JP2005287333A - Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 - Google Patents

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Abstract

【課題】 エシェリヒア属細菌においてＬ−システイン排出活性を担う酵素及びその遺伝子を明らかにし、同遺伝子をＬ−システイン生産菌の育種に利用し、新たなＬ−システインの製造法を提供する。
【解決手段】 Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr又はcusA遺伝子の発現が上昇するように改変されたエシェリヒア属細菌を培地で培養し、Ｌ−システインを培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−システインを採取することにより、Ｌ−システインを製造する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、Ｌ−システインの製造法に関し、詳しくはＬ−システインの製造に好適な微生物、及びそれを用いたＬ−システインの製造法に関する。Ｌ−システイン及びＬ−システインの誘導体は、医薬品、化粧品及び食品分野で利用されている。
従来、Ｌ−システインは、毛髪、角、羽毛等のケラチン含有物質から抽出することにより、あるいはＤＬ−２−アミノチアゾリン−４−カルボン酸を前駆体とする微生物酵素変換により得られている。また、新規な酵素を用いた固定化酵素法によるＬ−システインの大量生産も計画されている。
さらに、微生物を用いた発酵法によるＬ−システインの生産も試みられている。Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減された特定の変異を有するセリンアセチルトランスフェラーゼ（SAT）をコードするＤＮＡ配列により脱制御されたシステイン物質代謝を有する微生物を用いた、Ｌ−システインの製造法が知られている（特許文献１参照）。また、非特許文献１には、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を受けないシロイヌナズナ由来のSATアイソザイムをコードする遺伝子を導入したエシェリヒア・コリを用いたＬ−システインの製造法が開示されている。一方、特許文献２には、抗生物質又は微生物に毒性の物質を細胞から直接放出するために好適であるタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する微生物を用いたＬ−システインの製造法が報告されている。
また、本発明者らは、Ｌ−システイン分解系が抑制され、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼ（serine acetyltransferase（EC 2.3.1.30）：以下、「SAT」ともいう）を保持するエシェリヒア属細菌を用いたＬ−システインの製造法を開示している（特許文献３又は４参照）。これらの文献では、Ｌ−システイン分解系を抑制する手段としては、細胞中のシステインデスルフヒドラーゼ（以下、「CD」ともいう）活性を低下させることが開示されている。
特許文献５にはｍａｒ遺伝子などの排出遺伝子の発現を強化した微生物を用いたＬ−システイン等の製造法が開示されていた。また、非特許文献４にはyfiKがシステインの排出を促進することが開示されていた。さらに、非特許文献５にはCydDCがシステインの排出に関与していることが開示されていた。
ｅｍｒＡＢ、ｅｍｒＫＹ、ｙｏｊＩＨ、ａｃｒＥＦ、ｂｃｒ、ｃｕｓＡ遺伝子は、過剰発現させた際に宿主微生物に種々の薬剤に対する耐性を付与する遺伝子として知られていた（非特許文献６参照）。しかしながら、これらの遺伝子がシステイン排出能を有するかどうかは不明であった。
特表２０００−５０４９２６号公報 特開平１１−５６３８１号公報 特開平１１−１５５５７１号公報 特開２００３−１６９６６８号公報 特許第２９９２０１０号公報 FEMS Microbiol. Lett., vol.179 (1999) p453-459 Chandra et. al., Biochemistry, vol.21 (1982) p3064-3069 Austin Newton et. al., J. Biol. Chem. vol.240 (1965) p1211-1218 J.Bacteriol., 185, (2003) p1161-1166 J.Biol.Chem., 277(2002) p49841-49849 J.Bacteriol., Vol.183, （2001） p5803-5812
本発明は、新たなＬ−システイン排出遺伝子を同定し、該遺伝子をＬ−システイン生産菌の育種に利用し、新たなＬ−システインの製造法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ｅｍｒＡＢ遺伝子等の発現を強化させた株を用いることによって著量のＬ−システインを生産できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｅｍｒＡＢ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
（２） ｅｍｒＡＢ遺伝子が以下の（Ａ）又は（Ｂ）の遺伝子である（１）の微生物、（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質、及び配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（３） ｅｍｒＡＢ遺伝子が以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子である（１）の微生物、（ａ）配列番号１に示す塩基配列及び配列番号３に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子及び配列番号３に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子。
（４） Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｅｍｒＫＹ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
（５） ｅｍｒＫＹ遺伝子が以下の（Ｃ）又は（Ｄ）の遺伝子である（４）の微生物、（Ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｄ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質及び配列番号８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（６） ｅｍｒＫＹ遺伝子が以下の（ｃ）又は（ｄ）の遺伝子である（４）の微生物、（ｃ）配列番号５に示す塩基配列及び配列番号７に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
（ｄ）配列番号５に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子及び配列番号７に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子。
（７） Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｙｏｊＩＨ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
（８） ｙｏｊＩＨ遺伝子が以下の（Ｅ）又は（Ｆ）の遺伝子である（７）に記載の微
生物、
（Ｅ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｆ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質及び配列番号１２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（９） ｙｏｊＩＨ遺伝子が以下の（ｅ）又は（ｆ）の遺伝子である（７）の微生物、（ｅ）配列番号９に示す塩基配列及び配列番号１１に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
（ｆ）配列番号９に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子及び配列番号１１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子。
（１０） Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ａｃｒＥＦ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
（１１） ａｃｒＥＦ遺伝子が以下の（Ｇ）又は（Ｈ）の遺伝子である（１０）の微生物、
（Ｇ）配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｈ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質及び配列番号１６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１２） ａｃｒＥＦ遺伝子が以下の（ｇ）又は（ｈ）の遺伝子である（１０）の微生物、
（ｇ）配列番号１３に示す塩基配列及び配列番号１５に示す塩基配列を含む遺伝子、又は（ｈ）配列番号１３に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子及び配列番号１５に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子。
（１３） Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｂｃｒ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
（１４） ｂｃｒ遺伝子が以下の（Ｉ）又は（Ｊ）の遺伝子である（１３）の微生物、（Ｉ）配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｊ）配列番号１８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１５） ｂｃｒ遺伝子が以下の（ｉ）又は（ｊ）の遺伝子である（１３）の微生物、（ｉ）配列番号１７に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
（ｊ）配列番号１７に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１６） Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｃｕｓＡ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
（１７） ｃｕｓＡ遺伝子が以下の（Ｋ）又は（Ｌ）の遺伝子である（１６）の微生物、
（Ｋ）配列番号２０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
（Ｌ）配列番号２０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１８） ｃｕｓＡ遺伝子が以下の（ｋ）又は（ｌ）の遺伝子である（１６）の微生物、
（ｋ）配列番号１９に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
（ｌ）配列番号１９に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１９） エシェリヒア属細菌である（１）〜（１８）のいずれかの微生物。
（２０） エシェリヒア・コリである（１９）のエシェリヒア属細菌。
（２１） さらにセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された（１）〜（２０）のいずれかのエシェリヒア属細菌。
（２２） （１）〜（２１）のいずれかの微生物を培地で培養し、Ｌ−システインを培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−システインを採取する、Ｌ−システインの製造法。
本発明の微生物を使用することにより、Ｌ−システインを効率よく発酵生産することができる。
本発明の微生物は、システイン生産能を有し、かつ、ｅｍｒＡＢ、ｅｍｒＫＹ、ｙｏｊＩＨ、ａｃｒＥＦ、ｂｃｒ又はｃｕｓＡ遺伝子の発現が増強するように改変された微生物である。本発明の微生物は、Ｌ−システイン生産能を有する細菌において上記遺伝子の発現が増強するように改変されたものであってもよいし、上記遺伝子の発現が増強するように改変された細菌においてＬ−システイン生産能が付与されたものであってもよい。なお、発現が増強するように改変される遺伝子は、上記遺伝子のうちの２種類以上であってもよい。
本発明においてＬ−システイン生産能とは、本発明の微生物を培地に培養したときに、培地から回収することができる量のＬ−システインを培地中に蓄積する能力をいう。本発明においては、親株を遺伝子組み換えや変異処理することにより、Ｌ−システイン生産能を付与することもできるが、Ｌ−システイン生産能を本来的に有する細菌を用いることもできる。尚、本発明においてＬ−システインとは、特記しない限り、還元型Ｌ−システインもしくはＬ−シスチンまたはこれらの混合物を指す。
Ｌ−システイン生産能を付与する方法としては、変異処理や遺伝子組換え等の方法を挙げることができる。変異処理法としては、例えば、エシェリヒア属細菌を紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、Ｌ−システイン生産能を有するようになった株を選択する方法が挙げられる。遺伝子組換え法としては、後述するような遺伝子組み換えによりセリンアセチルトランスフェラーゼの活性を増強させる方法が挙げられる。
本発明の微生物はエシェリヒア属細菌が好ましい。エシェリヒア属細菌は、ナイトハルトらの著書（Neidhardt,F.C.et.al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C.,1208, table 1）に挙げられるもの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用できる。エシェリヒア・コリの野生株としては、例えばK12株又はその誘導体、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC No.47076）、及びW3110株（ATCC No.27325）等が挙げられる。これらを入手するには、例えばアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所 12301 Parklawn Drive,Rockville Maryland 20852,United States of America ）。
本発明において、ｅｍｒＡＢ遺伝子としてはｅｍｒＡ遺伝子及びｅｍｒＢ遺伝子を含む遺伝子をいう。これらの遺伝子は同時に発現を強化してもよいし、別々に発現強化してもよい。ｅｍｒＡ遺伝子としては、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。また、ｅｍｒＢ遺伝子としては、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。これらの遺伝子は、Ｌ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、Ｌ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上相同なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、上記数個とは、２〜２０個が好ましく、２〜１０個がより好ましく、２〜５個が特に好ましい。Ｌ−システイン排出能は、例えば、上記遺伝子を導入した微生物を培養したときに培地中に排出されるＬ−アミノ酸の量が野生株に比べて増加するか否かを調べることによって測定することができる。
ｅｍｒＡ遺伝子として具体的には、配列番号１に示す塩基配列を含む遺伝子を挙げることができる。ｅｍｒＢ遺伝子として具体的には、配列番号３に示す塩基配列を含む遺伝子を挙げることができる。なお、これらの遺伝子はＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。本発明において、ストリンジェントな条件下とは、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
本発明において、ｅｍｒＫＹ遺伝子としてはｅｍｒＫ遺伝子及びｅｍｒＹ遺伝子を含む遺伝子をいう。これらの遺伝子は同時に発現を強化してもよいし、別々に発現強化してもよい。ｅｍｒＫ遺伝子としては、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。また、ｅｍｒＹ遺伝子としては、配列番号８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。これらの遺伝子は、Ｌ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、Ｌ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上相同なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、上記数個とは、２〜２０個が好ましく、２〜１０個がより好ましく、２〜５個が特に好ましい。
ｅｍｒＫ遺伝子として具体的には、配列番号５に示す塩基配列を含む遺伝子を挙げることができる。ｅｍｒＹ遺伝子として具体的には、配列番号７に示す塩基配列を含む遺伝子を挙げることができる。なお、これらの遺伝子はＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。
本発明において、ｙｏｊＩＨ遺伝子としてはｙｏｊＩ遺伝子及びｙｏｊＨ遺伝子を含む遺伝子をいう。これらの遺伝子は同時に発現を強化してもよいし、別々に発現強化してもよい。ｙｏｊＩ遺伝子としては、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。また、ｙｏｊＨ遺伝子としては、配列番号１２
に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。これらの遺伝子は、Ｌ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、Ｌ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上相同なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、上記数個とは、２〜２０個が好ましく、２〜１０個がより好ましく、２〜５個が特に好ましい。
ｙｏｊＩ遺伝子として具体的には、配列番号９に示す塩基配列を含む遺伝子を挙げることができる。ｙｏｊＨ遺伝子として具体的には、配列番号１１に示す塩基配列を含む遺伝子を挙げることができる。なお、これらの遺伝子はＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。
本発明において、ａｃｒＥＦ遺伝子としてはａｃｒＥ遺伝子及びａｃｒＦ遺伝子を含む遺伝子をいう。これらの遺伝子は同時に発現を強化してもよいし、別々に発現強化してもよい。ａｃｒＥ遺伝子としては、配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。また、ａｃｒＦ遺伝子としては、配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。これらの遺伝子は、Ｌ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、Ｌ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上相同なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、上記数個とは、２〜２０個が好ましく、２〜１０個がより好ましく、２〜５個が特に好ましい。
ａｃｒＥ遺伝子として具体的には、配列番号１３に示す塩基配列を含む遺伝子を挙げることができる。ａｃｒＦ遺伝子として具体的には、配列番号１５に示す塩基配列を含む遺伝子を挙げることができる。なお、これらの遺伝子はＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。
本発明において、ｂｃｒ遺伝子としては、配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。この遺伝子は、Ｌ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、Ｌ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上相同なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、上記数個とは、２〜２０個が好ましく、２〜１０個がより好ましく、２〜５個が特に好ましい。
ｂｃｒ遺伝子として具体的には、配列番号１７に示す塩基配列を含む遺伝子を挙げることができる。なお、この遺伝子はＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。
本発明において、ｃｕｓＡ遺伝子としては、配列番号２０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。この遺伝子は、Ｌ−システイン排
出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、Ｌ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上相同なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、上記数個とは、２〜２０個が好ましく、２〜１０個がより好ましく、２〜５個が特に好ましい。
ｃｕｓＡ遺伝子として具体的には、配列番号１９に示す塩基配列を含む遺伝子を挙げることができる。なお、この遺伝子はＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。
以下、emrAB遺伝子の発現を強化する方法について説明する。他の遺伝子についても同様にして発現強化することができる。
emrAB遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞内のemrAB遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えば、emrAB遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを微生物に導入して形質転換すればよい。なお、emrA及びemrBの両遺伝子を含むDNAを導入してもよいし、emrA及びemrB遺伝子を別々に導入してもよい。
emrAB遺伝子としてエシェリヒア・コリのemrAB遺伝子を用いる場合、配列番号１及び３の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、emrAB遺伝子を取得することができる。他の微生物のemrAB遺伝子も、前記配列情報に基づいて作製したプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体ＤＮＡ又は染色体ＤＮＡライブラリーから取得することができる。なお、染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
次に、emrAB遺伝子を、宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターDNAに接続して組換えDNAを調製する。宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターとしては、宿主微生物の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184,（pHSG、pACYCは宝バイオ社より入手可）, RSF1010, pBR322, pMW219（pMWはニッポンジーン社より入手可）等が挙げられる。上記のように調製した組換えDNAを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and
Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）がある。
一方、emrAB遺伝子のコピー数を高めることは、emrAB遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体DNA上にemrAB遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、emrAB遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移
させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。
さらに、emrAB遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開00/18935号パンフレットに記載されたようにして、染色体DNA上またはプラスミド上のemrAB遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、emrABの発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅、emrABの発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、emrAB遺伝子のプロモーター領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変によりemrAB遺伝子の発現が強化される。なお、発現調節配列の改変は、emrAB遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
次に、Ｌ−システイン生産能を付与する方法として、Ｌ−システイン生合成系酵素活性が増強する方法について説明する。Ｌ−システイン生合成系酵素活性の増強は、例えば、セリンアセチルトランスフェラーゼ（SAT）活性を増強することによって行うことができる。エシェリヒア属細菌細胞内のSAT活性の増強は、SATをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、SATをコードする遺伝子断片を、エシェリヒア属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを宿主エシェリヒア属細菌に導入して形質転換すればよい。
SAT遺伝子は、エシェリヒア属細菌由来の遺伝子および他の生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。エシェリヒア・コリのSATをコードする遺伝子として、cysEが野生株及びＬ−システイン分泌変異株よりクローニングされ、塩基配列が明らかになっている（Denk, D. and Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515-525 (1987)）。したがって、その塩基配列（配列番号２１）に基づいて作製したプライマーを用いて、エシェリヒア属細菌の染色体DNAを鋳型とするPCRによって、SAT遺伝子を取得することができる（特開平11-155571号参照）。他の生物のSATをコードする遺伝子も、同様にして取得され得る。このようにして得られるSAT遺伝子は、上記ｅｍｒＡＢ遺伝子と同様にして発現増強を行うことができる。
なお、SAT遺伝子の発現に「Ｌ−システインによるフィードバック阻害」などの抑制機構が存在する場合には、該抑制機構に非感受性となるように、発現調節配列又は抑制に関与する遺伝子を改変することによっても、SAT遺伝子の発現を増強することができる。
例えば、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減又は解除されたSAT（以下、「変異型SAT」ともいう）をエシェリヒア属細菌に保持させることによって、SAT活性をさらに上昇させることができる。変異型SATとしては、野生型SAT（配列番号２２）の２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基をリジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基に置換する変異、又は２５６位のメチオニン残基に相当するアミノ酸残基からＣ末端側の領域を欠失させる変異を有するSATが挙げられる。前記リジン残基及びロイシン残基以外のアミノ酸残基としては、通常のタンパク質を構成するアミノ酸のうち、メチオニン残基、リジン残基及びロイシン残基を除く１７種類のアミノ酸残基が挙げられる。より好ましくはイソロイシン残基またはグルタミン酸残基が挙げられる。野生型SAT遺伝子に所望の変異を導入する方法としては、部位特異的変異が挙げられる。変異型SAT遺伝子としては、エシェリヒア・コリの変異型SATをコードする変異型cysEが知られている（WO 97/15673号国際公開パンフレット、特開平11-155571号参照）。２５６位のメチオニン残基をグルタミン酸残基に置換した変異型SATをコードする変異型cysEを含むプラスミドpCEM256Eを保持するエシェリヒア・コリJM39-8株（E. coli JM39-8(pCEM256E)、プライベートナンバー：AJ13391）は、平成９年11月20日より工業技術院生命工学工業技術研究所（郵
便番号305 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、FERM P-16527の受託番号のもとで寄託されている。
本発明において、「Ｌ−システインによるフィードバック阻害に非感受性」とは、上記のようにＬ−システインによるフィードバック阻害に非感受性になるように改変されるものであってもよいが、元来フィードバック阻害を受けないものであってもよい。シロイヌナズナのSATは、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を受けないことが知られており、本発明に好適に用いることができる。シロイヌナズナ由来のSAT遺伝子含有プラスミドとして、pEAS-m（FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453-459）が知られている。
上記のようにして得られる本発明のエシェリヒア属細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−システインを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−システインを採取することにより、Ｌ−システインを効率よく、かつ、安定に製造することができる。尚、本発明の方法により製造されるＬ−システインには、還元型のシステインに加えてシスチンも含まれる場合があるが、本発明の製造法の対象物にはシスチン又は還元型のシステイン及びシスチンの混合物も含まれる。
培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地が挙げられる。炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
培養は好気的条件下で30〜90時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。培養物からのＬ−システインの採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
（１）システイン排出遺伝子及びシステイン生合成系を増強した菌株の構築
親株としてはJM39株（F+ cysE51 tfr-8）（Denk,D. and Bock,A., J. Gen. Microbiol., 133, 515-525 (1987)）を用いた。JM39株を、pUC118に各種システイン排出遺伝子を組み込んだプラスミド（pUCemrAB、pUCemrKY、pUCyojIH、pUCacrEF、pUCbcr、pUCcusA）で各々形質転換した。各プラスミドの構築は、J.Bacteriol., Vol.183, 2001, 5803-5812のMaterials and Methods及びTable 1に記載の方法で行った。なお、pUCemrABはエシェリヒア・コリのemrR , emrA , 及びemrB遺伝子を含む3.9-kbのSalI-BamHI fragmentである。pUCemrKYはエシェリヒア・コリのevgS/A, emrK 及びemrY遺伝子を含む7.5-kbのSphI-BamHI fragmentである。pUCyojIHはエシェリヒア・コリのyojI 及びyojH遺伝子を含む4.0-kbのSalI-SphI fragmentである。pUCacrEFはエシェリヒア・コリのenvR, acrE 及びacrF遺伝子を含む5.9-kbのSalI-SphI fragmentである。pUCbcrはエシェリヒア・コリのyeiD 及びbcr遺伝子を含む2.3-kbのAccI-KpnI fragmentである。pUCcusAはエシェリヒア・コリのcusS, cusR/C/F/B 及びcusA遺伝子を含む9.0-kbのSphI-EcoRI fragmentである。形質転換
株は、アンピシリン耐性を指標として選択した。得られた形質転換体について、256番目のMetがIleに置換された変異型SAT遺伝子を含有するプラスミド（pACYC256I）にて形質転換した。形質転換株は、アンピシリン耐性＋クロラムフェニコール耐性を指標として選択した。なお、pACYC256IはpCEM256I（特開平１１−１５５５７１）に基き、以下のようにして構築した。すなわち、pCEM256I をBamHIとSalIで切断し、得られたMet256Ile変異型SATの遺伝子（プロモーター領域含む）を同制限酵素で切断したpACYC184（NIPPON GENE社）のラージフラグメントに連結してpACYC256Iを作製した。
（２）L-Cys（Ｌ−システイン）+L-CysH（Ｌ−シスチン）の生産
得られた形質転換体を、50mg/Lのアンピシリン、100mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB培地（トリプトン 10g/L、Yeast Extract 5g/L、NaCl 5g/L、pH7.0）プレートに塗布、37℃、12-24時間培養後、Cys生産培地（グルコース 30g/L、NH4Cl 10g/L、KH2PO4 2g/L、MgSO4・7H2O 1g/L、FeSO4・7H2O 10mg/L、MnCl2・4H2O 10mg/L、チオ硫酸 15g/L、アンピシリン 50mg/L (24時間毎に添加)、クロラムフェニコール 100mg/L、CaCO3 20g/L）20mlを入れたフラスコに接種し、30℃、24時間、48時間、72時間振とう培養した。L-システインの蓄積量は、沈殿したL-シスチンを溶解するため培養液を0.5N HClで希釈したものをLeuconostoc mesenteroidesを用いるバイオアッセイ（Tsunoda T. et al., Amino
acids, 3, 7-13 (1961)）によって定量した。結果を表１に示す。
Figure 2005287333
表１より、各種システイン排出遺伝子含有プラスミドの導入によってＬ−システイン蓄積が顕著に向上することが示された。
本発明の細菌を使用することにより、Ｌ−システインを効率よく製造することができる。Ｌ−システイン及びＬ−システインの誘導体は、医薬品、化粧品及び食品分野で有用である。

Claims (22)

  1. Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｅｍｒＡＢ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
  2. ｅｍｒＡＢ遺伝子が以下の（Ａ）又は（Ｂ）の遺伝子である請求項１に記載の微生物、
    （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
    （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質、及び配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
  3. ｅｍｒＡＢ遺伝子が以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子である請求項１に記載の微生物、
    （ａ）配列番号１に示す塩基配列及び配列番号３に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
    （ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子及び配列番号３に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子。
  4. Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｅｍｒＫＹ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
  5. ｅｍｒＫＹ遺伝子が以下の（Ｃ）又は（Ｄ）の遺伝子である請求項４に記載の微生物、
    （Ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
    （Ｄ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質及び配列番号８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
  6. ｅｍｒＫＹ遺伝子が以下の（ｃ）又は（ｄ）の遺伝子である請求項４に記載の微生物、
    （ｃ）配列番号５に示す塩基配列及び配列番号７に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
    （ｄ）配列番号５に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子及び配列番号７に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子。
  7. Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｙｏｊＩＨ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
  8. ｙｏｊＩＨ遺伝子が以下の（Ｅ）又は（Ｆ）の遺伝子である請求項７に記載の微生物、
    （Ｅ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
    （Ｆ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質及び配列番号１２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
  9. ｙｏｊＩＨ遺伝子が以下の（ｅ）又は（ｆ）の遺伝子である請求項７に記載の微生物、
    （ｅ）配列番号９に示す塩基配列及び配列番号１１に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
    （ｆ）配列番号９に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子及び配列番号１１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子。
  10. Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ａｃｒＥＦ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
  11. ａｃｒＥＦ遺伝子が以下の（Ｇ）又は（Ｈ）の遺伝子である請求項１０に記載の微生物、
    （Ｇ）配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号１６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
    （Ｈ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質及び配列番号１６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
  12. ａｃｒＥＦ遺伝子が以下の（ｇ）又は（ｈ）の遺伝子である請求項１０に記載の微生物、
    （ｇ）配列番号１３に示す塩基配列及び配列番号１５に示す塩基配列を含む遺伝子、又は（ｈ）配列番号１３に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子及び配列番号１５に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子。
  13. Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｂｃｒ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
  14. ｂｃｒ遺伝子が以下の（Ｉ）又は（Ｊ）の遺伝子である請求項１３に記載の微生物、
    （Ｉ）配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
    （Ｊ）配列番号１８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
  15. ｂｃｒ遺伝子が以下の（ｉ）又は（ｊ）の遺伝子である請求項１３に記載の微生物、
    （ｉ）配列番号１７に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
    （ｊ）配列番号１７に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
  16. Ｌ−システイン生産能を有し、かつ、ｃｕｓＡ遺伝子の発現が上昇するように改変された微生物。
  17. ｃｕｓＡ遺伝子が以下の（Ｋ）又は（Ｌ）の遺伝子である請求項１６に記載の微生物、
    （Ｋ）配列番号２０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は
    （Ｌ）配列番号２０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
  18. ｃｕｓＡ遺伝子が以下の（ｋ）又は（ｌ）の遺伝子である請求項１
    ６に記載の微生物、
    （ｋ）配列番号１９に示す塩基配列を含む遺伝子、又は
    （ｌ）配列番号１９に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−システイン排出能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
  19. エシェリヒア属細菌である請求項１〜１８のいずれか一項に記載の微生物。
  20. エシェリヒア・コリである請求項１９に記載のエシェリヒア属細菌。
  21. さらにセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が増強するように改変された請求項１〜２０のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌。
  22. 請求項１〜２１のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養し、Ｌ−システインを培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−システインを採取する、Ｌ−システインの製造法。
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