861 Tyr Glu Gly Thr His Val Val Ala Ala Gly Val Ser Glu Asn Ala Ala 195 200 205 210 aac act tgc atc acc atc acc gca act tct aag gcg tgg aac act gct 909 Asn Thr Cys Ile Thr Ile Thr Ala Thr Ser Lys Ala Trp Asn Thr Ala 215 220 225 ggt ttg aag tgt gct cag atc ttc ttc agt ggt gaa gcc gat gtg aag 957 Gly Leu Lys Cys Ala Gln Ile Phe Phe Ser Gly Glu Ala Asp Val Lys 230 235 240 gcc tgg aag aat ttg tcg gat att acc cgt gac ggt gtg tcc atc ctt 1005 Ala Trp Lys Asn Leu Ser Asp Ile Thr Arg Asp Gly Val Ser Ile Leu 245 250 255 gga ttg atc gct gcg gag aca gtg tac aac gag ggc gaa gaa ttc ctt 1053 Gly Leu Ile Ala Ala Glu Thr Val Tyr Asn Glu Gly Glu Glu Phe Leu 260 265 270 gat gag tca att cag att ctc aag gac aac cgt gac ttt gcg gct gct 1101 Asp Glu Ser Ile Gln Ile Leu Lys Asp Asn Arg Asp Phe Ala Ala Ala 275 280 285 290 gaa ctg gaa aag ctt ggc gtg aag gtc tac gca ccg gac tcc act tat 1149 Glu Leu Glu Lys Leu Gly Val Lys Val Tyr Ala Pro Asp Ser Thr Tyr 295 300 305 ttg atg tgg ttg gac ttc gct ggc acc aag atc gaa gag gcg cct tct 1197 Leu Met Trp Leu Asp Phe Ala Gly Thr Lys Ile Glu Glu Ala Pro Ser 310 315 320 aaa att ctt cgt gag gag ggt aag gtc atg ctg aat gat ggc gca gct 1245 Lys Ile Leu Arg Glu Glu Gly Lys Val Met Leu Asn Asp Gly Ala Ala 325 330 335 ttt ggt ggt ttc acc acc tgc gct cgt ctt aat ttt gcg tgt tcc aga 1293 Phe Gly Gly Phe Thr Thr Cys Ala Arg Leu Asn Phe Ala Cys Ser Arg 340 345 350 gag acc ctt gag gag ggc tgc gcc gta tcg cca gcg tgt tgt aaa 1338 Glu Thr Leu Glu Glu Gly Cys Ala Val Ser Pro Ala Cys Cys Lys 355 360 365 taatgagtaa aaagtctgtc ctgattactt ctttgatgct gttttccatg ttcttcggag 1398 ctggaaacct catcttcccg ccgatgcttg gattgtcggc aggaaccaac tatctaccag 1458 ctatcttagg atttctagca acgagtgttc tgctcccggt gctggcgatt atcgcggtgg 1518 tgttgtcggg agaaaatgtc aaggacatgg cttctcgtgg cggtaagatc tttggcctgg 1578 tgtttcctat tgctgcctat ttgtctatcg gcgcgtttta cg 1620 <210> 6 <211> 369 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 6 Met Arg Phe Pro Glu Leu Glu Glu Leu Lys Asn Arg Arg Thr Leu Lys 1 5 10 15 Trp Thr Arg Phe Pro Glu Asp Val Leu Pro Leu Trp Val Ala Glu Ser 20 25 30 Asp Phe Gly Thr Cys Pro Gln Leu Lys Glu Ala Met Ala Asp Ala Val 35 40 45 Glu Arg Glu Val Phe Gly Tyr Pro Pro Asp Ala Thr Gly Leu Asn Asp 50 55 60 Ala Leu Thr Gly Phe Tyr Glu Arg Arg Tyr Gly Phe Gly Pro Asn Pro 65 70 75 80 Glu Ser Val Phe Ala Ile Pro Asp Val Val Arg Gly Leu Lys Leu Ala 85 90 95 Ile Glu His Phe Thr Lys Pro Gly Ser Ala Ile Ile Val Pro Leu Pro 100 105 110 Ala Tyr Pro Pro Phe Ile Glu Leu Pro Lys Val Thr Gly Arg Gln Ala 115 120 125 Ile Tyr Ile Asp Ala His Glu Tyr Asp Leu Lys Glu Ile Glu Lys Ala 130 135 140 Phe Ala Asp Gly Ala Gly Ser Leu Leu Phe Cys Asn Pro His Asn Pro 145 150 155 160 Leu Gly Thr Val Phe Ser Glu Glu Tyr Ile Arg Glu Leu Thr Asp Ile 165 170 175 Ala Ala Lys Tyr Asp Ala Arg Ile Ile Ala Asp Glu Ile His Ala Pro 180 185 190 Leu Val Tyr Glu Gly Thr His Val Val Ala Ala Gly Val Ser Glu Asn 195 200 205 Ala Ala Asn Thr Cys Ile Thr Ile Thr Ala Thr Ser Lys Ala Trp Asn 210 215 220 Thr Ala Gly Leu Lys Cys Ala Gln Ile Phe Phe Ser Gly Glu Ala Asp 225 230 235 240 Val Lys Ala Trp Lys Asn Leu Ser Asp Ile Thr Arg Asp Gly Val Ser 245 250 255 Ile Leu Gly Leu Ile Ala Ala Glu Thr Val Tyr Asn Glu Gly Glu Glu 260 265 270 Phe Leu Asp Glu Ser Ile Gln Ile Leu Lys Asp Asn Arg Asp Phe Ala 275 280 285 Ala Ala Glu Leu Glu Lys Leu Gly Val Lys Val Tyr Ala Pro Asp Ser 290 295 300 Thr Tyr Leu Met Trp Leu Asp Phe Ala Gly Thr Lys Ile Glu Glu Ala 305 310 315 320 Pro Ser Lys Ile Leu Arg Glu Glu Gly Lys Val Met Leu Asn Asp Gly 325 330 335 Ala Ala Phe Gly Gly Phe Thr Thr Cys Ala Arg Leu Asn Phe Ala Cys 340 345 350 Ser Arg Glu Thr Leu Glu Glu Gly Cys Ala Val Ser Pro Ala Cys Cys 355 360 365 Lys
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/12 (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/12 (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 9/10 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） 1:19） Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA10 CA03 CA06 DA05 EA04 FA15 GA14 HA01 4B050 CC04 DD02 LL05 4B064 AE14 CA02 CA19 CC24 DA16 4B065 AA24X AA26Y AB01 BA02 BA03 CA14 CA15 CA29
Claims (10)
- 【請求項１】 Ｌ−システイン生産能を有するコリネ型
細菌。 - 【請求項２】 細胞内のセリンアセチルトランスフェラ
ーゼ活性が上昇した請求項１記載のコリネ型細菌。 - 【請求項３】 Ｌ−システインによるフィードバック阻
害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼを保
持することにより、細胞内のセリンアセチルトランスフ
ェラーゼ活性が上昇した請求項２記載のコリネ型細菌。 - 【請求項４】 前記Ｌ−システインによるフィードバッ
ク阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼ
が、野生型セリンアセチルトランスフェラーゼの２５６
位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン残
基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換する変
異、又は２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸
残基からＣ末端側の領域を欠失させる変異を有する請求
項３記載のコリネ型細菌。 - 【請求項５】 セリンアセチルトランスフェラーゼをコ
ードする遺伝子で形質転換されたこと、又は前記細菌細
胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする
遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子の発現調節配
列又は発現調節に関与する遺伝子が改変されたことによ
り、細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が
上昇した請求項２〜４のいずれか一項に記載のコリネ型
細菌。 - 【請求項６】 前記セリンアセチルトランスフェラーゼ
をコードする遺伝子がエシェリヒア属細菌のｃｙｓＥで
ある請求項５記載のコリネ型細菌。 - 【請求項７】 さらに、Ｌ−システイン分解系が抑制さ
れた請求項１〜６のいずれか一項に記載のコリネ型細
菌。 - 【請求項８】 細胞内のシステインデスルフヒドラーゼ
活性が低減されたことによりＬ−システイン分解系が抑
制された請求項７記載のコリネ型細菌。 - 【請求項９】 ａｅｃＤ遺伝子が破壊されたことにより
細胞内のシステインデスルフヒドラーゼ活性が低減され
た請求項８記載のコリネ型細菌。 - 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか一項に記載の
コリネ型細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−システ
インを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−システインを
採取することを特徴とするＬ−システインの製造法。
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